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TECNICAS O HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DE DNA, RNA Y PROTEINAS

1. SECUENCIACIÓN DEL ADN

La secuenciación del ADN consiste en dilucidar el orden de los nucleótidos de un polímero de ADN de
cualquier longitud, si bien suele dirigirse hacia la determinación de genomas completos, debido a que las
técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia
para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Una vez que ha sido
clonado un fragmento de ADN es necesario determinar su secuencia para conocer los genes que contiene y
la secuencia exacta de las proteínas que codifica, así como los elementos reguladores que funciona en cis.

La secuenciación del ADN es una técnica que no estuvo disponible hasta 1977 cuando Sanger, por un lado,
Maxam y Gilbert, por otro, idearon dos estratégicas diferentes con esta finalidad.
La técnica de Maxam y Gilbert está basada en la degradación química del ADN, la de Sanger tiene como base
la terminación de la síntesis de una cadena de ADN por una polimerasa mediante la utilización de
nucleótidos.

2. SOUTHERN BLOT

Su nombre procede del apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.
Es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN concreta en
una mezcla compleja de este ácido nucleico.

PASOS DE SOUTHERN BLOT

-Extracción del ADN. Se extrae ADN de cualquier tejido humano, este ADN se compara con el extraído de
muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.
-Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción. El ADN extraído de la muestra se trata con una
endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia
característica.
-Electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante
electroforesis en geles de agarosa, durante esto, las moléculas de ADN con carga negativa, migran hacia el
electrodo positivo, la velocidad de migración de estas se ve reducida por el gel de agarosa.
-Preparación de un ensayo de Southern. Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se
desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina, en
la neutralización de ésta.
-Hibridación con sonda radioactiva. Una sonda de locus único hibrida con el ADN de un fragmento de
restricción concreto en el ensayo de Southern la formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del
emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en la copia.
-Detección de los RFLPs mediante autorradiografía. Mediante esta técnica la membrana de nailon se
coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz, la película
registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva.
-Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales. En un análisis legal de DNA se caracterizan
polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes luego del revelado de una autorradiografía para la
primera sonda, para luego hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente.
3. HUELLA GENETICA

Esta técnica de huella genética fue desarrollada en 1984 por el genetista británico Alec Jeffreys, después de
que ciertas secuencias de ADN muy variable conocidas como mini satélites que no contribuyen a las
funciones de los genes, se repiten dentro de los genes. Este genetista reconoció que cada individuo tiene un
patrón único de mini satélites.
Como cada persona tiene un patrón único de ADN en sus células, la huella genética es la identificación
biométrica obtenida mediante el examen de mini satélites de ADN.

Para obtener la huella genética. Se toma una muestra de ADN del individuo, por ejemplo, a partir de las
células epiteliales presentes en la saliva, el ADN es "amplificado" - copiado para aumentar la cantidad
presente mediante una técnica llamada PCR (reacción en cadena de la polimerasa), luego el ADN
amplificado se corta en pequeños fragmentos usando enzimas que descomponen el ADN en secuencias de
código específicas, la mezcla resultante de secciones de ADN más cortos se separan mediante un proceso
llamado electroforesis en gel, se adhieren moléculas radiactivas a algunas regiones de ADN que a menudo se
repiten en diferentes grados en diferentes personas, finalmente una película fotográfica se deja en contacto
con el gel de electroforesis, las moléculas radiactivas impresionan la película y cómo resultado se obtiene un
patrón de bandas de ADN que es único para cada persona y que representa su huella genética.

4. WESTERN BLOT

Es una técnica analítica usada para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, tal
como la que se presenta en extractos celulares o de tejidos.

Se obtiene una muestra de tejido fresco, la cual se introduce en nitrógeno líquido para su rápida
congelación, de esta manera se evita la degradación de las proteínas. Seguidamente se añade un buffer que
contiene beta-mercaptoetanol, que impide que las proteínas se degraden, luego la muestra se homogeniza,
y se deshace mecánicamente para romper las membranas celulares y para solubilizar las proteínas en el
buffer.

