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MÉTODOS

CROMATOGRÁFICOS

Química Analítica e Instrumental 2017 Universidad Andrés Bello

TECNICAS SEPARATIVAS Precipitación.

Clasificación:

Extracción

Destilación

líquido - líquido

en fase sólida

Cromatografía

Estado I A , B Sistema Homogéneo Estado II A + B Sistema Heterogéneo Proceso

Estado I

A , B

Sistema Homogéneo

Estado I A , B Sistema Homogéneo Estado II A + B Sistema Heterogéneo Proceso 1

Estado II

A + B

Sistema Heterogéneo

Proceso 1

Estado II A + B Sistema Heterogéneo Proceso 1 Transformaciones físicas y/o químicas Proceso 2

Transformaciones físicas y/o químicas

Proceso 2 Mecánico, físico o
Proceso 2
Mecánico, físico o

raramente químico

físicas y/o químicas Proceso 2 Mecánico, físico o raramente químico Estado III A / B Dos

Estado III

A / B

Dos fases separadas

MÉTODOS DE SEPARACIÓN

FILTRACIÓN:

Consiste en retener partículas sólidas por medio de una barrera, la cual puede consistir de mallas, fibras, material poroso o un relleno sólido.

DECANTACIÓN Consiste en separar componentes que contienen diferentes fases (por ejemplo, 2 líquidos que no se mezclan, sólido y líquido, etc.) siempre y cuando exista una diferencia significativa entre las densidades de las fases. La Separación se efectúa vertiendo la fase superior (menos densa) o la inferior (más densa)

EVAPORACIÓN:

El procedimiento de Evaporación consiste en separar los componentes mas volátiles exponiendo una gran superficie de la mezcla. El aplicar calor y una corriente de aire seco acelera el proceso.

CRISTALIZACIÓN:

• Para efectuar la cristalización de un Sólido hay que partir de una Solución Sobre-Saturada, para el proceso de cristalización hay varios caminos:

-Enfriamiento de la solución, -Eliminar parte del Disolvente (Por ejemplo: por evaporación) a fin de aumentar la concentración del soluto, -Añadir un tercer componente que tenga una mayor solubilidad que el componente que se desea cristalizar.

•La rapidez del Enfriamiento definirá el tamaño de los cristales resultantes. Un enfriamiento rápido producirá cristales pequeños, un enfriamiento lento producirá cristales grandes. Para acelerar la Cristalización puede hacerse una "siembra" raspando las paredes del recipiente.

MÉTODOS DE SEPARACIÓN

DESTILACIÓN •Este método consiste en separar los componentes de las mezclas basándose en las diferencias en los puntos de ebullición de dichos componentes. •Los compuestos con una presión de vapor baja tendrán puntos de ebullición altos y los que tengan una presión de vapor alta tendrán puntos de ebullición bajos.

-Los tipos de Destilación más comunes son:

•Destilación Simple: se lleva a cabo por medio se una sola etapa,se evapora el líquido de punto de ebullición más bajo (mayor presión de vapor) y se condensa por medio de un refrigerante Destilación Fraccionada: se realiza en multi-etapas por medio de una columna de destilación en la cual, se llevan a cabo continuamente numerosas evaporaciones y condensaciones

Destilación por Arrastre: se hace pasar una corriente de vapor a través de la mezcla de reacción y los componentes que son solubles en el vapor son separados.

SUBLIMACIÓN La Sublimación aprovecha la propiedad de algunos compuestos de cambiar del estado sólido al estado vapor sin pasar por el estado líquido. Por ejemplo, el I2 y el CO2 (hielo seco) poseen esta propiedad a presión atmosférica.

EXTRACCIÓN:

• Cuando los solutos se distribuyen libremente entre dos solventes inmiscibles se establece una diferencia entre las relaciones de concentración en el equilibrio.

CROMATOGRAFÍA

La cromatografía: engloba a un conjunto de técnicas basadas en la separación de los componentes de una mezcla y su posterior detección, técnica constituída por una fase móvil y una fase estacionaria

La fase móvil consiste en un fluido (gas, líquido por ejemplo) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido.

