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e Imunologia Clínica
Brasília-DF.
Elaboração
Produção
Apresentação.................................................................................................................................. 4
Introdução.................................................................................................................................... 7
Unidade i
IMUNOHEMATOLOGIA............................................................................................................................ 9
CAPÍTULO 1
Sistema ABO............................................................................................................................ 9
Capítulo 2
Sistema Rh............................................................................................................................. 17
Unidade iI
IMUNOLOGIA CLÍNICA......................................................................................................................... 26
Capítulo 1
Anticorpos.......................................................................................................................... 26
Capítulo 2
Reação de precipitação e aglutinação.......................................................................... 35
Capítulo 3
Quantificação da concentração antigênica ou de anticorpos.............................. 39
Capítulo 4
Identificação de antígenos em células e antígenos..................................................... 52
Capítulo 5
Metodologias com uso de Biologia Molecular........................................................... 62
Capítulo 6
Diagnósticos laboratoriais (Ministério da Saúde).......................................................... 67
Referências................................................................................................................................... 82
Apresentação
Caro aluno
A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem
necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela
atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade
de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância – EaD.
Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos
a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma
competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para
vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo.
Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar
sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a
como instrumento para seu sucesso na carreira.
Conselho Editorial
4
Organização do Caderno
de Estudos e Pesquisa
Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de
forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões
para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao
final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e
pesquisas complementares.
A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos
e Pesquisa.
Provocação
Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes
mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor
conteudista.
Para refletir
Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita
sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante
que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As
reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões.
Praticando
Atenção
5
Saiba mais
Sintetizando
Exercício de fixação
Atividades que buscam reforçar a assimilação e fixação dos períodos que o autor/
conteudista achar mais relevante em relação a aprendizagem de seu módulo (não
há registro de menção).
Avaliação Final
6
Introdução
Historicamente a Imunologia surgiu como um ramo da microbiologia e conquistou seu espaço com
os estudos das doenças infecciosas e suas respectivas respostas. A nossa capacidade de coexistir
com diversos micro-organismos de nosso ambiente depende de um conjunto de fatores, e um destes
fatores é o Sistema Imune.
O Sistema Imune, por sua vez, é como um conjunto de células de defesa e/ou ataque eficaz que tem
a capacidade de distinguir os sinais de perigo para o organismo e protegê-lo contra estes patógenos
oportunistas. Esta distinção ocorre por comunicação por meio de sinais mediados por citocinas e
receptores. As células do Sistema Imune estão distribuídas por todo organismo, alojadas nos tecidos,
e desempenham o papel de sentinelas e circulando por vasos sanguíneos e linfáticos esperando o
sinal de que o organismo foi invadido.
A Imunologia Clínica tem o objetivo de investigar e orientar o clínico na apuração de diagnósticos das
patogenicidades por meio de resultados de exames laboratoriais. Para tanto é necessário conhecer
as estratégias traçadas pelo Sistema Imune, no que tange ao controle e/ou eliminação dos diferentes
patógenos, além de saber as estratégias de evasão utilizadas pelos patógenos para driblar a defesa e
o ataque do Sistema Imune.
Obviamente, sob o ponto de vista imunológico, um determinado agente infeccioso não precisa
se restringir a uma única estratégia patogênica, de modo que a resposta imune eficiente contra o
determinado micro-organismo pode incluir diversos mecanismos.
Objetivos
»» Reconhecer o sistema ABO e seus componentes: antígenos e anticorpos.
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IMUNOHEMATOLOGIA Unidade i
CAPÍTULO 1
Sistema ABO
É de suma importância a compreensão dos sistemas antigênicos das células sanguíneas. Além das
aplicações práticas da genética da célula sanguínea, como transfusões de sangue, transplantes e
estudos com fins antropológicos, a investigação dos antígenos das hemácias oferece uma visão
ampla de outros aspectos mais básicos da biologia humana.
