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Metodología
Cepas de levadura
Las cepas de levadura utilizadas en este estudio fueron:
1.Zygosaccharomyces rouxii CBS 732 (ATCC 2623), aislada de mosto de uva.
2.Zygosaccharomyces rouxii ATCC 42981, aislada de condimento salado.
3.Debaryomyces hansenii CBS 767 (ATCC 36239),fue aislada del ambiente.
4. Pichia farinosa CBS 7064,fue aislada de solución de sorbitol
5. Saccharomyces cerevisiae FL100 (ATCC 28383).(Nativa)
Tamaño de celda
Las características más visibles de una célula de levadura son su tamaño y forma.
Con el fin de estimar diversos parámetros fisiológicos, se estimó el peso seco, el
tamaño celular y el número de células viables en cultivos de crecimiento exponencial
de 1 ml ( A 600 = 1) de las cinco cepas.
No encontramos diferencias marcadas, con la excepción del tamaño de la celda (Figura 1
). Nuestros datos indican que, en general, el diámetro promedio de la celda está en el rango
de 4-6 μm. A excepción de D. hansenii , todas las células eran más grandes cuando se
cultivaban en YPD rica que en YNB mínima. Para P. farinosa y S. cerevisiae esta diferencia
fue muy pequeña, pero tanto para Z. rouxiiel crecimiento de cepas en YPD dio como
resultado células sustancialmente más grandes que las células cultivadas en YNB (Figura 1
). La razón de la distribución más amplia de valores para ambas cepas Z. rouxii en medio
YPD (Figura 1 ) es la agrupación de células en cadenas cortas. Las células de D. hansenii
eran más grandes cuando se cultivaban en un medio mínimo que en un medio rico, y tenían
una fase de retraso significativamente mayor y un tiempo de duplicación en comparación
con otras cepas evaluadas que crecían en YNB (datos no mostrados).
Crecimiento en presencia de estrés osmótico.
Figura 2
Crecimiento en presencia de estrés osmótico Para comparar directamente el nivel de
osmotolerancia de las cinco cepas de levadura probadas, primero comparamos su
crecimiento en YPD suplementado con 1 m de KCl o 1 m de NaCl (Figura 2 A).
Esta comparación nos mostró que todas las especies probadas toleran una solución de 1 m
de KCl, pero no NaCl. Z. rouxii CBS 732 y S. cerevsiae FL100 fueron muy sensibles al
NaCl, lo que sugiere que, aunque Z. rouxii CBS 732 es osmotolerante en general, los
cationes de sodio son más tóxicos para él que para las otras tres cepas osmotolerantes.
Para probar el efecto de solutos no tóxicos con más detalle, utilizamos medios con un
moderado (0.3 m) y alta concentración (2 m ) de KCl no tóxico, glucosa (hasta 45%) y
sorbitol (hasta 30%, no mostrado).
Se obtuvieron resultados similares con altas concentraciones de glucosa y sorbitol. Las
cepas Z. rouxii y D. hansenii crecieron ligeramente mejor en medio con 0,3 m KCl que sin
ninguna sal añadida. Sorprendentemente, D. hansenii era sensible a 2 m KCl, y Z. rouxii
aislado de mosto de uva (CBS 732) fue más inhibido por la alta concentracion de glucosa en
el medio que Z. rouxii ATCC 42981 procedente de alimentos salados (Figura 2 B).
Crecimiento en presencia de sales: (A) crecimiento en YPD sólida suplementada con 1 m
KCl o NaCl; (B) crecimiento en YPD sólida complementada con KCl o glucosa, como se
indica; (C) comparación del crecimiento en YPD sólido y medio YNB suplementado con 0,6
m NaCl Cuando se repitieron los mismos experimentos con medios de YNB mínimos, se
obtuvieron resultados similares,
es decir, mejor crecimiento de Z. rouxii y D. hansenii en presencia de concentraciones
moderadas de sal (Figura 2 C). Por otro lado, sorprendentemente, Z. rouxiiCBS 732 era
sensible a 0.6 m NaCl en placas YPD pero toleraba la misma cantidad de sal en medio
YNB.
P. farinosa era extremadamente osmotolerante; su crecimiento solo fue significativamente
limitado en placas con altas concentraciones de sal (> 2 m NaCl o KCl). En esta serie de
experimentos, repetidamente observamos que D. hanseniicreció bastante mal y su
osmotolerancia no fue tan alta como se esperaba (Figura 2 A-C)
Figura 4
Uso de fuentes de carbono no fermentables y producción de glicerol en condiciones
estándar
El crecimiento de células en presencia de etanol y / o glicerol en lugar de glucosa mostró
que solo S. cerevisiae FL100 podía usar estas dos fuentes de carbono (Figura 4 ), y solo Z.
rouxii ATCC 42981 podría crecer en glicerol. La capacidad de Z. rouxii ATCC 42981 y S.
cerevisiae para usar glicerol como única fuente de carbono, y la incapacidad de las otras
tres cepas para hacerlo, se confirmó mediante mediciones de crecimiento en medios
líquidos (no mostrados).
Como ya se mencionó, se cree que las levaduras osmotolerantes alcanzan más
eficazmente las concentraciones intracelulares de glicerol necesarias y producen menos
glicerol total sobre el estrés osmótico . Queríamos saber si las especies osmotolerantes
producen diferentes cantidades de glicerol que S. cerevisiae en condiciones estándar, es
decir, cuando se cultivan en YPD sin estrés osmótico.