FASE ESTACIONARIA

FASE MÓVIL

SUPERFICIE

ELUYENTE

PROCESO CROMATOGRÁFICO

Muestra:

tres componentes mezclados

PROCESO CROMATOGRÁFICO Muestra: tres componentes mezclados Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria Fase
PROCESO CROMATOGRÁFICO Muestra: tres componentes mezclados Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria Fase

Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria

mezclados Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria Fase estacionaria Se hace fluir una fase

Fase

estacionaria

Se hace fluir una fase móvil sobre la estacionaria

Dependiendo de la afinidad relativa por ambas fases, los componentes de la mezcla primitiva se separan

Fase móvil

CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es un sistema de separación dinámica:

-Continuamente se producen equilibrios entre los componentes de la mezcla a separar con las fases móvil y estacionaria.

-La fase estacionaria consiste en partículas, generalmente sólidas, pequeñas y con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial:

a) Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa .

b) En ocasiones es necesario un tratamiento químico de la fase estacionaria para conseguir

unas partículas de tamaño y poro adecuados.

La fase móvil puede ser un líquido o un gas:

-Su función es transportar a los componentes de la mezcla a través del sistema cromatográfico.

•En el proceso de separación se produce una competencia entre la fase móvil y la fase estacionaria por el componente.

•A este proceso se le denomina partición del componente distribuido entre las dos fases.

•Se establece un equilibrio entre la concentración del componente presente en la fase móvil y la concentración presente en la fase estacionaria.

•El coeficiente de distribución de un componente A se define como:

K = [Co]/[Cw]

LEY DE DISTRIBUCIÓN

Donde

K = [Co]/[Cw]

-K es el coeficiente de distribución del componente A,

- [C est .] = concentración del componente A en la fase estacionaria

-[C móv .] = concentración del componente A en la fase en la fase móvil.

-El valor del coeficiente de distribución es característico de un componente para una fase estacionaria y una fase móvil determinadas.

FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA

-Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria y con la fase móvil.

-De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando.

-La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil.

-Las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser :

La adsorción , que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial.

La absorción , que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera, absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial.

FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA

-Después de haber pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de compuesto.

•Los métodos cromatográficos actuales más modernos monitorean la salida de los componentes y eluyentes,

•esto se consigue conectando a la salida del sistema cromatográfico unos aparatos electrónicos, denominados detectores, que detectan pequeñas cantidades de componentes.

•Si se representan los valores de la concentración de esos componentes frente al tiempo o al volumen de eluyente se obtiene unas curvas Gaussianas denominadas cromatogramas.

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el archivo.

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La
La

FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA

FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA

La parte de imagen con el identificador de relación rId3 no se encontró en el

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Adsorción

Fase

Soporte Fase Estacionaria

Técnica

Móvil

Gas

 

Columna

GSC

Líquido

Columna

LC

HPLC

Líquido

Capa planar

TLC

PC

La  

La

 

FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA

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Partición

Fase

Móvil

Soporte Fase Estacionaria

Técnica

Gas

Columna

GLC

Líquido

Columna

LC

HPLC

FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA

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Intercambio iónico

Fase

Soporte Fase Estacionaria

Técnica

Móvil

Líquido

Columna

IEC

HPIC

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FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA

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Cromatografía de afinidad

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La
La

Permeación en geles

FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA

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Cromatografía de permeación

 

archivo.

Fase

Soporte Fase Estacionaria

Técnica

Móvil

Líquido

Columna

GPC

FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA

Cromatografía planar

vCromatografía en capa fina (TLC) vCromatografía en papel

Cromatografía en capa fina (TLC) v Cromatografía en papel La parte de imagen con el identificador

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de relación rId3 no se encontró en el archivo. La La parte de imagen con el

La

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Factores que influyen sobre la retención

v

Composición y propiedades de la fase móvil

v

Tipo y propiedades de la fase estacionaria

v

Fuerzas intermoleculares entre los componentes y las fase móvil y estacionaria

v

Temperatura

FUERZAS INTERMOLECULARES

vFuerzas de van der Waals vFuerzas de dispersión vIntercambio iónico vEnlaces de hidrógeno

TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

Tipos

Fase móvil

Fase estacionaria

Cromatografía en papel

Líquido

Sólido

Cromatografía en capa fina

Líquido

Sólido

Cromatografía de gases

Cromatografía líquida en fase inversa

Cromatografía líquida en fase normal

Cromatografía líquida de intercambio iónico

Cromatografía líquida de exclusión

Cromatografía líquida de adsorción

Cromatografía de fluidos supercríticos

Gas

Líquido (polar)

Líquido

(menos polar)

Sólido o líquido

Sólido o líquido (menos polar)

Sólido o líquido (polar)

Líquido (polar)

Sólido

Líquido

Sólido

Líquido

Sólido

Líquido

Sólido

APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA

• La cromatografía permite no sólo separar componentes de una muestra, si no también su identificación y cuantificación

Análisis Cualitativo à Basado en la medida de parámetros cromatográficos como tiempos y volúmenes de retención

Análisis Cuantitativo à basado en las medida de alturas u áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración

CROMATOGRAFÍA PLANA

La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel.

