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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN

FACULTAD DE BIOQUIMICA, QUIMICA Y FARMACIA

ASIGNATURA TRABAJO FINAL

“EFECTO DEL SOBRENADANTE DE CULTIVOS DE


Lactobacillus plantarum Y DE LA DNAsa SOBRE EL ESPUTO
DE PACIENTES CON FIBROSIS QUISTICA. ESTUDIO DEL
ESPUTO EN LA PROMOCION DE INFECCIONES Y LESIONES
PULMONARES EN RATONES.”

TRABAJO FINAL PARA OPTAR AL TITULO DE

LICENCIADO EN BIOTECNOLOGIA

JUAN CARLOS LAFUENTE

DIRECTORA: NADIA MARGARITA GOBBATO

LUGAR DE TRABAJO: CATEDRA DE INMUNOLOGIA

NOVIEMBRE 2017

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AGRADECIMIENTOS

 A mi directora de tesis Nadia por haberme guiado en cada momento y motivarme para

lograr este objetivo.

 A mis padres Marta y Carlos, por darme la vida, por su apoyo incondicional,

comprensión, cariño a quienes espero recompensar un poquito con esta meta alcanzada.

 A mis hermanas Carolina y Cristina por ser uno de los pilares de mi vida, por guiarme

y escucharme siempre.

 A Cecilia por su cariño permanente e incondicional. Por ayudarme a enfrentar

obstáculos con alegría y porque sin ella no hubiera alcanzado este objetivo.

 A Jorge y Gonzalo por el estímulo permanente y por compartir momentos de sus vidas

conmigo

 A mis compañeros y amigos de siempre Bruno, Mariano, Vero, Nacho, Rodrigo, Naty,

Gaby, Ro y Pablo, por apoyarme en cada momento de mi carrera.

 A Juan Carlos, Tito, Mirta, Clarita y Carlita, por hacerme más simple este camino.

 A Gaby, Eve, Rodrigo, Pao, Apa y Vero por ayudarme y apoyarme en el último y más

difícil escalón de esta carrera.

 Y a todos mis compañeros de trabajo que estuvieron siempre a mi lado.

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Índice
I) Presentación a congresos
II) Glosario
III) Resumen
1) INTRODUCCIÓN
a) Historia de la Fibrosis Quística.
b) Incidencia.
c) Población no caucásica
d) Rol del CFTR en el transporte epitelial de fluidos y electrolitos.
e) Mutaciones.
f) Fisiopatología de la enfermedad pulmonar en pacientes con Fibrosis Quística.
g) Composición del moco respiratorio.
h) Mecanismo de defensa del epitelio respiratorio
i) Infección de las vías aéreas con Pseudomonas aeruginosa e inflamación.
j) Efecto de la inflamación de las vías aéreas y su relación con la enfermedad
pulmonar progresiva.
k) DNasa y elastasa.
l) Biofilm
m) Crecimiento planctónico frente a crecimiento en biofilm. La adherencia
primaria y el desarrollo del biofilm.
n) Regulación del proceso de formación de biofilm.
o) Pseudomonas aeruginosa.
p) Probióticos – Lactobacillus plantarum – Antecedentes.
2) HIPÓTESIS.
3) OBJETIVOS GENERALES.
4) OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
5) MATERIALES Y METODOS
A) Esputo
A1) Obtención de muestras.
A2) Estudio de la celularidad del esputo.
A3) Estudio microbiológico del esputo.
A3.1) Siembra y aislamiento.
A3.2) Examen macroscópico de las colonias
A3.3) Examen microscópico – Tinción de Gram.
A3.4) Identificación fenotípica.
A3.5) Antibiogramas.
A3.6) Conservación de cepas aisladas.
A4) Obtención de los sobrenadantes de Lactobacillus plantarum ATCC10241
A5) Obtención de polimorfonucleares por gradiente de Ficolle-Hipaque.
A6) Obtención de polimorfonucleares lisados (PMN lisados).
B) Efecto del sobrenadante de Lactobacillus plantarum sobre la patogenicidad de
Pseudomonas aeruginosa.
B1) Efecto sobre el biofilm de Pseudomonas aeruginosa.
B2) Efecto sobre la elastasa presente en el esputo.
B3) Efecto del sobrenadante de Lactobacillus plantarum in vivo.

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6) RESULTADOS Y DISCUCIÓN.
A) Esputo – Celularidad y bacterias identificadas.
B) Efecto sobre la elastasa.
C) Efecto del sobrenadante del cultivo de Lactobacillus plantarum in vivo.
D) Estudios histológicos de los pulmones.
7) CONCLUSIONES.
8) PROYECCIONES.
9) BIBLIOGRAFÍA.

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Los resultados obtenidos en este trabajo de investigación dieron lugar a
las siguientes presentaciones en congresos nacionales e internacional en
la modalidad póster:

“El esputo de pacientes con Fibrosis Quística en la promoción de infecciones y lesiones


pulmonares. Estrategias para la inhibición de las mismas”.
Lafuente JC; Ramos AN; Rachid M; Valdez JC; Silva C; Venecia A; Perret L; Soto A Gobbato
N.
X Reunión de Investigación en Ciencias de la Salud. Departamento de Investigación. Facultad
de Medicina. UNT. S.M. de Tucumán. 18 y 19 de noviembre. (2008)

“Efecto de la DNasa y del sobrenadante de cultivos de Lactobacillus plantarum sobre el


biofilm de Pseudomonas auruginosa y elastasa del esputo de pacientes con fibrosis
quística”.
JC Lafuente, N Gobbato, AN Ramos; C Silva de Ruiz, M Rachid, A Venecia, L Perret, A Soto,
JC Valdez.
LVI Reunión Científica de la Sociedad Argentina de Inmunología – XI Jornada Científica del
Grupo Rioplatense de Citometría de Flujo.– La Falda – Córdoba. 22 al 24 de Octubre. (2008)

“Supernatants of Lactobacillus platarum culture inhibit biofilm of Pseudomonas


aeruginosa and ellastasa released from sputum by DNase”.
Lafuente JC, Gobbato N, Ramos AN, Rachid M, Silva C, Venecia A, Perret L, Soto A, Valdez
JC. Biolatina2008 – Biotechnology in Latin America San Pablo –Brasil. 29 Setiembre al 1
Octubre. (2008)

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GLOSARIO
ABC: ATP-binding-cassette
AHL: Acil-homoserinlactonas
AMP: Adenosin monofosfato
ARN: Acido Ribonucleico
ASL: Líquidos de la superficie de las vías aérea
ATP: Adenosin trifosfato
BAL: Bacterias ácido lácticas
BNF: Bacilos no fermentadores
C: Cultivo
CFTR: (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) regulador de conductancia
transmembrana de la fibrosis quística.
DNA: Acido Desoxiribonucleico
DNasa I: Desoxirribonucleasa Humana I
DO: Densidad óptica
ENAC: canales de sodio epiteliales.
EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica
EPS: Exopolisacárido
FA: Filtrado ácido
FAO: Organización para la Alimentación y la Agricultura de las Naciones Unidas
FQ: Fibrosis Quística
GB: Glóbulos blancos
GR: Glóbulos rojos
HNE: Elastasa proveniente de los neutrófilos humanos
IFN- Interferon
IgA: Inmunoglobulina A
IL-1: Interleuquina 1
IL-8: Interleuquina 8
LB: Medio de cultivo Luria-Bertani
LBA: Lavado broncoalveolar
Lp: Lactobacillus plantarum

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LPS: Lipopolisacárido
MMP9: metaloproteinasa 9
MO: Macrofagos
MRS: Medio de cultivo
NE: Elastasa de Neutrofilos
O2: Oxigeno
OMS: Organización Mundial de la Salud
Pa qsc 101:Pseudomona aeruginosa mutante qsc 101
Pa: Pseudomonas aeruginosa
PCAs: péptidos catiónicos antimicrobianos
PCL: Líquido periciliar = ASL
pH: Potencial Hidrógeno
PMN: Polimorfonucleares
QS: Quorum Sensing
r.p.m: revoluciones por minuto
ROS: especies reactivas de oxígeno
Sa: Staphylococcus aureus
SF: Solución fisiológica
SLp: Sobrenadante de Lactobacillus plantarum
SLPI: Inhibidor de la Proteasa Secretora de Leucocitos
Th1: T helper 1
Th2: T helper 2
TIMP-1: del inhibidor tisular de mmp tipo 1
TNF-a: Factor de necrosis tumoral alfa
UFC/g : Unidades formadoras de colonias por gramo de tejido

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INTRODUCCION

“Ay, de aquel niño que al ser besado en la frente sabe salado. Él está

embrujado y pronto debe morir”. (Esta frase del folklore irlandés del siglo XV, atribuía el sabor salado
del sudor a una brujería). (Astudillo, Pedro 2010)

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INTRODUCCION
RESUMEN

La fibrosis quística es una enfermedad genética que predispone a infecciones crónicas

pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. Esta bacteria formadora de biofilm es altamente

resistente tanto a los antibióticos como a la respuesta inmune del hospedador. Los leucocitos

polimorfonucleares son los componentes más significativos de la defensa contra las

infecciones en la Fibrosis Quística aunque contribuyen notablemente a la hiperviscosidad del

moco bronquial debido a que su gran aflujo y muerte en las vías aéreas lleva a la liberación de

grandes cantidades de DNA extracelular. También se liberan componentes histolíticos tales

como la elastasa que dañan el tejido pulmonar. La nebulización con DNasa para fluidificar el

moco bronquial y removerlo a través de manipulaciones fisioterapéuticas es significativa para

reducir la infección y mejorar la función pulmonar. Sin embargo, dicha fluidificación

promueve la liberación de elastasa y sustancias inflamatorias que pueden agudizar los

síntomas de la enfermedad.

El Sobrenadante del cultivo de Lactobacillus plantarum tiene, al igual que la DNasa,

capacidad inhibitoria del biofilm de P. aeruginosa crecida en los esputos. La Elastasa

bacteriana y la que es liberada del esputo por la fluidificación con DNasa es inhibida por

Sobrenadante de Lactobacillus plantarum in vitro, In vivo esta técnica no es sensible. El

Sobrenadante del cultivo de Lactobacillus plantarum podría complementar la actividad de la

DNasa en la terapia de Fibrosis Quística y sugiere investigaciones multidisciplinarias para

mejorar el tratamiento de esta enfermedad.

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INTRODUCCION
Historia de la Fibrosis Quística

La primera descripción clínica de FQ se atribuye a Dorothy Andersen (patóloga de

Nueva York) (Andersen DH, 1938), quien en 1938 publicó una revisión de las característica

clínico-patológicas de la enfermedad y utilizó por primera vez el término de “fibrosis quística

de páncreas”, aunque ya había referencias en la literatura europea respecto a que “los niños

cuyo sudor es salado tienen mal pronóstico”.

En 1945 Farber (Farber S, 1944) propuso el término mucovisidosis al observar, en

estudios anátomo-patológicos, la secreción de un moco espeso y pegajoso que producía la

obstrucción y pérdida da la función en los distintos órganos afectados.

Andersen y Hodges en 1954 concluyeron que la incidencia familiar era concordante

con una herencia autosómica recesiva. En aquella época el diagnóstico se realizaba por la

familiaridad y la afectación respiratoria y digestiva.

Gibson y Cooke en 1959 (Gibson LE, Cooke RE) diseñaron y publicaron la prueba de

estimulación del sudor, la cual permitía analizar las concentraciones electrolíticas de cloro en

el sudor, como método estandarizado para el diagnóstico de FQ.

Recién en la década de 1980 se descubrió que el defecto fundamental se debía a la falla

en la secreción celular de cloro: Tsui LC et. al en 1985 localiza el gen responsable del defecto

en el cromosoma 7 y Kerem B et. al en 1989 lograron el aislamiento y caracterización de esta

proteína denominada Reguladora de Conductancia de Transmembrana de Fibrosis Quística

(CFTR o cystic fibrosis transmembrane conductance regulator); también se identificó que la

anomalía genética más frecuente, que afectaba al 70% de los enfermos conocida como

F508del, consistía en una deleción de tres nucleótidos que originaba la alteración del

aminoácido fenilalanina en la posición 508.

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INTRODUCCION

Incidencia

La FQ presenta una gran variabilidad de incidencia entre diferentes países y razas. En

la Argentina, aunque no se dispongan de datos definitivos, la incidencia es aproximadamente

de 1:3.500 nacimientos (la prevalencia en la población general sería de 1/30 (Segal E. 1999).

En los Estados Unidos 30.000 personas y un número proporcionalmente similar en el mundo

sufren esta enfermedad, siendo una de las enfermedades genéticas letales más comunes entre

los caucásicos: 1 cada 3.500 niños que nacen por año en EEUU padecen FQ y tienen una

sobrevida de 37,5 años (Bethesda MD, 2008).

En la población caucásica en el mundo, la incidencia de esta enfermedad es de

1/2500-3500 nacidos vivos (Ratjen F, Döring G, 2003).

Existe una gran variabilidad entre los distintos países: en Quebec (Canadá) se reporta

una incidencia de 1 por cada 891 recién nacidos vivos (Canadian Patient Data Registry

Nacional Report, 1995); en Finlandia es de 1 por cada 25.000 nacimientos (Kollberg H, 1982);

en el Reino Unido es de 1 por 2.500 nacimientos (Dodge JA, 1988). En España, en el año

1999 comenzaron a realizarse programas de detección precoz de Fibrosis Quística; así, en la

Comunidad de Canarias se ha reportado una incidencia de 1 por 2.810 nacimientos (Armas H

et al, 1994) mientras que en Cataluña 1 por cada 4.510 nacimientos (Telleria J et al, 2002).

Población no caucasiana

En los grupos no caucasianos las cifras son muy inferiores; así, en la población de

raza negra americana se indica una incidencia de 1 por cada 17.000, en la raza oriental de

Hawai 1 por cada 90.000 y en Japón de 1 cada 320.000 a 680.000 nacidos vivos (Casals T,

2003). Estos resultados pueden oscilar debido a factores genéticos o carencia de métodos

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INTRODUCCION
diagnósticos para la detección de la enfermedad, ya que en estos países existen otros

problemas de salud que son más prioritarios.

Gen CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulador)

Figura 1: Gen CFTR

El gen CFTR de 230 kb está en el brazo largo del cromosoma 7 y se compone de 27 exones

que codifica una proteína de 1480 aminoácidos denominada CFTR, situada en la porción

apical de la membrana de las células epiteliales, que se expresa en las células secretorias,

senos paranasales, pulmones, páncreas, hígado y tracto reproductivo. Funciona como un canal

de cloro (Cl) dependiente de AMP cíclico. La vía normal de síntesis y maduración de la

proteína CFTR en las células epiteliales se inicia con la transcripción en el núcleo celular de

un ARN mensajero, con modificaciones durante su paso por el Retículo Endoplásmico que

incluye acoplamiento, glucosilación y tránsito en el Aparato de Golgi hasta la membrana

celular donde se ancla y funciona como un canal regulador de Cl -. La proteína CFTR

pertenece a la familia de proteínas transportadoras de membrana (ATP-binding-cassette o

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INTRODUCCION
ABC). Contiene dos dominios de nucleótidos que se unen e hidrolizan ATP, dos conjuntos de

segmentos que abarcan la membrana que forman el canal y un dominio regulador (R) central.