Extraídas las proteínas se carga la muestra en un gel vertical de poliacrilamida, la corriente eléctrica hace
que las proteínas contenidas en la muestra migren a través del gel de poliacrilamida a una velocidad
diferente dependiendo de su peso molecular y su potencial eléctrico de esta manera se obtiene una
columna con las proteínas separadas por peso molecular.
Luego de esto se transfieren las proteínas a una membrana porosa estéril esta parte es la conocida como
“blot”. También mediante el paso de electricidad se hace mover, esta vez horizontalmente, las proteínas
desde el gel de poliacrilamida a la membrana.
Finalmente si la proteína que se quiere aislar es conocida se realiza una inmunodetección. Seguidamente
se revela la membrana con soluciones fotográficas y se expone la película fotográfica en oscuridad. Si todo
ha salido bien se obtiene una banda exclusivamente a la altura del tamaño esperado de nuestra proteína.

5. LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Es una técnica en biología molecular cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento
de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento
original, o molde. Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores, ADN
molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los ingredientes se colocan en un tubo, junto con los
cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que
permiten la síntesis del ADN.
Los pasos básicos son:
La reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los
moldes de cadena sencilla para el siguiente paso, luego la reacción se enfría para que los cebadores puedan
unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla y finalmente la
temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas
cadenas de ADN.

6. MUTAGÉNESIS DIRIGIDA O DE SITIO DIRIGIDO

La mutagénesis de sitio dirigido, también llamada mutagénesis dirigida, es una técnica de biología
molecular utilizada para crear mutaciones puntuales en una cadena de ADN. Se requiere sintetizar un
fragmento corto de ADN, el cebador, que contenga la mutación. El cebador debe hibridar con la molécula
simple (unicatenaria) de ADN que contiene el gen de interés. Utilizando una ADN polimerasa, se elonga la
cadena (el fragmento unicatenario más el cebador) incorporando la mutación al ADN y formando una
molécula de ADN completa bicatenaria. Dicha doble cadena de ADN puede ser introducida en
una célula hospedadora y clonada. Tras esto, se escogen los mutantes.

La mutagénesis dirigida es una potente técnica con la que se puede realizar diagnósticos claros y seguros de
una manera muy económica. Con esta técnica, es posible detectar mutaciones específicas o repeticiones de
nucleótidos. Generalmente, el diagnóstico de algunas enfermedades poco frecuentes, como las del MERRF y
la fibrosis quística, se lleva a cabo en los laboratorios mediante el uso de esta técnica.

7. HIBRIDACION IN SITU CROMOGENICA (CISH)

Es una técnica en la que una hebra de ADN o ARN complementaria se usa para localizar un ADN o ARN
específico en una muestra de tejido, esta técnica tiene alta especificidad pero es poco sensible, por ello se
pueden obtener falsos negativos.

El CISH ofrece:

-Evaluación del estatus del gen a la misma vez que se evalúa la morfología del tejido.
-Resultados cuantitativos.
-Uso sencillo con microscopia.

La metodología puede ser utilizada para evaluar amplificación de genes, deleción de genes, translocaciones
cromosómicas y número de cromosomas esta es muy parecida a la técnica FISH, concuerda 86%-96% con el
FISH, pero en este caso se usa una sonda de color visible y no fluorescente, como es el caso del FISH. Por eso
tiene la ventaja de ser más barata, ya que sólo requiere un microscopio de campo claro y no necesita
fluorescencia.

8. RT-PCR

La PCR de transcripción inversa o RT-PCR, permite el uso de RNA como molde. Un paso adicional permite la
detección y amplificación del RNA. El RNA se transcribe de forma inversa en DNA complementario (cDNA)
utilizando una transcriptasa inversa. La calidad y pureza del RNA molde es esencial para el éxito de la RT-
PCR. El primer paso de la RT-PCR es la síntesis de un híbrido DNA / RNA., la transcriptasa inversa tiene una
función RNasa H, que degrada la porción de RNA del híbrido, luego la molécula de DNA de cadena sencilla
restante sirve entonces como molde para la formación de cDNA, mediante la actividad DNA polimerasa
dependiente de DNA, de la transcriptasa inversa. Teniendo en cuenta que la eficiencia de la reacción de la
primera cadena puede afectar al proceso de amplificación.
A partir de este proceso, se utiliza el procedimiento de PCR convencional para amplificar el cDNA. La
posibilidad de revertir el RNA en cDNA por RT-PCR tiene muchas ventajas. El RNA es monocatenario y muy
inestable, lo que dificulta el trabajo con este material. Más comúnmente, sirve como un primer paso en
qPCR, que cuantifica la cantidad de RNA que ha sido transcrito en una muestra biológica.

9. QPCR

La PCR cuantitativa o PCR en tiempo real es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación
de ácido desoxirribonucleico (ADN). Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional (punto
final), un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de
reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia
marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras
excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más
productos específicos, dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que
también se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultánea).

La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz
de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por
el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar
rápidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos
nucleicos y las enzimáticas del ADN polimerasa.

10. ELECTROFORESIS

La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la
finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa, este
fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los
años cincuenta.

La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un electrolito. Sus
extremos se sumergen en dos depósitos independientes que contienen ambos al electrolito y están unidos a
los electrodos del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeño trazo transversal
en la tira. La distancia de migración se mide en relación un marcador interno. Las placas son reveladas con
sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular. Por lo general, para caracterizar la molécula se
determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo eléctrico y se utiliza para determinar, en el caso
de proteínas, la masa molecular o para detectar cambios de aminoácidos y separar cuantitativamente
distintas especies moleculares; en el caso de ácidos nucleicos se determina su tamaño, medido en pares de
bases.

11. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

La electroforesis bidimensional es una técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas
de proteínas altamente complejas. La base de su elevado poder de resolución está precisamente en la
bidimensionalidad, es decir, en que las proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos. En
primer lugar las proteínas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de
acuerdo con su punto isoeléctrico (isoelectroenfoque). Tras esta separación por carga las proteínas son
separadas de acuerdo con su masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en
presencia de SDS (SDS-PAGE). Tras la tinción del gel las proteínas aparecen formando manchas circulares
(spots). El proceso comienza con electroforesis en una dimensión, luego separa las moléculas en una
dirección de 90 grados de la primera. En la electroforesis "1D", las proteínas se separan en una dimensión,
de manera que todas las moléculas se encuentren a lo largo de un carril. Debido a que es poco probable que
dos moléculas sean similares en dos propiedades distintas, éstas se separan más eficazmente con
electroforesis en 2-D que en la electroforesis en 1-D.

12. ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY O ENSAYO POR INMUNOABSORCIÓN LIGADO


A ENZIMAS).

Se trata de una técnica de laboratorio que permite detectar pequeñas partículas llamadas antígenos, que
habitualmente son fragmentos de proteínas. La identificación es específica, es decir, consigue que pequeños
segmentos de proteínas destaquen y no puedan ser confundidas con otras.

Para poder identificar los antígenos se utilizan moléculas con dos componentes acoplados: un anticuerpo (que
se une al antígeno de forma específica) y una enzima (que se activa y señala la unión al antígeno). Antes del
descubrimiento del ELISA se utilizaban moléculas radioactivas en vez de enzimas, lo que suponía un riesgo
añadido innecesario en el laboratorio y un mayor coste.
Gracias a esta técnica se han podido realizar estudios científicos en campos como la biología, la bioquímica y
la medicina. En el hospital se utiliza principalmente para identificar gérmenes agresores que se encuentran en
la sangre, orina, esputos, etcétera. La técnica pronto se generalizó con el empleo de equipos simples y muy
baratos que se utilizan todavía hoy en muchos centros diagnósticos de todo el mundo.

13. ELECTROFORESIS SDS-PAGE

En este tipo de electroforesis utilizamos dodecil sulfato de sodio (SDS), que es un detergente usado en muchas
preparaciones bioquímicas dado que se une con firmeza a las proteínas y las hace asumir una estructura
desordenada de manera de obtener una eficiente desnaturalización.
La electroforesis de proteínas en un gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) separa a las macromoléculas
en el orden de sus masas moleculares por los efectos de filtración por geles. Este tipo de electroforesis es una
variante de la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) donde los geles se forman por polimerización de
la acrilamida y la N, N’-metilen bisacrilamida inducida por radicales libres en un buffer. La carga otorgada por
el SDS enmascara a las cargas proteicas intrínsecas de forma que las proteínas tratadas con SDS tienden a
presentar relaciones carga/masa casi idénticas y formas similares (desplegadas). Es por esto que la separación
ocurre por efecto de filtración de geles en función del MW (separación por tamaño o largo de la cadena
polipeptídica).

14. NORTHERN O NORTHERN BLOT

Es una variante del método anterior, el procedimiento que se sigue es similar al Southern en el lugar de
utilizar ADN como sustrato de estudio, se emplea ARN. Se utiliza para identificar las cadenas de ARN de
secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para
identificar ADN, el método Northern sirve para identificar ARN. El ARN se extrae y se fracciona en tamaños
variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las
cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo
Southern.
El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica. Esta
técnica se ha aplicado en estudios de la modulación de la síntesis de interleucina 6 en pacientes con artritis
reumatoide, en el análisis de expresión de receptores que participan en la síntesis de moléculas en cultivos
celulares, en análisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de enzimas, y en la regulación de la expresión
génica de marcadores moleculares de células leucémicas humanas y moléculas del reconocimiento
inmunológico.
15. HIBRIDACIÓN IN SITU (HIS)

Es un método histoquímico que emplea a la biología molecular de la misma manera que la


inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. La especificidad de la hibridación in situ (HIS) se
basa en la unión recíproca de una secuencia de oligonucleótidos (la sonda), con una secuencia
complementaria de nucleótidos presente en las moléculas de ARN o ADN dentro del tejido.

Permite la detección de genes o expresión de genes dentro del contexto morfológico de la célula o tejido.
Para conseguirlo se requiere que el ácido nucleico sea liberado de su entorno celular para tener acceso la
sonda, pero preservando la morfología para la consiguiente interpretación y análisis. Para ello se emplean
fijadores especialmente de entrecruzamiento, como la formalina, paraformaldehido, glutaraldehido. Entre
las principales aplicaciones de la HIS tenemos la detección de ARN o ADN de origen viral, el análisis de la
expresión génica (detección de ARNm) y los análisis cromosómicos.

Entre las ventajas de esta técnica están su alto grado de resolución espacial que permite la localización de
secuencias génicas a escala cromosómica, con lo que se pueden detectar translocaciones y otras
alteraciones, así como también el estudio de expresión génica a escala celular y subcelular.

16. SONDAS DE PNA (PEPTIDE NUCLEIC ACID)

Fueron inventadas en 1990 por un grupo de científicos daneses, Son una nueva clase de sondas híbridas
entre ácido nucleico y proteínas, diseñadas para la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos.
Su estructura está formada por una cadena de aminoácidos que forman el esqueleto principal, y a los cuales
se les unen las bases nitrogenadas, siguiendo los parámetros conformacionales descritos por Watson y Crick.
Las bases (A, T, C, G) están colocadas a la misma distancia que en el DNA.

Esta estructura hibrida le confiere una serie de características especiales:

 Son moléculas de simple cadena


 No están cargadas siendo el esqueleto principal flexible.
 Sus hibridaciones son rápidas, específicas y sensibles.
 Presentan una especificidad y sensibilidad más elevada que los oligomeros DNA/RNA
 Hibrida bajo condiciones donde el DNA no puede.
 Enlaces más fuertes
 Moléculas muy estables y no son degradadas por proteasas ni nucleasas.

17. MAPAS DE RESTRICCIÓN

Esta técnica se basa en el principio de la enzimología de restricción donde de una molécula de ADN dada se
obtendrán siempre los mismos fragmentos cada vez que sea expuesta a una enzima de restricción
particular. La complejidad del mapa depende del tamaño de la molécula (a mayor número de bases será
mayor el número de sitios de restricción) y del número de enzimas utilizadas. De esta forma, dos moléculas
de ADN del mismo tamaño pueden ser fácilmente diferenciadas por los mapas de restricción que producen
al tratarlas con las mismas enzimas.

Este principio lo utiliza el procedimiento denominado (RFLP), pero aprovechando el hecho de la existencia
de variaciones en la constitución genética de la población (polimorfismo genético), que hace que se
observen diferencias entre los individuos en cuanto al número y longitud de los fragmentos producidos. La
existencia de los RFLPs es la base de la técnica que se ha denominado huellas digitales del ADN y que
permite establecer inequívocamente la relación padres e hijos, entre otras aplicaciones.
18. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

La hibridación o renaturalización de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos
cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una única molécula
de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el
interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260
nm), la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya
que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energía, están
totalmente expuestos a la fuente emisora de energía.

Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales:

A=T; A=U; C≡G; G≡C; T=A o U=A

El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que contiene a la molécula.
El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización
ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de
hidrógeno; por tanto, y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos,
dicha energía se traduce en una mayor temperatura. El %GC no es igual para todas las especies, es más, el
%GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los
protocolos de extracción de ADN.

19. HIBRIDACIÓN DE ADN O RAMIFICADO (BRANCHED DNA)

La metodología de hibridación con ADN ramificado o branched DNA (bDNA) se basa en hibridaciones
consecutivas de sondas que reconocen por una parte la secuencia de ADN o ARN en estudio y por otra,
secuencias introducidas a la reacción para amplificar la señal de hibridación. En este método la visualización
del ADN blanco no depende de un proceso enzimático, como en la reacción de polimerasa en cadena, sino
de la amplificación de la señal de hibridación. Esta metodología es altamente reproducible y se utiliza
clínicamente en la cuantificación de carga génica en pacientes portadores del VIH, VHB y VHC.

20. HIBRIDACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS

Es un método empleado para identificar colonias bacterianas que contengan determinada secuencia de
ácidos nucleicos de interés. La metodología consiste en sembrar los clones sobre placas de Petri con agar
para después de crecidos transferirlos a membranas de nylon o nitrocelulosa y luego realizar la hibridación.

Para realizar este método. Se parte de una mezcla de bacterias recombinantes que portan distintos
fragmentos de DNA exógeno, entre ellos el fragmento que interesa localizar y un marcador que confiere
resistencia a un antibiótico determinado. Se distribuye la muestra en una placa de Petri con un medio de
cultivo sólido que contiene el antibiótico de selección. Sólo las bacterias que hayan adquirido
el plásmido recombinante crecerán formando colonias aisladas. Cada colonia se origina por divisiones
sucesivas de una única bacteria inicial y todas las células de una colonia son idénticas.

Por medio de la aplicación de un filtro de nitrocelulosa que se pone en contacto con la superficie de la placa
de Petri, bacterias de cada una de las colonias se transfieren al filtro y se forma una réplica. La réplica se
trata con una solución alcalina que rompe las células y desnaturaliza el DNA del plásmido. El DNA se une
químicamente al filtro. Se lava del filtro el exceso de solución que contiene las sondas que no han hibridado.
Las moléculas de cadena doble que se hayan formado permanecen en su lugar en el filtro y se visualizan por
medio de autorradiografía.
21. MICROARRAY O CHIP DE ADN

Un chip de ADN o microarrays es una superficie sólida a la cual se une una colección de fragmentos de ADN.
Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy variables y pueden ser de vidrio, plástico e incluso de
silicona. Los chips de ADN se usan para analizar la expresión diferencial de genes, y se monitorean de
manera simultánea los niveles de miles de ellos. Su funcionamiento consiste, básicamente, en medir el nivel
de hibridación entre la sonda específica , y la molécula diana (target), y se indican generalmente
mediante fluorescencia y a través de un análisis de imagen, lo cual indica el nivel de expresión del gen.

Suelen utilizarse para identificar genes con una expresión diferencial en condiciones distintas. Por ejemplo,
para detectar genes que producen ciertas enfermedades mediante la comparación de los niveles de
expresión entre células sanas y células que están desarrollando ciertos tipos de enfermedades.

Los chips de ADN se pueden usar para detectar ARN, que puede traducirse o no en proteínas. Los científicos
se refieren a esta clase de análisis como análisis de expresión o análisis del transcriptoma, y tiene por objeto
establecer un patrón o perfil de los genes transcritos presentes en un tipo de células determinado.

22. ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPOS PULSANTES (PFGE)

Schwartz y Cantor desarrollaron en 1984 un sistema denominado electroforesis en gel de campo pulsante
(PFGE) con el que consiguieron separar cromosomas de levadura de varios cientos de (kpb).

La PFGE consigue la separación de grandes fragmentos de DNA induciendo su reorientación mediante


cambios periódicos en el campo eléctrico, cuya duración determina el intervalo de tamaños que se pueden
separar (cuanto mayor sea el tamaño de los fragmentos a separar, mayor ha de ser la duración de los
campos aplicados).

En una Electroforesis en Gel de Campos Pulsantes (PFGE), los fragmentos se someten a varios campos
eléctricos de distinta orientación.

Al aplicarse el primero (E1) durante cierto tiempo, los fragmentos se estiran y se orientan según la dirección
de dicho campo, si luego se aplica un segundo campo (E2), perpendicular al anterior, se obliga a los
fragmentos de DNA a relajarse y elongarse y alinearse de acuerdo con este segundo campo eléctrico.
Cuanto menos tarde una molécula en reorientarse, antes migra en la dirección de E2; el tiempo que se
consume en esta reorientación depende del tamaño de los fragmentos, tardando más los mayores.

23. PIROSECUENCIACIÓN O SECUENCIACIÓN 454

Es una tecnología que permite determinar una secuencia de ADN a gran escala, aplicable a genomas
completos, mediante luminiscencia. Esta técnica es muy rápida y más barata que la secuenciación por el
método de Sanger. La pirosecuenciación se diferencia del método de Sanger en que se basa en la detección
de la liberación de pirofosfato cuando se incorporan los nucleótidos, mientras que en la segunda la
detección se da por la terminación de la cadena con didesoxinucleótidos.

- Fragmentar el ADN a secuenciar mediante un proceso conocido como nebulización.


- Mediante una emulsión de aceite se generan micro esferas, a las que se intenta que esté atado un único
fragmento de ADN.
- En cada microrreactor se encuentran los elementos necesarios para la reacción de PCR: oligonucleótidos,
dNTPs, polimerasa y un único fragmento de ADN molde.
-Mediante la amplificación por PCR, se generan muchas copias del mismo fragmento de ADN original.
- Después se liberan las cuentas de la emulsión y se colocan en placas donde se procede con la
secuenciación. Para realizar la secuenciación se vierte la emulsión sobre una fase sólida con celdillas. En
cada una de estas celdas se produce una pirosecuenciación. La secuenciación completa se lleva a cabo
añadiendo uno de los cuatro nucelótidos y observando qué celdilla se ilumina. Después de cada adición de
nucleótidos se lava y se añade el siguiente nucleótido. Este proceso se repite hasta completar la secuencia.

24. FISH O HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU

Es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la cual estos son hibridados
con sondas que emiten fluorescencia y permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas así
como de las anomalías que puedan presentar.
Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son los 13, 18, 21, X e Y, que son los más
propensos a sufrir anomalías. Están relacionados a enfermedades como el síndrome de Patau (13),
el síndrome de Edwards (18), el síndrome de Down (21), el síndrome de Turner (X) y el síndrome del
superhombre (Y), entre otros.
FISH usa segmentos de una única hebra de ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia
fluorescente que puede ligarse a un cromosoma específico; estos segmentos de ADN son llamados sondas.
En un principio se empleaban sondas de carácter radiactivo, pero este tipo de marcaje fue reemplazado por
los fluoróforos por mayor seguridad, eficacia y facilidad de detección.
El primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del DNA para separar la doble hélice. A la
muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés (fragmento de ADN marcado
fluorescentemente), las sondas hibridan a las regiones específicas para las que han sido diseñadas. Después,
se tiñen los núcleos con un color de contraste inespecífico, las sondas de DNA pueden marcarse con
moléculas fluorescentes (método directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes
(método indirecto). Por último, se visualiza la muestra preparada bajo un microscopio de fluorescencia.

25. CLONACIÓN
La clonación de genes o "clonación molecular" son un conjunto de métodos experimentales utilizados
en biología molecular que se utilizan para ensamblar moléculas de ADN y lograr su copiado dentro
de organismos receptores.
El clonado molecular por lo general utiliza secuencias de ADN de dos organismos diferentes: la especie que
es la fuente del ADN que se desea clonar, y la especie que servirá de receptor vivo para el copiado del ADN
recombinado. Los métodos de clonado molecular son herramientas muy importantes en los campos
contemporáneos de la biología y medicina moderna.
Para la realizar la clonación, el ADN que obtiene del organismo objeto del trabajo, luego se trata con
enzimas en un tubo de ensayo para producir fragmentos más pequeños de ADN. Posteriormente estos
fragmentos son combinados con el vector ADN para generar las moléculas de ADN a recombinar, ell ADN a
recombinar es luego introducido en un organismo receptor (generalmente una cepa fácil de cultivar
producto de laboratorio, benigna, de la bacteria E. coli bacteria). De esta forma se generara una población
de organismos en los cuales el ADN a recombinar es copiado junto con el ADN del receptor. Debido a que
contienen fragmentos extraños de ADN estos son microorganismos transgénicos o modificados
genéticamente (OGM). Este proceso se ve favorecido por el hecho que se puede inducir a una célula de
bacteria única a incorporar y copiar una única molécula de ADN recombinante. Se puede expandir esta
célula única de manera exponencial para generar una gran cantidad de bacterias, cada una de las cuales
contiene copias de la molécula recombinante original. Por lo tanto la población de bacterias que se
producen, y la molécula de ADN recombinante, son denominadas "clones". En forma estricta el, ADN
recombinante son la moléculas de ADN, mientras que el clonado molecular son los métodos experimentales
utilizados para ensamblarlos.
26. CITOMETRIA DE FLUJO
La Citometría de flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en
hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de
un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a
diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas
señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea
de varios parámetros en una misma célula.
En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden estar vivas o fijadas,
pero obligadamente en suspensión celular y en forma de célula única. Al obligarlas a pasar alineadas una a
una frente a un haz láser mediante un flujo continuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, emite luz
fluorescente como consecuencia de la excitación láser a la que es sometida. Los parámetros que típicamente
se miden de forma simultánea por cada célula son:

1. Dispersión frontal de la luz a 2º (forward scatter), valor proporcional al tamaño celular.


2. Dispersión de la luz ortogonal (side scatter), proporcional a la cantidad de estructuras granulares o
complejidad de la célula.
3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.

27. POLIMORFISMOS EN LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS (AFLP)

Los polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados, (AFLP/Amplified Fragment Length


Polymorphism), pertenecen al grupo de marcadores moleculares multi-locus que permiten analizar al azar
regiones de ADN distribuidas en todo el genoma sin tener conocimiento previo de éste.
Los AFLP consisten en la digestión completa del ADN genómico total con enzimas de restricción, seguida de
la amplificación selectiva de los fragmentos obtenidos para detectar polimorfismos debidos a mutaciones en
la secuencia de ADN en, o cerca de, los sitios de restricción. Los polimorfismos se detectan por electroforesis
como un patrón de fragmentos de ADN amplificados (bandas) que difieren en número y tamaño, este patrón
es altamente específico y debido a las restricciones de la técnica es altamente reproducible.
El desarrollo de la técnica combina tres pasos principales:
1) La digestión del ADN genómico total con dos enzimas de restricción, una de corte raro y una de corte
frecuente.
2) La unión de secuencias específicas (adaptadores) a los bordes de los fragmentos generados por la
restricción, se generan extremos con una secuencia conocida que permitirá que el fragmento sea
amplificado mediante PCR.
3) Dos reacciones de PCR, la primera, conocida como amplificación preselectiva, se lleva a cabo con
iniciadores que corresponden a la secuencia específica del adaptador que se unió a los bordes digeridos más
un nucleótido extra (A, G, C, o T) en el extremo 3’.

28. STR
Los Short Tándem Repeats (STR) son los marcadores genéticos más clásicos y comúnmente utilizados.
Consisten en fragmentos relativamente cortos (entre 2 y 6 nucleótidos) de la secuencia genética que se
repiten un número variable de veces, una a continuación de la otra, siendo ese número el elemento
diferenciador entre alelos. La secuencia de las regiones flanqueantes a ambos lados es iguales en todos los
sujetos.
Un mismo STR puede tener varias formas alternativas (alelos) por ejemplo de, 2, 4, 7, 9, 12 y 17 repeticiones
de la misma secuencia básica. Se transmiten tanto por vía materna como paterna de manera que cada
individuo recibe un alelo tanto de su padre como de su madre biológica.
Así por ejemplo una persona, si es heterocigota, puede tener un alelo de 7 repeticiones y otro de 12. Existen
muchos STR descritos, localizados en regiones del genoma perfectamente identificadas, en todos los
cromosomas humanos. No todos ellos son igualmente útiles para los análisis genéticos.

29. Polimorfismos de nucleótido único (SNP)

Los polimorfismos de nucleótido único (“Single Nucleotide Polymorphisms”, SNP) son la forma más sencilla
de polimorfismo genético ya que consisten en el cambio de un sólo nucleótido en el contexto de una
secuencia genética. Se distribuyen de manera heterogénea por todo el genoma y se encuentran tanto en las
regiones codificantes (exones) como no codificantes (intrones y región promotora) de los genes así como en
las zonas del genoma en donde no asientan genes conocidos (a veces llamado “ADN basura”).

Este tipo de polimorfismo tiene una gran importancia biológica, ya que determinan la mayor parte de la
variabilidad genética de los individuos, causando muchas de las diferencias fenotípicas (observables) de los
mismos. Se cree que se trata de mutaciones puntuales acaecidas en diferentes momentos de la historia
evolutiva de la especie y que en su momento fueron estabilizadas en el genoma humano por conferir algún
tipo de ventaja adaptativa al medio en ese momento (por ejemplo, mayor capacidad metabólica o de
detoxificación al ingerir un nuevo tipo de alimento) o por no conferir ninguna desventaja.