Histórico
Historicamente, a separação dos indivíduos em grupos de acordo com os antígenos presentes
em suas hemácias foi demonstrada pela primeira vez em 1900–1901, pelo médico austríaco Karl
Landsteiner. Ao reagir amostras de sangue de diversas pessoas, isolou eritrócitos fazendo diferentes
combinações entre plasma e hemácias. Encontrou como resultado a presença de aglutinação dos
glóbulos em alguns casos e sua ausência em outros. Dessa forma, Karl Landsteiner classificou os
seres humanos em 3 grupos sanguíneos distintos, a saber, A, B e O, e ainda explicou o fato de
algumas pessoas morrerem depois de transfusões de sangue e outras não. Mais tarde, em 1902, o
grupo sanguíneo AB foi descrito por von Decastello e Sturli.
Destaca-se como importante no Sistema ABO, na prática transfusional, o fato de ser esse o sistema
que possui maior capacidade de provocar a produção de anticorpos, ou seja, é o mais antigênico.
Como os eritrócitos humanos não expressam moléculas HLA de classe I e II, essas moléculas de
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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA
Antígenos de hemácias
A composição antigênica das hemácias é importante na terapia transfusional.
Esses anticorpos são formados naturalmente contra antígenos que não estão presentes nas
hemácias. Os estímulos são passivos, gerados por bactérias que colonizam o trato intestinal a partir
do nascimento. Geralmente, os anticorpos do Sistema ABO são misturas de IgM e IgG (Unidade
II). Tanto anticorpos ABO classe IgM ou IgG, são capazes de desativar o sistema complemento,
provocando hemólise intravascular em transfusões incompatíveis.
Indivíduos pertencentes ao grupo de sangue tipo AB não tem anticorpos anti-A ou anti-B. Já os
indivíduos portadores de sangue tipo A possuem anticorpos anti-B, os pertencentes ao grupo B
possuem anticorpos anti-A e os indivíduos do grupo O, finalmente, possuem as aglutininas anti-A
e aglutininas anti-B.
10
IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA
O esquema abaixo mostra as transfusões possíveis quanto ao sistema ABO (Figura 2):
É interessante abordar que o grupo sanguíneo O pode ser doado para todos os grupos existentes;
sendo denominados doadores universais. Entretanto, indivíduos portadores do sangue O não
podem receber sangue de nenhum outro grupo – apenas do seu próprio grupo. O grupo AB, por sua
vez, pode receber sangue de qualquer outro tipo, constituindo-se receptores universais.
Genética
Os antígenos A e B são herdados segundo a Lei de Mendel. O grupo ABO de um indivíduo é
determinado pela presença de um (homozigótico) ou dois (heterozigótico) dos três alelos: A, B e H,
cujo gene está localizado no cromossomo 9 (Tabela 1).
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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
Bioquímica
É importante destacar que os produtos dos genes A e B não são os antígenos A e B por si; as
glicosiltransferases têm como função modificar a membrana celular e levar à síntese dos antígenos
A e B. Existe uma substância precursora na forma de cadeia lateral oligossacarídica associada com
glicoesfingolipídeos e glicoproteínas de membrana. Após conversão dessa substância precursora na
substância H, o precursor imediato dos antígenos A e B está sob influência dos alelos H e h, que
são herdados independentemente do gene determinando o tipo ABO. O H é comum; o h é raro. Em
dose simples ou dupla, o gene H apresenta uma enzima, a H-transferase, que converte a substância
precursora em substância H. A presença de um alelo A ou B determina a atividade da A ou B-transferase
correspondente, que subsequentemente converterá a substância H em antígeno A ou B.
Quando o antígeno A ou B está ausente das hemácias, o anticorpo correspondente está presente no
plasma. Ao nascimento, essas iso-hemaglutininas estão ausentes, mas desenvolvem-se durante os 6
primeiros meses de vida. