UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

CARRERA DE MEDICINA
I CICLO 2018-2019

Virología
Temas:
 Liberación de virus para su estudio
 Cultivos virales
 Métodos de contaje de virus

Integrantes:
Jhony Patricio Hinojosa Grijalva
Kiara Katherine López Montoya
Tyrone Saúl González Cabrera

PROFESORA:
Dra. Mosquera Herrera Carmen

SEMESTRE:
Cuarto semestre

GRUPO:
Grupo 3
 Método de identificación viral
Liberación del virus de la célula infectada
Para que se pueda obtener una sustancia con contenido viral se debe realizar la
purificación del virus,
Purificación: consiste en producir una sustancia con máxima capacidad infectiva y
mínimo peso y componentes

Vibración sónica
LIBERACIÓN DEL VIRUS A
PARTIR DE LA CÉLULA Homogenización
INFECTADA
Congelación o descongelación

Método de purificación química

Para la purificación del virus, se debe evitar condiciones que conduzcan a la
desnaturalización de proteínas
Los virus pueden precipitarse por:
1. Sulfato de amonio o alcohol
2. Absorción por columnas DEAE CELULOSA
3. Fosfato de calcio
4. Resinas de intercambio iónico
5. Sephadex o eritrocitos

Métodos físicos
Consiste en la separación de contaminantes

Centrifugación tipos:

Centrifugación diferencial
Centrifugación isopícnica
Centrifugación diferencial
(También llamada de frontera móvil). El tubo se llena con muestra y se centrifuga. El
comportamiento de cada componente de la muestra depende de su forma,
tamaño, densidad y, lógicamente, de las condiciones de centrifugación. Se obtienen sólo
2 fracciones: sedimento y sobrenadante.
[Nota: la palabra precipitado es más adecuada para algo insoluble, que precipita por
centrifugación o por otros mecanismos (por ej., una reacción química); sedimento es
más correcto para lo que se ha forzado a ir al fondo pero seguiría siendo soluble; pellet
es una palabra inglesa para lo que queda compactado en el fondo como consecuencia
de la centrifugación]
Una aplicación típica es el fraccionamiento subcelular (separación de los distintos
componentes de una célula, principalmente de los orgánulos) (véase Luque o Alberts)
empleando sucesivas centrifugaciones a velocidad creciente.
esquema de procedimiento de centrifugación diferencial en fraccionamiento subcelular

Centrifugación isopícnica o de equilibrio de sedimentación

Se utiliza también un gradiente de densidad, pero en este caso el tiempo de

centrifugación es lo suficientemente largo (hasta 1 o 2 días) como para que se alcance
el equilibrio de sedimentación (entre la fuerza centrífuga, el empuje hidrostático de la
célula y su difusión). Para conseguirlo, se usan gradientes continuos que cubren todo el
intervalo de densidades de los componentes de la muestra: en el fondo del tubo la
densidad del medio ha de ser mayor que la del componente más denso. De esta forma,
independientemente del tiempo de centrifugación, las partículas, células, etc. nunca
sedimentarán en el fondo, sino que alcanzan una posición estable intermedia en el
gradiente, donde se concentran en una banda muy estrecha (mejor resolución). Lo más
frecuente es mezclar la muestra con el material que formará el gradiente y generar un
gradiente autoformado a la vez que se hace la separación. Requiere velocidades muy
altas (ultra centrifugación) para que se forme el gradiente.
Además de la mayor resolución, lo interesante de esta técnica es que separa
exclusivamente según la densidad de los componentes de la muestra, que se sitúan en
la posición del gradiente donde la densidad del medio es igual a la suya propia
(isopícnica = de igual densidad, en griego).
 CULTIVOS CELULARES
Se estudian tres sistemas:
1. Cultivos con animales de
experimentación (in vivo)
2. Cultivos con huevos
embrionados (in vivo)
3. Cultivos con células in vitro
Antes de realizar los cultivos se debe
conocer los requerimientos del
laboratorio para poder efectuar dichos
procedimientos con las normas de
bioseguridad.

Requerimientos para un laboratorio de cultivos

Se requiere barreras de Bioseguridad
Barreras de protección
Guantes
Mascarillas
Anteojos y Ropas especiales (alto riesgo)
Inmunización con vacunas virales
Medidas para no contaminar el agente
Práctica microbiológica
Flujos laminares
Protección del medio ambiente o la comunidad
Adecuado flujo de aires
Acceso restringido del área

Tener en cuenta que los virus se clasifican en nivel de seguridad

CULTIVOS CON ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Animales usados:
1. Primates
2. Conejos
3. cobayo
4. hurón
5.Ratones
Virus de inoculación intraperitoneal
Picornaviridae
Reoviridae: Rotavirus, Reovirus
Adenoviridae: Mastadenovirus (A-F)
Caliciviridae: Norovirus
Astroviridae: Astrovirus
Flaviviridae: Virus del dengue, fiebre amarilla
Virus de inoculación intracerebral
Virus Coxasckie: Cepas A-B
Poliovirus
Herpetoviridae: Herpes simple 1-2
Virus de la Rabia
Togaviridae: Chicungunya, Virus de la rubeola
Arenavirus: Virus de la coriomeningitis linfocítica
USADO EN:
Estudio de patogenia
Oncogenicidad
Inmunidad a virus
Preparación de antisueros
Inocuidad de vacunas