El dominio R, único para la proteína CFTR, está altamente cargado con numerosos sitios de

fosforilación para la proteín quinasa A o C (Gibson RL et al 2003; Ratjen F, Doring G, 2003).

Está formada por dos dominios transmembrana (TM1 y TM2), cada uno de los cuales

atraviesa 6 veces la doble capa lipídica de la membrana celular para anclar la proteína; dos

sitios de unión a ATP (NFB1 y NFB2) y un dominio regulador R, múltiples sitios de

fosforilación (nueve en total), dependiente de AMP cíclico, mediante los cuales controla la

actividad del canal. El primer dominio (TM1) es el soporte físico del canal. La abertura y

cierre del canal se activa por fosforilación del domino R por una proteinquinasa dependiente

del AMP cíclico; parece ser que la fosforilación parcial de R al mismo tiempo que ocurre la

fosforilación de NBF1estabiliza la apertura del canal y permite la salida de Cl - a favor de un

gradiente mientras que la fosforilación parcial de R y de NBF2 conduce al cierre del canal. El

CFTR normal funciona también como regulador de canales de Na, estableciendo un balance

entre absorción de Na+ y secreción de HCO3- para hidratar la superficie de la vía aérea

(Ostedgaard LS et al 2001).

Rol del CFTR en el transporte epitelial de fluidos y electrolitos

La expresión de la proteína CFTR está altamente regulada en las células epiteliales

del pulmón, páncreas, intestino, ductos biliares, riñón, glándulas salivales y del sudor, testículo

y útero. El CFTR normal funciona como un regulador de los canales de Na + y Cl- dependiente

de AMP cíclico en la membrana apical de las células epiteliales, estableciendo un balance

entre la absorción de Na+ y la secreción de Cl- y HCO3- para hidratar la superficie de las vías

aéreas.

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INTRODUCCION
Como se observa en la figura 2 el epitelio de las vías aéreas es el encargado del

transporte de electrolitos y las glándulas de la submucosa controlan la cantidad y composición

del ASL. El mal funcionamiento del CFTR daña el transporte de electrolitos lo que conduce a

una disminución de las defensas pulmonares ya que se daña el clearence mucociliar de las

bacterias (Kunzelmann K., Schreiber R, 2012).

Figura 2: Modelo de transporte de las vías aéreas de iones Cl- y de iones Na+ de las glándulas submucosas

A) y de la superficie del epitelio B) (PCL = periciliary fluid = ASL) (Kunzelmann and Schreiber, 2012)

La mutación en el gen CFTR altera el contenido de Na+ y Cl- en el líquido periciliar

del epitelio respiratorio y de las glándulas submucosas secretoras de moco; se produce una

acumulación de secreciones viscosas y purulentas en las vías aéreas de los pacientes con FQ,

disminución del aclaramiento mucociliar, infecciones respiratorias recurrentes y deterioro

progresivo de la función pulmonar. La característica fundamental de la enfermedad son los

tapones mucosos y la dilatación de los ductos y túbulos de las glándulas submucosas que están

presentes en estos pacientes y que aumentan la viscosidad del moco del epitelio respiratorio y

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INTRODUCCION
de las glándulas submucosas secretoras de moco. Por lo tanto la falta de secreción de iones Cl-

a través de la membrana apical de las células epiteliales de las glándulas submucosas conduce

a la hiperabsorción de iones Na+, deshidratación de las vías aéreas (reducido contenido de

agua en las secreciones por efecto osmolar lo que aumenta la viscoelasticidad del moco),

clearence mucociliar comprometido e infección de los pulmones.

Mutaciones

Aunque se han descripto un gran número de mutaciones para la FQ, solamente 22

mutaciones han sido identificadas con una frecuencia del 0,1 % de los alelos conocidos. Las

restantes mutaciones son muy raras o limitadas a uno o unos pocos pacientes. La mutación

más común y la primera que ha sido identificada es la deleción de tres pares de bases que

codifican para la Fenilalanina en la posición 508 de la proteína CFTR (denominada Delta508).

Esta mutación está presente en el 70 % de los pacientes de raza blanca.

Como se observa en la figura Figura 3 en personas sanas el gen CFTR es transcripto a un

ARN mensajero; transportado al Retículo Endoplásmico y al Aparato de Golgi para luego

insertarse en la membrana de la célula donde funciona como canal de Cl-. Como toda

glicoproteína de transmembrana, las etapas posteriores a la traducción comienzan en el

Retículo endoplásmico con la formación de una forma inmadura de core-glicosilada, que es un

precursor de su forma madura completamente glicosilada. La proteína madura, correctamente

plegada, se procesa a través del aparato de Golgi para ser finalmente liberada en la membrana

apical de la célula donde se expresa normalmente (Lubamba B. et al, 2012)

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INTRODUCCION

Figura 3: Funcionamiento del gen CFTR en personas sanas (McKone E.F. et al, 2004)

Se han descrito cinco clases de mutaciones:

Figura 4: 5 clases de mutaciones del gen CFTR (Ronald L. Gibson el al. 2003)

La mutación Clase I (ejemplo: G542X) (No hay síntesis): Es una mutación que

impide la traducción. Es la resultante de un defecto de inestabilidad del ácido ribonucleico

mensajero (RNAm) o de una proteína anormal, la cual es rápidamente degradada. Hay una

inhibición de la síntesis de la proteína. Esta mutación genera un RNAm no funcional y en

consecuencia, la ausencia total o parcial de la expresión de la proteína.

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INTRODUCCION
Las mutaciones Clase II (ejemplo: ∆F508) (Bloqueo del proceso): resultan de una

falla en el proceso de síntesis de la proteína Esta clase incluye a la mutación DeltaF508 y es la

más común; consiste en una deleción de 3 nucleótidos que tiene como consecuencia la pérdida

del aminoácido fenilalanina en la posición 508. Cuando la proteína CFTR con la mutación

delta F508 llega al retículo endoplasmático, el mecanismo de control de calidad de este

componente celular reconoce que esta proteína no tiene la conformación correcta, detecta esta

proteína como defectuosa y es degradada mediante proteólisis.

Figura 5: Mutación de clase II

La deleción delta 508 es la causa más común de la Fibrosis Quística que se produce

eliminándose el último nucleótido “C” de la Isoleucina (Ile) y los dos primeros de la

Fenilalanina (Phe). Al tener un código genético alterado la Ile de la posición 507 no se

modifica ya que codifica tanto con el triplete ATC (que tenía) como con el ATT (resultante

luego de la deleción), resultando sólo la eliminación del aminoácido Phe.

La mutación Clase III (ejemplo: G551D) (Bloqueo en la regulación): resulta de una

proteína correctamente localizada pero defectuosa en la regulación de la actividad del canal de

cloro. Esta mutación genera una proteína inmadura que llega a la membrana celular, pero el

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INTRODUCCION
canal de cloruro no está debidamente activado, lo que en consecuencia deriva una proteína

inactiva incapaz de transportar los iones.

La mutación Clase IV (ejemplo: R347P) (Conductancia alterada): está

correctamente localizada y regulada pero tiene un defecto en la conductancia del cloro. Las

mutaciones se encuentran en la membrana. Pese a la mutación la proteína llega a la superficie

celular y el canal de cloruro está activado, pero hay una disminución en la conductancia, por lo

tanto tendremos un canal defectuoso de iones cloro.

La mutación Clase V (ejemplo: A455E) (Síntesis reducida): resulta en una reducida

síntesis de CFTR, con una clara tendencia a presentar una enfermedad leve, con test de sudor

en valores límites y con una secreción intestinal residual de cloro. Esta mutación resulta en

una disminución de la cantidad de proteínas CFTR, debido a un empalme incorrecto: la

mutación de una Citosina por una Timina en la posición 3849 + 10kb. En esta mutación existe

un pequeño porcentaje de empalmes correctos que dan proteínas CFTR funcionales y activas,

pero de igual manera tenemos un fenotipo marcadamente atenuado.

Fisiopatología de la enfermedad pulmonar en pacientes con FQ

Los mecanismos de defensa del pulmón comprenden la tos, las barreras anatómicas,

los cambios aerodinámicos y los mecanismos celulares. El tracto respiratorio inferior está

protegido por el mecanismo de defensa mucociliar local que comprende la integridad del

epitelio ciliado (que se mueve de manera coordinada impulsando el mucus desde las vías

aéreas hacia la orofarínge donde son ingeridos o expulsados), el fluido periciliar (que es

esencial para el clearence mucociliar y para optimizar el medio en el cual son efectivos los

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INTRODUCCION
agentes antimicrobianos) y el mucus (actúa como barrera física y química contra los

organismo y las partículas que ingresan a las vías respiratorias)(Boucher R C. 1994).

Las células ciliadas y las células Globet son las más importantes en el mecanismo de

defensa mucociliar local. El epitelio ciliado asiste a la defensa mucoliar local modulando el

fluido de la superficie de las vías aéreas y produciendo péptidos antimicrobianos. La principal

función del epitelio ciliado es el clearence del mucus desde el tracto respiratorio inferior a

través del bateo coordinado de las cilias. Los péptidos antimicrobianos (Travis SM et al, 1999)

son los principales mediadores de la muerte de las bacterias; incluyen péptidos como la

Lisosima, la Lactoferrina, la Fosfolipasa A2, el Inhibidor de la Proteasa Secretora de

Leucocitos (SLPI) y Lactoperoxidasa. Otras sustancias que contribuyen a las defensas

inespecíficas son el complemento, proteasas, IgA y las defensinas (Bals R et al, 1999) que son

péptidos antimicrobianos ricos en cisteína: las Alfa-Defensinas, que están en los gránulos

secretorios de los granulocitos y que actúan a nivel de las superficies mucosas de las vías

aéreas; las Beta-Defensinas.

Composición del moco respiratorio

El moco respiratorio está compuesto de 1% de sales, 2-3 % de proteínas y

glicoproteínas de alto peso molecular (mucinas), 3-5% de lípidos y 95% de agua (Houtmeyers

E et al, 1999).

En el mucus de los pacientes con FQ hay DNA proveniente de la fagocitosis frustrada

de los PMN y de las bacterias, que se puede unir a proteína, mucinas y lípidos aumentando la

viscosidad del moco, lo que lleva a un transporte ineficiente del mucus y que sirve de sustrato

para formar el biofilm bacteriano. La mucina es producida por las células Globet y las

glándulas de la submucosa en el aparato de Golgi, almacenada en gránulos y liberada por

92
INTRODUCCION
exocitosis. La mucina liberada rápidamente se expande y se hincha por hidratación; todo este

proceso depende de la concentración de sales de las vías aéreas, de la osmolalidad, del

contenido de agua y del pH; todos estos factores dependen del transporte de iones y agua

controlados por las células ciliadas.

El mucus protege, hidrata y humidifica las vías respiratorias, actúa como una barrera

de filtración y está involucrada en la defensa mucociliar. Las bacterias y partículas inhaladas

se adhieren a la capa de mucus donde son depuradas por los PMN y los macrófagos. También

actúan en el mucus los péptidos antibacterianos como la Lisosima junto con la antiproteasas y

las Inmunoglobulinas. Luego las células, bacterias y partículas son eliminadas de las vías

aéreas por el clearence mucociliar (Houtmeyers E et al, 1999).

Mecanismos de defensa del epitelio respiratorio

La tos y las cilios remueven mecánicamente los debris y microorganismos inhalados

atrapados en el moco, mediante un mecanismo denominado clearance mucociliar

(aclaramiento mucociliar) (figura 6). Las células epiteliales secretan múltiples sustancias con

actividad pro y anti-inflamatorio como también con actividades antimicrobianas; funcionan

como una barrera inmunitaria innata. Los macrófagos, linfocitos B y T, neutrófilos y también

células epiteliales representan los componentes celulares de los sistemas inmunitarios (innato

y adaptativo).

92
INTRODUCCION

Figura 6: mecanismos de defensa del epitelio respiratorio

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INTRODUCCION
Infección de las vías aéreas con Pseudomonas aeruginosa e inflamación

La FQ presenta una ruptura en la interacción entre el epitelio ciliado, el fluido periciliar

y el mucus. La presencia de CFTR anormal produce un incremento en la absorción de sodio y

agua y una reducción en la secreción de Cloruro lo que conduce a un fluido hipertónico de la

superficie de las vías respiratoria (ASL), que rompe el mecanismo de defensa mucociliar local:

el mucus está deshidratado y más viscoso reduciendo el clearence mucociliar. El ASL

hipertónico puede inactivar los péptidos antibacterianos lo que conduce a la mayor

susceptibilidad a las infecciones bacterianas. (Puchelle E et al, 2002).

En la figura 7 (Gibson 2003) se explican los eventos patogénicos que llevan a la

infección crónica de las vías aéreas de pacientes con FQ por P.aeruginosa (verde claro: capa

de mucus; amarillo: células epiteliales de las vías aéreas; líquido periciliar o ASL: por debajo

de la capa de mucus, en las cilias; vector: clearence mucociliar y neumonía

La presencia de aumento en la densidad de las macrocolonias y de menor cantidad de

PMN da como resultado una masa mucopurulenta con hipoxia (gradiente todo azul).

(Worlitzsch, D. et al, 2002).

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INTRODUCCION

a) Epitelio de las vías aéreas normales: delgada capa de mucus; la

baja densidad del ASL facilita el clearence mucociliar, lo que está

indicado por el vector. Una velocidad normal en el consumo de O 2 no

produce gradientes en la presión en el ASL.

b) a f): Epitelio de vías aéreas de FQ.

b) CFTR defectuoso elimina el ASL (flechas para abajo) y el mucus

se adhiere a la superficie epitelial y se detiene el transporte de moco

(vector bidireccional). El transporte acelerado de iones y el elevado

consumo de O2 no generan gradientes de O2 en la delgada capa de ASL.

c) Persistente hipersecreción de mucus por las células Globet lo que

lleva a la formación de tapones mucosos (aumenta la altura del mucus).

El elevado consumo de O2 genera hipoxia dentro de la gruesa capa de

mucus.

d) Los gradientes de hipoxia son detectados por la Pseudomonas

aeruginosa y entra al mucus, activamente o pasivamente.

e) Pseudomonas aeruginosa se adapta al nicho con hipoxia dentro de

la masa de mucus con incremento de la formación de alginato y la

creación de macrocolonias.

f) Las macrocolonias resisten las defensas, resisten a los PMN y se

preparan para la infección crónica.

Figura 7: Eventos patogénicos en pacientes con FQ por P.aeruginosa

Efecto de la inflamación de las vías aéreas y su relación con la enfermedad

pulmonar progresiva

La FQ afecta principalmente las vías aéreas y las glándulas submucosas. Los pulmones

de los recién nacidos son estructuralmente normales a excepción del aumento del diámetro

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INTRODUCCION
acindar de las glándulas mucosas de la tráquea, lo que sugiere tapones mucosos como

evidencia de inflamación o infección. Con el tiempo, la infección se hace crónica con una

inflamación intensa. Las secreciones respiratorias de estos pacientes poseen alta concentración

de neutrófilos, citocinas y quimiocinas. Se produce una respuesta neutrófilica intensa

localizada en los espacios perobronquiales y endobronquiales. Se producen cambios

patológicos con formación de tapones mucopurulentos en los broquiolos. La inflamación de

las vías aéreas está dominada por los PMN con IL-8 y elastasa elevadas. Las vías aéreas se

dilatan y se produce la bronquiectasia que es secundaria a la proteólisis y condrólisis de los

tejidos de soporte. En el estadio más avanzado aparece en el parénquima pulmonar atelectasia

(Gibson RL et al, 2003)

Figura 8: Formación de biofilm en alveolos pulmonares. (Costerton W et al. 2003)

La enfermedad pulmonar crónica de la FQ se caracteriza por una afluencia de PMN en

las vías aéreas (Conesea M et al, 2003), con una respuesta inflamatoria prolongada la cual es

incapaz de eliminar las bacterias, especialmente Pa. Los mediadores para el influjo de PMN

son la IL-8, el factor de necrosis tumoral alfa, la IL-1, entre otros. La IL-8 es producida por

varios tipos de células pulmonares (macrófagos alveolar, célula epitelial bronquial,

92
INTRODUCCION
fibroblasatos), los macrófagos y los neutrófilos; es la quimiocina más importante de los PMN

en las vías aéreas de FQ. El macrófago alveolar tiene un rol central en el reclutamiento de los

neutrófilos en el pulmón ya que ellos producen IL-8 en respuesta a cualquier estímulo exógeno

lipopolisacárido derivado de la pared de las bacterias (LPS). El Factor de Necrosis Tumoral

Alfa estimula el proceso oxidativo y secretorio de los PMN y éste junto con la IL-1 pueden

gatillar a los PMN para una mayor respuesta a los quimiotácticos (Gibson RL et al, 2003).

Tanto la inmunidad innata como la adaptativa participan en la enfermedad crónica

pulmonar de la FQ (Figura 9)

Figura 9: Respuesta inmune en la enfermedad cronica (Conesea M et al, 2003)

El LPS bacteriano puede activar tanto a los macrófagos (MO) como a las células

epiteliales de las vías respiratorias, que a su vez producen IL-8, TNF-a e IL-1. Estos

mediadores primarios pro-inflamatorios son los responsables de la activación de los

neutrófilos y del reclutamiento en las vías respiratorias. Las citocinas secretadas por los

Macrófagos activados favorecen el desarrollo de una respuesta Th1 o una respuesta Th2. La

activación exagerada de las células epiteliales de las vías respiratorias, de neutrófilos y de la

respuesta Th2 en la FQ está delimitada por una línea. Posiblemente en la FQ está afectada la

92
INTRODUCCION
secreción de IFN- por las células Th1 y la activación de la actividad bactericida de los

Macrófagos.

Cualquiera que sea el mecanismo que lleve a una inflamación pulmonar donde

predominen los PMN, éstos no son capaces de eliminar la infección bacteriana (“fagocitosis

frustrada”) debido a la mutación de P. aeruginosa no mucoide a una cepa mucoide, por la

síntesis de un exopolisacárido (alginato) que protege a las células bacteriana de la fagocitosis

por los PMN (Hoiby N. et al, 2001).

Figura 90: Fagositósis frustrada

Los PMN activados son las primeras células efectoras en la patogénesis de la FQ. Los

PMN liberan cantidades masivas de Elastasa y otras proteasas como la alfa-1 antitripsina y el

inhibidor de la proteasa secretoria de los leucocitos. Debido a la fagocitosis frustrada, los

PMN liberan grandes cantidades de DNA que contribuye a incrementar la viscosidad de las

secreciones endobroquiales reduciendo el clearence mucociliar. La secreción de citocinas y

quimiotácticos promueve la migración de los PMN en las vías aéreas. Una vez que llegaron,

gatillan la liberación de mediadores proinflamatorios para perpetuar la respuesta inflamatoria.

Los PMN contienen proteasas en sus gránulos, que son críticas en la respuesta de los PMN

92
INTRODUCCION
durante la infección. Sin embargo, grandes cantidades de proteasas escapan de los PMN

debido a la fagocitosis frustada de los mismos; entre ellas está la elastasa y la metaloproteinasa

9 de la matriz (MMP-9). Las metaloproteasas de matriz (MMP) son enzimas proteolíticas que

regulan recambio de la matriz extracelular y ayudan en la restauración de la arquitectura del

tejido después de una lesión. Ejercen un papel importante en la patogénesis de las

enfermedades crónicas neutrofílicas pulmonares, como la FQ, donde se demostró que se

produce un desbalance proteasa/antiproteasa (TIMP-1 Tissue Inhibitor of Metalloprotease-1) y

que la elastasa proveniente de los neutrófilos humanos (HNE) sería capaz de activar una pro-

MMP-9 y degradar TIMP-1; por lo que estos autores plantean como estrategia viable para

reducir la inflamación la restauración del balance proteasa/antiproteasa (Gaggar A et al, 2007).

DNAasa y elastasa

La enfermedad pulmonar en la FQ está caracterizada por infección bacteriana de las

vías aéreas con migración masiva de neutrófilos en un proceso inflamatorio e infeccioso de

curso crónico (Cantin, A. 1995).

El reclutamiento de neutrófilos por efecto de la Interluquina-8 (IL-8) conduce a la

acumulación de grandes cantidades de DNA extracelular en las secreciones de las vías

respiratorias, que impide el aclaramiento del moco de las vías aéreas que aumenta la

viscosidad del esputo. ADN tiene una propiedad inherente para formar un gel viscoso y las

hebras de ADN polimerizadas junto a las glicoproteínas mucosas son responsables de las

propiedades viscoelásticas del esputo de FQ. Posiblemente el DNA liberado de P. aeruginosa

actúa como un potente estimulador de la producción de IL-8 por las células epiteliales de las

vías respiratorias (Delgado MA et al, 2006).

92
INTRODUCCION
La combinación de inflamación e infección determina obstrucción y destrucción

progresiva de las vías aéreas, con desarrollo de bronquiolitis y bronquiectasias; en los

pulmones de los pacientes fibroquísticos se generan zonas fibróticas que dan lugar a las

dilataciones bronquiales llamadas bronquiectasias, capaces de formar una gran cantidad de

moco. Este moco, que es más viscoso y espeso que el normal, se retiene en dichos bronquios,

haciendo muy costosa la expectoración y sirviendo también como medio de cultivo para que

los gérmenes se desarrollen y produzcan infección.

Inmediatamente después de realizado el diagnóstico de FQ, las estrategias utilizadas en

el tratamiento de estos pacientes infectados son el tratamiento antibiótico precoz por vía

intravenosa, inhalatoria y oral para la erradicación de la bacteria; adicionada con la

antibioticoterapia el uso de nebulizaciones diarias con agentes mucolíticos como la DNasa

recombinante humana (Dornasa pancreática o Pulmozime) (Dosis: 2,5 mg (2 ml) 1 vez por

día) para fluidificar el moco eliminándolo por maniobras kinesiológicas para disminuir así la

probabilidad de infección. Es un elemento fundamental para reducir la viscosidad de las

secreciones bronquiales mediante la degradación del ADN de los neutrófilos. La DNasa

incrementa la actividad elastolítica del esputo en la FQ “in vitro” (Cantin AM, 1998) como así

también en los esputo de pacientes con FQ (Shah PL et al, 1996).

La fisioterapia respiratoria constituye uno de los pilares importantes en el tratamiento

de la misma y debe incorporarse en la rutina diaria para facilitar la eliminación del moco,

disminuyendo la carga bacteriana y la proteólisis y mantener lo más limpio posible las vías

respiratorias de secreciones para minimizar el daño pulmonar. Las secreciones acumuladas en

las vías aéreas respiratorias incrementan la resistencia al flujo aéreo con la necesidad de mayor

92
INTRODUCCION
trabajo respiratorio. Se desencadena un proceso de inflamación, infección y obstrucción que se

retroalimenta y define la progresión de la enfermedad pulmonar.

La clonación del gen que codifica la Desoxirribonucleasa Humana I (DNasa I) ha

permitido el desarrollo de un agente mucolítico donde la DNasa I humana recombinante

(DNasa hr) se administra en forma de aerosol (nebulizaciones) a estos pacientes todos los días

antes de realizar las maniobras kinesiológicas. La DNAasa digiere el DNA extracelular

polimérico reduciendo así la viscosidad del esputo en los pacientes con FQ, lo que se asocia a

una mejora en la obstrucción del flujo de aire y una disminución en el número de infecciones

respiratorias en general (Shak, S et al, 1990).

Los neutrófilos también liberan elastasa (NE) que degrada la elastina, fibronectina,

laminina, colágeno produciendo mayor daño pulmonar. La NE es una potente secretadora ya

que ejerce un efecto estimulador sobre las glándulas de las vías respiratorias aumentando la

hipersecreción pulmonar (Schuster A et al, 1995).

Los efectos beneficiosos de las nebulizaciones con DNasa se deben a que incrementa

la actividad elastolítica del esputo ya que degrada el ADN extracelular polimérico reduciendo

así la viscosidad del esputo en los pacientes con FQ. Los efectos adversos del tratamiento con

DNasa son la producción de una faringo/laringitis (ronquera) dosis dependiente, en general

transitoria y sin que sea necesaria la suspensión de la droga y la liberación de elastasa

produciendo daño pulmonar.

La Elastasa es una serina proteasa que se encuentra en los gránulos azurófilos de los

neutrófilos y es liberada cuando son estimulados por citoquinas y quimioatractantes como

Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-), Interleuquina 8 (IL-8), C5a, lipopolisacárido

bacteriano (LPS) (Roghanian A et al, 2008). Es una enzima degradativa que actúa

92
INTRODUCCION
intracelularmente para degradar los patógenos ingeridos o extracelularmente para degradar

componentes de la matriz extracelular. Debido a la fagocitosis frustrada los neutrófilos de los

pacientes con FQ se libera más cantidad de elastasa a los tejidos lo que lleva a una mayor

degradación de los tejidos (Korkmaz B et al, 2008)

Biofilm

Los biofilms se definen como comunidades de microorganismos que crecen embebidos

en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo.

Aunque la composición del biofilm es variable, en general el componente mayoritario del

biofilm es el agua, que puede representar hasta un 97% del contenido total. Además de agua y

de las células bacterianas, la matriz del biofilm es un complejo formado principalmente por

exopolisacáridos secretados por las propias células que forman parte del mismo. En menor

cantidad se encuentran otras macromoléculas como proteínas, DNA y productos diversos

procedentes de la lisis de las bacterias. Las bacterias embebidas en esta matriz de biopolímero,

en comparación con las células planctónicas, están muy bien protegidas contra los antibióticos

y otros agentes antimicrobianos, así como de las defensas del hospedador (protegidas de la

acción de los anticuerpos y del ataque de las células fagocíticas) y por lo tanto son muy

difíciles o imposibles de erradicar (Costerton W et al, 2003).

La característica que mejor distingue las infecciones crónicas relacionadas con

biofilms de las infecciones agudas es su respuesta a tratamientos antibióticos. Mientras que las

infecciones agudas pueden ser eliminadas tras un breve tratamiento antibiótico, las infecciones

por biofilms normalmente no consiguen ser completamente eliminadas y producen episodios

92
INTRODUCCION
recurrentes. Esto se debe a que las bacterias del biofilm pueden ser hasta 1000 veces más

resistentes a los antibióticos que esas mismas bacterias crecidas en medio líquido.

Crecimiento planctónico frente a crecimiento en biofilm. La adherencia primaria

y el desarrollo del biofilm

El mecanismo de formación del biofilm (Figura 11) consta de varias etapas. En la etapa

inicial las células que están en estado planctónico (o sea que se mueven libremente) se

adhieren en forma reversible a una superficie o sustrato. En esta etapa las bacterias todavía

son susceptibles a los antibióticos lo que explica el éxito de la profilaxis en esta etapa. La

motilidad brindada por los flagelos y las fimbrias son importantes en bacterias gram-negativas

(P. aeruginosa, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonella enteritidis); bacterias gram-

positivas inmóviles, como estafilococos, estreptococos y micobacterias también forman

biofilm por lo cual la motilidad no es un requisito esencial.

La siguiente etapa es la unión irreversible a la superficie, la multiplicación de las

bacterias (las bacterias comienzan a dividirse), la formación de microcolonias (las células hijas

se extienden alrededor del sitio de unión formando microcolonias). En una etapa posterior

comienza la producción de una matriz de polímero (Exopolisacárido o EPS) alrededor de la

microcolonia que constituye la matriz del biofilm y forma estructuras similares a setas

(mushrooms) entre las cuales se observa la presencia de canales.

La composición del exopolisacárido es diferente en cada bacteria y varía desde

alginato en P. aeruginosa, celulosa en S. typhimurium, un exopolisacárido rico en glucosa y

galactosa en V. cholerae, poli-N-acetilglucosamina en S. aureus, etc. Algunas bacterias de la

matriz del biofilm se desprenden del mismo para poder colonizar nuevas superficies, cerrando

92
INTRODUCCION
el proceso de desarrollo de propagación del biofilm. La matriz del biofilm maduro puede

contener canales llenos de agua a través de los cuales las bacterias móviles pueden colonizar

la parte superior del biofilm (Høiby N et al. 2011).

Figura 101: Formación de biofilm para Pseudomonas aeruginosa. (Høiby N et al. 2011).

Regulación del proceso de formación del Biofilm

El proceso de formación del biofilm está regulado por un proceso de “quorum

sensing” o autoinducción. El sistema de quorum sensing es un mecanismo de regulación

dependiente de la acumulación en el medio ambiente de una molécula señal o autoinductor,

que permite a la bacteria sentir la densidad de población existente. Para bacterias gram-

negativas este autoinductor es acilhomoserina lactona y para bacterias gram-positivas son

péptidos. Cuando se acumula en el medio una suficiente cantidad del autoinductor se activa un

receptor específico que altera la expresión de genes afectando a distintos fenotipos (Reading

NC et al. 2006)

Pseudomonas aeruginosa: Es una bacteria Gram (-) que pertenece a las

Enterobacterias.

92
INTRODUCCION
El porcentaje total de pacientes (todas las edades) que tenían al menos un cultivo en

vías respiratorias en 2001 fue positivo para Pseudomonas aeruginosa en un 58,7%

| P. aeruginosa es el patógeno más importante en la FQ y, sobre la base de las respuestas

inmunitarias en niños pequeños, la infección parece ocurrir mucho antes de lo que se creía

anteriormente. Hasta el 80% de los pacientes con FQ son finalmente infectados con este

organismo, y la adquisición del organismo está asociada con el deterioro clínico. La fuente de

cepas de P. aeruginosa en pacientes con FQ no ha sido claramente establecida. Hay una

amplia distribución de genotipos de P. aeruginosa que se han demostrado en niños pequeños,

lo que sugiere la adquisición de depósitos ambientales, y sólo rara vez los pacientes con FQ

parecen compartir genotipos, generalmente sólo cuando son hermanos o están

epidemiológicamente vinculados. La comparación de los genotipos de las vías respiratorias

superiores e inferiores recogidas simultáneamente de los pacientes demuestra que distintas

cepas genéticas pueden colonizar diferentes sitios anatómicos en la vía respiratoria de la FQ.

La presencia de biofilms de P. aeruginosa en pacientes con FQ en las vías respiratorias

se sugirió por primera vez debido a las señales de detección de quórum que los organismos

producen para señalar la expresión de genes dependientes de la densidad celular. Además,

tanto la microscopía electrónica de transmisión como la de barrido han demostrado

agrupaciones organizadas y microcolonías de P. aeruginosa en el esputo expectorado de FQ

compatible con la formación de biofilm. Posteriormente, se ha sugerido que la presencia de

hipoxia local dentro de las placas de moco en las vías aéreas incrementa la producción de

alginato de Pseudomonas, lo que puede conducir a una mayor formación de biofilm.

Recientemente se ha informado de que las variantes del fenotipo resistentes a los antibióticos

92
INTRODUCCION
de P. aeruginosa con una mayor capacidad para formar biofilms surgen a alta frecuencia en los

pulmones de los pacientes con FQ.

Probióticos- Lactobacillus plantarum-Antecedentes

Según la Organización para la Alimentación y la Agricultura de las Naciones Unidas

(FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) han declarado que los probióticos tienen

el potencial para proporcionar beneficios para la salud y que las cepas específicas son seguras

para su uso en humanos (Food and Agriculture Organization of the United Nations and World

Health Organization 2001).

Los probióticos se pueden definir como organismos vivos no patógenos que cuando

son administrados en cantidades adecuadas confieren un beneficio en la salud del hospedador.

Los Lactobacilos están ampliamente distribuidos en los alimentos y en el medio ambiente y

colonizan partes del cuerpo humano como bacterias comensales. En el cuerpo humano

colonizan tres regiones anatómicas: cavidad oral, los intestinos y el tracto vaginal.

(Bernardeau M et al, 2006). Las especies de Lactobacilos son las primeras bacterias en ser

descriptas como probióticos ya que ejercen un amplio rango de actividades que promueven la

salud, tal como mejora en la resistencia a los patógenos, reduce los niveles de colesterol en el

suero, mejora la diarrea inducida por antibióticos (Reid G et al, 2003); ejerce efectos en la

inmunomodulación del sistema inmune ya que pueden interactuar con las células inmunes

mucosas o las células epiteliales que recubren la mucosa para modular funciones específicas

del sistema inmune mucoso (Wells JM, 2011). Los Lactobacilos juegan un rol importante para

mantener la salud vaginal en las mujeres ya que producen ácido láctico, peróxido de

hidrógeno, bacterioricinas y otras sustancias antimicrobianas que inhiben a los

microorganismos patógenos en la vagina (Redondo-Lopez V et al, 1990).

92
INTRODUCCION
El uso de bacterias inofensivas para desplazar a organismos patógenos es una

alternativa para combatir las infecciones. La aplicación de esta estrategia conocida como

interferencia bacteriana se llama BACTERIOTERAPIA. Los Lactobacilos son potentes

estimuladores de IL-12 potenciando así la inmunidad mediada por células; la interacción con

monocitos, macrófagos y células dendríticas produce un patrón diferente de citocinas y

quimiocinas en comparación con la bacterias patógenas (Hessle C et al, 1999 y 2000).

La BACTERIOTERAPIA, al utilizar bacterias inocuas para desplazar organismos

patógenos, resulta en una alternativa muy prometedora en la lucha contra las infecciones

crónicas. En el año 1989 un grupo de investigadores comenzó aplicando cultivos enteros de

Lactobacillus plantarum en las heridas crónicas infectadas, para interferir las infecciones

producidas por patógenos como Pseudomonas aeruginosa, en pacientes que estaban en la

Unidad de Cirugía Plástica y Quemados del Hospital Centro de Salud de San Miguel de

Tucumán. El Dr. Juan Carlos Valdéz y su grupo de colaboradores realizaron estudios básicos y

clínicos de interferencia bacteriana entre Unidad de Cirugía Plástica y Quemados del Hospital

Centro de Salud y Cátedra de Inmunología del Instituto de Microbiología de la Facultad de

Bioquímica de la UNT, con resultados muy alentadores. Se han realizado tratamientos

bacterioterápicos adyuvantes aplicando cultivos de L. plantarum en quemaduras infectadas en

ratones y en úlceras crónicas estudiando su impacto en las células del lecho ulceroso (Peral

MC et al, 2009). Determinaron que el cultivo total y el sobrenadante del cultivo de L.

plantarum inhibe in vitro la multiplicación y viabilidad de P. aeruginosa como también la

síntesis de elastasa y la producción de biofilm. En ensayos in vivo se estableció, en un modelo

experimental murino de quemaduras infectadas con P. aeruginosa, que el cultivo de L.

plantarum en inhibe dicha infección aumentando la actividad antibactaeriana de los fagocitos

92
INTRODUCCION
PMN y de otras células involucradas en la lesión (Valdez JC et al, 2005) y (Ramos A et al,

2010) (Valdez JC 2010).

Otros resultados obtenidos por el mismo grupo de investigadores muestran que P.

aeruginosa promueve procesos inflamatorios que son citotóxicos para los PMN y que el

tratamiento de la lesión con sobrenadante de L. plantarum favorece el infiltrado de PMN con

actividad microbicida y menos lesivos para el tejido, mientras que disminuye la inflamación y

la citotoxicidad producida por sobrenadantes de P. aeruginosa (Ramos AN et al, 2010).

En base a los resultados obtenidos por este grupo de investigadores sobre la actividad

antimicrobiana y antipatogénica que ejerce el sobrenadante de L. plantarum sobre P.

aeruginosa, se podría reproducir la infección pulmonar con esta bacteria en modelos animales

e investigar los mecanismos celulares y moleculares por los cuales la bacterioterapia revertiría

el proceso de la infección y estudiar la interferencia entre bacterias patógenas y no patógenas

que se produce en este modelo animal. La infección pulmonar con P. aeruginosa, aunque con

la limitación de no ser una infección de años de cronicidad que se observa en FQ, serviría para

mejorar el entendimiento sobre los mecanismos fisiopatogénicos de la infección y para realizar

ensayos biológicos de sustancias que puedan paliar esta afección. Se podría proyectar el

desarrollo biotecnológico del sobrenadante de cultivos L. plantarum ya que presentan una

probada eficacia y un bajo costo.

92
HIPOTESIS
Hipótesis

Los sobrenadantes obtenidos de cultivos de Lactobacillus plantarum tienen la capacidad

de complementar la actividad fluidificante de la DNasa, la cual es utilizada en los pacientes

con Fibrosis Quística, para adicionar sus propiedades bacteriolíticas e inhibitorias del biofilm

de Pseudomonas aeruginosa. Esta complementariedad es de fundamental importancia en la

calidad de vida y sobrevida del paciente ya que favorece la depuración pulmonar realizada por

los kinesiólogos.

92
OBJETIVOS
Objetivos Generales

Las infecciones respiratorias, en especial la Fibrosis Quística, tienden a la cronicidad

pues son refractarias al tratamiento con antibióticos y a los mecanismos de defensa del

hospedador, causando una gran morbi-mortalidad y ocasionando cuantiosos gastos a los

sistemas de salud.

La estrategia utilizada hoy en día para la eliminación de las bacterias en estos pacientes

consiste en el tratamiento antibiótico precoz, cuyo éxito se basa en la ausencia del modo de

crecimiento en biofilm de las bacterias. Pero en el estadio de infección bronquial crónica,

donde las bacterias ya están establecidas como biofilm, su eliminación es imposible, salvo de

manera muy transitoria. Junto con la antibiótico-terapia se administran nebulizaciones diarias

con DNasa recombinante humana para fluidificar el mucus, de modo que se lo pueda eliminar

por maniobras kinesiológicas y disminuir así la probabilidad de infecciones. Es el tratamiento

más ampliamente utilizado para reducir la viscosidad del esputo. La DNAsa digiere el DNA

extracelular polimérico reduciendo así la viscosidad del esputo en los pacientes con FQ.

Objetivos específicos

La FQ es una enfermedad genética, con hiperviscosidad del moco, lo cual predispone a

infecciones respiratorias pulmonares por bacterias productoras de biofilm con alta morbi-

mortalidad.

La respuesta a la infección, dada principalmente por PMN, no sólo no es efectiva pues

no puede eliminar a las bacterias en biofilm, sino que exacerba la enfermedad. Esto se debe a

que los PMN muertos, tras una fagocitosis frustrada, liberan DNA lo que aumenta la

viscosidad del moco y sirve de sustrato para el biofilm bacteriano. También liberan radicales

92
OBJETIVOS
libres y enzimas tales como la elastasa, que contribuyen a la ruptura del tejido circundante y

son básicos en la patogénesis del daño estructural progresivo de las vías aéreas.

Cuando la infección bronquial crónica ya se ha instalado, ninguna estrategia de curación

es altamente eficaz, motivo por el cual es necesario optimizar los tratamientos para tratar de

erradicarlas

En trabajos previos se demostró que los cultivos de Lactobacillus plantarum poseen una

probada inocuidad y gran efectividad sobre la patogenicidad de Pseudomonas aeruginosa. Se

observó además que los sobrenadantes obtenidos de cultivos de Lactobacillus plantarum

disminuían la carga bacteriana en heridas crónicas. Esta acción está basada en la inhibición de

las señales quórum sensing, de la producción de elastasa y de la formación de biofilm del

patógeno. Estudios preliminares en curso indicarían la potencial acción inhibitoria de

sobrenadantes de cultivos de Lactobacillus plantarum sobre el biofilm y la elastasa de

Pseudomonas aeruginosa crecida de los esputos de pacientes con Fibrosis Quística.

Los objetivos propuestos en esta tesina son:

 Aislar y tipificar las cepas bacterianas del moco de pacientes con Fibrosis Quística.

 Realizar ensayos de interferencia con el sobrenadante obtenido de cultivos de

Lactobacillus plantarum.

 Estudiar si el sobrenadante de cultivos de Lactobacillus plantarum muestra acción

inhibitoria sobre biofilm de Pseudomonas aeruginosa cultivada sobre distintos lechos: a)

lechos de mucus de pacientes con Fibrosis Quística; b) lechos de neutrófilos humanos aislados

de sangre periférica; c) lechos de neutrófilos humanos aislados de sangre periférica lisados; d)

sobre el DNA purificado de los neutrófilos aislados de sangre periférica.

92
OBJETIVOS
 Evaluar la liberación de elastasa del mucus de pacientes nebulizados y no nebulizados

con DNasa, después del tratamiento In Vitro del moco con DNasa y la inhibición que podría

ejercer el sobrenadante del cultivo de Lactobacillus plantarum.

 Investigar en modelos experimentales murinos, la acción del mucus de pacientes con

Fibrosis Quística, tratados y no tratados con DNasa, en la injuria tisular en pulmón.

 Ensayar la potencial inhibición que tienen los sobrenadantes de cultivos de

Lactobacillus plantarum sobre dicha injuria.

92
MATERIALES Y METODOS
Materiales y Métodos

 ESPUTO

a.-Obtención de las muestras

Las muestras de esputo fueron obtenidas de pacientes con FQ mediante maniobras

kinesiológicas para la depuración de las vías aéreas, con y sin nebulización previa con DNasa

recombinante humana, acorde a las indicaciones del médico tratante.

Para fluidificar el moco los pacientes fueron previamente nebulizados con DNasa

recombinante humana (Pulmozyme) 2,5 mg, 1 hora antes de la fisioterapia respiratoria.

Los pacientes que no recibían DNasa también fueron nebulizados pero sólo con

solución fisiológica más salbutamol veinte minutos antes de comenzar la terapia kinesiológica.

La cavidad bucal de los pacientes fue higienizada con un cepillado dental y buches con

agua antiséptica para evitar la contaminación de la muestra con la flora oral.

Se realizaron maniobras kinésicas respiratorias (claping, vibrocompresión, ciclo activo,

etc) para la depuración de las vías aéreas y la toma de muestra del moco.

Las muestras de esputo fueron recolectadas en frascos de plástico estériles el que se

transportó en una conservadora con frío hasta el laboratorio. Cabe aclarar que las muestras de

esputo son normalmente desechadas.

Las muestras de esputo de cada paciente fueron utilizadas como lecho para el

desarrollo de biofilm bacteriano en el ensayo de formación de biofilm y para medir el

contenido de Elastasa del mismo.

La fluidificación del moco (dilución ¼) se realizó con soluciones de Ditiotreitol (10

mM de DTT preparado con H2O estéril) que disgrega la mucosidad y no afecta su viabilidad.

92
MATERIALES Y METODOS
Ética: La utilización de las muestras se realizó con la autorización del Comité de Ética

del Hospital del Niños Jesús y con el consentimiento informado de los padres o tutores de los

pacientes.

b.- Estudio de la celularidad del esputo

La celularidad y el estado de las células del esputo fueron estudiados en frotis teñidos

con May Grünwal- Giemsa. Técnica: realizar extendidos del esputo con un ansa sobre

portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados. Fijar por calor directamente sobre la

llame de un mechero. Una vez secos colorear con la técnica de tinción de Gram. Contar 200

células por frotis con microscopia óptica de inmersión (100x) y determinar la cantidad

relativa de células en un score de 1 a 4+.

Las muestras se clasificaron según el esquema de graduación de Murray y Washington

(Guía de Trabajos Prácticos de la Catedra de Bacteriología de la Facultad de Bioquimica,

Quimica y Farmacia de la UNT) considerándose como aceptables aquellas que presentaban

menos de 10 células epiteliales y más de 25 PMNs.

c.- Estudio microbiológico del esputo

c.1- Siembra y aislamiento

El aislamiento, identificación y sensibilidad a los antibióticos se realizó siguiendo la

metodología microbiológica de rutina para bacterias que se aíslan del moco de pacientes con

FQ, utilizando protocolos validados y de uso corriente en el Laboratorio de Bacteriología

Clínica de la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la U.N.T. y lo especificado por

el Manual de Procedimientos en Microbiología Clínica Vol. I (ASM). Las bacterias aisladas

fueron conservadas en freezer a -20ºC para realizar estudios posteriores in vitro.

92
MATERIALES Y METODOS
Las muestras se sembraron en los siguientes medio de cultivo por estría manteniendo

las condiciones de esterilidad:

 Sangre Agar Base (Britania)

 Agar chocolate

 Sangre Agar Base Con Azida (Britania)

 Mc Conkey (Britania)

 BHI caldo (Brain Heart Infusion)(Britania):

Se incubaron en jarras de incubación en atmósfera entre 5-10% de CO2, durante 24 h a

37°C en estufa.

c.2.- Exámen macroscópico de las colonias:

Luego de la incubación se observaron las colonias que crecieron en las cajas de Petri .

Se analizó: color, tamaño, textura, forma, bordes y hemólisis.

c.3.- Exámen microscópico - Tinción de Gram

Es una coloración diferencial utilizada de rutina y que permite diferenciar dos

grandes grupos de bacterias: Bacterias Gram (+) y Bacterias Gram (-). Las bacterias Gram (+)

se tiñen de color violeta ya que retienen el Cristal Violeta tras la decoloración y las bacterias

Gram (-) se colorean de rojo rosadas ya que al no retener el Cristal Violeta tras la decoloración

se colorean con la Fucsina básica. Esta tinción es insuficiente para hacer diagnóstico

bacteriológico, pero es fundamental para dar una presunción rápida de los agentes patógenos

observados en el material en estudio y necesaria para definir el camino a seguir.

Técnica de Gram: Se preparó un extendido fino de la colonia en estudio: Se colocó una gota

de solución fisiológica (SF) en un portaobjeto limpio y desengrasado. Con ansa se tomó una

pequeña cantidad de la colonia y se formó una suspensión homogénea con la SF. Se dejó secar.

92
MATERIALES Y METODOS
Se fijó el material al portaobjeto por calor. Se pasó el portaobjeto 3 veces durante unos

segundos por la llama de un mechero Bunsen.

Primer colorante: se cubrió los extendidos completamente con Violeta de Genciana y se dejó

actuar durante 1 min. Se añadió Lugol. Se decoloró rápidamente con etanol-acetona. Se lavó

con agua destilada inmediatamente después de la decoloración.

Segundo colorante: se cubrió los extendidos con Fucsina básica (colorante de contraste) y se

dejó actuar por 3 min. Se lavó con agua corriente. Se dejó secar. Se observó al microscopio

óptico 100 x con aceite de inmersión.

Figura 12: Estructura de la pared celular bacteriana de (a) Gram positivas y (b) Gram negativas.

92
MATERIALES Y METODOS
c.4.- Identificación fenotípica

La identificación de los distintos tipos de microorganismos se realizó mediante una serie

de pruebas bioquímicas. Consistió en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de

un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Los resultados de los test se analizaron según clasificaciones actualizadas obtenidas del

Manual de Bergey’s (1994).

De los aislamientos bacteriológicos se seleccionaron cocos Gram (+) y bacilos Gram

(-), productores de biofilm. Para la identificación de los bacilos Gram (-) se realizaron las

propiedades bioquímicas: TSI, urea, citrato, fenialanina, SIM, Dnasa, cetrimide, agar P y F.

Para la identificación de los cocos Gram (+), catalasa negativa se realizó sensiblidad a

optoquina, prueba de las cadenas, PYR, LAP, NaCl 6,5%; para los cocos Gram positivo,

catalasa positiva se utilizó coagulasa, DNasa y manitol.

 Citocromo Oxidasa: Este test es fundamental para diferenciar dos grupos de bacterias

Gram negativas: las sospechosas de ser enterobacterias (fermentadoras de glucosa, oxidasa

negativa) y las no fermentadoras de glucosa, oxidasa positiva, como es el caso del Género

Pseudomonas. Esta prueba determina la presencia de la enzima Citocromo-c-oxidasa, que

cataliza el transporte de e- desde un donador de e- (NADH) a un aceptor usualmente O2. El

sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos; por lo

tanto, es importante para identificar a los organismos que carecen de la enzima o son

anaerobios obligados.

Técnica: con las colonias Gram (-) realizar suspensiones densas en 0,5 ml de solución

fisiológicas y colocar discos de Oxidasa 30 µg (Britania), que contienen Oxalato de Dimetil-p-

92
MATERIALES Y METODOS
fenilendiamina. Interpretación: Positivo: cuando la muestra toma color púrpura al cabo de diez

segundos.

Con las cepas oxidasa positivo realizar las pruebas bioquímicas para bacilos Gram (-) no

fermentadores de Glucosa (BNF) que son las siguientes:

a) Prueba de oxidación-fermentación (OF) (Hugh y Leifson): La mayoría de los

bacilos no fermentadores desarrollan lentamente y producen ácidos débiles formados por la

degradación oxidativa de la Glucosa. Para su detección se necesita un medio de oxido-

fermentación más sensible como el de Hugh y Leifson. Este medio difiere de los medios de

fermentación de hidratos de carbono y la concentración de proteínas (Peptona) se reduce del

1% al 0,2%; la concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5% al 1% y

también la concentración de agar está disminuida, con lo cual su consistencia es semisólida.

La menor cantidad de Peptona reduce la formación de productos oxidativos a partir de

Peptona, que tiende a elevar el pH del medio y puede neutralizar los ácidos débiles producidos

por los bacilos no fermentadores; la mayor concentración de hidratos de carbono sirve para

aumentar la producción bacteriana de ácido. Y la consistencia semisólida del agar permite que

los ácidos formados en la superficie difundan por todo el medio, facilitando la visualización

del viraje del indicador de pH (Azul de bromotimol).

Técnica: Se utilizaron dos tubos con medio O/F para cada cepa, previamente fundidos a baño

maría, y se adicionó Glucosa al 1%. Se dejó enfriar y se sembraron ambos tubos por punción.

A uno de los tubos, se lo cubrió con 1 cm de parafina fundida para poder observar el fenómeno

de fermentación. Se incubó a 37°C y a las 24 h se leyeron los resultados (Tabla 2).

92
MATERIALES Y METODOS
Interpretación: Amarillo -Verde Azulado---- Oxidativo

Amarillo – Amarillo---- Fermentativo

Verde Azulado - Verde Azulado---- Sin oxidación ni fermentación

b) TSI agar (Triple Sugar Iron): Es un medio diferencial que permite distinguir bacterias Gram

(-) entre sí basadas en el estudio de la fermentación de los hidratos de carbono: Glucosa,

Lactosa y Sacarosa, con formación de ácido que es detectada por el Rojo de Fenol (se produce

viraje del indicador de rojo a amarillo); la producción de Acido Sulfhídrico por reducción del

Sulfato de Sodio, que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el Sulfuro de

Hierro de color negro, y la producción de gas durante la fermentación. Se lo utiliza para

analizar una única especie bacteriana tomada de una sola colonia aislada en placas de agar.

Técnica: Se sembró por punción y estriado en la superficie. Se incubó en aerobiosis 24 h a

37°C.

Interpretación:

1- Superficie alcalina/profundidad ácida (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo

fermentó glucosa solamente.

2- Superficie ácida/profundidad ácida (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo

fermentó glucosa, lactosa y/o sacarosa.

3- Superficie alcalina/profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo no

fermenta azúcares.

4- La presencia de burbujas o la ruptura del medio de cultivo indicó que el microorganismo

produce gas.

5- Ennegrecimiento del fondo del tubo indicó producción de sulfuro de hierro.

92
MATERIALES Y METODOS
c) Hidrolisis de Bilis Esculina: Medio para identificar microorganismos capaces de

hidrolizar la Esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde

oliva hasta negro. Se sembró por estría y se incubó a 37°C durante 24-48 h.

Interpretación:

Positivo: oscurecimiento o ennegrecimiento del medio de cultivo.

Negativo: ausencia de oscurecimiento del medio de cultivo.

d) King A: Utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies de

Pseudomonas en base a la producción de Piocianina. Se sembró por estría y se incubó a 37°C

durante 24-48 h.

Interpretación:

Positivo: producción de piocianina, pigmento de color azul-verdoso que rodea

la colonia, o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusión

del pigmento.

e) King B: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación

de especies de Pseudomonas en base a la producción de fluoresceína. . Se sembró por estría y

se incubó a 37°C durante 24 h.

Interpretación:

Positivo: observación de fluoresceína, pigmento de color amarillo-verdoso

fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a

fenómenos de difusión.

92
MATERIALES Y METODOS
f) Cetrimide: se usa para la identificación selectiva de Pseudomonas aeruginosa (P.

aeruginosa) cuyo crecimiento no es inhibido por Cetrimide. Se sembró por estría y se incubó a

37°C 24 h.

Interpretación:

Positivo: presencia de crecimiento microbiano.

g) Medio FLN:

Permite determinar si hay fermentación de Lactosa, reducción de Nitrógeno desde NO 3- hasta

N2 y fluorescencia por el pigmento. Se sembró por estría y se incubó a 37°C 24 h.

Interpretación:

Fermentación de lactosa: superficie de color amarillo en el bisel.

Presencia de fluorescencia: color fucsia intenso.

Reducción desde NO3- hasta N2: resquebrajamiento del agar.

h) Medio M-N:

Permite detectar la reducción de NO3- a NO2- o bien a N2 y además si hay movilidad. Se sembró

por punción, se incubó durante 24 – 48h a 37°C.

Interpretación:

Movilidad positiva: crecimiento alejado de la línea.

Movilidad negativa: crecimiento sobre la línea.

Reducción de nitratos: color rojo al revelar con Reactivo de Griess.

i) Crecimiento a 42°C: Permite determinar si la cepa en estudio puede crecer en

condiciones elevadas de temperatura. Se sembró y se incubó a 42°C durante 24 h.

Interpretación:

Positivo: P. aeruginosa.

92
MATERIALES Y METODOS
Negativo: otros bacilos no fermentadores (BNF).

j) Crecimiento a 4°C: Permite verificar si el bacilo negativo puede crecer en condiciones

de temperatura muy bajas. Se sembró y se incubó a 4°C durante 24 h.

Interpretación:

Positivo: otros BNF.

Negativo: P. aeruginosa.

c.5.- Antibiogramas

Para determinar la sensibilidad de las cepas bacterianas aisladas de las muestras de esputo

frente a los diferentes antibióticos se realizó el método de difusión en agar con monodiscos

comerciales; el antibiótico difunde por el agar creando un gradiente de concentración

decreciente según se aleja del disco.

Procedimiento: Para cada cepa, se preparó una suspensión utilizando como patrón la escala

0,5 de Mc Farland. Se sembró por diseminación utilizando hisopos estériles embebidos en las

suspensiones en placas de Petri que contenían medio de cultivo Mueller-Hinton agar de una

altura de 4 mm. Se colocaron los discos de antibióticos (Britania) siguiendo los patrones para

cada tipo de microorganismo, teniendo en cuenta las normativas de la CLSI (Clinical and

Laboratory Standards Institute). Se incubaron a 37°C durante 24 h.

Los Discos utilizados para BNF fueron: Aztreonam (30 µg), Imipenem (10 µg),

Cefepime (30g), Ceftazidima (30 µg), Piperacilina (100 µg), Gentamicina (10 µg), Amikacina

(30 µg), Ciprofloxacina (5 µg), Ceftazidima+Ác. Clavulánico (30/10 µg), Meropenem (10

µg), Piperacilina+Tazobactama (100/10 µg),

A las 24 h de incubación se observaron halos transparentes indicando las zonas de

inhibición. Para determinar si la cepa era sensible o resistente a los antibióticos, se midieron

92
MATERIALES Y METODOS
los diámetros en milímetros de cada halo y usando una tabla de valores (20º Curso intensivo

de actualización en antimicrobianos “Dra. Alicia Rossi”–17º Curso latinoamericano de

actualización en antimicrobianos, 2006) se determinó la sensibilidad o la resistencia de la cepa

bacteriana en estudio frente a los distintos antibióticos utilizados.

c.6 Conservación de cepas aisladas

Se prepararon suspensiones densas de los microorganismos aislados por duplicado en 1

ml de BHI caldo adicionado con glicerol 40% para las Pseudomonas. Se conservaron a -20°C

en el cepario de la Cátedra de Inmunología, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia,

U.N.T.

d.- Obtención de los sobrenadantes de Lactobacillus plantarum ATCC 10241.

Se trabajó con una cepa de Lactobacillus plantarum ATCC 10241 (Lp) obtenida del

cepario de la Cátedra de Inmunología, Instituto de Microbiología, Facultad de Bioquímica,

Química y Farmacia, U.N.T. Se realizó cultivo overnight en medio MRS (Man Rogosa

Sharpe) caldo (Britania) a 37°C 12 h. Posteriormente el cultivo fue centrifugado 20 min a

8000 rpm y filtrado con filtros millipore de 0,22 m para obtener un sobrenadante libre de

células. El pH del sobrenadante fue de pH =5.22±0.43.

e.- Obtención de Polimorfonucleares por gradiente de Ficoll-Hipaque

Los Polimorfonucleares Neutrófilos (PMN) en su mayor parte necrosados, son los

componentes celulares más importantes en el esputo de paciente con FQ, por lo que fueron

utilizados como lechos para el desarrollo de biofilm y para los ensayos de Elastasa en

comparación con los ensayos de esputos.

92
MATERIALES Y METODOS
Se utilizaron PMN de sangre circulante purificados por gradiente en Ficoll-Hypaque y

Dextrano tipo 500 (Sigma, St. Louis MO, USA) al 6% en solución fisiológica. Los eritrocitos

contaminantes fueron eliminados mediante un shock hipotónico.

Técnica: En 2 tubos estériles colocar 2 ml de Ficoll-Hypaque (Sigma, St Louis, MO, USA)

(densidad: 1074-1077) más 5 ml de sangre venosa heparinizada, en forma suave con flujo

constante de modo que quede una interfase neta. Y centrifugar 30 minutos a 3000 rpm.

Figura 13: Imagen y esquema de obtención de PMN por la técnica de Ficoll-Hypaque

Descartar plasma, linfocitos y Ficoll-Hypaque y dejar PMN y GR. Agregar 2

volúmenes de solución fisiológica y resuspender suavemente. Luego agregar el Dextrano en

una proporción de 3 partes de sangre diluida: 1 parte de Dextrano. Homogeneizar con

inversión suave. Dejar sedimentar durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Y separar

92
MATERIALES Y METODOS
sobrenadante (PMN) y descartar el pellet. Depositar el sobrenadante en frascos de 50 ml y

completar a volumen. Centrifugar a 1500 r.p.m. durante 10 minutos.

Realizar la lisis hipotónica con el pellet de la siguiente manera: 4,5 ml de agua

destilada fría estéril; agitar con pipeta Pasteur durante 20 segundos y agregar 0,5 ml de

solución fisiológica 10X y homogeneizar. Luego centrifugar inmediatamente a bajas

revoluciones. Resuspender el pellet en medio de cultivo suplementado con 1% de Suero

Bovino Fetal. Realizar el recuento de PMN con Azul Tripán en cámara de Neubauer.

Determinar la viabilidad. Concentración de trabajo: 1x106 cél/ml.

f.- Obtención de PMN lisados (PMNlisados)

Los PMN obtenidos como se indica en el párrafo anterior fueron lisados por congelación

/descongelación y conservados a -20°C hasta su uso.

EFECTOS DEL SOBRENADANTE DE L. PLANTARUM SOBRE LA

PATOGENICIDAD DE P. AERUGINOSA

I.- Efecto sobre el biofilm de P. aeruginosa:

Se evaluará el efecto del sobrenadante de L plantarum sobre el biofilm de P

aeruginosa comparándolo con el uso de la DNasa recombinante humana. Para determinar los

porcentajes de inhibición del biofilm se utilizarán microplacas de 96 wells para realizar la

técnica del cristal violeta.

II.- Efecto sobre la Elastasa presente en el esputo

Se medirá la actividad de la Elastasa en el esputo y su inhibición en presencia de

sobrenadante de L plantarum, con el método de Elastina Rojo Congo.

92
MATERIALES Y METODOS
III.- Efecto del sobrenadante in vivo. Las modificaciones histológicas del pulmón

(congestión vascular, edema, infiltración celular) fueron estudiadas en ratones Balb/c

instilados con el esputo de los pacientes con FQ.

I.- Efecto sobre el biofilm de P. aeruginosa:

Los ensayos de producción de biofilm de P. aeruginsoa se realizaron mediante la

técnica de O´Toole y Kolter (1998). Para este ensayo se utilizaron cultivos overnight de P.

aeruginosa los cuales fueron diluidos 1:7 con medio LB (Luria Bertoni). En todos los casos se

trabajó por triplicado.

Las bacterias patógenas productoras de biofilm fueron obtenidas de muestras clínicas

de los pacientes con FQ, para contar con cepas recientemente aisladas. La evidencia

epidemiológica en nuestro medio revela una alta incidencia de infecciones crónicas e indica a

las cepas productoras de biofilm como responsables de dichos procesos.

Uno de los componentes del biofilm de P. aeruginosa es el ADN de secreción o el

ADN proveniente del hospedador, principalmente de los PMN. Con el objeto de imitar

parcialmente lo que ocurre in vivo, se dejó crecer el biofilm P. aeruginosa sobre distintos

lechos a saber: mocos de los pacientes y de PMN lisados. Figura 14

Formación de biofilm de 1 h de incubación

Técnica:

a) Dispensar en los pocillos 100 ul de de los distintos lechos que fueron:

1) Lechos de mocos de los pacientes (sin diluir y diluidos 1:4 con DDT).

2) Lechos de PMN lisados.

3) Sin lecho.

92
MATERIALES Y METODOS
b) Luego colocar en todos los pocillos 100 ul de una suspensión de P. aeruginosa, que

tenga una DO=0.7 leído a 540 nm en lector de ELISA e incubar 1 hora (fase planctónica). El

biofilm formado luego de esta incubación es independiente del crecimiento bacteriano ya

que el mismo es insignificante.

c) Luego agregar a cada pocillo 25 ul de Cristal Violeta al 0,1% en agua destilada e

incubar 20 minutos a temperatura ambiente (tapar para evitar la evaporación).

d) Lavar 2 veces con 200 ul de PBS, aspirando el contenido de cada pocillo. Se lavó 3

veces con PBS descartando cada vez el sobrenadante para eliminar las bacterias

planctónicas y exceso de colorante.

e) Eluir 2 veces con 200 ul de etanol 95% (v/v) y transferir a tubo de hemólisis con 1,6

ml de etanol.

f) Leer a DO 540 nm en espectrofotómetro.

g) Graficar DO =540 nm en función del tiempo. La DO a esta longitud de onda es

directamente proporcional al biofilm formado.

92
MATERIALES Y METODOS

Figura 14: Biofilm de P aeruginosa en medio LB, TSI no fermentativo y Esquema de placa de PVC

de 96 pocillos.

Formación de biofilm de 6 h de incubación

Técnica:

a) Dispensar en los pocillos 100 ul de de los distintos lechos que fueron:

1) Lechos de mocos de los pacientes (sin diluir y diluidos 1:4 con DDT).

2) Lechos de PMN lisados.

3) Sin lecho.

92
MATERIALES Y METODOS
b) Luego colocar en todos los pocillos 100 ul de una suspensión de P. aeruginosa, que

tenga una DO=0.7 leído a 540 nm en lector de ELISA diluida 1:7 en medio LB e incubar 6

horas (Formación del biofilm). El biofilm formado luego de esta incubación es dependiente

del crecimiento bacteriano.

c) Luego de la incubación agregar a cada pocillo 25 ul de Cristal Violeta al 0,1% en

agua destilada. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente (tapar para evitar la evaporación).

d) Lavar 2 veces con 200 ul de PBS, aspirando el contenido de cada pocillo. Se lavó 3

veces con PBS descartando cada vez el sobrenadante para eliminar bacterias planctónicas y

exceso de colorante.

e) Eluir 2 veces con 200 ul de etanol 95% (v/v) y transferir a tubo de hemólisis con 1,6

ml de etanol.

f) Leer a DO 540 nm en espectrofotómetro.

g) Graficar DO =540 nm en función del tiempo. La DO a esta longitud de onda es

directamente proporcional al biofilm formado.

DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD INHIBITORIA DE LOS

SOBRENADANTES DE CULTIVO DE L PLANTARUM Y DE LA DNASA SOBRE LA

PRODUCCIÓN DE BIOFILM DE P. AERUGINOSA

Para determinar la acción inhibitoria de la DNasa y del sobrenadante de cultivos de L.

plantarum sobre el biofilm de P. aeruginosa, los ensayos de producción de biofilm fueron

realizados con el agregado de LB y de DNasa recombinante humana (Pulmozyme Dornasa

92
MATERIALES Y METODOS
Alfa de Roche 100 mg%) o con el agregado de sobrenadantes de cultivos de L plantarum.

Estos ensayos se realizaron en 2 (dos) placas de 96 well en paralelo.

Técnica:

a) Dispensar en los pocillos 100 ul de de los distintos lechos que fueron:

1) Lechos de mocos de los pacientes (sin diluir y diluidos 1:4 con DDT).

2) Lechos de PMN lisados.

3) Sin lecho.

b) En todos los pocillos agregar 100 ul de una suspensión de P. aeruginosa, que tenga

una DO=0.7 leído a 540 nm en lector de ELISA junto con el agregado de 50 ul de LB y de 50

ul de DNasa recombinante humana (Pulmozyme Dornasa Alfa de Roche 100 mg%) o con el

agregado de 100 ul de sobrenadante de cultivos de L plantarum e incubar 1 hora.

c) Agregar a cada pocillo 25 ul de Cristal Violeta al 0,1% en agua destilada e incubar

20 minutos a temperatura ambiente (tapar para evitar la evaporación).

d) Lavar 2 veces con 200 ul de PBS, aspirando el contenido de cada pocillo. Se lavó 3

veces con PBS descartando cada vez el sobrenadante para eliminar las bacterias

planctónicas/biofilm y el exceso de colorante.

e) Eluir 2 veces con 200 ul de etanol 95% (v/v) y transferir a tubo de hemólisis con 1,6

ml de etanol.

f) Leer a DO 540 nm en espectrofotómetro.

g) Graficar DO =540 nm en función del tiempo. La DO a esta longitud de onda es

directamente proporcional al biofilm formado.

Con los resultados se determinó el porcentaje de inhibición del biofilm

92
MATERIALES Y METODOS

Figura 15: Espectrofotómetro y placas de PVC de 96 wells

II.- Efecto sobre la Elastasa

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ELASTASA EN LAS MUESTRA DE ESPUTO

Las muestras de esputos de cada paciente fueron utilizadas para medir el contenido de

Elastasa. La actividad elastolítica de las muestras de esputos de los diferentes pacientes

tratados y no tratados con DNasa así como los esputos tratados in vitro con DNasa, fue

detectada con Elastina-Rojo Congo (Sigma, St Louis, MO, USA) como sustrato. Es un test

colorimétrico que se basa en medir la liberación del Rojo Congo cuando la Elastasa de las

muestras de esputo utiliza la elastina como sustrato (Gambello y Iglewski, 1991). Si hay

92
MATERIALES Y METODOS
elastasa en el esputo, la misma ataca a la elastina y libera el rojo congo al medio, lo cual

aumentará la absorbancia a 495 nm.

Técnica:

a) Agregar 500 ul de las muestras de esputo a tubos eppendorf que contenían 20 mg de Elastina-

Rojo Congo en 1 ml de buffer ECR (Na2HPO4, 10 mM, pH 7.0)

b) Incubar con agitación constante 18 horas a 37 ºC.

c) Remover el pellet (rojo congo-elastina) por centrifugación.

d) Leer la absorbancia del sobrenadante coloreado en un espectrofotómetro a DO de 495 nm. Se

utilizó como 100% de actividad de Elastasa un ensayo con 100 ul de PBS.

DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD INHIBITORIA DE LOS

SOBRENADANTES DE CULTIVO DE L PLANTARUM SOBRE LA ELASTASA QUE

CONTIENEN LAS MUESTRAS DE ESPUTO

El ensayo de inhibición de la Elastasa ejercida por el sobrenadante de cultivo de L

plantarum se realizó agregando sobrenadante de cultivo de L. plantarum.

Técnica:

e) Colocar 500 ul de las muestras de esputo a tubos eppendorf que contenían 20 mg de Elastina-

Rojo Congo en 1 ml de buffer ECR (Na2HPO4, 10 mM, pH 7.0) con el agregado de 100 ul de

sobrenadante de cultivo de L. plantarum.

f) Incubar con agitación constante 18 horas a 37 ºC.

g) Remover el pellet por centrifugación.

h) Leer la absorbancia del sobrenadante coloreado en un espectrofotómetro a DO de 495 nm. Se

utilizó como 100% de actividad de Elastasa un ensayo con 100 ul de PBS.

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MATERIALES Y METODOS

Figura 16: Ensayo de inhibición de la Elastasa

III.- Efecto del sobrenadante de cultivos de Lactobacillus plantarum in vivo.

Modelo de injuria pulmonar en ratones Balb/c

Se utilizaron ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad, obtenidos de una colonia

cerrada (endocriados) pertenecientes al bioterio del Instituto de Microbiología “Dr. Luis C.

Verna” de la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la UNT. Todos los animales

recibieron alimento standard y agua at libitum. Cada experimento consistió de 3 ratones por

ensayo.

Anestesia: Se utilizó Pentotal Sódico en una dosis de 70 mg/kg por vía intraperitoneal.

Material descartables y de cirugía: En la Figura 17 se exponen el material de cirugía

y descartables utilizados en la extracción del lavado broncoalveolar. Detalle de la preparación

de la cánula para realizar la traqueotomía: la cánula para la traqueotomía se diseñó con una

pipeta Pasteur de 1 ml recortada en ambos extremos y adosada a una jeringa de tuberculina

para facilitar el ingreso y la extracción del líquido de lavado bronqueoalveolar. Se utilizaron

elementos de cirugía, previamente lavados y esterilizados y también material descartable.

92
MATERIALES Y METODOS

Figura 17: Material de cirugía y elementos descartables utilizados en la extracción del lavado broncoalveolar.

Instilación del esputo: para la instilación de las muestras de esputo los animales de

experimentación deben sostenerse de cúbito dorsal como se observa en la figura 18. La

administración de las muestras de esputo fluidificados con DDT se llevó a cabo bajo anestesia

intraperitoneal (Figura 19) suave para suprimir el efecto de la deglución y facilitar que la

muestra instilada pase directamente a la tráquea y no al esófago. La instilación se realizó de

acuerdo a Hsieh y col. (2005).

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MATERIALES Y METODOS

Figura 18: Ratón Balb/c usado en los ensayos in vivo.

Manera correcta de sostenerlo para instilar el esputo.

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MATERIALES Y METODOS
Con una jeringa de tuberculina usando una aguja truncada para evitar dañar al animal

figura 19 los ratones fueron instilados con 100 ul del esputo repartiendo 50 ul en cada una de

las narinas. Los ratones fueron sacrificados a la hora siguiente de la instilación del esputo, con

una dosis letal de Pentobarbital intraperitoneal.

Figura 19: Instilación del esputo en los ratones Balb/c

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MATERIALES Y METODOS
Daño tisular en los pulmones

El daño tisular en los pulmones se determinó mediante:

a) Análisis del lavado bronquial (LBA), obtenido según técnica de (Vaughn JM et al. 2007).

 Celularidad observada en un frotis coloreado con May Grünwall-Giemsa

 Cantidad de glóbulos rojos mediante la técnica de hemólisis

 Recuento de glóbulos blancos en cámara de Neubauer y determinación de la viabilidad con

Azul Tripán

 Determinación de Elastasa por el método de la Elastina Rojo Congo

b) Estudios histológicos de los pulmones

a) ANÁLISIS DEL LAVADO BRONQUIAL

Obtención del lavado broncoalveolar: con el ratón anestesiado, se procede a retirar la capa

de piel de la zona ventral utilizando elementos de cirugía, luego se quita la capa muscular,

teniendo especial cuidado en la zona torácica (figura 20). En la zona de la tráquea hay

depósitos de grasa que deben ser quitados cuidadosamente para que la tráquea quede a la

vista.

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MATERIALES Y METODOS

Figura 20: Procedimiento para descubrir la tráquea.

Para sujetar la tráquea se pasó una aguja curva N° 2 con el hilo por debajo de la

misma (figura 21). Se realizó un nudo suave con un hilo de sutura para poder sujetar, en el

paso siguiente, la cánula que contiene el líquido de lavado.

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MATERIALES Y METODOS
Figura 21: Paso de la aguja curva N° 2 con el hilo de sutura.

Con una tijera se realizó un corte parcial de la tráquea para generar un hojal para el

ingreso de la cánula (figura 22). La cánula fue sujetada a la tráquea ajustando el nudo

realizado previamente con el hilo de sutura.

Figura 22: Corte parcial de la tráquea para generar un hojal para el ingreso de la cánula.

La tráquea fue canalizada usando una pipeta Pasteur de 1ml y los pulmones fueron

lavados con 1,5 ml de PBS estéril muy lentamente (observar cómo se hinchan los pulmones) y

luego se aspira también muy lentamente el líquido introducido (para no dañar los pulmones)

(Figura 23 y 24).

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MATERIALES Y METODOS

Figura 23: Ingreso del líquido de lavado a la cavidad pulmonar.

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MATERIALES Y METODOS

Figura 24: Foto superior: sin la solución de lavado.

Foto inferior: con la solución de lavado.

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MATERIALES Y METODOS
Se midió el volumen del líquido bronco-alveolar recuperado de cada lavado,

descartando volúmenes inferiores a 2 ml, y se lo centrifugó a 1500 rpm durante 15 minutos

obteniéndose un pellet y un sobrenadante.

En el pellet se determinó:

I) Poblaciones celulares en un frotis con el líquido del lavado broncoalveolar coloreado

con May Grünwall-Giemsa mediante microscopía óptica.

II) Cantidad de glóbulos rojos con la técnica de hemólisis (lisis con agua destilada a 4

°C 15 min y posterior lectura en espectrofotómetro a longitud de onda de 414 nm).

III) Recuento en cámara de Neubauer de los glóbulos blancos y determinación de la viabilidad con

Azul Tripán.

Con el sobrenadante se determinó el contenido de Elastasa en el lavado

broncoalveolar con la técnica de Elastina-Rojo Congo (según técnica descripta anteriormente).

b) ESTUDIOS HISTOLÓGICOS

El estudio histológico fue de fundamental importancia para poder observar las

modificaciones histológicas que se producen por la infección con P. aeruginosa.

1) Toma de muestra:

Los pulmones de los animales de experimentación se obtuvieron cortando la tráquea

justo por debajo de la laringe (Figura 25.)

92
MATERIALES Y METODOS

Figura 25: Obtención de los pulmones

2) Proceso de fijación: este proceso estabiliza y preserva la estructura física y química

de las muestras ya que se detienen todos los procesos líticos; ésto se logra sometiendo el

material a la acción de los fijadores, que producen la muerte instantánea de las células de la

muestra. Los pulmones fueron fijados con Formol al 10% en agua destilada.

3) Procedimiento de inclusión en parafina:

a) Deshidratación: Al finalizar la fijación, las muestras están impregnadas en agua, o sea

están hidratadas. La parafina es insoluble en agua; por lo tanto es necesario deshidratar las

muestras por medio de reactivos líquidos anhidros, pero ávidos en agua (Alcohol Etílico).

La deshidratación se la realizó en forma gradual para evitar las distorsiones ocasionadas

por los cambios bruscos usando una batería de Alcohol Etílico ascendente, constituida por 6

baños: 50º, 70°, 80°, 96°, 100º I y 100° II. Las muestras se pasaron por cada uno de los baños

durante 2 min.

92
MATERIALES Y METODOS
b) Diafanización: Como la parafina no es soluble en alcohol, es necesario pasar la

muestra por un reactivo intermedio que permite extraer el alcohol de la muestra para que

penetre la parafina a los tejidos. Estos reactivos se llaman aclarantes ya que cuando se coloca

la muestra, ésta se pone traslúcida. Este proceso se llama Diafanización y se lo realizó pasando

la muestra por 2 baños de Xilol con una duración de 10 min en cada baño.

c) Inclusión propiamente dicha:

I) Imbibición o impregnación en parafina: La parafina es sólida a temperatura ambiente.

Por lo tanto, se fundió la parafina en estufa a 56-58ºC y se realizó 3 baños en la misma. De

esta manera se garantizó que la parafina impregne completamente la muestra.

II) Formación del bloque: La parafina fundida se colocó en moldes de papel. Se tomó la

muestra con pinzas y se la colocó en los moldes de modo que el plano de corte quede hacia

abajo. Se la dejó solidificar.

4) Cortes con micrótomo: Se realizaron los cortes con micrótomo (Figura 26) (espesor

menor de 4 micras) obteniendo láminas delgadas para ser observadas al microscopio óptico

con el objeto de identificar los detalles histológicos. El material cortado se colocó en

portaobjetos previamente desengrasados para su posterior coloración.

92
MATERIALES Y METODOS

Figura 26: Micrótomo

5) Coloración con Hematoxilina-Eosina: para poder colorear es necesario realizar la:

I) Desparafinación: se realizó mediante el pasaje de los portaobjetos con el corte en 2 baños

de Xilol de 10 min cada uno. De esta manera la parafina es eliminada completamente.

II) Hidratación: la hidratación de los cortes es necesaria para poder colorear las muestras. Se

usó una batería descendente de alcoholes: 2 baños de Alcohol Absoluto (100º I y 100º II), 96º,

80º, 70º, 50º y finalmente agua destilada. La duración en cada uno varía de 1 a 2 min.

III) Coloración propiamente dicha: La coloración es un proceso por el cual un cuerpo se

colorea frente a la acción de un colorante, de modo que cuando se lave en la solución en que

ha sido preparado el colorante, no se decolore. La coloración con Hematoxilina-Eosina es una

coloración combinada donde se usan colorantes ácidos y básicos, coloreando el citoplasma y

el núcleo. Los núcleos se colorean de violeta a azul, mientras que el citoplasma se colorea de

rosa.

92
MATERIALES Y METODOS
Técnica: Los cortes se colorearon con Hematoxilina de Mayer durante 10 min; se

diferenciaron con agua corriente durante 10 min y ligeramente en agua destilada. Luego, se

colorearon con Eosina durante 5 min, se lavaron con agua destilada y posteriormente con

alcohol 80º, 96º, 100º I y 100º II (2 min en cada uno), y finalmente Xilol I y Xilol II (2 min

en cada uno). Se Montó en Bálsamo de Canadá y se observó en microscopio óptico.

Los cortes histológicos coloreados se observaron con microscopio óptico 40x y 100x

observando los siguientes parámetros: presencia de infiltrado celular, la extensión relativa de

la inflamación (alveolar e intersticial), congestión vascular, edema, alteración del epitelio

bronquial, focos de hemorragia. Se observó un mínimo de 10 a 20 campos para obtener un

análisis representativo de la alteración en el tejido.

Score: +:1-10/campo 40x

++:10-20/campo 40x

+++: más de 20/campo 40x

92
RESULTADOS Y DISCUSION
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 ESPUTO - Celularidad y bacterias identificadas

Las muestras de esputo procedían de pacientes que fueron previamente nebulizados con

DNasa y de pacientes que no fueron nebulizados con DNasa. ( Tabla 1)

En el estudio de la celularidad de los frotis de esputo de los distintos pacientes

coloreados con May Grünwal-Giemsa se observaron gran cantidad de PMN. También se

observó que las muestras tenían gran cantidad de moco lo que dificultaba su manejo por lo que

fue necesario usar el DDT para poder pipetear. Y muchas células epiteliales.

Las bacterias aisladas por técnicas de cultivo de rutina fueron: P. aeruginosa cepa

mucoide multiresistente, St. aureus pigmentado, St. pyógenes beta hemolítico del grupo F.

Esputo
Tratamiento
de Coloración con Giemsa Estudio bacteriológico
con DNasa
pacientes

M1a
Células +++ / PMN + / P. aeruginosa
M1b
macrófagos + / moco +++ St aureus
M1e

M2b DNasa

M2c Células +++ / PMN +++ /


P. aeruginosa
M2d macrófagos +++ / moco +++

M2f DNasa

M3a St aureus
Células + / PMN +++ /
St. pyógenes beta hemolítico
M3b macrófagos + / moco +
del grupo F

92
RESULTADOS Y DISCUSION
Células + / PMN +++ / P. aeruginosa mucoide
M4a
macrófagos + / moco + multiresistente

M5c DNasa Células +++ / PMN +++ / St. pyógenes beta hemolítico

M5e macrófagos +++ / moco + del grupo F

M6a
Células ++ / PMN +++ /
M6b DNasa P. aeruginosa cepa mucoide
macrófagos + / moco +++
M6c DNasa

M9a Células +++ / PMN +++ / St. aureus pigmentado

M9f macrófagos +++ / moco +++ (dorado) (muy virulento)


Tabla 1: Celularidad y bacterias detectadas

Score: + (1-2/campo 40x); ++ (2-8/campo 40x); +++ (8-15/campo 40x)

92
RESULTADOS Y DISCUSION
Producción del biofilm de Pseudomonas aeruginosa y su inhibición con sobrenadantes

cultivos de Lactobacillus plantarum y con DNasa

Se graficaron los porcentajes de inhibición por acción de la DNasa y del sobrenadante

de cultivos de Lactobacillus plantarum sobre el biofilm de P aeruginosa dependiente (6h) e

independiente (1h) del crecimiento de la bacteria.

Se tomó como 100% el biofilm de P. aeruginosa en ausencia de DNasa y del

sobrenadante de cultivos de Lactobacillus plantarum.

Grafico 1: Inhibición con 1 hora de incubación

92
RESULTADOS Y DISCUSION

Grafico 2: Inhibición con 6 horas de incubación

En ambos ensayos (de 1 h y de 6 h de incubación) hay un marcado efecto de la

inhibición con el sobrenadante de cultivos de Lactobacillus plantarum y con la DNasa sobre el

biofilm formado en lechos de PMN y de los esputos de los diferentes pacientes.

Para el lecho de PMN el sobrenadante de cultivos de Lactobacillus plantarum muestra

mayor inhibición que la DNasa sobre el biofilm dependiente del crecimiento (p<0,005) e

independiente del crecimiento para PMN (p<0,0001).

En los lechos con esputo no hay diferencias entre ambos inhibidores en el ensayo

dependiente del crecimiento mientras que en el biofim independiente del crecimiento la

inhibición es significativamente mayor con el sobrenadante de cultivos de Lactobacillus

plantarum en todos los casos.

* Significativamente mayor p<0,0001 ** Significativamente mayor p<0,005

92
RESULTADOS Y DISCUSION

II.- EFECTO SOBRE LA ELASTASA

Se evaluó la actividad de Elastasa en el esputo y su inhibición con SLp y con DNasa en

pacientes tratados previamente con DNasa y no tratados con DNasa.

En pacientes no nebulizados previamente con DNasa los resultados fueron los

siguientes:

Grafico 3: Efectos sobre la elastasa en pacientes sin nebulizar

Considerando que el tratamiento in vitro con DNasa del esputo de los pacientes no

nebulizados con DNasa produce la máxima liberación de elastasa, se observa que los

tratamientos con SLp y con DNasa+SLp ejercen un importante porcentaje de inhibición en la

liberación de elastasa (p<0,001).

92
RESULTADOS Y DISCUSION
Cuando se compara el efecto que produce la mezcla de DNasa+SLp y SLp solo, se

observa que la mezcla DNasa+SLp ejerce un porcentaje mayor de inhibición con respecto al

tratamiento con SLp (DNasa+SLp vs SLp p<0,01).

En pacientes nebulizados previamente con DNasa los resultados fueron los

siguientes:

Grafico 4: Efectos sobre la elastasa en pacientes nebulizados previamente

El esputo de pacientes nebulizados previamente con DNasa tiene un importante

contenido de elastasa que se incrementa cuando éste es tratado in vitro con DNasa. El

tratamiento del esputo con SLp produce una importante inhibición de la elastasa semejante a la

inhibición producida por la mezcla de DNasa+SLp (*p<0,01).

Los esputos de los pacientes que han sido previamente nebulizados con DNasa tienen un

importante contenido de elastasa que proviene de la necrosis de los PMN y de las bacterias.

La combinación de SLp con DNasa no afecta la capacidad inhibitoria del SLp sobre la

elastasa (PBS vs DNasa+SLp **p<0,001).

92
RESULTADOS Y DISCUSION
III.- EFECTO DEL SOBRENADANTE DE CULTIVOS DE LACTOBACILLUS

PLANTARUM “IN VIVO” para estudiar el daño tisular en los pulmones de los ratones

instilados con el esputo.

En el pellet del lavado broncoalveolar se determinaron las poblaciones celulares en un

frotis coloreado con May Grünwall-Giemsa mediante microscopía óptica. Se observaron gran

cantidad de PMN; también macrófagos alveolares y células ciliadas (figura 27 y 28)

Figura 27: Frotis de LBA coloreado con Grünwall-Giemsa

92
RESULTADOS Y DISCUSION

92
RESULTADOS Y DISCUSION

Figura 28: Frotis de LBA coloreado con Grünwall-Giemsa

92
RESULTADOS Y DISCUSION
Cantidad de glóbulos rojos mediante la técnica de hemólisis

Grafico 5: recuento de GR del LBA de muestras de pacientes con y sin tratamiento con DNasa previo

92
RESULTADOS Y DISCUSION
En muestras de pacientes nebulizados previamente con DNasa se observa mayores

cantidades de GR, como así también en las muestras tratadas con DNasa, donde se observo la

mayor cantidad de GR, y tal valor se atenuaba mediante la utilización de la mezcla de

DNasa+SLp.

Grafico 6: determinación de Hemoglobina

En la determinación de Hemoglobina mediante lectura a 414 nm, se puede observar

que en muestras de pacientes con nebulización previa con DNasa los valores de hemoglobina

92
RESULTADOS Y DISCUSION
son mayores que en los que no se nebulizaron, y la cantidad de hemoglobina en todos los

casos fue significativamente mayor al control con PBS.

92
RESULTADOS Y DISCUSION
RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS EN CÁMARA DE NEUBAUER Y

DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD CON AZUL TRIPÁN

Grafico 7: viabilidad de GB mediante recuento en cámara de Neubauer

La menor cantidad de glóbulos blancos se encontró en la muestra tratada con la mezcla

de DNasa+SLp, obteniéndose mayores valores en las muestras con PBS, DNasa y SLp por

separado, y sin diferencias significativas entre ellas y el control con PBS.

92
RESULTADOS Y DISCUSION
Determinación de Elastasa por el método de la Elastina Rojo Congo

El método no tiene sensibilidad para determinar la Elastasa del LBA por la baja concentración.

92
RESULTADOS Y DISCUSION
2.- ESTUDIOS HISTOLÓGICOS DE LOS PULMONES.

Figura 29: Grupo control (instilados con PBS)

Parénquima pulmonar sin cambios histopatológicos.

Figura 30: Grupo de ratones instilados sólo con esputo de pacientes con Fibrosis Quística.

Parénquima pulmonar que muestra abundante infiltrado inflamatorio a predominio de PMN

peribronquial. Marcadas zonas de congestión y hemorragia.

92
RESULTADOS Y DISCUSION

Figura 31: Grupo de ratones instilados con esputo de pacientes con Fibrosis Quística y tratados

posteriormente sólo con DNasa.

Parénquima pulmonar que exhibe escaso infiltrado inflamatorio con predominio de

PMN, sectores con marcada congestión y edema perivascular e intraparenquimatoso. Aisladas

zonas de hemorragia.

92
RESULTADOS Y DISCUSION

Figura 32: Grupo de ratones instilados con esputo de pacientes con Fibrosis Quística y tratados

posteriormente con una mezcla en partes iguales de DNasa +SLP

Parénquima pulmonar que exhibe áreas de congestión vascular. Edema perivascular.

Se consideró que existe protección cuando la mayoría de los cortes muestren ausencia

de patologías pulmonares.

92
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES

De acuerdo a los ensayos realizados y expuestos en esta tesina así como los resultados

obtenidos, se puede concluir que el sobrenadante del cultivo de Lactobacillus plantarum:

 Tiene, al igual que la DNAsa (Dornasa pancreática-enzima recombinante humana) capacidad

inhibitoria de biofilm de Pseudomonas aeruginosa crecida en los esputos de pacientes con FQ.

 Su actividad es similar que la encontrada para la DNasa, la cual actúa específicamente sobre el

DNA de las células necrosadas en el esputo y por eso lo fluidifica.

 Con lo cual podría complementar la actividad de la DNasa en la terapia de FQ.

 No sólo inhibe al biofilm de P aeruginosa sino también al biofilm de las superficies bióticas

como son los lisados de PMN y sobre los esputos de los pacientes con FQ.

 La Elastasa es liberada del esputo por la fluidificación con DNasa e inhibida por el

sobrenadante de Lactobacillus plantarum in vitro. In vivo esta técnica no es sensible. La

fluidificación del moco por la nebulización con DNasa libera gran cantidad de elastasa

proveniente de los PMN necrosados. En particular, la elastasa liberada después de la

nebulización con DNasa es inhibida por el sobrenadante del cultivo de Lactobacillus

plantarum. La inhibición de la elastasa por el sobrenadantes de Lactobacillus plantarum

inhibiría su actividad lítica sobre los tejidos así como su actividad inductora de secreción de

moco por las células y las glándulas.

 No solo inhibe la elastasa bacteriana, sino también la elastasa liberada por los PMN. Esta

actividad es muy manifiesta en los esputos de los pacientes previamente tratados con DNasa.

92
CONCLUSIONES
 En ensayos “in vivo” se estableció, en ratones instilados con el esputo de los pacientes con FQ,

que un cultivo de Lactobacillus plantarum en MRS puede inhibir dicha infección modificando

la actividad de los fagocitos PMN.

Teniendo en cuenta que la inhibición de la formación de biofilm y la inhibición de la

elastasa es difícil de lograr por interferentes naturales o de síntesis y que el sobrenadante del

cultivo de Lactobacillus plantarum tiene esta propiedad, es que destacamos la posibilidad de

considerar su uso clínico.

Es posible llegar a formular una combinación de DNasa y sobrenadante del cultivo de

Lactobacillus plantarum para fluidificar DNA e inhibir elastasa.

La actividad inhibitoria actúa sobre cualquier esputo.

La infección no se elimina por que las bacterias persisten gracias a la formación del

biofilm aún bajo tratamiento antibiótico.

La utilización de un complemento tal como el sobrenadante del cultivo de

Lactobacillus plantarum podría controlar elastasa y biofilm. Los tiempos de aplicación, las

sustancias usadas en terapias complementarias y el estado del paciente durante la aplicación, y

las características físicas del esputo, deberán ser controlados por kinesiólogos con un profundo

conocimiento de la fisiopatogenia de la FQ y de las nuevas variantes terapéuticas para

optimizar el tratamiento de esta enfermedad que vayan surgiendo de investigaciones

multidisciplinarias.

92
PROYECCIONES
PROYECCIONES

En base a los resultados obtenidos en este trabajo se proyectarán estudios que

complementarán estas investigaciones:

 Se evaluarán los efectos del sobrenadante de Lactobacillus plantarum sobre Pseudomonas

aeruginosa aislada de esputos de pacientes con Fibrosis Quística de manera tal de estudiar la

factibilidad de aplicación del mismo en forma de nebulizaciones en infecciones pulmonares.

 Se estudiará la interferencia bacteriana

 Se estudiarán las funciones de la respuesta inmune innata cuya desregulación es una de las

causas de las infecciones pulmonares crónicas.

 Se determinará el efecto deletéreo de la inducción de apoptosis y necrosis que ejercen los

componentes del esputo y las bacterias aisladas del mismo sobre Polimorfonucleares de sangre

circulante de voluntarios.

 Se determinará el contenido de IL-8 en el lavado broncoalveolar de ratones. La IL-8 es una

citoquina pro-inflamatoria, que está involucrada en una amplia variedad de procesos

fisiológicos y que provoca la migración de Polimorfonucleares y otras células al sitio de la

inflamación, consecuente con una importante injuria tisular.

Estos resultados y las proyecciones planteadas en esta tesina exigen el desarrollo de

líneas de investigación que permitan considerar la posibilidad futura de formular un producto

biotecnológico económico, de fácil obtención y manipulación, de aceptable estabilidad para

ser aplicable de manera nebulizable, en conjunto con la DNasa recombinante humana,

comparando su efectividad con el de terapias de uso corriente.

92
BIBLIOGRAFIA
BIBLIOGRAFIA

Andersen DH. Cystic fibrosis of the páncreas and its relation to celiac disease: clínica and
pathological study. Am J Dis Child 1938; 56:344-399.

Anne H Thomson MD FRCP; Human recombinant DNase in cystic fibrosis, J R Soc Med
1995;88 (Suppl. 25):24-29

Armas H, González C. Gonzalez G. Screening neonatal de fibrosis quística mediante tripsina


inmunorreactiva sérica. Medicina Fetal y Neonatología 1994; 4: 261-6

Bals R, Weiner DJ, Moscione AD, Meegalla RL, Wilson JM. Augmentation of Innate Host
Defense by Expression of a Cathelicidin Antimicrobial Peptide. 1999. Infect. Immun
67(11):6084–6089

Bernardeau M, Guguen M, Vernoux JP. (2006). Beneficial lactobacilli in food and feed: long-
term use, biodiversity and proposals for specific and realistic safety assessments. FEMS
Microbiol Rev 30:487–513

Bethesda, MD; Cystic Fibrosis Foundation. 2008. Patient registry 2008. Annual data report to
the center directors.

Boucher R C. Human airway ion transport. Part two. 1994 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150:
581-593

Canadian Patient Data Registry Nacional Report 1995. Canadian Cystic Fibrosis Foundation

Cantin AM. “DNase I acutely increases cystic fibrosis sputum elastase activity and its
potential to induce lung hemorrhage in mice”. Am J Respir Crit Care Med 1998;157: 464–469.

92
BIBLIOGRAFIA
Cantin, A. 1995. Cystic fibrosis lung inflammation: early, sustained and severe. Am. J. Respir.
Crit. Care Med. 151:939–941.

Casals T. Epidemiología y patogénesis. En: Sociedad Científica de lucha contra la fibrosis


quística, ed. Manual de Fibrosis Quística. 2003 p. 13-9

Conesea M, CopreniaE, Di GioiaaS, De Rinaldisb P, Fumarulob R. (2003). Neutrophil


recruitment and airway epithelial cell involvement in chronic cystic fibrosis lung disease.
Journal of Cystic Fibrosis 2: 129–135

Costerton W, Veeh R, Shirtliff M, Pasmore M, Post C and Ehrlich G. 2003. The application of
biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. The Journal of Clinical
Investigation 112 (10):1466-1477.

Delgado MA, Poschet JF, and Deretic V 2006. Nonclassical Pathway of Pseudomonas
aeruginosa DNA-Induced Interleukin-8 Secretion in Cystic Fibrosis Airway pithelial Cells.
Infection and Immunity 74(5):2975–2984.

Dodge JA. Cystic fibrosis in the United Kingdom 1977-85: an improving picture. BMJ 1988;
297: 1599-602

Farber S; Pancreatic function and disease in early life. Pathologic changes associated with
pancreatic insufficiency in early life.Arch Pathol. 1944; 37:238-250.

Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization.
2001, posting date. Regulatory and clinical aspects of dairy probiotics. Food and Agriculture
Organization of the United Nations and World Health Organization Expert Consultation
Report. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health
Organization Working Group Report

92
BIBLIOGRAFIA
GaggarA, Y Li, Weathington N, Winkler M, Kong M, Jackson P, Blalock JE, Clancy JP. 2007.
Matrix metalloprotease-9 dysregulation in lower airway secretions of cystic fibrosis patients.
Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 293: L96–L104

Gibson LE, Cooke RE. A test for concentration of electrolyte in sweat in cystic ficrosis fo the
pancreas utilizing pilocarpine by iontophoforesis. Pediatrics. 1959; 23:545-549.

Gibson R. L., Burns J.L., and Ramsey B.W. Pathophysiology and management of Pulmonary
Infections in Cystic Fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 2003. 168: 918–951.

Hessle C, Andersson B, Wold A. 2000. Gram-positive bacteria are potent inducers of


monocytic IL-12 while gram-negative bacteria preferentially stimulate IL-10 production.
Infect Immun 68: 3581–3586

Hessle C, Hanson LA, Wold AE. 1999. Lactobacilli from human gastrointestinal mucosa are
strong stimulators of IL-12 production. Clin Exp Immunol 116:276–282

Høiby N, Johansen HK, Moser C, Song Z, Ciofu O, Kharazmi A. 2001. Pseudomonas


aeruginosa and the in vitro and in vivo biofilm mode of growth. Microb Infect 3:23–35

Høiby N et al. 2011. The clinical impact of bacterial biofilms. REVIEW. Int J Oral Sci 3: 55-
65).

Houtmeyers E, Gosselink R, Gayan-Ramirez G, Decramer M. Regulation of mucociliary


clearance in health and disease. 1999. Eur Respir 13: 1177-1188

Hsieh JC, Tham DM, FengW, Huang F, Embaie S, Liu K, Dean D, Hertle R, FitzGerald DJ,
and Mrsny RJ. (2005) “Intranasal Immunization Strategy To Impede Pilin-Mediated Bindingof
Pseudomonas aeruginosa to Airway Epithelial Cells”. Infection and Immunity 73(11):7705–
7717.

92
BIBLIOGRAFIA
Huaman Martinez MA, González ML and Bosch A. In: "Biofilms: Formation, Development
and Properties". William C. Bailey (Editor). Nova Science Publishers, Inc. Hauppauge, New
York, EEUU, ISBN: 978-1-61728-293-5

Kerem B, Rommers J, Buchamam J, et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic
analysis. Science 1989; 245:1973-1080.
Kollberg H. Incidence and survival curves of cystic fibrosis in Sweden. Acta Paediatr 1982;71:
197-202

Korkmaz B, MoreauT, Gauthier F. 2008. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G:


Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie 90: 227-
242.

Kunzelmann K., Schreiber R. (2012). Airway epithelial cells—Hyperabsorption in CF?. The


International Journal of Biochemistry & Cell Biology 44; 1232– 1235.

Lubamba B., Dhooghe B., Noel S., Leal T. (2012). Cystic fibrosis Insight into CFTR
pathophysiology and pharmacotherapy.Clinical Biochemistry 45 1132–1144

McKone E.F., Aitken M.L. (2004). Cystic fibrosis: disease mechanisms and therapeutic target.
Drug Discovery Today: Disease Mechanisms | Respiratory diseases 1(1); 137-143

Ostedgaard L.S., Baldursson O., and Welsh M.J. Regulation of the Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator Cl- Channel by Its R Domain. THE JOURNAL OF
BIOLOGICAL CHEMISTRY. 2001; 276, (11): 7689–7692

Peral MC, Huaman Martinez MA, Valdez JC 2009. Bacteriotherapy with Lactobacillus
plantarum in Burns. International Wound Journal 6 (1):73-81

Puchelle E; Bajolet O; Abely M. Airway mucus in cystic fibrosis. 2002. Paediatric Respiratory
Review 3:115-119

92
BIBLIOGRAFIA

Ramos A, Peral de la Torre M and Valdez J. Differences between Pseudomonas aeruginosa in a


clinical sample and in a colony isolated from it: comparison of virulence capacity and
susceptibility of biofilm to inhibitors. Comp. Immun. Microbiol. Infect. 2010; 33: 267–275

Ramos AN, Gobbato N, Rachid M, González L, Yantorno O, Valdez JC (2010).Effect of


Lactobacillus plantarum and Pseudomonas aeruginosa culture supernatants on
polymorphonuclear damage and inflammatory response. International Immunopharmacology
10:247-251

Ratjen F, Döring G. Cystic fibrosis Lancet. 2003;361(9358):681-689


Redondo-Lopez V, Cook RL, Sobel JD. (1990). Emerging role of lactobacilli in the control
and maintenance of the vaginal bacterial microflora. Review of Infectious Diseases 12:856-
872

Reading NC & Sperandio V. (2006) Quorumsensing: the many languages of bacteria. FEMS
Microbiol Lett 254:1–11. Minireview.

Reid G, Jass J, Sebulsky MT, McCormick JK. 2003. Potential Uses of Probiotics in Clinical
Practice. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS 16(4): 658–672

Roghanian A, and Sallenave JM. 2008. Neutrophil Elastase (NE) and NE Inhibitors: Canonical
and Noncanonical Functions in Lung Chronic Inflammatory Diseases (Cystic Fibrosis and
Chronic Obstructive Pulmonary Disease). JOURNAL OF AEROSOL MEDICINE AND
PULMONARY DRUG DELIVERY 21(1):125-14).

Rommens J, Iannuzzi M, Kerem B, Drumm M, Melmer G, Dean M, et al. Identification of the


cystic fibrosis gene: Chromosome Walking and Jumping. Science 1989; 245: 1059-1065.

92
BIBLIOGRAFIA
Schuster A, Fahy JV, Ueki I, Nadel JA. 1995. Cystic fibrosis sputum induces a secretory
response from airway gland serous cells that can be prevented by neutrophil protease
inhibitors. Eur Respir J 8:10–14.

Segal E. Consenso de Fibrosis Quística. Arch. argent. pediatric 1999; 97(3):188-224.

Shah PL, Scott SF, Knight RA, Hodson ME. 1996. The effects of recombinant human DNase
on neutrophil elastase activity and interleukin-8 levels in the sputum of patients with cystic
fibrosis. Eur Respir J 9:531–534.

Shak, S, Capon DJ, Helmiss R, Marsters S A, and Baker CL. 1990. Recombinant human
DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:9188–
9192.

Telleria J, Alonso M, Garrote J, Fernández I,Blanco A. Screening neonatal en fibrosis


quística.An Esp Pediatr 2002; 57: 60-5

Travis SM, Conway BD, Zabner J, Smith JJ, Anderson NN, Singh PK, Greenberg EP, Welsh
MJ. 1999. Activity of Abundant Antimicrobials of the Human Airway.Am. J. Respir. Cell Mol.
Biol 20:872–879

Tsui LC, Buchwald M, Barker D, Braman JC, Knowlton R, Schumm JW, et al. Cystic fibrosis
gene: Locus defined by genetically linked polymorphic DNA maker, Science 1985; 230:1054-
1057

Valdez JC, Ramos AN, Gobbato NM, Rachid MM, Peral MC. 2010 Chapter 2: “Biological and
chemical studies to support the use of lactobacilli as a strategy for control of biofilm-
producing bacteria. Interference Lactobacillus plantarum-Pseudomonas aeruginosa”.

92
BIBLIOGRAFIA
Valdez JC, Peral M, Rachid M, Santana M and Perdigón G. Interference of Lactobacillus
plantarum on Pseudomonas aeruginosa in vitro and in infected burns. The potential use of
probiotic in wound treatment. Clin Microbiol Infect. 2005; 11: 472-479

Vaughn JM, Wiederhold NP, McConville JT, Coalson JJ, Talbert RL, Burgess DS, Johnston
KP, Williams III RO, Peters JI. (2007) Murine airway histology and intracellular uptake of
inhaled amorphous itraconazole. International Journal of Pharmaceutics 338:219–
224

Wells JM. 2011. Immunomodulatory mechanisms of lactobacilli. Wells Microbial Cell


Factories, 10(Suppl 1):S17; pages:2-15

Worlitzsch, D. et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas


infections of cystic fibrosis patients. (2002) J. Clin. Invest. 109, 317–325

92