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GUÍA Nº 5: ORGANIZACIÓN
SUBCELULAR
INTRODUCCIÓN
Las células aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de años, probablemente debido a la
agregación espontánea de moléculas. Las primeras células eran relativamente simples y
pequeñas, similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes.
Luego aparecieron las células eucariontes, más grandes y de organización más compleja,
que hoy forman parte de animales y plantas (Fig. 1 y 2).
Por definición y a diferencia de las células procariontes, las células eucariontes poseen un
núcleo que contiene la mayoría del ADN envuelto en una membrana. Esto deja al material
genético en un compartimento separado del resto de los contenidos de la célula o
citoplasma, donde ocurren las reacciones metabólicas.
El Núcleo (Fig.3) es el organelo más grande de la célula y está separado del citoplasma por
una envoltura nuclear compuesta por dos membranas; estas membranas aparecen perforadas
por poros, a través de los cuales se lleva a cabo la comunicación con el citosol. El núcleo
contiene todo el ADN cromosomal, el que se encuentra empacado en las fibras de cromatina
por su asociación con proteínas denominadas histonas.
Fig. 3: Núcleo.
El Retículo Endoplásmico (R.E.) (Fig.4) corresponde a sacos, tubos y capas de membranas
que se extienden a través del citoplasma y que ocupan un amplio sector de la célula. La
membrana del Retículo endoplásmico es una continuación de la membrana nuclear. Se
especializa en la síntesis de lípidos y proteínas de membrana, así como también de
materiales que están destinados a ser exportados de la célula. El Retículo endoplásmico
rugoso (R.E.R.) está asociado a los ribosomas, que se unen en su parte externa y se
encargan de la síntesis de proteínas. El Retículo endoplásmico liso (R.E.L.) está constituido
por un sistema laberíntico de túbulos irregulares, ramificados que no contienen ribosomas y
se encarga del metabolismo de lípidos.
Los Ribosomas (Fig.5) son grandes complejos de ARN y proteínas. Se componen de una
subunidad mayor y una subunidad menor que se ensamblan para formar un complejo que se
encarga de llevar a cabo el proceso de traducción en la síntesis de proteínas. Los ribosomas
procariontes y eucariontes son muy similares y pueden encontrarse tanto libres en el
citoplasma como unidos a membranas formando parte del retículo endoplásmico rugoso.
Fig. 6: Mitocondria.
Los Cloroplastos (Fig.7), al igual que las mitocondrias, contienen su propio ADN y
también tendrían un origen simbiótico. Se encuentran sólo en los organismos capaces de
realizar fotosíntesis, como las algas verde-azules y las plantas.
Los cloroplastos corresponden a plastidios que contienen clorofila y están rodeados de una
membrana doble. Los cloroplastos están compuestos por la envoltura, estroma y los
tilacoides.
Fig. 7: Cloroplasto.
El Aparato de Golgi (Fig.8) está constituido por cisternas discoidales aplanadas, paralelas
y superpuestas, formadas por membranas lipoprotéicas. Se encarga de la modificación,
destinación, y empaquetamiento de macromoléculas de secreción o que están destinadas a
otros organelos. Alrededor de él se encuentran numerosas vesículas pequeñas que
transportan sustancias entre el mismo organelo y los diferentes compartimentos de la célula.
Los Lisosomas son vesículas membranosas que contienen enzimas hidrolíticas requeridas
para la digestión de moléculas al interior de la célula. De este modo, estas enzimas se
mantienen aisladas del resto de los componentes celulares evitando la degradación de
moléculas como proteínas y ácidos nucleicos.
FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
Así como un tejido puede ser separado en las células que lo constituyen, con las técnicas
adecuadas la célula puede separarse en los diferentes organelos y macromoléculas que la
componen. Una de las técnicas más utilizadas para tal propósito es el Fraccionamiento
Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y
con alto grado de pureza. Esta técnica fue desarrollada entre otros por Albert Claude y
Christian de Duve entre 1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la
célula basándose en su tamaño y densidad.
Para aumentar el campo gravitatorio se usan las Centrífugas (Fig.10). Estos instrumentos
consisten en rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen girar a diferentes
velocidades, de manera que a mayor velocidad el campo gravitacional obtenido es mayor.
Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de giro del rotor. En otras palabras,
el campo gravitacional generado depende directamente del radio de giro y de la velocidad
de rotación.
Al término de una centrifugación se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el fondo del
tubo se obtiene un sedimento o pellet y sobre él una parte líquida llamada sobrenadante.
Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son fracciones enriquecidas,
pero no totalmente puras de los diferentes organelos. Existen otras modalidades de
centrifugación en las que se utilizan medios de mayor densidad, que se obtienen con
soluciones de sacarosa, polímeros o proteína. Permiten realizar el proceso de separación en
gradientes de densidad, obteniendo organelos con mayor grado de pureza.
Al centrifugar una muestra se obtienen dos fases claramente definida: el pellet que
corresponde al sedimento propiamente tal y el sobrenadante que corresponde a la fracción
líquida que permanece sobre el material sedimentado.
Los pellet obtenidos corresponden a los organelos que han sedimentado, éstos se
resuspenden y se guardan para el resto de los análisis bioquímicos, mientras que los
sobrenadantes se vuelven a centrifugar.
