AISLAMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

I. OBJETIVO

 Aislar las bacterias de la familia micrococcaceae, género staphylococcus y

estudiar sus propiedades fermentativas y patogenicidad.

II. MATERIALES Y EQUIPOS

 Pipetas
 Placas Petri MUESTRAS
 Matraces Erlenmeyer
 Asa de kolle bacteriológica  Queso fresco
 Extensores  Carne
 Mechero bunsen  Sudor de la frente
 Cuenta colonias  Esputo de garganta
 Incubadora  Interior de fosas nasales
 Agar Baird Parker
 Cucharillas
 Platillo
 Cuchillo

III. FUNDAMENTO TEORICO

Staphylococcus es un género de bacterias estafilococáceas de la clase Cocci.

Comprende microorganismos que están presentes en
la mucosa y en la piel de los humanos y de otros
mamíferos y aves, incluyendo a 35 especies y 17
subespecies, muchas de las cuales se encuentran en
los humanos. Las especies que se asocian con más
frecuencia a las enfermedades en humanos son
Staphylococcus aureus (el miembro más virulento y
conocido del género), Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus

Características generales

Morfológicamente los Staphylococcus son cocos grampositivos. Los estafilococos

crecen fácilmente sobre casi todos los medios bacteriológicos, en cultivos su crecimiento
es mejor en el medio sal manitol y agar sangre, esto puede llegar a dar problemas en el

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corazón o hígado tales como la pérdida de un hígado es un coco anaerobio facultativo,
esto significa que puede crecer tanto en condiciones con oxígeno como carente de este.
Su mayor velocidad de crecimiento es a 5 - 25 °C; pero también se puede ver en activa
fisión binaria entre 30 y 27 °C. Además, producen catalasa, lo que los diferencia de los
estreptococos. Tiene importancia médica principalmente el S. aureus, y en humanos
además de éste, el S. saprophyticus y el S. epidermidis.

Factores de virulencia
Contiene varias características en sus factores de virulencia. En su estructura se
encuentran los ácidos teicoicos y lipoteicoico, y los péptidoglicanos.

Los ácidos le sirven para adherirse a superficies corporales junto con las especies de
estafilococo que tienen cápsula, y en conjunto los ácidos teicoicos y el péptido glicano
tienen la característica que activan el sistema inmune del complemento y sirven además
de evasores de la fagocitosis.

Entre sus factores de virulencia que le sirven para la invasión y le sirven al laboratorista
para su identificación están:

 La presencia de catalasa.
 La presencia de coagulasa en el caso del S. aureus (patognomónico).
 La fermentación del azúcar Manitol específico como la coagulasa del estafilococo
aureus (el más importante).
 Presencia de B lactamasa, que rompe el anillo b lactámico de los antibióticos con
esta estructura

Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus, conocido como estafilococo áureo o
comúnmente estafilococo dorado, es una bacteria anaerobia
facultativa, Gram positiva, productora de coagulasa, catalasa,
inmóvil y no esporulada que se encuentra ampliamente
distribuida por todo el mundo.

En la actualidad, este microorganismo se encuentra como el

principal causante de las infecciones nosocomiales. Esta
situación se ve favorecida por el hecho de que esta especie
habita tanto en las mucosas como en la piel de los seres humanos, lo que permite que
a través de las heridas quirúrgicas pueda penetrar en el torrente sanguíneo del paciente
por medio del contacto directo o indirecto con el personal sanitario, con un objeto
contaminado o incluso con otro paciente.

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Morfología
S. aureus es un coco inmóvil, de 0,5 a 1 μm de diámetro,
que se divide en tres planos para formar grupos de células
irregulares semejantes a racimos de uvas. En extendidos
de pus los cocos aparecen solos, en pares, en racimos o
en cadenas cortas. Los racimos irregulares son
característicos de extendidos tomados de cultivos que se
desarrollan en medios sólidos, mientras que en otros
cultivos son frecuentes las formas de diplococos y en cadenas cortas. Unas pocas cepas
producen una cápsula o capa de baba que incrementa la virulencia del microorganismo.
S. aureus es un microorganismo grampositivo pero las células viejas y los
microorganismos fagocitados se tiñen como gramnegativos.

Toxinas
S. aureus produce muchas y muy variadas toxinas. Estas toxinas se
dividen en 4 tipos: citotoxinas, enterotoxinas, toxinas exfoliativas y
toxinas del choque tóxico.