Figura 6
Resistencia a cationes tóxicos, fármacos catiónicos y potencial de membrana
plasmática
Cuando probamos la tolerancia de las células al Li + tóxico , observamos diferencias
sorprendentes (Figura 6 A). Z. rouxii CBS 732 fue altamente sensible incluso a una baja
cantidad de LiCl, mientras que la otra cepa Z. rouxii (ATCC 42981) podría crecer en
presencia de altas concentraciones de LiCl. Las células de D. hansenii también fueron
extremadamente tolerantes al LiCl (hasta 1 m ). Este resultado sugirió dos cosas. Primero,
la sensibilidad observada de Z. rouxii CBS 732 a cationes tóxicos de metales alcalinos (Na
+ y Li + , Figuras 2A y 6)A) podría deberse a una menor capacidad para exportar o
secuestrar estos cationes; y, viceversa, la alta tolerancia al litio de Z. rouxii ATCC 42981 y
D. hansenii podría ser causada por un sistema muy eficaz para el flujo de salida de litio. En
general, hay dos tipos de exportadores activos de catión de metal alcalino en la membrana
plasmática de la levadura; una ATPasa y un antiporter. En S. cerevisiae , el sistema más
poderoso para exportar cationes tóxicos de metales alcalinos es la Ena ATPasa, y el
antiportador Nha1 juega un papel menos significativo en la desintoxicación de cationes. Un
catión, ATPasa, aún no se ha caracterizado en Z. rouxii CBS 732. En esta cepa, solo se ha
descrito un exportador de Na + y Li + antipuerto. Los exportadores de cationes en Z. rouxii
ATCC 42981 aún no se han estudiado, pero se han descrito tanto ATPasas eficientes como
antiporter en D. hansenii (Almagro et al ., 2001 ; Velkova y Sychrova, 2006 ). Figura 6
Efecto de cationes tóxicos, fármacos catiónicos y estimación del potencial de membrana
relativo: crecimiento en placas de YPD sólidas con varias concentraciones de: (A) cloruro de
litio; (B) higromicina B, espermina y TMA; (C) potencial de membrana relativa de células
cultivadas en YPD líquido a la fase exponencial media; resultados promedio de tres
experimentos independientes ± SD se presentan En segundo lugar, las diferencias en las
tolerancias de litio pueden ser el resultado de una diferencia en el potencial de la membrana
plasmática, que sirve como la fuerza motriz para la afluencia de cationes y fármacos
catiónicos. Para dilucidar si las diferencias observadas en la tolerancia al litio podrían
atribuirse a un aumento de la afluencia de Li + en las células, se evaluó la tolerancia de las
células a diversos fármacos catiónicos. Estos tres medicamentos, higromicina B, espermina
y tetrametilamonio (TMA), afectan a las células de levadura de diferentes maneras y, por lo
tanto, un aumento simultáneo de la tolerancia / sensibilidad a todos estos fármacos sugiere
una diferencia en el potencial de membrana (Barreto et al ., 2011 ). Como se muestra en la
figura 6 B, Z. rouxii ATCC 42981 fue ligeramente más tolerante a los fármacos catiónicos
que Z. rouxii CBS 732. Además, P. sorbitophila fue bastante tolerante a los fármacos
catiónicos, en contraste con su sensibilidad relativa al LiCl (Figura 6A). Las células de D.
hansenii fueron muy sensibles a la higromicina B tanto a 30 ° C como a la temperatura
óptima (aproximadamente 25 ° C, ver información de apoyo, figura S1), lo que contrastaba
con su alta tolerancia a Li + (Figura 6 A). Finalmente, estimamos el potencial de membrana
relativo de las células que crecen en YPD (Figura 6 C). Nuestros resultados mostraron que,
a excepción deD. hansenii , las otras cuatro cepas podrían tener un potencial de membrana
similar. Con D. hansenii , observamos hiperpolarización significativa en comparación con las
otras cepas. Las curvas de tinción obtenidas para D. hansenii (no mostradas) fueron más
similares a las de las especies de Candida (Elicharova y Sychrova, 2013 ) que a las de S.
cerevisiae , lo que probablemente reflejó su proximidad filogenética. La hiperpolarización
relativa observada de la membrana plasmática de D. hansenii confirmó, por un lado, los
resultados de las pruebas de caída en presencia de fármacos catiónicos, principalmente
higromicina B (Figura 6).B), y por otro lado, sugirió que la alta tolerancia al litio de las
células de D. hansenii se debía a la presencia de un mecanismo eficiente de desodificación
de Li + (¿exportación?). Resistencia al estrés oxidativo
Conclusiones
•Resultados mostraron que algunas especies osmotolerantes son más robustos cuando se
enfrenta a varios tipos de estrés que otros, que algunas de las especies aislado
también son altamente tolerantes a sales y otras tensiones y,viceversa, algunas cepas
aisladas de un ambiente salino tolerar altas concentraciones de azúcares.
• Una comparación de los parámetros fisiológicos y capacidad de crecimiento, tanto en
condiciones normales y de estrés reveló diferencias importantes entre las cepas
osmotolerantes y especies, y nos hacen creer que, nuestros resultados pueden
contribuir a la futura selección de cepas y especies osmotolerantes apropiadas para
mejorar la productividad de los diversos procesos biotecnológicos relacionados con la
levadura.
Aplicación en Microbiología industrial y ambiental
Los productos biotecnológicos obtenidos a partir de levaduras influyen sobre diversos
sectores de interés comercial como: alimentos, bebidas, químicos, enzimas
industriales, productos farmacéuticos, agro y medio ambiente