ANEXO A

CRITERIOS PARA LA ACREDITACIÓN DE LABORATORIOS QUE REALIZAN

ANALISIS MICROBIOLÓGICOS

Introducción

El presente anexo es una guía auxiliar, para los laboratorios y los evaluadores, de
requisitos específicos que deben garantizarse al realizar ensayos microbiológicos y
puede ser aplicable a laboratorios que obtienen resultados como parte de un servicio o
de actividades de investigación y desarrollo.

Se considera que los ensayos microbiológicos incluyen ensayos de esterilidad, límite

microbiano, detección, aislamiento, recuento e identificación de microorganismos y sus
metabolitos en diferentes materiales y productos o cualquier otro tipo de ensayo en el
que utilicen microorganismos como parte de un sistema de detección. Este documento
puede también servir de guía para los laboratorios que utilizan técnicas en áreas
relacionadas con la microbiología, como bioquímica, biología molecular y cultivos
celulares.

Para una mejor aplicación de los criterios definidos en este anexo, los mismos se han
asociado a un apartado general de la norma de referencia NC-ISO/IE 17025:2006, sin que
los subapartados estén en concordancia exacta con los de la referida norma.

5.3-Instalaciones y condiciones ambientales

5.3.1-Instalaciones

5.3.1.1-Es recomendable que los laboratorios dispongan de dos tipos de dependencias:

a) áreas auxiliares (oficinas de administración, aseos, guardarropas, almacenes,

archivos, etc.)
b) áreas de ensayo y otras (preparación de material, esterilización, etc) donde se
llevan a cabo las actividades específicas de un laboratorio de microbiología. Los
requerimientos recomendados en esta guía están dirigidos para estas últimas.

5.3.1.2-La ubicación, el diseño y la distribución de las diferentes dependencias del

laboratorio debe ser tal que el peligro de contaminación de las muestras, ya sea
derivado de las condiciones ambientales, contaminación cruzada u otras causas,
sea mínimo. Se debe favorecer un diseño "sin camino de regreso", es decir que la
circulación de las muestras y el personal sea en una sola dirección, con entrada y
salida diferentes. Cuando esto no sea posible, deben tomarse medidas
alternativas, como las siguientes:
a) realizar los procedimientos de manera secuencial, tomando las debidas
precauciones para garantizar la integridad de los ensayos y de las muestras;
b) separación de actividades en el tiempo o en el espacio.

5.3.1.3-En general, es conveniente que existan áreas separadas o claramente

designadas para las siguientes actividades:
- recepción y almacenamiento de muestras.
- preparación de muestras.
- mantenimiento de las cepas de referencias
 - áreas analíticas diferenciadas de las áreas de apoyo.
- áreas de apoyo (preparación de medios de cultivo y reactivos, esterilización y
descontaminación, almacenamiento, lavado de material, etc.).

5.3.1.4-El área de lavado (después de la descontaminación) puede compartirse con otras

partes del laboratorio, siempre que se tomen las debidas precauciones para evitar
la transferencia de trazas de substancias que podrían afectar negativamente al
crecimiento microbiano. La conveniencia de la separación física debe juzgarse
considerando los parámetros específicos del laboratorio (por ejemplo, número de
ensayos realizados, tipo de ensayos, etc.).

5.3.1.5-Con el objetivo de reducir el riesgo de contaminación y facilitar las labores de

limpieza y desinfección, se recomiendan a continuación y a título de ejemplo, una
serie de medidas. Estas no son exhaustivas y no todas ellas podrán aplicarse en
todas las situaciones.

