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UNIVERSIDAD CATOLICA BOLIVIANA “SAN PABLO”

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA


INGENIERIA BIOQUIMICA - IQM 452
INSTITUCION: UNIVERSIDAD CATOLICABOLIVIANA “SAN PABLO”
MATERIA: LABORATORIO DE INGENIERIA BIOQUIMICA
NUMERO DE PRACTICA: 7
NOMBRE DE LA PRACTICA: CULTIVO E IDENTIFICACION DE
BACTERIAS
DOCENTE: ING. DIANA LOSANTOS
ESTUDIANTE: PRINCESS AMPARO CAMPOS CALLEJAS
GRUPO: SÁBADO 8:00-10:00
FECHA: 30-05-2018
NUMERO DE CELULAR: 69864005
NUMERO DE TELEFONO: 2846025
CULTIVO E IDENTIFICACION DE BACTERIAS

1. OBJETIVO.
1.1.Objetivo general
 Identificar bacterias mesófilas aerobias en diversas muestras mediante tinción
de Gram
1.2.Objetivos específicos.
 Aplicar los conocimientos previo de desinfección y esterilización en la
practica.
 Utilizar la tinción de Gram como medio de identificación de bacterias en las
muestras analizar.
2. FUNDAMENTO TEORICO.
2.1. ESTERILIZACION Y DESINFECCION

Bacterias

Las bacterias son organismos unicelulares microscópicos, sin núcleo ni clorofila, que
pueden presentarse desnudas o con una cápsula gelatinosa, aisladas o en grupos y que
pueden tener cilios o flagelos.
La bacteria es el más simple y abundante de los organismos y puede vivir en tierra, agua,
materia orgánica o en plantas y animales.
Tienen una gran importancia en la naturaleza, pues están presentes en los ciclos naturales
del nitrógeno, del carbono, del fósforo, etc. y pueden transformar sustancias orgánicas en
inorgánicas y viceversa.
Son también muy importantes en las fermentaciones aprovechadas por la industria y en
la producción de antibióticos.
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Típica formación bacteriana.
Desempeñan un factor importante en la destrucción de plantas y animales muertos.
En efecto, la vida en nuestro planeta no existiría sin bacterias , las cuales permiten
muchas de las funciones esenciales de los ecosistemas. Una bacteria de tamaño típico es
tan pequeña que es completamente invisible a la vista .
Las bacterias son muy importantes para el ser humano, tanto para bien como para mal,
debido a sus efectos químicos y al rol que juegan en diseminar enfermedades.
Las bacterias pertenecen a la clase procariota debido a que su núcleo no está rodeado por
una membrana y consiste de una sola molécula de ADN cuya división es no-mitótica.
En su efecto beneficioso, algunas bacterias producen antibióticos tales como
estreptomicina capaces de curar enfermedades.
Análogamente, las bacterias son muy importantes ya que convierten nitrógeno en una
forma útil por ciertas raíces de plantas o proveen el gusto intenso en yogurt.
Las bacterias se usan en la producción de ácido acético y vinagre, varios aminoácidos y
enzimas, y especialmente en la fermentación de lactosa a ácido láctico, la cual coagula
las proteínas de la leche, y se usan en la fabricación de casi todos los quesos, yogurt y
productos similares.

Tipos de bacterias.
Ellas también ayudan a la descomposición de la materia orgánica muerta. Actualmente,
los métodos de la ingeniería genética son usados para mejorar los tipos de bacterias con
fines comerciales y muestran una gran promesa futura.
En cosméticos, muchos de los activos, tales como proteínas y péptidos de bajo peso
molecular, ingredientes antiarrugas y antioxidantes, están siendo creados con el uso de
tipos específicos mejorados de bacterias.
La mayoría de las bacterias pueden clasificarse en tres categorías de acuerdo a su
respuesta al oxígeno gaseoso.
La bacteria aerobia crece en la presencia de oxígeno y lo requiere para su continuo
crecimiento y existencia.
Otras bacterias son anaerobias, y no pueden tolerar el oxígeno gaseoso.
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Bacterias en la lengua.
El tercer grupo es el anaerobio facultativo, el cual prefiere crecer en presencia de oxígeno,
aunque puede hacerlo sin él.
Tinción de gram

La Tinción de Gram es una técnica que permite observar las bacterias. Las bacterias son
microorganismos unicelulares que conviven habitualmente con el ser humano. En muchos
casos forman parte de nuestra flora habitual y la de nuestro entorno sin ocasionar ningún
peligro para la salud. En otras situaciones, las bacterias pueden ser patógenas, es decir,
producen infecciones de diversos tipos: cutáneas, abdominales, óseas, etc.