HUEVOS EMBRIONADOS
Procedimientos para inocular virus en huevo embrionado
1. Revisión
2. Asepcia
3. Realizar un orificio
4. Introducción de la aguja
5. Se tapa con tela adhesiva
6. Se incuba a 37ºC
7. Se observa resultados

Se usa Huevos de pollo o pato,

además deben ser embriones de 7-
14 días.
CARACTERÍSTICAS
1. Bacteriologicamente estériles.
2. Carecen de respuesta inmune
3. Fácil manipulación
4. Puede Poseer virus latentes
escasos
CULTIVOS DE CÉLULAS

Cultivo primario
Los más utilizados son:
Fibroblastos de riñon de primates
Células embrionarias
Fibroblastos de prepucio humano
Como es el medio?
Glucosa
Sales
Aminoácidos no esenciales
Vitaminas
Suero fetal Bovino
Ph isotónico: 7,2-7,4
Antibióticos / Antimicoticos

Características esenciales
de las células del medio:
1. Crecimiento
horizontal
2. Inhibición por
contacto

DIFERENCIAS DE CULTIVOS
Cultivo primario Línea celular diploide Línea celular continua
Se puede realizar de 5- 50-100 pasajes Crecimiento ilimitado
10 pasajes

Línea celular diploide

Son de crecimiento limitado
(50-100 pasajes)
Cromosomas Diploide

Línea Celular continua

Son de crecimiento ilimitado
Se las denomina líneas
inmortales
Cromosomas variable
(Aneuploidea)
 EFECTOS CITOPATOGÉNICOS

Muerte celular
Redondeamiento celular
Degeneración celular
Agregación
Pérdida de adherencia al sustrato
Cambios histológicos característicos: cuerpos de inclusión en el núcleo o en el
citoplasma, marginación de la cromatina
Sincitios: Células multinucleadas gigantes fruto de la fusión celular provocada
por virus.
Cambios en la superficie celular
Expresión del antígeno vírico
Hemadsorción (expresión de hemaglutinina)
HEMAGLUTINACION

Los virus pueden formar puentes entre los glóbulos rojos para constituir una red
.
En 1941 por Hirst (influenza Orthomyxoviridae)
La Hemaglutinina es una glucoproteína en forma de “Espinas” cortas que se
proyectan de la envoltura viral donde el virus se unirá a cualquier eritrocito con
los receptores de una clase diferente
La unión de moléculas de hemaglutinina viral a receptores mucoproteicos en
glóbulos rojos

Los eritrocitos aglutinados se depositarán en forma de retículo en el fondo del

tubo , en forma de sierra
Los eritrocitos no aglutinados se depositarán en forma de botón
Los receptores son mucoproteínas que tienen ácido N-acetil-neuramínico
(NANA) son inactivados por la enzima neuraminidasa y separa los viriones del
eritrocito. Este proceso se llama Elusión a 37

REACCION DE INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION

Si se hace reaccionar un virus con capacidad hemaglutinitante con su anticuerpo

específico, este anulará su capacidad de hemaglutinación por bloqueo de las
hemaglutininas presente en las envolturas del virión.
Para identificar y tipificar virus como para determinar la presencia de anticuerpos
específicos inhibidores de la hemaglutinación en los sueros de los pacientes.

Cuantificación viral por la técnica de cuantificación de unidades formadoras de

placas (UFP) METODO DE AGAROSA

La técnica de recuento de placas permite cuantificar la cantidad de viriones

presentes en un inóculo. Es un procedimiento enumerativo que se utiliza en
investigación. Se basa en el recuento de lesiones focos en membrana
corioalantoidea de embrión de pollo, focos de proliferación en cultivos celulares
(virus tumorales)
Para realizar el plaqueo, los de cultivo celulares (en botellas o policubetas)se
infectan con diluciones de virus.luego de una hora de adsorción a 37C se cubre
la monocapa celular con medio de cultivo semisólido que contiene agar, agarosa,
o metilcelulosa y se procede a la incubación de las células durante varios días
La infectividad se puede expresar en unidades formadoras de placas (UFP)
por ml. El título se calcula directamente a partir de la dilución de la muestra (d),
el número de placas contado (n)y el volumen del inóculo(v)
CUANTIFICACION MEDIANTE LA TECNICA DE PUNTO FINAL

Se realizan diluciones seriadas del virus con base 10, las que se inoculan en
números iguales de unidades de prueba. Luego de la incubación se registra ACP
en los cultivos en los animales.
EL método de Reed y Muech se basa en que si una unidad de prueba dio
resultado positivo en una dosis alta de virus también dará positivo en muestras
mayores y negativo con dosis más bajas
La estimación de la dosis infectivas de cultivo 50 (DICT) se basa en las
frecuencias acumulativas de la respuestas positivas y negativas.
3El método de reed y Muech toma en cuenta los resultados obtenidos en varias
diluciones del inóculo. La dilución que infecta el 50% de las unidades de la
prueba se denomina Dosis Infectante de Cultivo (DICT)50 si se trata de cultivo
o bien dosis letal 50(DL50) si se trata de animales
obtenidos en varias diluciones del inóculo. La dilución que infecta Dosis
infectante de cultivo50 DICT50) si se trata de cultivos, o bien Dosis Letal 50
(DL50

Virus

1) Infección de monocapa celular

3) Replicación en células adyacentes

2) Cubrir con agarosa y nutrientes

4) Tinción con colorante vital (rojo neutro)