a) referentes al diseño:
- las áreas de trabajo deben ser suficientemente espaciosas como para poder
mantenerse limpias y ordenadas. El espacio requerido dependerá del volumen
de análisis realizados y de la organización interna del laboratorio;
- uniones cóncavas entre suelo, paredes y techos;
- iluminación empotrada en los techos;
- las áreas de trabajo deben estar debidamente ventiladas, lo que puede
conseguirse mediante ventilación natural o forzada, o mediante el uso de
unidades de aire acondicionado, equipadas con filtros para el polvo en la
entrada de aire;
- disponer de suficiente espacio para almacenamiento;
- las tuberías que transportan líquidos no deben pasar por encima de las
superficies de trabajo, a no ser que estén provistas de un revestimiento
herméticamente sellado;
- no se recomienda el empleo de persianas internas en las ventanas. Si esto
fuera inevitable, deben estar incluidas en el programa regular de limpieza del
laboratorio;
- utilización de pantallas solares exteriores.

b) referentes a materiales:
- las paredes, techos, suelos y superficies de trabajo deben ser lisas, de material
no absorbente y fácil de limpiar y desinfectar;
- las superficies de madera de instalaciones y accesorios deben estar
debidamente protegidas y selladas. Evitar las maderas rugosas y sin revestir;
- no se recomiendan los azulejos como material de recubrimiento de las
superficies de trabajo.

c) otras:
- minimizar la apertura de puertas y ventanas durante la realización de los
ensayos;
- los armarios, estanterías, equipos y material de laboratorio deben estar
colocados de forma que se evite la acumulación de polvo y se facilite su
limpieza. Se recomienda el uso de armarios hasta el techo;
- para facilitar las labores de limpieza, los teléfonos y ordenadores que se
encuentren dentro del área de ensayo pueden estar provistos de un protector.
 El sistema de ventilación de los equipos informáticos debe estar orientado de
manera que se evite la contaminación. Por ejemplo, el flujo de aire no debe
dirigirse hacia las superficies de trabajo;
- utilizar lavamanos de accionamiento no manual;
- ausencia de mobiliario, documentos y objetos que no sean los estrictamente
necesarios para la realización de los ensayos. No debe haber plantas y objetos
personales innecesarios en las áreas de trabajo.

5.3.1.6-Cuando el trabajo en condiciones estériles sea limitado o tenga lugar sólo

ocasionalmente, puede ser suficiente con utilizar una superficie de trabajo limpia,
siempre que se apliquen técnicas asépticas rigurosas.

5.3.1.7-Deberá establecerse un programa documentado de limpieza y desinfección del

laboratorio, los equipos y las superficies, que tenga en cuenta los resultados de la
vigilancia de las condiciones ambientales y la posibilidad de contaminación
cruzada.

5.3.1.8-Dependiendo del tipo de ensayos que se realicen, el acceso al laboratorio de

microbiología debe restringirse al personal autorizado. Cuando existan este tipo
de restricciones, el personal deberá conocer:

a) el uso restringido de una determinada área;

b) las restricciones impuestas al trabajo que puede realizarse en dichas áreas;
c) las razones para imponer esas restricciones.

5.3.1.9-En el laboratorio de microbiología, debe utilizarse la indumentaria apropiada para

el tipo de ensayos que se realicen. El personal debe despojarse de esta
indumentaria antes de abandonar el área.

5.3.1.10-El personal debe estar capacitado para trabajar en este tipo de áreas evitando
la contaminación hacia el interior y hacia el exterior.

5.3.1.11-El laboratorio para realizar sus ensayos microbiológicos, debe poseer el

correspondiente autorizo del Centro Nacional de Seguridad Biológica.

5.3.2-Condiciones ambientales

5.3.2.1-Si el laboratorio detecta una posible contaminación debe definir los recuentos
máximos de microorganismos que considere aceptables y establecer medidas a
tomar para corregir las situaciones en que se sobrepasen estos límites. Estas
medidas incluyen, por ejemplo:

- limpieza y desinfección a fondo del laboratorio (incluyendo superficies de trabajo

y filtros del aire acondicionado);
- incremento de la frecuencia de las operaciones de limpieza y desinfección;
- modificaciones en los procedimientos de limpieza y desinfección;
- la instalación de unidades de aire acondicionado.

5.3.2.2-Debe considerarse la posibilidad de contaminación cruzada causada por los

equipos. Por ejemplo:
- el material desechable debe estar limpio o estéril, en función de su uso;
 - el material de vidrio reutilizable debe estar debidamente limpio o estéril, en
función de su uso;
- lo ideal es que los laboratorios dispongan de más de un autoclave. Sin embargo,
siempre que se tomen las debidas precauciones para separar las cargas de
descontaminación y esterilización, y siempre que exista un programa
documentado de limpieza para controlar las condiciones ambientales tanto
externas como internas del autoclave, el laboratorio puede utilizar un único
autoclave.
-es conveniente que los procesos de esterilización sean controlados
periódicamente.

5.4- Métodos de ensayo y validación de métodos.

5.4.1-validación de métodos

5.4.1.1-Los ensayos microbiológicos cualitativos que exprese el resultado en término de

detección / no detección, y los métodos de confirmación e identificación se validarán
siempre que sea necesario determinando la especificidad, la desviación positiva y
negativa, el límite de detección, el efecto matriz y los otros indicadores requeridos. Se
considerará las recomendaciones dadas por la AOAC en 1999 y otros documentos
similares.

5.4.1.2-Para la validación de los métodos cuantitativos se asumirá todo lo recomendados

para los mismos en normas como la de EURACHEM, FDA, ISO y AOAC. Siempre se
considerará las diferentes matrices en que se empleará el ensayo.

5.4.1.3-A los sistemas de ensayo que se venden en el mercado (kits) siempre se le

deben comprobar su utilidad en las condiciones propias que trabaja el laboratorios,
verificando los datos sobre validación procedentes de fuentes alternativas y del
fabricante. El laboratorio debe solicitar a los fabricantes datos sobre validación y
evidencias de que cumplen un sistema reconocido de aseguramiento de la calidad.
Cuando no se disponga de datos completos sobre la validación, el laboratorio debería
completar la validación del método antes de utilizarlo con carácter rutinario. Cuando se
haya realizado una validación, el laboratorio tendrá que verificar periódicamente que se
cumplen los parámetros documentados, por ejemplo, utilizando muestras inoculadas, etc.

5.4.1.4-Las validaciones pueden utilizar muestras contaminadas naturalmente y

contaminadas artificialmente tratando que simulen lo mejor posible las condiciones
naturales. Se considerarán diferentes niveles de contaminación.

5.4.2-Incertidumbre de la medición

5.4.2.1-El cálculo de la incertidumbre en esta materia está siendo abordado en la

actualidad por la comunidad de laboratorios y se espera que en un futuro se disponga
de unas directrices más claras en el campo de la microbiología.

5.5- Equipos

5.5.1- Reactivos y medios de cultivos

5.5.1.1-Se debe garantizar que la calidad de los reactivos y medios de cultivos sea la
apropiada para los ensayos. Se verificará la calidad de cada lote de reactivo crítico
a su entrada al laboratorio usando controles positivos y negativos de
microorganismos que sean reconocidos.

5.5.1.2-Se recomienda realizar controles adicionales con carácter aleatorio, para

asegurarse de que los productos siguen cumpliendo las especificaciones
requeridas. Estos controles pueden incluirse en el programa interno de control de
calidad.

5.5.1.3-Los medios de cultivo, productos en polvo deshidratados y reactivos comerciales

deben consumirse antes de la fecha de caducidad. El laboratorio debe registrar la
fecha de recepción, la fecha de caducidad y la fecha de apertura del envase. El
almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas. Todos los
envases, especialmente los que contengan medios deshidratados, deben estar
herméticamente cerrados. No deben utilizarse medios deshidratados que presenten
compactación o un cambio de color.

5.5.1.4-Para la preparación de medios, soluciones y tampones, debe utilizarse agua

destilada, desionizada o de ósmosis inversa, y que haya sido sometida a controles
periódicos que aseguren su calidad (conductividad, pH y carga microbiana) y llevar
un registro actualizado de los mismos.

5.5.1.5-Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben prepararse, controlarse,

almacenarse y utilizarse de acuerdo con un procedimiento documentado. En los
documentos ISO 7218 e ISO/TR 11133-1 se incluyen una serie de directrices para
la preparación y esterilización de medios, así como los tiempos de almacenamiento
recomendados.
5.5.1.6-Los lotes de medios preparados según fórmula en el laboratorio deben verificarse
a través de promociones de crecimientos con el cultivo de microbianos procedentes
de una colección reconocida y debe verificarse que los medios selectivos inhiben el
crecimiento de microorganismos no deseados.

5.5.1.7-Debe verificarse la esterilidad de los medios y diluyentes preparados en el

laboratorio.

5.5.1.8-El laboratorio debe asegurarse de que los medios y reactivos (incluidas las
soluciones madre) están debidamente etiquetados para garantizar su identificación,
concentración, condiciones de almacenamiento, caducidad y/o períodos
recomendados de almacenamiento. Asimismo, debe poder identificarse a la
persona que ha preparado el medio o reactivo, la fecha de preparación y la fecha
de caducidad, ya sea por medio de una etiqueta o de un registro apropiado.

5.5.2- Equipos e instrumental

5.5.2.1-Normalmente los equipos, sus componentes e instrumental de laboratorio deben

mantenerse limpios. Se esterilizaran o desinfectarán según un programa
establecido, tales como:
- aparatos de filtración, homogenizadores peristáltico, batidoras, contenedores de
cristal o plásticos, asas de siembras
 - baños de agua, incubadoras, gabinetes microbiológicos, autoclaves, freezer y
refrigeradores
- termómetros, balanzas, medidores de pH, contadores de colonias

5.5.2.2-Los laboratorios contarán con procedimientos que garanticen la limpieza y

esterilización de los materiales hasta el momento en que van a ser usado. La
preparación de los materiales debe ser de tal forman que no interfiera con los
crecimientos microbianos.

5.5.2.3-La medición de temperatura es crítica en casi todos los ensayos microbiológicos

y en el mantenimiento de muestras y materiales. Por ello especial cuidado se
debe tener en la calibración y control de todos los instrumentos dedicados a la
medición de temperatura

5.5.2.4-La estabilidad, uniformidad y distribución de la temperatura, así como el tiempo

requerido para alcanzar el equilibrio de ella en los equipos y locales donde es
fundamental este indicador (baños de agua, incubadora, autoclaves, hornos)
deben estar establecidas y registrados sus comportamientos y los cambios o
reparaciones que se ejecuten en los equipos e instrumentos relacionados con
este indicador.

5.5.2.5-Se mantendrán registros que demuestren el correcto ciclo de las esterilizaciones

y sus controles.

5.6 Trazabilidad de las mediciones

5.6.1-Cepas de referencia

5.6.1.1-Para demostrar la trazabilidad, el laboratorio debe utilizar cepas de referencia de

microorganismos suministrados por una colección nacional o internacional
reconocida. . Se debe mantener procedimientos que demuestren la identificación
y autenticidad de las cepas, su manejo para mantener pureza y viabilidad,
demostración de la estabilidad y el control de ellas.

5.6.1.2-Debe demostrarse que las cepas de referencias mantienen sus características

originales. Se recomienda realizar bancos de subcultivos que faciliten una reserva
con las condiciones iniciales y con un número de pases bien definido. Se puede
seguir las indicaciones del Anexo B de la ISO/TR 11133-1 para la creación y
manejo de estos bancos, incluyendo las preparaciones de trabajo.