Todo el proceso se realiza en frío (4ºC) para evitar una posible degradación de las
estructuras celulares y así conservar intactas la mayor parte de las características
funcionales originales del organelo que se pretende aislar.
Procedimientos y observaciones
Sus profesores prepararán un homogenizado filtrado, el cual se obtendrá de la siguiente
manera:
§ Muestra: hígado de pollo, lavado con suero fisiológico frío 3 veces para eliminar
restos de sangre.
§ Picar el hígado, adicionar 100 ml de suero y homogenizar el tejido utilizando el
ULTRA- TURRAX. En esta etapa de obtiene el Homogenizado Total (HT)
• Filtrar el HT a través de gasa posicionada sobre un embudo de vidrio. Recibir en un
vaso precipitado de 200 ml y mantener en hielo. El homogenizado obtenido post-filtración
se denomina homogenizado crudo HC.……………………………………………………..
• Mantener el HC en hielo y repartir un volumen de 10 ml a cada grupo de trabajo.
Guardar 1mL de HC en un tubo eppendorf de 1,5mL y conservar en hielo. Centrifugar los
9 mL restantes a 1000 RPM por 5 minutos a 4ºC.
• Transferir el sobrenadante 1 a tubo de centrifugación y resuspender el pellet 1 (Fracción
Nuclear) con 5 ml de suero frío, conservar en frío. Centrifugar el sobrenadante 1 a 6000
RPM por 20 minutos a 4ºC.
• Transferir el sobrenadante 2 a tubo de centrifugación y resuspender el pellet 2 (Fracción
Mitocondrial) con 1 ml de suero frío, conservar en frío. Centrifugar el sobrenadante 2 a
6000 RPM por 20 minutos a 4ºC.
• Guardar el sobrenadante 3 (Fracción Miscrosomal) y eliminar el pellet conteniendo
Recordar:
• Minimizando la exposición al oxigeno se puede mantener la funcionalidad de la porción
mitocondrial por largo tiempo. Por lo tanto, tape con parafilm sus tubos hasta su
evaluación.
• A 4ºC se minimiza la activación de daño generado por fosfolipasas y proteasas. Por lo
tanto, mantenga sus tubos en hielo todo el procedimiento.
• Marque adecuadamente sus tubos para evitar confusión.
Cada organelo contiene enzimas o moléculas que lo caracterizan, las que no se encuentran
en los otros compartimentos celulares y permiten identificarlos.
El ADN es la molécula marcadora de núcleos. Esta macromolécula puede ser identificada
mediante colorantes básicos que se unen a ella cuando se encuentra ionizada, como el
azul de tripán, azul de toluidina y azul B.
Las mitocondrias pueden ser identificadas por la actividad de la enzima Succinato
deshidrogenada (SDH) que cataliza la deshidrogenación estéreo específica
de Succinato a Fumarato durante el ciclo de Krebs, según la siguiente reacción:
SDH
Succinato --------------> Fumarato + 2 H+ + 2 e-
Los protones y electrones liberados permiten seguir la reacción a través de la decoloración
del azul de metileno, que en su estado oxidado es azul y al reducirse se torna incoloro.
Sin embargo, el azul de metileno reducido puede fácilmente ser oxidado por el oxígeno del
aire, y recobrar su coloración azul intensa. Para evitar esto, se cubre el medio de reacción
con aceite mineral o vaselina líquida, lo que permite realizar la reacción en ausencia de
oxígeno.
Procedimientos y observaciones
§ Agite el contenido de cada tubo y agregue a cada uno de ellos 200 uL de aceite mineral
o vaselina líquida. Luego de agregar la vaselina, NO agite nuevamente el tubo.
§ Coloque los tubos en un baño termorregulado a 37º C y observe si ocurre decoloración
en algunos de los tubos (5-10 min).
BIBLIOGRAFIA
Biología Celular y Molecular. De Robertis y de Robertis. 11 Ed., 2da impresión, 1998, Ed.
El Ateneo, Bs. Aires.
Biología Celular y Molecular. Lodish ycol. (2002) 4°Edición, Ed. Panamericana.
The Cell: A Molecular Approach. Cooper, G.M. 1997, ASM Press, Washington, U.S.A.
Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured
filroblasts. Christian Frezza, Sara Cipolat & Luca Scorrano. NATURE PROTOCOLS VOL.2
NO.2. 2007.
1. Para el homogenizado
Higado de pollo
Pinzas.
Bisturí. Tijeras.
Homogenizador.
Embudo.
Gasa.
Centrifuga.
Hielo.
Buffer IBc
3 Microscopios.
Corte de hígado de rata
Porta objetos.
Cubreobjetos.
1 Lápiz rotulador
Centrifuga.
Baño termorregulador.
Hielo
2 gotarios. (p/g)
8 tubos de ensayo (p/g).
Gradilla para tubos de eppdenf
1 baso precipitado de 50 ml (p/g).
Azul de Metileno diluido 50 veces del stock.
Succinato 0.1 M.
H2O destilada. (picetas).
Azul de tripan.
Aceite mineral o vaselina.
Tubos Falcon 15 mL para centrifuga (5 p/g)
tubos eppdendorf 2 mL (5 p/g)
Tubos eppdendorf 1.5 mL (5 p/g)
Puntas de pipeta para 1 mL Puntas
pipeta 200 uL