Laboratorio de Química-Física

Primer semestre 2018

Determinación del coeficiente de partición de amoxicilina

Cristián Lamaizon Muñoz, Francisco Guzmán Toro

Carrera: Química y Farmacia
Correo: cnlamaizon@uc.cl, fjguzman1@uc.cl

Resumen. En el práctico realizado primero se realizaron tres disoluciones de amoxicilina a pH igual

a 5.0 y tres a pH igual a 7.4. Mediante espectrofotometría se determinaron sus absorbancias y con la
construcción de una curva de calibrado, se determinó la concentración inicial de éstas. Luego se tomó
una alícuota de cada disolución y se juntó con otra alícuota de n-octanol para la posterior distribución
de la amoxicilina entre ambas fases. Realizado esto, se midió la absorbancia a las disoluciones acuosas
resultantes determinando mediante la misma curva de calibrado la concentración de éstas. Luego de un
análisis de los datos, se pudo descartar ciertas disoluciones con resultados no coherentes. Para el caso
en donde se pudo obtener un coeficiente de reparto P y respectivo valor de LogP, la amoxicilina a pH
7.4 tiene un valor de P y de LogP de 0.0539 y -1.2681 respectivamente y la que se encuentra a pH 5.0
tiene un valor de 0.0509 y -1.2935, por lo que al primer pH la amoxicilina tiene un mayor grado de
lipofilia, por lo tanto mayor velocidad para atravesar membranas lipídicas.

1. Introducción grado de hidrofilia es mayor que el de lipofilia de una

Al evaluar la eficacia terapéutica de un
fármaco, ésta no solamente depende de la actividad
biológica y la respuesta fisiológica que se genere, sino
que también hay que considerar todos los procesos
involucrados desde la administración del fármaco,
pasando por su actividad biológica, hasta la
eliminación de éste, por lo que sus propiedades
fisicoquímicas van a condicionar muchos de estos
procesos. En este sentido tanto el transporte del
fármaco, generalmente a través del plasma, disolución
acuosa, como la absorción a través de las membranas
lipídicas toman vital importancia en la eficacia
terapéutica de éste [Delgado et al., 2004]. Es por esto
que al momento de evaluar un fármaco, sea necesario
considerar la solubilidad de éste tanto en disoluciones
acuosas como en orgánicas. El balance de la
solubilidad entre ambos medios viene dado por el
coeficiente de reparto o partición (P) [Sangster, 1989],
el que se define para una sustancia X como:
[𝑋]𝑜𝑟𝑔
𝑃= (1)
[𝑋]𝑎𝑞
Al considerar la Ley de acción de masas, se
hace evidente que la concentración de X en equilibrio
corresponde al reparto de X que originalmente se
encontraba en la fase acuosa, esto hace que la ecuación
1 se pueda reescribir de la siguiente forma:
[𝑋]𝑎𝑞 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − [𝑋]𝑎𝑞 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙
𝑃= (2)
[𝑋]𝑎𝑞 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
Además, al analizar el significado de los
valores de P, se puede apreciar que para un P<1, el
molécula. Caso contrario de lo que pasa cuando P toma
valores mayores a 1, en donde el grado de hidrofilia es
menor que el de lipofilia para la molécula en cuestión,
indicando la facilidad de atravesar la membrana
lipídica [Delgado et al., 2004].
Para modelos biológicos es necesario
considerar la naturaleza de la membrana lipídica y la
interacción que puede sufrir el fármaco con ésta. Los
fosfolípidos anfipáticos de la membrana lipídica hacen
necesario que el disolvente orgánico utilizado debe
tener propiedades similares a ésta [Delgado et al.,
2004] por lo que se volvió aparente que, para
propósitos biológicos, un coeficiente de partición
basado en solventes de naturaleza éster o alcohol con
cadenas carbonatadas largas eran más apropiados,
siendo el n-octanol elegido como el solvente lipofílico
más usado en estas aplicaciones [Sangster, 1989].
En el caso de moléculas de ionizables, hay
que tomar en cuenta el grado de ionización de ésta,
esto es, si la molécula presenta un equilibrio químico
de protonación o desprotonación, solamente podrá
atravesar la membrana la fracción no ionizada, ya que
ésta es la más liposoluble.
Para estos sistemas el pH del medio es una
variable a considerar, ya que altera de forma directa el
grado de ionización de la molécula (figura 3),
alterando así el coeficiente de reparto y, en
consecuencia el LogP, haciendo más hidrofílica o
lipofílica la molécula de interés. En estas situaciones
se hace uso de una corrección de P, tomando en cuenta
el grado de ionización (α), obteniendo así un
coeficiente de distribución (D) para los casos en donde
se considere una especie ionizable, para estos efectos
D se calcula de la siguiente manera:
𝑃𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 𝐷 𝑅2 = 0.9992
𝑃= = (3)
1−𝛼 1−𝛼
Siendo P el coeficiente de partición para la
molécula no ionizada, Pexperimental el coeficiente de
partición al ocupar un amortiguador de fosfato con un
pH igual a 7.4, el que es igual a D, y α el grado de
ionización, el que se determina según la ecuación 4
para ácidos y 5 para bases [Delgado et al., 2004]:
1 [𝐴𝑚𝑜𝑥𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎] = 0.0069𝑀
𝛼á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑠 = (4)
1 + 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑜𝑔(𝑝𝐾𝑎 − 𝑝𝐻)
1 2.2 Determinación de la concentración final de
𝛼𝑏𝑎𝑠𝑒𝑠 = (5)
1 + 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑜𝑔(𝑝𝐻 − 𝑝𝐾𝑎 )
Así, al relacionar P con D, de igual forma de
puede relacionar la forma logarítmica de estos
parámetros, siendo LogD una medida de distribución,
la que es proporcional a la velocidad con la cual una
molécula atraviesa una membrana, a un pH dado, ya
que de esta forma se considera el grado de ionización
de la molécula.
2. Materiales y métodos
-6 tubos de ensayo
-2 pipetas graduadas 10 mL
-1 micropipeta 1000 μL
- 6 celdas UV-visible
-Tapón de goma
-Fármaco (amoxicilina)
-1-octanol
-Agua
2.1 Determinación de la concentración inicial de las
disoluciones acuosas
Para determinar las concentraciones iniciales se
prepararon 6 disoluciones de 100 mL (3 a pH =5,0 y 3
a pH=7,4) a partir de disoluciones madres de
concentración 0,066 M. Luego se miden las
absorbancia de las disoluciones acuosas a longitud 400
nm (tabla 1 y 2), colocando cierto volumen de ellas en
celdas para espectrofotometría UV-Visible. Antes de
cada medición se corrige con blanco (que es agua
destilada o buffer de fosfato según corresponda), para
calibrar el equipo.
Con los datos teóricos entregados durante el
laboratorio de la preparación de las disoluciones de
amoxicilina, con sus diferentes absorbancias y
concentraciones, como se puede ver en la tabla 3, se
pudo construir una curva de calibrado (figura 1). A
partir de ésta se obtuvo una ecuación de la recta
mediante regresión lineal en programa GraphPad
2
Prism5. Con ella se puede despejar las concentraciones
a ambos pH durante el laboratorio.
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 18.57[𝐴𝑚𝑜𝑥𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎] − 0.0002857
(6)
Por ejemplo, al sustituir la absorbancia de la
disolución 1 (Abs=0,128) a pH 7,4, obtenemos la
siguiente concentración de amoxicilina:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 18.57[𝐴𝑚𝑜𝑥𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎] − 0.0002857
0.128 = 18.57[𝐴𝑚𝑜𝑥𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎] − 0.0002857
0.128 + 0.0002857 = 18.57[𝐴𝑚𝑜𝑥𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎]
soluto en la disolución acuosa
Se miden con pipeta graduada 4 mL de la
disolución acuosa y 3 mL de 1-octanol, ambos se
añaden en un tubo de ensayo. Después se tapa con
tapón de goma, se agita por 1 minuto hasta que el
sistema alcance el equilibrio, posterior a la separación
de las fases. Luego se extrajeron 2,5 mL de fase acuosa
con pipeta, y se colocaron en una celda UV-Visible
para medir las absorbancias a 400 nm (Abs2) en el
espectrofotómetro (tabla 1-2). Posteriormente se
determinaron las concentraciones finales mediante la
misma recta utilizada anteriormente pudiendo
determinar así el coeficiente de reparto (tabla 4)
3. Resultados y Discusión
Como se puede observar para la amoxicilina (AMX)
(figura 3), a bajas concentraciones (disolución 1 y 2
para ambos valores de pH), luego de realizar la
repartición de ésta en n-octanol, hay un aumento de la
absorbancia, lo que aparentemente significaría un
aumento de la concentración de la AMX en la
disolución acuosa. Solo las disoluciones a mayor
concentración dan resultados más coherentes para lo
esperado, dando una leve disminución de la
concentración de amoxicilina luego de repartirla en n-
octanol.
Para el primer caso, donde hay un aparente aumento
de la concentración, al determinar el coeficiente de
reparto (P), éste da un valor negativo, lo que no
permite determinar un valor de LogP. En el segundo
caso, para ambos valores de pH, el valor de P
experimental es positivo, menor a 1, indicando un alto
grado de hidrofilia de la AMX. Siguiendo con esta
línea, a un pH igual a 7.4 se obtiene un menor valor de
P respecto a pH 5.0, lo que indicaría un mayor grado
de hidrofilia de la molécula a este valor de pH.
Estos resultados darían cuenta del tipo de AMX usada,
teniendo un alto grado de solubilidad en disolventes
acuosos la que se encuentra en formato de sal sódica
(NaAMX) [Xu et al., 1999].
Para el caso de los antibióticos β-lactámicos de la
familia de las penicilinas, donde la AMX forma parte
[Bhattacharyya et al., 1978], suele ocurrir una
degradación de la porción β-lactámica mediante una 3.1 Figuras y Tablas
hidrólisis ácida [Frau et al., 1997] (también es posible
la hidrólisis básica), rompiendo el enlace amido como Tabla 1. Absorbancias experimentales a 400 nm en
se observa en la figura 4 y formando así el ácido disoluciones a pH 7,4
penicilánico [Valvo et al., 1997], sustancia que
Tubo 1 2 3
absorbe cercana a los 320 nm [Valvo et al., 1999].
Disolución acuosa
Esto podría ser la causa de los resultados anómalos de 4 4 4
(mL)
las absorbancias que mostrarían un aparente aumento Octanol (mL) 3 3 3
de la concentración de amoxicilina. Las absorbancias Cinicial en agua
medidas luego de la repartición en n-octanol podrían 0,0101 0,0218 0,0349
(mol/L)
corresponder a la degradación de la AMX. Si se
Abs 1 0,187 0,405 0,648
considera que a menores concentraciones habría un
mayor grado de hidrólisis, entonces en estas Abs 2 0,205 0,471 0,619
situaciones se generarían resultados más anómalos Cfinal en agua (mol/L) 0,0110 0,0253 0,0333
respecto de lo esperado al tomar en cuenta la
distribución de las especies en equilibrio.
Como se observa en las disoluciones de mayor Tabla 2. Absorbancias experimentales a 400 nm en
concentración, hay una absorbancia más coherente a lo disoluciones a pH 5,0
esperado, aun así no se podría descartar
completamente la presencia de especies
correspondientes a la degradación de la AMX. Tubo 1 2 3

Al considerar que hay una gran proporción de AMX Disolución acuosa

respecto a la original en las disoluciones 3 en ambos 4 4
(mL) 4
pH, se podría determinar LogP, el cual es menor para
el pH 7.4. Al tomar en cuenta la naturaleza ionizable
Octanol (mL) 3 3 3
del compuesto, en donde, según los valores de pKa de
los hidrógenos de la AMX mostrados en la figura 3, en
donde, se observa que la diferencia radica en la carga Cinicial en agua
0,0069 0,0158 0,0254
positiva del grupo amino (pKa=6.71) a pH 5.0 respecto (mol/L)
al amino cuando se encuentra a pH 7.4, el que se
encuentra con una carga neta igual a cero, en este Abs 1 0,128 0,294 0,472
último caso podemos corregir el valor de P como se
explica en la ecuación 3 y determinando el grado de Abs 2 0,150 0,301 0,448
ionización (α) para esta especie, adquiriendo un P
corregido igual a 0.0539, el que, al aplicar el Cfinal en agua (mol/L) 0,0081 0,0162 0,0241
logaritmo, nos genera un valor de LogP igual a
-1.2681, menor para el caso de pH de 5.0, por lo que
se puede suponer que la variación de pH afecta Tabla 3. Curva de calibrado para determinación de
directamente en cómo se distribuye la amoxicilina Amoxicilina a 400 nm
entre agua y n-octanol, ya que altera de forma Disolución
Concentración
significativa la protonación o desprotonación de la Disolución madre Absorbancia
inicial (mol/L)
especie, en estos casos se prefiere utilizar D, ya que (mL)
toma en consideración este equilibrio. 1 10 0,117 0,066
2 20 0,243 0,0132
Además, al comparar el LogP corregido que se obtuvo,
igual a -1.2681, con la literatura, que corresponde a un 3 30 0,375 0,0198
valor de 0.87 [Sangster, 1989], hay una gran variación 4 40 0,491 0,0264
entre estos dos valores, teniendo el registrado en la 5 50 0,618 0,0330
literatura un mayor grado de lipofilia que el obtenido
en esta experiencia, por lo tanto, respecto a la 6 60 0,744 0,0396
velocidad para poder atravesar membranas biológicas, 7 70 0,846 0,0462
el determinado experimentalmente no tiene una gran
capacidad para realizar este proceso, situación
contraria a lo que sucede para el caso del registrado en
la literatura
 Tabla 4. Determinación de P y de LogP para
amoxicilina a pH 7.4 y 5.0 respectivamente
pH=7.4
Ci (M) Cf (M) P LogP
0.0101 0.0110 -0.0964 -
0.0218 0.0253 -0.1631 -
0.0349 0.0333 0.0448 -1.3490
pH=5.0
Ci (M) Cf (M) P LogP
0.0069 0.0081 -0.1723 - Figura 3. Molécula de amoxicilina con valores de
0.0158 0.0162 -0.0238 - pKa sobre hidrógenos ácidos y porción β-lactámica
0.0254 0.0241 0.0509 -1.2935 en rojo (modificado de Babić et al., 2007).
Ci es la concentración (M) inicial de amoxicilina
en 4 mL de la disolución acuosa. Cf es la 3.2 Abreviaturas y Acrónimos
concentración (M) de amoxicilina en 4 mL de la
disolución acuosa luego de que el compuesto AMX: Amoxicilina
fuera distribuido en 3 mL de n-octanol. P es el
coeficiente de partición (ec. 2). LogP es el
logaritmo en base 10 del coeficiente de partición
P.