5.6.1.3-En caso de emplear células estas deben ser suministradas por una colección
nacional o internacional reconocida. Se debe demostrar su autenticidad,
viabilidad y pureza. Tener procedimientos de manejo que eviten la contaminación
cruzada y con micoplasmas, reproducirlas con los medios y reactivos óptimos
para mantener sus condiciones iniciales y garantizar su trazabilidad.

5.6.2-Materiales de referencia y materiales de referencia certificados.

5.6.2.1-Los materiales de referencia y los materiales de referencia certificados

proporcionan la trazabilidad esencial en las mediciones y son utilizados, por
ejemplo, para demostrar la exactitud de los resultados, calibrar equipos y
 métodos, validar métodos y permitir la comparación de métodos al ser utilizados
como patrones de referencia. Se recomienda su utilización siempre que sea
posible.

5.6.2.2-Los materiales y substancias de referencia, así como los materiales de referencia

certificados, deben almacenarse y manipularse en unas condiciones que no
alteren su integridad, de acuerdo con un procedimiento documentado y el método
de ensayo correspondiente.

5.8- Manipulación de los objetos de ensayo

5.8.1-El transporte y conservación de la muestra debe ser en condiciones que garanticen

su integridad. Estas condiciones deben ser controladas y registradas. La flora
microbiana puede ser sensible a factores tales como temperatura o duración del
almacenamiento y transporte, por lo que es importante verificar y registrar el estado
de la muestra cuando se recibe en el laboratorio.

5.8.2-En el traslado debe asegurarse que no se contamine la muestra y en casos que

sea necesario que no existan escapes que puedan afectar a las personas o el
ambiente.

5.8.3-Los ensayos deben realizarse tan rápido como sea posible. Las muestras que se
encuentran a la espera de ser analizadas deben almacenarse en condiciones
adecuadas para reducir al mínimo cualquier modificación en la población
microbiana presente.

5.8.4-El laboratorio debe disponer de un procedimiento que incluya la entrega de

muestras. Si la muestra es insuficiente o si se encuentra en mal estado debido a
deterioro físico, temperatura incorrecta, envase roto o etiquetado defectuoso, el
laboratorio debe rechazarla o describir su estado en el informe del ensayo, si es
posible realizar el trabajo.

5.8.5-El envase y etiquetado de las muestras puede estar, en potencia, altamente

contaminado y las muestras deben manipularse y almacenarse con precaución
para evitar que se propague la contaminación.

5.8.6-Debe existir un procedimiento documentado para la conservación y eliminación de

muestras. Cuando se sepa que algunas porciones de muestras de ensayo están
altamente contaminadas, deben descontaminarse antes de su eliminación. Si es
necesario, las muestras deben conservarse hasta que se hayan obtenido los
resultados del ensayo, o más tiempo.

5.8.7-Los laboratorios deben contar con procedimientos para la correcta disposición de

los materiales contaminados de manera que no afecten a los ensayos en ejecución,
las muestras para próximos ensayos, ni a las personas, ni al ambiente.

5.9-Aseguramiento de la calidad de los resultados

5.9.1.-El laboratorio contará con procedimientos diseñados para la realización del control
interno de manera que pueda realizar la evaluación continúa del trabajo. El mayor
 objetivo es asegurar la consistencia de los resultados día a día y su conformidad
con los criterios establecidos.

5.9.2-El control interno considerará la evaluación de reactivos, medios de cultivos,

calidad de materiales y cultivos de referencias, métodos de ensayos, y otros. La
frecuencia de los controles se establecerá en proporción a la frecuencia de los
fallos.

Bibliografía

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Rev.05.
2. NC-ISO/IEC 17025:2006-Requisitos generales para la competencia de los
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6. 6. ISO 16140:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for
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7. ISO/TR 11133-1:2000. Microbiología de los alimentos para consume humano y
animal. Guía para la preparación y producción de medios de cultivo. Parte 1:
Directrices generales para el Aseguramiento de la Calidad para la preparación de
medios de cultivo en el laboratorio