Desarrollo de plantas

tolerantes a herbicidas.

Mario Muñoz Cortés, Ignacio Pezoa Soto.

Escuela de Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad Mayor.

Resumen.
Los cultivos de interés agronómico han combatido contra las malezas por los
nutrientes del suelo desde tiempos inmemorables. Para controlar las hierbas y
malezas invasoras se han desarrollado plantas que puedan tolerar ciertos
herbicidas, y de esta manera incrementar su rendimiento y producción. El uso
indiscriminado de herbicidas ha llevado a la aparición de malezas mutantes
resistentes. Es por esto que el desarrollo de plantas tolerantes a herbicidas está
cambiando hacia estrategias de generación de plantas multirresistentes para poder
tener acceso a un portafolio más amplio de herbicidas y así evitar la generación de
malezas resistentes.
En el presente informe se abordarán principalmente los herbicidas glifosato,
glufosinato y 2,4-D, y se explicará cómo la biotecnología se enfrenta al problema
actual del uso de herbicidas y la resistencia adquirida.

Introducción.
Las hierbas invasoras en las cosechas han existido desde el origen de la agricultura
y han interferido continuamente en la productividad de las cosechas. Antes del uso
de herbicidas sintéticos, se utilizaban distintas estrategias para combatir las hierbas
invasoras, tales como la eliminación mecánica de éstas a través de agricultores.
Con la llegada de los herbicidas sintéticos y el mayor uso de maquinaria en la
agricultura, se han reemplazado las estrategias tradicionales de eliminación de
hierbas de los cultivos, incluyendo la cantidad de gente involucrada en los procesos.
Los herbicidas han contribuído a poder controlar de mejor manera las hierbas
invasoras y poder brindar un mejor entorno para el crecimiento de las cosechas y de
esta manera incrementar la producción de alimento por hectárea, con todos los
beneficios económicos que esto trae consigo (Reddy y Nandula, 2012).

Si bien muchas especies distintas de plantas transgénicas han sido generadas, solo
cuatro son las que abarcan el mayor porcentaje de cosechas, tales como soya,
maíz, algodón y canola. En el año 2013 el 84% de los cultivos vegetales
genéticamente modificados poseían genes de tolerancia a herbicida (Brookes y
Barfoot, 2015).

Historia.
La tolerancia a herbicidas es una característica predominante en casi la totalidad de
los cultivos vegetales genéticamente modificados y gracias a su utilidad,
probablemente va a seguir siendo así en el futuro cercano. Los primeros organismos
vegetales genéticamente modificados para tolerar herbicidas de amplio espectro,
tales como glifosato, fueron cultivados de manera comercial desde la década de los
90’. Actualmente, esta resistencia sigue siendo bastante común en los cultivos
modificados, pero cada vez se les añaden nuevas características con el fin de, por
ejemplo, mejorar la calidad nutricional de la planta y aumentar su tolerancia a
sequías y frío.

Uno de los herbicidas más utilizados corresponde a glifosato, que posee la

característica de inhibir la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS)
involucrada en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos y fenoles en plantas y
microorganismos. Esta enzima no existe en humanos, por lo que el glifosato no
tiene ningún efecto directo en el metabolismo de las personas.

El excesivo uso de herbicidas para controlar cultivos alrededor del mundo ha

resultado en la generación de malezas resistentes hacia los herbicidas. Los
investigadores han explorado estrategias para mejorar los herbicidas, y así expandir
el espectro de acción en contra de las malezas, sin perjudicar a los cultivos de
interés ni a los consumidores (Reddy y Nandula, 2012). }

Los cultivos resistentes a herbicidas pueden ser clasificados a grandes rasgos en

cultivos no-transgénicos, que utilizan técnicas de breeding y selección clásica,
cultivos transgénicos, modificados a través de ingeniería genética. En la Tabla 1 se
muestran ejemplos de cultivos resistentes a herbicidas generados a partir de
técnicas de selección clásicas, mientras que en la Tabla 2 se observan cultivos
transgénicos y los genes asociados a la modificación genética. En dichas tablas se
pueden apreciar algunos herbicidas utilizados en cada cultivo modificado. Por
ejemplo, en la Tabla 1 se mencionan herbicidas como Sulfonilurea, que interfiere el
proceso de síntesis de valina, isoleucina y leucina, afectando principalmente a las
malezas y causando una pequeña toxicidad en las plantas del cultivo. Es por esto
que para poder abarcar un espectro más amplio de malezas, se comenzaron a
generar plantas que pudieran tolerar herbicidas no selectivos. Por ejemplo, en la
Tabla 2 se menciona el glifosato, correspondiente a un herbicida no selectivo de
amplio espectro, que afecta una ruta metabólica exclusiva de plantas y
microorganismos, correspondiente a la ruta de síntesis de compuestos aromáticos
(Figura 1). En la primera fila de ambas tablas se presentan los primeros cultivos
modificados, su resistencia y su año de divulgación.

Figura 1. Vía de shikimato y el sitio de inhibición de la ruta por glifosato (Duke and
Powles, 2008).

El primer cultivo tolerante a herbicidas generado a través de técnicas

convencionales correspondió a Canola resistente al herbicida triazina, divulgado el
año 1984. En el caso de los cultivos transgénicos, el primer cultivo registrado
corresponde a Algodón resistente a bromoxinil el año 1995. Este herbicida dejó
rápidamente de ser utilizado, debido a que no cumple con las características de ser
de amplio espectro, y por ende falló en proveer un control adecuado de hierbas y
malezas. A causa de esto, se comenzaron a buscar alternativas que brindaran
mejores resultados y así el año 1996 se generó el primer cultivo resistente a
glifosato (Canola). El glifosato como lo hemos mencionado anteriormente, posee la
característica de ser no-selectivo y matar un amplio espectro de plantas, ayudando
así a aumentar la calidad de los cultivos tolerantes y su productividad. Gracias a
esto, el glifosato se utiliza hasta el día de hoy como uno de los principales
herbicidas en la mayor parte de los cultivos a nivel mundial (Duke and Powles,
2008).

Tabla 1. Ejemplos de cultivos resistentes a herbicidas no-transgénicos,

desarrollados a partir de breeding clásico o técnicas clásicas de selección (Green,
2012).

Método de selección Familia de Cultivo Año de divulgación

herbicida

Cruza de planta Triazina Canola 1984

Mutagénesis de Sulfonilurea Soya 1987

semilla

Mutagénesis de Imidazolinona Arroz 1998

semilla

Tabla 2. Ejemplos de cultivos resistentes a herbicidas transgénicos y sus genes

asociados (Green, 2012).

Cultivo Resistencia Gen Año de divulgación

Algodón Bromoxinil bxn 1995

Canola Glifosato epsps 1996

Maíz Glifosato epsps 2001

Alfalfa Glifosato epsps 2005

Soya Glufosinato pat 2009

Una estrategia común en el día de hoy es generar plantas con múltiples

resistencias, tanto para herbicidas selectivos como 2,4-D, como para herbicidas no
selectivos como glifosato.

El 2,4-D es un herbicida sistémico hormonal auxínico muy común utilizado en el

control de las malezas de hoja ancha. Fue desarrollado durante la segunda mundial
y logró funcionar como el primer herbicida selectivo exitoso en el control de trigo
maíz, arroz y cereales similares, ya que ataca a las dicotiledóneas, sin afectar
monocotiledóneas .
Figura 2. Mecanismo de acción del 2,4-D sobre la célula vegetal, en donde afecta
su estructura e inhibe su nutrición, promueve la producción de agentes oxidantes,
provocando daño al DNA, la peroxidación proteica y lipídica, y acidifica el citosol y la
vacuola.
Debido al uso indiscriminado de 2,4-D a lo largo de todo el mundo durante décadas,
se han descubierto 28 especies de malezas que han desarrollado resistencia natural
al herbicida, el mismo caso se puede observar en otros herbicidas tales como el
glifosato, que al ser sobreutilizado ha hecho que aparezcan 34 especies de malezas
a nivel mundial resistentes al herbicida (Schute y cols., 2017). Es por esto que los
días de los cultivos resistentes a un solo herbicida están terminando. Los nuevos
desarrollos de ingeniería genética buscan combinar genes de resistencia hacia
distintos herbicidas, para generar cultivos multiresistentes. Una opción común es
generar cultivos resistentes a glifosato y glufosinato, herbicida de amplio espectro
que cuenta con muy pocas especies resistentes a nivel mundial, tales como maíz,
soya o algodón. El glufosinato actúa inhibiendo a la enzima glutamina sintasa,
llevando a la acumulación fatal de amoniaco.

Técnicas utilizadas
Entre las técnicas utilizadas para la transformación de plantas vamos a nombrar las
más importantes y daremos ejemplos de la tolerancia a herbicidas otorgadas por las
herramientas biotecnológicas (Lombardo y cols., 2015).

Tabla 3. Herramientas biotecnológicas utilizadas en la producción de plantas

resistentes a herbicidas

Estrategias utilizadas

1 Transplastómicas

2 Mutagénesis oligonucleótido dirigida

3 Edición génica con nucleasas (ZNFs, TALENs, meganucleasas,

CRISPR/Cas9)

4 Transformaciones con Agrobacterium spp.

Debido a que la transformación de organismos vegetales se realiza

predominantemente a través de Agrobacterium spp., se hará énfasis en su
utilización para generar plantas tolerantes a herbicidas.

El uso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que en estado natural posee la

capacidad de transformar una gran diversidad de especies vegetales, se
fundamenta debido a la alta eficiencia de la transformación. La transformación es
constitutiva, ya que el microorganismo tiene la capacidad de incorporar material
genético en el genoma del hospedero, produciendo así cambios en la expresión
genotípica y fenotípica de la planta (Gelvin SB, 2017).

En el año 1989 se diseñó una planta de tabaco transgénico resistente a 2,4-D

utilizando A. tumefaciens para transformar con el gen tfdA que codifica para una
monooxidasa de la ruta del catabolismo del 2,4-D de la bacteria Alcaligenes
eutrophus, junto con el promotor 35S del virus mosaico de la coliflor y el terminador
nos (Figura 3). Esto permitió el uso de un barato herbicida en importantes cultivos
dicotiledóneos.
Figura 3. T-DNA del vector. Se observa el promotor 35S, el gen tfdA y el terminador
NOS3. Además se muestran marcadores de resistencia para kanamicina (Km) y
tetraciclina (Tc), y los bordes LB-RB (Lyon y cols., 1989).

Para otorgarle resistencia a glifosato a una planta, una estrategia común consiste en
hacer que la planta sobreexprese EPSPS o exprese una EPSPS insensitiva a
glifosato, derivada de Agrobacterium spp. Otras estrategias contemplan la expresión
de enzimas como glifosato oxidoreductasa (GOX) que degrada el glifosato, o
glifosato acetiltransferasa (GAT) que modifica el glifosato (Schütte y cols., 2017).
A modo de ejemplo de la generación de una planta resistente a glifosato, se muestra
a continuación un constructo (Figura 4) utilizado para agrotransformar germoplasma
de alfalfa (Medicago sativa), otorgándole el gen de resistencia GR79Ms que codifica
para la enzima EPSPS, inhibida por el glifosato, pero que al ser expresada en altas
cantidades es capaz de resistir la acción del herbicida. El gen GR79Ms es una
modificación de un gen novel aislado desde suelos contaminados con glifosato,
denominado AM79 (Lin y cols., 2007), que sufrió la optimización de codones para
aumentar la compatibilidad con alfalfa.
Figura 4. T-DNA del vector binario pCA-GR usado para la transformación de alfalfa.
Se aprecia promotor 35S, el gen de resistencia GR79Ms y el terminador nos.
Además se muestra un marcador de selección para kanamicina (npt II). No se
muestran los bordes LB-RB.

Para el caso del glufosinato, se muestra en la Figura 5, un T-DNA con los bordes
LB-RB indicando que se transformó mediante Agrobacterium, también 3 unidades
transcripcionales que consisten en a) promotor y terminador nos, con el gen de pat
que codifica para una enzima (fosfinotricin acetiltransferasa) que inactiva el
glufosinato al acetilarlo. En segundo lugar un promotor 35S y un terminador nos
regulando un gen reportero de GFP. Finalmente un marcador de selección
correspondiente a higromicina fosfotransferasa (hpt), regulado por promotor y

terminador 35S.

Figura 5. T-DNA utilizado para otorgar resistencia a glufosinato a plantas de ajo

(Allium sativum) a través de agrotransformación (Ahn y cols., 2013).

Impacto Agrocultural

El uso deliberado de los herbicidas por los agricultores ha sido en gran parte por la
mal información al respecto, debido a que las industrias venden su producto como si
fuera la única solución a todos sus problemas. Se ha demostrado que el uso
excesivo de herbicidas afecta la consistencia de los cultivos. Por ejemplo, el
glifosato, que se consideraba como el menos dañino, demostró generar efectos
adversos en el suelo al destruir su microflora (Ahmad, 1995) y generar resistencia
en malezas a largo plazo.
.
Figura 6. Gráfico que representa la relación entre el uso de glifosato y la aparición
de malezas resistentes.

Al tener que utilizar más herbicidas para controlar las malezas, de a poco se ha
comenzado a afectar ecosistemas enteros, disminuyendo su biodiversidad por la
constante matanza de las especies no relacionadas a los cultivos que cumplen
funciones fundamentales en los ciclos de vida de insectos y otros animales. Es por
esa razón que se han hecho acuerdo internacionales con el fin de proteger la flora y
fauna, limitando el uso de herbicidas tóxicos, ya que la agricultura necesita
relacionarse de manera más amigable con el medio ambiente si quiere persistir en
el tiempo.
Figura 7. Representación circular del número de las autorizaciones aceptadas para
el uso de ingeniería genética para modificar fenotipo de especies vegetales.

Conclusiones y perspectivas.
El desarrollo de cultivos tolerantes a herbicidas ha revolucionado la agricultura,
causando un gran aumento de productividad, ofreciéndole a los agricultores una
manera eficaz de controlar las malezas. Hay que considerar que el uso prolongado y
excesivo de los mismos herbicidas por largos periodos ha contribuído a generar
resistencias en las malezas, produciendo problemas de productividad. Es por esto
que las nuevas tecnologías de producción de cultivos modificados tienen que
apuntar hacia la diversificación del portafolio de herbicidas utilizados actualmente,
buscando alternativas más efectivas y amigables con el medio ambiente,
procurando disminuir la prevalencia de hierbas resistentes que puedan llegar a
afectar los cultivos.
Teniendo esto en consideración, las estrategias a seguir deberán enfocarse en la
prevención de la aparición más que de el control de hierbas resistentes al crear
cultivos multiresistentes. Mientras más agricultores comiencen a adoptar prácticas
preventivas, el riesgo de que se generen más hierbas resistentes disminuye
considerablemente y la salud de los cultivos mejorará.
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