Para poder identificarlas y tratarlas es necesario clasificarlas. Las diferentes clasificaciones


atienden a diversos criterios y características bacterianas: morfología, metabolismo,
presencia de pared celular, etc.

Una de las maneras de diferenciar a las bacterias es en base a la presencia de una pared
celular. Así, hay bacterias con una pared gruesa (formada por peptidoglicanos) y otras con
una pared mucho más delgada.

Las Gram positivas y las Gram negativas se diferencian en su estado de ánimo, ni en su


polaridad, sino en si se colorean o no con un tinte especial llamado tinción de Gram. Con
esta tinción se verían violetas, las positivas y rosita, las negativas; por una diferencia
estructural entre ambas, pues su pared celular es distinta. Así la capa más externa de las
Gram positivas es de peptidoglicano y la de las negativas es una bicapa lipídica con
lipopolisacáridos.
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3. PRACTICA DEL EXPERIMENTO


3.1.Materiales y equipos.

TABLA 1.

Nombre del material Cantidad (u) Volumen (ml) Material


Probeta 1 100 Vidrio
Pizeta 1 N/A N/A
Caja Petri 5 N/A Vidrio
Vaso de precipitado 5 100 Vidrio
Pipeta graduada 5 1 Vidrio
Propipeta 1 N/A Goma
Matraz Erlenmeyer 1 250 Vidrio
Espátula 2 N/A Vidrio
Cepillo para tubos 1 N/A Sintético
Aza de siembra 2 N/A Metálico
Mechero Bunsen 1 N/A N/A
Balanza analítica 1
Hornilla eléctrica 1 N/A N/A
Microscopio 1 N/A N/A
Autoclave de carga vertical 1 N/A Acero
Papel kraft  5 piezas, 3x50 N/A Papel
cm
 5 piezas, 30x20
cm
 1 pieza de 8x10
cm
Cordel 1 trozo N/A -
Cinta masking 1 rollo N/A -
Algodón 1 paquete N/A -
Aspersor o atomizador 1 N/A Plástico
Tijeras 1 N/A -
Encendedor 1 N/A -
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En la Tabla 1 se muestran 4 columnas, en la primera el nombre de los materiales utilizados en la práctica,
e3n la segunda columna se muestra la cantidad de cada uno de los materiales nombrados, en la tercera se
ve el volumen de cada material y en la cuarta columna se muestra la composición material de cada
instrumento de laboratorio utilizado.

3.2.Reactivos

TABLA 2.

Nombre del reactivo Masa (g) Volumen (ml) Cantidad


Agua destilada H2O c.n. c.n. -
Detergente liquido c.n. c.n. 1
Solución e hipoclorito de sodio 1g/Lt c.n. c.n. -
Solución acuosa de etanol al 75% c.n. 50 1
Agar nutritivo 4.2 150 1
Aceite de inmersión - - 1 gota
Muestra de bacteria (leche saborizada) c.n. 1 -
Reactivos para la tinción c.n. 9 1-2gotas
 Violeta de genciana
 Lugol
 Descolorante
 Safranina
En la Tabla 2 se muestran los reactivos puestos en la primera columna, en la segunda se menciona la
masa de cada reactivo utilizado, en este caso no se tuvieron cantidades fijas, es decir, se utilizó la cantidad
másica necesaria de cada compuesto, en la tercera el volumen necesario de cada compuesto, además se
especifican el tipo de muestra para la practica de bacterias y también los reactivos o colorantes para la
tinción de Gram

Etanol: alude al alcohol etílico, una sustancia cuya fórmula química es CH3-CH2-OH. Se
trata de un líquido que se genera a partir de la fermentación de productos que presentan
una elevada cantidad de carbohidratos. El etanol, en condiciones normales de temperatura
y presión, es inflamable e incoloro. En cualquier proporción, por otra parte, es soluble en
agua; la obtención del etanol se realiza a través de la fermentación anaeróbica de una
disolución que contiene levadura y azúcares. Mediante la destilación, se puede separar el
etanol del agua.

Agar nutritivo: El medio contiene extracto de carne, peptona y agar, siendo una
formulación suficiente para el desarrollo de los microorganismos. El extracto de carne
proporciona al medio fuente de carbohidratos, de nitrógeno y vitaminas. El empleo de
este medio es de acuerdo al tipo de estudio por realizar. PREPARACION: Rehidratar 23
g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar agitando
frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para disolverlo por
completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15 minutos. Enfriar
aproximadamente a 45ºC. Vaciar en cajas de Petri estériles. Conservar en refrigeración
de 2 a 8ºC.

Cristal Violeta: o violeta de genciana ,compuesto químico empleado como indicador de


pH y colorantes .El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células
bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana.
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Lugol: Es una disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico en agua destilada. El
lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y
Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente
(son sustancias que aumentan la afinidad de la célula por el colorante. Suelen añadirse
después del colorante en determinadas tinciones diferenciales), haciendo que el cristal
violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las
células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.

Alcohol – Acetona: o descolorante, es un compuesto químico con formula química


CH3(CO)CH3 es un líquido incoloro de olor característico. La mezcla de alcohol-acetona
que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el
complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que
los Gram negativos sí lo hacen.

Safranina: Colorante biológico, su fórmula química es C20N14ClN4, es un dimetil de


safranina. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración
de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que
las Gram positivas permanecen violetas.

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una
tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del
protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas
(si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).

Aceite de inmersión: Aceite hecho principalmente a base de aceite mineral. Restringiendo


el movimiento de una muestra. Al intercalar entre el objetivo y el aceite, el índice de
refracción en casi igual al vidrio, los rayos emergentes continúan su camino sin
desviación, consiguiendo mayor calidad de luz llegue al objetivo, mejorando
notablemente la visión.

4. Procedimiento
5. DATOS.

FIGURA 1. Colonias formadas en la caja petri


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En la figura 1 se muestra las colonias formadas, poco visibles y se conto con 40 UFC

FIGURA 2. Vista de la muestra bacteriana de leche

En la figura 2 se tiene la muestra en el microscopio, donde se cuenta con bacterias de tipo


Gram -, por su coloración violeta.

6. CALCULOS Y RESULTADOS

Calculo para preparar el agar nutritivo, según:

28 𝑔𝑟. −1000 𝑚𝑙

𝑥 − 150 𝑚𝑙

Regla de 3

𝑥 = 4.2 𝑔𝑟

Tipo de bacterias que se observaron en la práctica de acuerdo a la tinción.

Según lo observado, se vieron bacterias del tipo coco y diplococos, también se vieron
esteptococos.
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Por datos bibliográficos se tiene: Bacillus spp.

Colonias medianas, convexas, blanquecinas como cera, forma fusiforme y circular,


bordes redondeados.

Colonias de Bacillus sp en agar nutritivo.

Colonias Grandes, planas, blanquecinas, forma irregular, bordes lobulados, dan la


apariencia de estar secas, también se observa una protuberancia en el centro de las
colonias lo cual les da una apariencia de huevo estrellado.

Colonias de Bacillus sp en agar nutritivo.

7. CONCLUSIONES

Se lograron identificar bacterias en las muestras, en este caso leche. Donde se tuvieron
un poco de dificultades al contar las colonias ya que son de tamaño muy pequeño.

Las bacterias si se pudieron identificar como Gram -, mediante los procedimientos de


tinción debido a la coloración obtenida, estas bacterias son difíciles de nombrar ya que
no se tiene una claridad visual.

8. CUESTIONARIO
8.1.¿Qué son las Unidades Formadoras de Colonias?
-UFC es el número mínimo de células separables sobre la superficie, o dentro, de un
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medio de agar semi-sólido que da lugar al desarrollo de una colonia visible del orden de
decenas de millones de células descendientes. Las UFC pueden ser pares, cadena o
racimos, así como células individuales Unidad formadora de colonias.
8.2.¿Por qué se diluyó la muestra en relaciones 1:10 y 1:100?
-Esta dilución se la realizo para no tener la muestra demasiado concentrada, a la vez
saturada ya que se cultivó para su propagación y crecimiento de bacterias.
8.3.Detalle la función específica que realiza cada reactivo utilizado en la tinción de
Gram.
-Violeta de genciana: colorante catiónico, penetra en todas las células bacterianas (tanto
Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana.

-Lugol: Suelen añadirse después del colorante en determinadas tinciones diferenciales,


haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula
bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa
con el cristal violeta.

-Alcohol – Acetona: o descolorante, la mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve


para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta.
Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo
hacen.

-Safranina: Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración
de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que
las Gram positivas permanecen violetas.

8.4.Explique por qué tanto bacterias Gram + como Gram – presentan coloraciones
características. ¿A qué se debe este fenómeno?
-Se debe a la resistencia de la pared celular las Gram – a diferencia de las Gram + tienen
menos resistencia por lo que son más fácil de romper, con lo cual no retiene el colorante,
pasa lo contrario con las Gram +, que si adquieren mejor coloración.
9. BIBLIOGRAFIA
 PROCEDIMIENTO, Guía de laboratorio
 TINCION DE GRAM, fecha de consulta 30 de mayo de 2018,
https://www.salud.mapfre.es/pruebas-diagnosticas/otras-pruebas-
diagnosticas/tincion-de-gram/
 BACTERIAS, fecha de consulta 29 de mayo de 2018,
http://www.profesorenlinea.cl/Ciencias/Bacteria.htm
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