Universidad Peruana Unión - Microbiología Ambiental

Gina Tito Tolentino

PRÁCTICA N°3

Preparación De Materiales Y Medios De Cultivo Para Esterilizar

1.1. Introducción

Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con
material y medios de cultivo estériles. En Microbiología la esterilización se define como
“el proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas
de resistencia) de un objeto, medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de
microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos
métodos de esterilización, entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias
termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de óxido de etileno (para jeringas y
cajas de plástico).

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el

crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones
como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un
grado correcto de acidez o alcalinidad. El agar es un elemento solidificante muy empleado
para la preparación de medios de cultivo.

El objetivo de este informe es Destacar la importancia de la esterilización de los

materiales de microbiología para reducir la contaminación cruzada y garantizar la calidad
de los análisis de microrganismos.

1.2. Metodología.

1.2.1. Materiales.

• Agua destilada o desionizada

• Algodón, gasa
• Balanza
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• Espátulas
• Matraz de Erlenmeyers de 250 y 1000 ml
• Medios de cultivo o ingredientes deshidratados
• Lápiz marcador de vidrio
• Papel indicador de pH
• Papel aluminio y papel corriente no absorbente
• Pipetas graduadas
• Probetas de 100 ml
• Tubos de ensayo

1.3. Procedimiento.

▪ Preparación de caldo lauryl triptosa.

✓ Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la cantidad de 5.02 g

del polvo para preparar 141 ml de caldo nutritivo.

✓ Coloque el polvo en un matraz de Erlenmeyer de 250 ml limpio y seco, y agregue

cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.

✓ Mezcle la preparación con movimientos giratorios hasta la completa disolución,

pasando por encima del mechero, haciendo varias repeticiones.

✓ Elabore tapones de algodón para 15 tubos, antes de distribuir el medio líquido,

deben estar esterilizados los tubos y luego añadir con una pipeta graduada a razón
de 10 ml en cada tubo.

✓ Coloque los tapones de algodón a los tubos evitando que estén flojos o muy
compactos.

✓ Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor, envuélvalos con papel,

identifíquelos con el nombre del medio, la fecha de preparación y el nombre de la
persona responsable en la elaboración.
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1.3.1. Preparación de Agar nutritivo (Extracto de carne de 0.3; peptona, 0.5

%; agar, 1.5%)

✓ Prepare 200 ml de caldo nutritivo. (repita los pasos 1,2 y 3 del procedimiento
anterior con la corrección en el peso para la nueva cantidad solicitada y en el
Erlenmeyer a usar, debe tener unas tres veces el volumen que tendrá el medio).

✓ Agregue 3 g de agar (1.5 %), y lleve a licuar en baño de agua a ebullición hasta
que el medio luzca transparente a la luz.

✓ Elabore tapones de algodón para unos 16 tubos.

✓ Una vez licuado el medio, déjelo enfriar ligeramente y distribúyalos en los

tubos con una pipeta graduada. Prepare 6 tubos con 12 ml y 10 tubos con 7
ml.

✓ Repita los pasos 6, 7,8 del procedimiento anterior.

✓ El medio restante debe ser acondicionado para su esterilización junto a lo

anterior.

1.3.2. Preparación de Agar mac conkey (peptona, 1.7 %; proteosa – peptona,

0.3 %; lactosa, 1%, sales biliares, 0.15%; NaCl, 0.5%; agar, 1.5%, rojo
neutro, 0.003%, cristal violeta, 0.0001 %).

✓ Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la cantidad de 5.3 g

del polvo para preparar 106 ml de Agar macConkey

✓ Coloque el polvo en un matraz de Erlenmeyer de 1000 ml limpio y seco, y

agregue cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.

✓ Mezcle la preparación con movimientos giratorios hasta la completa disolución,

pasando por encima del mechero, haciendo varias repeticiones.

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✓ Elabore tapones de algodón para 15 tubos, antes de distribuir el medio líquido,

deben estar esterilizados los tubos y luego añadir con una pipeta graduada a

razón de 10 ml en cada tubo.

✓ Coloque los tapones de algodón a los tubos evitando que estén flojos o muy

compactos.

✓ Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor, envuélvalos con papel,

identifíquelos con el nombre del medio, la fecha de preparación y el nombre de

la persona responsable en la elaboración.

1.4. Resultados.

En el trabajo que se realizó obtuvimos como resultado que algunos materiales estaban
llenos de agua, esto sucedió debido a que un grupo de chicos que envolvían, envolvieron
mal la primera capa de 7 tubos de ensayos. Esto fue cansada a que el papel estaba rota y
fue por donde ingreso el agua al momento de poner al autoclave. Y esto impedía continuar
el trabajo y ya no sirven la para realizar lo que se proponía, Ya que no se puede verter el
medio de cultivo mientras los materiales estén llenos de agua. Finalmente, como grupo
coincidimos en que esto ocurrió por una negligencia nuestra, ya que los materiales no
estaban bien envueltos. El propósito a la cual queremos llegar fue a destacar la
importancia de la esterilización de los materiales de microbiología para reducir la
contaminación cruzada y garantizar la calidad de los análisis de microrganismos.