Cultivo
Los estafilococos crecen rápidamente en casi todos los medios
bacteriológicos bajo condiciones aerobias o microaerofílicas.
Los Medios diferenciales para S.aureus son el medio manitol-
salino o Chapman y el medio Baird-Parker.

Su temperatura óptima de crecimiento va de 35 a 40 °C y el pH

óptimo oscila entre 7,0 y 7,5 aunque soportan pH mucho más
extremos. Soportan tasas elevadas de cloruro sódico, hasta un
15%.

Pruebas bioquímicas
La prueba de la coagulasa es sencilla y tiene una especificidad muy
alta. La prueba se puede realizar con un cultivo o en tubo y consiste
en la búsqueda del factor de aglutinación. Se lleva a cabo con la
administración de S. aureus a plasma de conejo con EDTA, al cabo
de unas horas podrá verse la formación de un coagulo (prueba
positiva). Puede usarse la aglutinación en látex y la Hemaglutinación
pasiva como medio alternativo para detectar el factor de agregación.

Desoxirribonucleasa (DNasa)
Como se mencionó, S. aureus produce DNasa termoestable que es detectable en el
medio de prueba del mismo nombre. Su uso es principalmente como confirmación
diagnóstica.

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Catalasa
Los estafilococos y los micrococos se diferencian de los
estreptococos y los enterococos por esta prueba. Esta
prueba detecta la presencia de enzimas-citocromo oxidasa.
La prueba se realiza agregando una gota de peróxido de
hidrógeno (3% vol) sobre la muestra en un portaobjetos de
vidrio. Es positiva si se observa un burbujeo intenso. Entre la causa más frecuente de
falsos positivos se encuentra el realizarla en un medio que contenga sangre (los
eritrocitos pueden causar burbujeo) y la presencia de pseudocatalasa en algunas cepas
estafilocócicas.

Sensibilidad a la lisostafina
Esta prueba mide la facilidad con la que los microorganismos estafilocócicos se lisan en
presencia de lisostafina. Lisostafina es una endopeptidasa que rompe los puentes de
entrecruzamiento de glicina en el peptidoglucano.
Entre las bacterias de lisis rápida y marcada encontramos: S. aureus, S. simulans,
S.cohnii y S. xylosus; y las de lisis lenta o insensibles: S. hominis, S. saprophyticus y S.
haemoliticus.

Oxidasa
Esta prueba es rápida, se usan discos de papel filtro con tetrametil-p-fenilendiamina
como reactivo y DMSO para hacer permeables a las bacterias al reactivo. La prueba se
basa en que evidenciar la reacción de óxido-reducción y se torna violeta a los 30
segundos cuando es positiva. Staphylococcus aureus, y la mayoría de las especies del
mismo género son oxidasa-positivos.

Enzimoinmunoanálisis
Estas pruebas buscan la presencia de proteínas específicas de S. aureus, la mayoría
de ellas busca a la proteína A y la β-N-acetilglucosaminidasa. La sensibilidad y
especificidad de este estudio, en cultivos no contaminados es cercana al 100%.

BUENAS PRACTICAS DE MANUFACTURA

Las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM), es un conjunto de instrucciones
operativas o procedimientos operacionales que tienen que ver con la prevención y
control de la ocurrencia de peligros de contaminación.
Tiene que ver con el desarrollo y cumplimiento de nuevos hábitos de Higiene y de
Manipulación, tanto por el personal involucrado en los procesos, como en las
instalaciones donde se efectúa el proceso, en los equipos que se utilizan para hacer un
producto, en la selección de los proveedores.

La implementación de BPM es una herramienta básica para la obtención de productos

seguros para el consumo humano, que se centralizan en la higiene y forma de
manipulación.
El Reglamento sobre Vigilancia y Control Sanitario de Alimentos y Bebidas, aprobado

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 por Decreto Supremo Nº 007-98-S.A, establece la obligatoriedad del uso de BPM para
todos los establecimientos elaboradores-industrializadores de alimentos.

HIGIENE PERSONAL
Las personas que trabajan en contacto directo con el producto, áreas de producto,
materias primas o insumos deben:
 Baño diario.
 Usar ropa limpia.
 Los bolsillos de las camisas deben estar cerrados.
 Los zapatos cerrados limpios y en buenas condiciones.
 Lavarse las manos con agua y jabón al inicio del turno y después de ir al servicio
sanitario, antes y después de comer, después de toser, estornudar o tocarse la
nariz, después de fumar, después de manipular la basura.
 No utilizar joyas.
 Utilizar guantes limpios.
 Mantener el cabello recogido.
 No se deben consumir alimentos en el puesto de trabajo.
 No se debe fumar en los pasillos o áreas de Producción.
 Prevenir la contaminación por sudor, cabellos, cosméticos, esmaltes y otros.

PRACTICAS DE HIGIENE
Los empleados deben cumplir con normas de higiene:
 Dar el mejor uso higiénico a baños, vestirse y demás servicios.
 Mantener limpio y aseado el puesto de trabajo, libre de trapos sucios, papeles,
vasos de gaseosa, desperdicios de materiales u otros que deben vaciarse en los
recipientes de aseo.
 No almacenar basuras en rincones de la planta, a la intemperie o en sitios
diferentes a los recipientes de aseo.
 Ayudar a mantener el estado de aseo, orden y limpieza de los pisos de edificios,
planta en general y las instalaciones de servicio como pasillos, comedores, patios y
jardines.
 No escribir letreros en las paredes de la planta, sanitarios, vestieres o edificaciones.
 El personal contratista debe cumplir las normas de higiene y procedimientos de
BPM.

PRACTICAS DE SEGURIDAD
 Utilizar todos los implementos de seguridad establecidos para cada puesto de
trabajo.

ESTADO DE SALUD
 Participar en los exámenes de salud anuales realizados por el departamento
médico.
 Avisar en caso de enfermedades contagiosas, heridas en las manos, hongos.

PRACTICAS DE ALMACENAMIENTO

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  Mantener los alrededores y el interior limpios y sin acumulaciones de basura y
desechos.
 Los productos deben almacenarse en estibas nunca directamente en el piso.
 Separación de 60 cm entre arrumes y paredes
 Utilizar las materias primas más antiguas de acuerdo a la fecha de recibo.
 Evitar exposición del producto a rayos solares.
 Productos en proceso o terminado no deben almacenarse próximos a materiales
como detergentes, químicos, fumigantes, evitando la contaminación cruzada.
 Áreas de materias primas e insumos y producto terminado rechazados, o devueltos
separadas.

PRACTICAS DE TRANSPORTE
 Deben ser inspeccionados en cargue y descargue.
 No presentar olores extraños como pintura, libres de infestación, roedores,
desperdicios y basuras. Condiciones mecánicas y de protección como carpas en
buen estado.
 No transportar simultáneamente producto terminado con sustancias contaminantes

¿Cuáles son los beneficios de implementar BPM?

1. Proporciona evidencia de una manipulación segura y eficiente de los alimentos.
2. Crece la conciencia del trabajo con Calidad entre los empleados, así como su nivel de
capacitación
3. Reducción de reclamos, devoluciones, reproceso y rechazos.
4. Disminución en los costos y ahorro de recursos.
5. Aumento de la competitividad y de la productividad de la empresa.
6. Posicionamiento de la empresa.
7. Fideliza a los cliente.
8. Indispensable para comercializar en el TLC.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1. Preparación de las muestras

a) Tomar un trozo de algodón húmedo y pasarlo por la frente (mejor si está

sudando) y depositarlo en un matraz, repita hasta tener cuatro algodones y
luego se agrega agua destilada. Agitar y tapar el matraz.

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 b) Tomar dos trozos de algodón húmedo e introducirlos en el interior de las fosas
nasales completamente, luego depositarlos en un matraz y agregar agua
destilada. Agitar y tapar el matraz.

c) En un vaso precipitado con poca agua destilada agregar esputo directamente

de la garganta al vaso, agitar bien y tapar.

d) Moler el queso en el mortero y con una cucharilla agregar a un matraz y añadir

agua destilada. Agitar y tapar el matraz.

e) Picar la carne en trozos finos, con una cucharilla agregar todo a un matraz y
añadir agua destilada. Agitar y tapar el matraz.