Cromatografía en papel

Técnica de mediana resolución en el cual una mezcla de solutos sembrada sobre papel de filtro logra separarse entre si basándose en:

papel de filtro logra s epararse entre si basándose en: Los diferentes coeficientes de partición de

Los diferentes coeficientes de partición de los solutos entre la fase acuosa estacionaria débilmente unido a las fibras de celulosa del papel y a la fase líquida orgánica móvil corriendo a través de la hoja por acción capilar

móvil corriendo a través de la hoja por acción capilar Diferencias en la adsorción del soluto

Diferencias en la adsorción del soluto a las fibras de celulosa y disolución en la fase móvil.

Cromatografía en capa fina (TLC)

- En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un pequeño espesor constante a lo largo de la placa.

- El eluyente ascenderá, por capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” de los componentes.

- Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente, plástico (ej: acetato) ó metálicos (ej: aluminio). Los tamaños de la placa para CCf convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2.

- Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia, para facilitar la identificación de las muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son coloridos se requerirán técnicas de revelado.

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el

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Cromatografía en capa fina (TLC)

Cualitativa

x x
x x

x

x

Identificación

Cuantitativa

x x x x
x x x x
x x x x

x x

x

x

x x
x x
x x

x

x

Pureza

  x x
 
 
  x x

x

x

Ausencia

Preparativa

x x Identificación Cuantitativa x x x x x x Pureza   x x A u

CROMATOGRAFÍA CUALITATIVA

El índice de retención Rf (Ratio of Front)

El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de adsorbente, eluyente, así como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturación, etc.). Tiene una reproducibilidad de ± 20%, por lo que es mejor correr duplicados de la misma placa.

Una propiedad que permite identificar sustancias en una mezcla

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el archivo.

La parte de imagen con el identificador de relación

La parte de imagen con el identificador de relación

CROMATOGRAFÍA CUANTITATIVA

Estimación del área de la mancha (por medida, pesada)

Determinación indirecta (raspado y valoración)

Determinación directa (Densitómetro)

Fuente de luz

Detector

directa (Densitómetro) Fuente de luz Detector La parte de imagen con el identificador de relación rId2
directa (Densitómetro) Fuente de luz Detector La parte de imagen con el identificador de relación rId2
La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el archivo.

Placa

cromatográfica

Detector La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el

FASE ESTACIONARIA EN CCF

w Para la selección del adsorbentes deber tomar las siguientes consideraciones:

Polaridad Tamaño de partícula Diámetro Área Superficial Homogeneidad

Adsorción:

Exclusión molecular:

Silica Gel (Oxido de Silicio). Alumina (Oxido de Aluminio). Celulosa. Fluorisil (Silicato de Magnesio). Sulfato de Calcio.

Fluorisil (Silicato de Magnesio). Sulfato de Calcio. T i e r r a s d e

Tierras de Diatomea Sephedex (geles)

Fase Estacionaria (3):

Intercambio Iónico:

Resinas

Catiónicas

Aniónicas

Acido sulfónico

RSO 2 - H +

Acido carbóxilico

RCO 2 - H +

Ión amonio cuaternario

R 3 NR + OH -

Grupo amina

R 3 NH3 + OH -

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)

En la elección del eluyente influyen varios factores:

·Precio.

•Pureza.

•No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).

•No utilizar compuestos muy volátiles.

•Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

Fase Móvil

Polaridad

Alta

Baja

Ácidos carboxílicos Alcoholes Aminas Tioles Aldehídos Cetonas Esteres Éteres

COOHAminas Tioles Aldehídos Cetonas Esteres Éteres OH NH 2 SH CHO CO COOR OCH 3 Hidrocarburos

OH Aminas Tioles Aldehídos Cetonas Esteres Éteres COOH NH 2 SH CHO CO COOR OCH 3 Hidrocarburos

NH 2

SH

Aldehídos Cetonas Esteres Éteres COOH OH NH 2 SH CHO CO COOR OCH 3 Hidrocarburos No

CHOAldehídos Cetonas Esteres Éteres COOH OH NH 2 SH CO COOR OCH 3 Hidrocarburos No Saturados

CO Aldehídos Cetonas Esteres Éteres COOH OH NH 2 SH CHO COOR OCH 3 Hidrocarburos No Saturados

COOR

Cetonas Esteres Éteres COOH OH NH 2 SH CHO CO COOR OCH 3 Hidrocarburos No Saturados

OCH 3 Hidrocarburos No Saturados Hidrocarburos Saturados

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)

Fase Móvil

Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina.

w

éter de petróleo

w

-éter dietílico

w

-tolueno

w

-cloroformo

w

-dietil-éter, t-butil-éter

w

-acetona

w

-diclorometano

w

-iso-propanol

w

-acetato de etilo

w

-etanol

w

-n-pentano, n-hexano

w

-metanol

w

-ciclohexano

w

-ácido acético

w

-tetracloruro de carbono

REVELADORES EN CCF

Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras pueden revelarse mediante:

Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó F366), el número que aparece como subíndice nos indica la longitud de onda de excitación del indicador utilizado.

• La introducción de la placa en vapores de yodo.

• El rocío con una solución de agua/H 2 SO 4 1:1 (dentro de un compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de extracción de gases).

• Después calentar

Generales

Selectivo

Específico

H 2 SO 4 , Lámpara ultravioleta

I 2, Ftalato de anilina (azúcares)

Ninhidrina (Amino-ácidos) Resorcina (Cetosas) Difenilamina + U.V. 254 (I. Clorados)

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA TLC

Ventajas de la cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa), ya que:

n El material que precisa es más simple.

conseguir las

separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. n El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos en la industria.

El

tiempo

que

se necesita

n

para

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

• Todo el proceso de separación acontece en la columna

•El proceso de cromatografía en columna se controla por cromatografía en capa fina, de tal manera que se puede separar cada componente de la mezcla.

• La cromatografía en columna se usa para separar grandes

cantidades de material: >100 mg. El proceso de cromatografía consta de una fase móvil (eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente), los cuales dependen de las sustancias. •Es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de proteínas

(adsorbente), los cuales dependen de las sustancias. •Es una técnica que se emplea en el fraccionamiento
EMPAQUETADO COLUMNA
EMPAQUETADO
COLUMNA
APLICACIÓN MUESTRA
APLICACIÓN
MUESTRA
ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES
ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES

RESERVORIO

f. móvil FASE ESTACIONARIA La parte de imagen con el identificador de relación rId4 no
f.
móvil
FASE
ESTACIONARIA
La parte de imagen
con el identificador
de relación rId4 no
se encontró en el
La parte de imagen con el
identificador de relación rId4
no se encontró en el archivo.
MUESTRA
La
La
La
pa
par
La
La
te
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La
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parte
parte
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FLUJO
de
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im
image
image
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n
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el
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cador
cador
n
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ide
el
n
id
relació
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nti
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DIFUSIÓN
en
n
rId4
n
rId4
fic
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ide
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ca
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or
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SEPARACIÓN
La parte de
imagen

FRACCIONES

PERFIL DE ELUCIÓN

La parte de imagen La con el identificador par de La pa

La parte de imagen La con el identificador par de

La parte de imagen La con el identificador par de La pa
La parte de imagen La con el identificador par de La pa
La parte de imagen La con el identificador par de La pa
La parte de imagen La con el identificador par de La pa

La

pa

relación rId2 no se te

rte

encontró

en el

archivo. de

de

1

2

3

4

5

6

7

8

9

ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE LAS FRACCIONES Espectrofotométrico respuesta del detector
ANÁLISIS DEL
CONTENIDO DE LAS
FRACCIONES
Espectrofotométrico
respuesta del detector

Abs 280nm – Proteínas Otras Abs - Colorantes

Moléc. distribuida en f.móvil

1 2 3 4 5 6 7 8 9
1
2
3
4
5
6
7
8
9

fracción

Tipos de cromatografía en columna
Tipos de
cromatografía
en columna

Cromatografía de filtración en gel

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL

Esta cromatografía se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas.

-El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado.

-En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores,

y en segundo lugar las menores.

- Columnas largas y de mayor volumen aseguran separaciones de mayor calidad.

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL

PRINCIPIO DE LA CROMATROGRAFÍA

Las moléculas pequeñas penetran en los pequeños conductos que presentan las esferas de gel, donde la velocidad de flujo de solvente es menor.

Las moléculas grandes, incapaces de penetrar en los pequeños conductos de las esferas de gel, se mueven entre ellas donde la velocidad de flujo de solvente es mayor.

Como consecuencia las moléculas de mayor peso molecular son eluidas antes que las de menor peso molecular.

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL

SOPORTE à Resina de micropartículas esféricas formadas por polímeros hidrofílicos (dextrano, agarosa, poliacrilamida o mezcla de ellos).

Tamaños de poro à intervalo o rango de fraccionamiento.

P.e.

Sephadex G25:

Sephadex G200:

1000 – 5000 Da 5000 – 250000 Da

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el

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FASE MÓVIL

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F. ESTACIONARIA

MICROPARTÍCULAS

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL

F. ESTACIONARIA à (LÍQUIDA) solvente

acuoso (el mismo que el de la fase móvil) que

se encuentra dentro de micropartículas.

F. MÓVIL à (LÍQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la columna por los espacios intersticiales (entre las micropartículas).

los espacios intersticiales (entre las micropartículas). La parte de imagen con el identificador de relación rId2

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el archivo. FASE MÓVIL

F. ESTACIONARIA

MICROPARTÍCULAS

La parte de La parte de imagen con el imagen identificador con el de relación
La parte de La parte de imagen con el imagen identificador con el de relación

La parte de La parte de imagen con el imagen identificador con el de relación rId2 no se encontró identificador en el de archivo.

relación rId2 no se encontró

APLICACIÓN

MUESTRA

ELUCIÓN

Molec. GRANDES à RÁPIDAS

* Avanzan con mayor velocidad a través de los espacios intersticiales (con f. móvil)

Molec. PEQUEÑAS à LENTAS

* Son retenidas por las fibras de las micropartículas y avanzan con menos velocidad (con f. estacionaria).

PERFIL DE ELUCIÓN

menos velocidad (con f. estacionaria). PERFIL DE ELUCIÓN grande pequeña 1 2 3 4 5 6
grande pequeña 1 2 3 4 5 6 7 8 9 respuesta del detector
grande
pequeña
1
2
3
4
5
6
7
8
9
respuesta del detector

fracción

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO CATIÓNICO

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO CATIÓNICO Se utiliza cuando se quiere. separar una mezcla cuyos componentes son especies

Se utiliza cuando se quiere. separar una mezcla cuyos componentes son especies químicas que, a un pH adecuado, se disocian en iones Permite separar y purificar determinados analitos que, con posterioridad, se cuantifican por absorción molecular,etc

posterioridad, se cuantifican por absorción molecular,etc En el interior de la columna se sitúa la fase

En el interior de la columna se sitúa la fase estacionaria, que es un gel intercambiador de iones, el cual debe de acondicionarse previamente al paso de la fase móvil, que contiene la muestra.

al paso de la fase móvil, que contiene la muestra. Tras el paso de dicha muestra,
al paso de la fase móvil, que contiene la muestra. Tras el paso de dicha muestra,

Tras el paso de dicha muestra, se eluyen los componentes no unidos a la fase estacionaria, y posteriormente se eluyen los componentes unidos (separándose en fracciones, si fuera el caso) que se cuantificaran por otros métodos ya mencionados.

SOPORTE à Resina de micropartículas formadas por polímeros sintéticos o naturales (dextranos, celulosas, agarosa).

F. ESTACIONARIA à (SÓLIDA) Grupos con cargas iónicas unidos al soporte.

Carga positiva (+) à intercambiadores de aniones (-):

cromatografía aniónica Carga negativa (-) à intercambiadores de cationes (+):

cromatografía catiónica

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el archivo.

FASE MÓVIL

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el archivo.

F. ESTACIONARIA

MICROPARTÍCULAS

F. MOVIL à (LÍQUIDA) Solvente que anula la interacción electrostática.

2 posibilidades:

Gradientes de pH à cambio de cargA de las moléculas de la muestra.

Gradientes iónicos (salinos) à competencia por grupos electrófilos.