30. SSCP

El Polimorfismo de Conformación de Cadena Simple o SSCP (Single Stranded


Conformational Polymorphism) es una técnica de rastreo de mutaciones basada en el distinto
comportamiento electroforético que presentan las moléculas monocatenarias de ADN según
su secuencia en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Al ser una técnica de rastreo o
barrido es útil para determinar de forma rápida la presencia de mutación, pero no aporta
información acerca de la mutación concreta que presenta el ADN.
Los fragmentos de ADN a analizar por esta técnica deben tener una tamaño medio de unas
400 pares de bases, de manera que el primer paso es amplificar por PCR la región del gen de
interés que queremos estudiar. A continuación, el producto de la PCR
se desnaturaliza calentándolo a 94ºC y se enfría rápidamente en hielo. El cambio de
temperatura debe ser brusco para que las moléculas de cadena simple no vuelvan a hibridar
entre sí, sino consigo mismas. Un cambio de una sola base en la secuencia puede hacer que
cambie la conformación. Finalmente, los fragmentos reasociados se someten a electroforesis
no desnaturalizante en gel de acrilamida, pudiéndose detectar tanto en geles de poliacrilamida
como mediante electroforesis capilar con control de la temperatura. Para la visualización no se
puede emplear bromuro de etidio, ya que es un agente intercalante. Por ello, se suele teñir el
gel con tinción de plata.
Hoy en día, la técnica SSCP es más usada como método de diagnóstico en Biología
Molecular, ya que puede ser utilizada para genotipar. Es decir, permite detectar determinados
alelos tanto en homocigosis como en heterocigosis, gracias a que cada alelo, debido a su
diferencia en la secuencia genética, migrará con distinta movilidad durante la electroforesis.
Esto implica una notable utilidad en el diagnóstico de ciertas enfermedades genéticas.
31. POLIMORFISMO DE LONGITUD DE FRAGMENTO DE RESTRICCIÓN (RFLP)

El polimorfismo de longitud de fragmento de Restricción (RFLP) es una técnica inventada


en 1984 por el científico Inglés Alec Jeffreys durante la investigación en enfermedades
hereditarias. Se utiliza para el análisis de modelos únicos en la DNA hace fragmentos
para genético distinguir entre los organismos estos modelos son llamados (Variable
Number de las Repeticiones En Tándem, VNTRs).
El polimorfismo Genético se define como las diferencias genéticas heredadas entre
individuos hacia adentro sobre el 1% de población normal. La técnica del PTFR explota
estas diferencias en series de la DNA para reconocer y para estudiar la variación
intraspecies e interspecies.

Extracción de la DNA

Para comenzar con, la DNA se extrae de sangre, de saliva o de otras muestras y


se purifica.

Fragmentación de la DNA

La DNA purificada se digiere usando los endonucleases de la restricción. Los


sitios de reconocimiento de estas enzimas son generalmente 4 a 6 pares bajos de
largo. Cuanto más corta es la serie reconocida, mayor es el número de fragmentos
generados de la digestión.

Por ejemplo, si hay una serie corta de GAGC que ocurra en varias ocasiones en
una muestra de la DNA. El endonuclease de la restricción que reconoce la serie
de GAGC corta la DNA en cada repetición del modelo de GAGC.

Si una muestra relanza la serie de GAGC 4 veces mientras que otra muestra la
relanza 2 veces, la longitud de los fragmentos generados por la enzima para las
dos muestras será diferente.

Electroforesis del Gel

Los fragmentos de la restricción producidos durante la fragmentación de la DNA


se analizan usando electroforesis del gel.
Los fragmentos están negativo - cargado y se pueden separar fácilmente por la
electroforesis, que separa las moléculas basadas en su talla y carga. Las
muestras hechas fragmentos de la DNA se colocan en el compartimiento que
contiene el gel electroforético y dos electrodos.

Cuando un campo eléctrico es aplicado, los fragmentos emigran hacia el electrodo


positivo. Fragmentos Más Pequeños se mueven más rápidamente a través del gel
que sale los más grandes detrás y las muestras de la DNA se separan así en
bandas distintas en el gel.

Visualización de Bandas El gel se trata con los tintes luminiscentes para hacer
las bandas de la DNA visibles.