4.2. Siembra de las muestras preparadas

Se siembran las muestras preparadas en placas Petri con medio de cultivo agar
Baird Parker por distintos métodos de siembra ya estudiados (realizar este
proceso cerca del mechero para tener un medio aséptico de trabajo).

a) Se toma la muestra de la frente y con el asa de kolle ya esterilizada con el

mechero se toma un poco de muestra y se le agrega a la placa con agar por
el método de estría en sectores (dividir la placa en cuatro partes).

b) Luego se toma la muestra de fosas nasales y se realiza el mismo método de

siembra de estriado en sectores, no olvidar esterilizar el asa de kolle.

c) Se toma la muestra de garganta y se utiliza el método ya mencionado

nuevamente, se estría en dos sectores primero sin dejar espacios y luego
dejando espacios, tomar nuevamente un poco de muestra y realizar lo mismo
en los otros dos sectores.

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 d) Se toma ahora la muestra de queso y con la pipeta agregar dos gotas dentro
de la placa Petri y con un extensor repartir la muestra homogéneamente por
toda la superficie del agar.

e) Por último se toma la muestra de carne y de nuevo se realiza la siembra por

extensión procurando esparcir bien la muestra.

Llevar las placas Petri con el inoculo sembrado a la

incubadora a unos 38ºC por 48horas para que crezcan
los staphylococcus aureus. Luego retirar las placas y
observar las colonias formadas en el cuenta colonias.

V. RESULTADOS

Al extraer las placas con las muestras incubadas luego de 48horas se tuvo la siguiente
apreciación con el cuenta colonias:

 La placa donde se sembró muestras de la frente se observó mediante el cuenta

colonias que se formaron colonias de color negro y unos pocos tenían un halo
transparente a su alrededor.

 La placa que tenía la muestra de las fosas nasales también formo colonias negras
y solo uno tenía un halo transparente.

 Para la placa con muestra de garganta apenas creció una colonia negra pero esta
tenía el halo transparente a su alrededor difícilmente visible.

 Luego al observar la placa con la carne se notó que tenía una mayor cantidad de
colonias negras que las anteriores muestras pero solo uno o dos tenían el halo
transparente.

 Por último, la placa que contenía el queso molido presento una cantidad, aun
mayor que la de la carne, de colonias negras y casi todas ellas poseían el halo
transparente a su alrededor.

VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 En todas las placas con muestra sembrada en el agar Baird Parker se formaron
colonias de color negro, según el agar esto indica que todas las colonias son
staphylococcus pero son de diferente especie.

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  Ahora para determinar cuáles fueron staphylococus aureus, estos forman a su
alrededor un anillo blanquecino (halo) con el agar Baird Parker lo que permite su
identificación con respecto a las demás especies del genero staphylococcus.

 Con respecto a la cantidad de colonias, la mayor cantidad de colonias estaban en el

queso, por estar hecho a base de la leche en donde todo microorganismo pude
crecer y entre ellos estaba el staphylococus aureus, ahora su presencia indica que
ese queso no era apto para consumo por riesgo a contaminación, tal vez era un
queso hecho con leche sin pasteurizar por eso la gran cantidad de staphylococus
aureus. Posiblemente estarían inactivos pero de no mantenerse en condiciones de
refrigeración podrían activarse las bacterias y causar enfermedades a quien lo
ingiera.

 En las demás muestras se refuta la teoría de que los staphylococus aureus se

encuentran en distintas partes del cuerpo de los animales y seres humanos y que
su exceso puede provocar contaminación.

VII. CONCLUSIONES

 El staphylococus aureus es una bacteria perteneciente a la familia micrococcaceae

del genero staphylococus, que es patógeno y Gram positivo, se encuentra en el
cuerpo de animales de sangre caliente.

 Para detectar su presencia en agar Baird Parker se debe observar que en este agar
solo crecen staphylococus y para diferenciar el aureus se debe observar si las
colonias forman un halo transparente a su alrededor.

 Con esto se busca detectar si los alimentos son aptos para el consumo del público,
si no se generan las colonias.

 El agar usado fue el Baird Parker, pero existen otros agares del tipo diferencial para
detectar la presencia del staphylococus aureus.

 De no reconocer bien si se tiene staphylococus aureus en la placa se debe realizar

pruebas bioquímicas para determinar si los resultados corresponden según tablas
teóricas a los del staphylococus aureus.

 Al saber que el cuerpo humano posee el staphylococus aureus, debemos tener

buenos hábitos de higiene para prevenir una posible contaminación.

VIII. BIBLIOGRAFIA

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 http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus
 http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus
 http://www.centrocastelmonte.com/buenas-practicas-de-manufactura-peru-
bpm.html

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