PRÁCTICA

PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO:

COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL -
TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS

I. OBJETIVOS

- Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de

coloración.
- Distinguir las características macroscópicas y las estructuras microscópicas de los
Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las especies de
Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.

II. MARCO TEORICO : COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL

Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasto

posee un índice de refracción cercano al agua, se requiere generalmente tinciones
biológicas para visualizarlos adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras
internas.
Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren uno
de otro en cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución de los
átomos de hidrógeno por otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos más
comunes hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales
cromóforos del compuesto.

2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES

PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150  m y 0.500  m de espesor, pudiendo
incluso alcanzar 0.8  m (Lactobacillus). Las paredes de las células jóvenes son
más delgadas que las células de cultivo antiguo.

GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas está constituida

principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes
peptídicos.
 Sin embargo estas células contienen también una gran cantidad de ácidos teicocos,
polímeros de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato y aminoácidos como D-
alanina o azúcares como la glucosa están unidos a los grupos glicerol y ribitol.

GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de

manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con
surcos u ondulante, que contiene el antígeno o somático conocido como
lipopolisacárido LPS, una capa densa intermedia, y la membrana plasmática
interna. Un espesor de 0.0075  m.

2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Este tipo de preparaciones son las más frecuentes, tanto las obtenidas
directamente a partir de muestras clínicas como las obtenidas a partir de desarrollo
de cultivos.

Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son:

a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos líquidos o sólidos.

Producto líquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de
vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda del
asa de platino.
Cultivo en medio sólido. Puede prepararse una suspensión del material en una
gota de solución salina colocada previamente en el portaobjetos, extendiéndola
con ayuda del asa de platino.

b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente.

c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del

material a estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo. Consiste
en una muerte rápida de los microorganismos, debida a la coagulación de las
albúminas protoplásmicas. Existe un gran número de fijadores, tanto en forma
simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales de fijación son: por el
calor y alcohol en frío.

d. Coloración. Es el proceso de coloración de los microorganismos.

e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante.

f. Secado. Se secará la preparación al aire.

CLASIFICACIÓN DE LAS COLORACIONES

La clasificación de los colorantes es algo confusa, pero está basada en los cromóforos
presentes.

a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o Básico, término

que no índica sus reacciones de pH en solución, sino, si una parte de la molécula
es aniónica o catiónica.
 Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la
cromatina nuclear de las células. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde
de Malaquita. Safranina.
  Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas, tales como
estructuras citoplásmaticas, y como colorante de contraste. Ej: ácido pícrico.
 Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante ácido con uno básico.
Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
 Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en
alcohol. Ej: Sudán III.

CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES

a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la
morfología y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de metileno,
Tinción fucsina.

b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de

manifiesto las características de afinidad de los microorganismos por ciertos
colorantes como; Tinción Gram, Tinción ácido-alcohol resistente.

c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de

manifiesto estructuras bacterianas. como; Tinción de flagelos, Tinción de esporas,
Tinción de cápsulas, Tinción de corpúsculos metacromáticos

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: PREPARACIÓN DE UN FROTIS

BACTERIANO: COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL

3.1. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Preparación del Frotis

- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa
inmediatamente arriba de la porción azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de
la posición vertical como sea posible. Déjela enfriar (cuente hasta 20).
- Tome una porción de la muestra que se va examinar, colocando el asa en
posición plana en la superficie del líquido.
- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplánese ligeramente en el centro de éste
(el portaobjeto deberá estar numerado).
- Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjeto muévala trazando
una espiral del centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra
y cada uno de los 4 lados del portaobjetos.
- Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir cualesquiera
bacterias que se encuentren en ella.

Fijación
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del mechero de Bunsen, con
la muestra hacia arriba.
- Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción.

3.2. TINCIONES SIMPLES

Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Azul de metileno (solución acuosa
al 1%), Safranina (solución acuosa 1%), Asas de platino, Gérmenes diferentes,
Aceite de inmersión.

TINCIÓN DE AZUL DE METILENO

Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante
por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las
esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.

Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para
hacer un frotis.
- Con él esa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva
en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua).
Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para
obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5
minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga
directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de
inmersión.

Grafique la Observación y Resultados

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TINCIÓN DE SAFRANINA

Las bacterias aparecen de color rojo.

Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para
hacer un frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva
en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua).
Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para
obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se deja
actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga
directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
 - Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de
inmersión.

Observación y Resultados

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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES

Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram,
Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión.

TINCIÓN GRAM
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular
bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de iodo (Mordiente).
Algunas bacterias debido a su naturaleza química de sus paredes celulares, poseen
la capacidad de retener el cristal violeta, aún luego del tratamiento con un
decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias
se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared
celular, pierden la coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con
el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las
bacterias Gramnegativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas
vistas al microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus paredes
celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante
por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las
esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.

Reactivos
- Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml, Agua
destilada csp=100 ml)
- Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua
destilada= 100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) ó Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada csp=100
ml)

Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias
Grampositivas y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para
obtener la fijación del frotis, con la finalidad de que el material no sea
arrastrado durante el proceso de tinción.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con
solución de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas
gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante violeta.
Se requiere unos 10 segundos más o menos. También puede utilizar etanol
comercial como decolorante , en este caso dar más tiempo aproximadamente
1 minuto.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de caño.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de
inmersión.

Grafique la Observación y Resultados

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IV. OBSERVACIONES