Figura 1. Curva de calibrado para amoxicilina a

400 nm en donde, mediante regresión líneal se
obtuvo una recta
Absorbancia=18.57[Amoxicilina]-0.0002857
Con un R2=0.9992.

Figura 2. Hidrólisis ácida del anillo β-lactámico

(modificado de Frau et al., 1997).

4
APENDICE
a. Deducción del grado de ionización de ácidos
y bases (modificado de Delgado et al., 2004).

4 Conclusión [5] Bhattacharyya P., Winifred M., “Amoxicillin,”

in Analytical profiles of drug substances. Vol. 7
A través de esta experiencia se pudo determinar la
(K. Florey, ed.), pp. 20–41, Academic Press, Inc.,
relación de hidrofilia y lipofilia de la AMX, siendo
1978.
ésta determinada mediante el parámetro físicoquímico
P, el que genera resultados coherentes para dos [6] Delgado A, Minguillón C, Joglar J. Introducción
disoluciones de AMX, obteniendo un valor de 0.0448 a la química terapéutica. 2nd ed. Ed. Diaz de
a un pH igual 7.4 el cual es corregido según el grado Santos. 2004. España. Pp 13-29.
de ionización, obteniendo un valor de 0.0539 y una
[7] Frau J, Coll M, Donoso J, Muñoz F, Vilanova B,
concentración inicial de AMX igual a 0.0349 M y un
García-Blanco F., Alkaline and acidic hydrolysis
valor de 0.0509 a un pH igual a 5.0 con una
of the β‐lactam ring. Electronic Journal Of
concentración inicial de AMX igual a 0.0254 M.
Theoretical Chemistry, Vol. 2, 56–65 (1997)
Además se pudo determinar el valor de LogP para
[8] Valvo L, Alimonti S, Alimenti R, De Sena C,
estas dos disoluciones. Aunque el valor es similar, se
Signoretti EC, Draisci R, Giannetti L.
observan leves diferencias que indicarían la velocidad
Investigation of a new amoxicillin sodium
respecto a cada pH, siendo la amoxicilina que se
impurity unstable in solution. J Pharm Biomed
encuentra en un pH de 7.4 la que tendría más
Anal. 1997 Jan;15(4):487-93.
características lipofílicas, por lo tanto una velocidad
mayor para atravesar membranas biológicas [9] L. Valvo, L. Manna, R. Alimenti, S. Alimonti, P.
Bertocchi, E. Ciranni. Amoxicillin sodium–
Referencias
potassium clavulanate: evaluation of gamma
[1] Sangster, J. Octanol-Water Partition Coefficients radiation induced effects by liquid
of Simple Organic Compounds (1989). Journal chromatography on both the individual drugs and
of Physical and Chemical Reference Data their combination. Journal of Pharmaceutical and
18(3):1111-1229 Biomedical Analysis 21 (1999) 9–14.
[3] Xu, Q., Trissel, L. Stability-indicating Hplc
Methods for Drug Analysis. First ed, London,
Pharmaceutical Press, 1999.
[4] Babić S, Horvat A, Mutavdžić D, Kaśtelan-
Macan M. Determination of pKa values of active
pharmaceutical ingredients (2007) Trends in
Analytical Chemistry. 1043-1061.