Preparación de caldo
Preparación de Agar Preparación de Agar mac
lauryl triptosa.
nutritivo conkey

1000ml 28gr
1l 1000ml 35.6gr 1000ml 50gr
386ml x
141ml x 106ml x
X=10,81gr
X=5,02gr. X=5.3gr
La cantidad de agua.
La cantidad de agua. La cantidad de agua.
7 x [(4x10] + [(1x15)]
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7 x [(2x10] + 7x (40+15) 7x (1x15)

[(1x15)] =141. 7x 55=385ml 7x15=105ml
+1=106ml.

1.5. Discusión.

Las sustancias termolábiles, se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los

componentes después de que estos hayan sido previamente esterilizados en la autoclave
y enfriados a temperatura ambiente o a 40-50ºC si se trata de medios con agar. Antes de
su esterilización los medios líquidos se reparten en los recipientes adecuados (tubos,
matraces, etc.). Si es un medio sólido y se ha de distribuir en tubos o en matraces será
necesario fundir el agar en baño Maria u horno microondas, una vez fundido y
homogenizado, se distribuye en caliente a los tubos ó matraces (no en placas Petri) se tapa
y se esteriliza en la autoclave. (universidad nacional de nordeste , 206)

La respuesta más acertada de porqué se debe esterilizar los materiales fue que al hacer
una nueva practica o análisis no deben quedar residuos anteriores, si esto pasa queda
contaminado por el reactivo anterior, esto puede llegar a afectar los resultados de tu nuevo
análisis, además. Tampoco tiene que entrar agua a los tubos de ensayo.

En nuestro laboratorio de microbiología se recomienda esterilizar el material con la

autoclave para poder eliminar todo el microorganismo ya que esta se utiliza en altas
temperaturas, pero sin dañar el objeto.

Conclusión.

Concluimos que la esterilización sirve para la eliminación total de los

microorganismos incluyendo las esporas. La autoclave es una de las maquinas que percibe
poder esterilizar los materiales y eliminar los microorganismos siempre en cuando
teniendo mucho cuidado con los materiales que envolvemos, es necesario tener bien
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esterilizado todos nuestros materiales para preparar los medios de cultivos y evitar su
contaminación con otros agentes ya que puede alterar los resultados. Esto nos permite
destacar la importancia de la esterilización de los materiales de microbiología para reducir
la contaminación cruzada y garantizar la calidad de los análisis de microrganismos.

Cuestionario.
1. ¿Cuáles son las ventajas de los medios complejos para el cultivo de
microorganismos?

Porque Contienen sustancias altamente nutritivas, pero de composición

indefinida. Suelen llevar sustancias como extractos de carne, peptona, extractos
de levadura, bovril. La ventaja de este medio de cultivo es que contiene muchos
factores de crecimiento, por lo que podemos cultivar en él gran número de
microorganismos. El inconveniente es que no conocemos lo que
el microorganismo está consumiendo. Ejemplos: Caldo nutritivo: extracto de
carne + peptona + agua

2. Determine la naturaleza química y la función nutritiva de cada uno de los

ingredientes que contienen los medios que ha utilizado.
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3. Describa la autoclave y su forma de uso.

Autoclave: (Vapor a presión) Para lograr una esterilidad confiable el método
estándar es el vapor saturado, en autoclave, a una temperatura de 121 °C durante
15 minutos. En el caso de descontaminación el tiempo puede extenderse a 30
minutos. Esta temperatura se logra por vapor de agua a una atmósfera de presión
sobre la presión atmosférica. Los recipientes a colocar en la autoclave no deben
estar totalmente llenos y deben tener tapas flojas o estar tapados con algodón con
una sobre tapa para permitir la ebullición libre y la liberación del aire disuelto.
Para grandes volúmenes de líquidos se debe permitir un mayor tiempo de purgado.
Este método se utiliza para esterilizar medios de cultivos y soluciones. En el caso
de líquidos, éstos no deben formar emulsiones con el agua como Ej: aceite o
vaselina. También se utiliza para esterilizar ropa de cama o material textil en
general, siempre que la autoclave esté prevista de un sistema de secado por vacío.

4. ¿Qué otros métodos de esterilización se emplean para los medios de cultivo? ¿Qué
ventajas otorgan

✓ Aldehídos: Son agentes alquilones que actúan sobre las proteínas,

provocando una modificación irreversible en enzimas e inhiben la
actividad enzimática. Estos compuestos destruyen las esporas.
✓ Glutaraldehído: Consiste en preparar una solución alcalina al 2% y
sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague
de 10 minutos. Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único
esterilizante efectivo frío. Puede esterilizar plástico, goma, vidrio, metal,
etc.

✓ Formaldehído: Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales

pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodón,
que después pueden ser expuesta al calor para una rápida esterilización
(acción del gas formaldehído).
✓ Esterilización por gas-plasma de Peróxido de Hidrógeno: Es proceso de
esterilización a baja temperatura la cual consta en la transmisión de
peróxido de hidrógeno en fase plasma (estado entre líquido y gas), que
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ejerce la acción biocida. Posee como ventajas: No deja ningún residuo

tóxico. Se convierte en agua y oxígeno al final del proceso. El material no
precisa aireación.

Bibliografía

✓ Protocolo2_3_19088.pdf. (s.f.). Obtenido de

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Protocolo2_3_19088.pdf

✓ Universidad nacional de nordeste . (206). Obtenido de facultad de agroidustrias

: http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp3.pdf

Anexos.
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