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el archivo.

FASE MÓVIL

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el archivo.

F. ESTACIONARIA

MICROPARTÍCULAS

•Gradiente de pH •Gradiente salino

•Gradiente de pH •Gradiente salino se encontró identificador en el de relación rId2 no se encontró
•Gradiente de pH •Gradiente salino se encontró identificador en el de relación rId2 no se encontró
•Gradiente de pH •Gradiente salino se encontró identificador en el de relación rId2 no se encontró

se encontró identificador en el de relación rId2 no se encontró en

La parte de imagen con La imagen el identificador parte con de el

de relación rId2 no archivo.

APLICACIÓN

MUESTRA

ELUCIÓN

* Cromatografía catiónica

Molec. MENOR CARGA (+) à RÁPIDAS

* Son desplazadas más fácilmente por la f.móvil.

Molec. MAYOR CARGA (+) à LENTAS

* Son retenidas por los grupos cargados iónicamente de la f. estacionaria.

PERFIL DE ELUCIÓN

q+

Q+ + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 respuesta del detector
Q+
+
-
1
2
3
4
5
6
7
8
9
respuesta del detector

fracción

Na +

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

• Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimáticos y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a los solutos (analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva.

adecuados, retienen a los solutos (analitos ), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva.

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

PRINCIPIO

Las esferas de gel están recubiertas de un ligando por el que tiene afinidad alguna de las proteínas a aislar. Al pasar la muestra a través de la columna ésta proteína es retenida en la superficie de las esferas, eluyéndose las demás.

Para eluir la proteína retenida por afinidad se suele aumentar la fuerza iónica la solución de solvente o incluir en éste el ligando soluble a altas concentraciones de manera que compita con el que está unido en las esferas.

SOPORTE à Matriz de micropartículas hidrofílicas sin carga, con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrílica).

F. ESTACIONARIA à (SÓLIDA) Ligandos (grupos químicos) específicos unidos a la matriz.

-- Comerciales:

Concavalina A à une glicoproteínas Proteína A à une IgG (anticuerpos)

-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz

-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz La parte de imagen con el identificador de

La parte de imagen con el identificador de relación rId3 no se encontró en el archivo.

FASE MÓVIL

de relación rId3 no se encontró en el archivo. FASE MÓVIL La parte de imagen con

La parte

de

imagen

con el

identifica

no se encontró en el archivo. FASE MÓVIL La parte de imagen con el identifica dor

dor de

no se encontró en el archivo. FASE MÓVIL La parte de imagen con el identifica dor
no se encontró en el archivo. FASE MÓVIL La parte de imagen con el identifica dor

F. ESTACIONARIA

MICROPARTÍCULAS

F. MÓVIL à (LÍQUIDA) Solución que anula o

disminuye la afinidad con el ligando de la fase

estacionaria.

-- Solución con el propio ligando à Molécula + ligando libre -- Solución con algo que interacciona con el ligando à Molécula

con algo que interacciona con el ligando à Molécula La parte de imagen con el identificador

La parte de imagen con el identificador de relación rId3 no se encontró en el archivo.

FASE MÓVIL

de relación rId3 no se encontró en el archivo. FASE MÓVIL La parte de imagen con

La parte

de

imagen

con el

identifica

no se encontró en el archivo. FASE MÓVIL La parte de imagen con el identifica dor

dor de

no se encontró en el archivo. FASE MÓVIL La parte de imagen con el identifica dor
no se encontró en el archivo. FASE MÓVIL La parte de imagen con el identifica dor

F. ESTACIONARIA

MICROPARTÍCULAS

La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no se encontró en el

La parte de imagen con el identificador de relación

rId2 no se

encontró en el archivo. La parte de imagen con el identificador de relación rId2 no

no se encontró en el archivo. La parte de imagen con el identificador de relación rId2

APLICACIÓN

MUESTRA

LAVADO

ELUCIÓN

ESPECÍFICA

Molec. NO INTERACCIÓN à RÁPIDAS

* No se unen al ligando de la fase estacionaria.

Molec. INTERACCIÓN à LENTAS

* Se unen al ligando de la f. estacionaria. Elución específica.

PERFIL DE ELUCIÓN

ELUCIÓN

LAVADO ESPECÍFICA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 respuesta del detector
LAVADO
ESPECÍFICA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
respuesta del detector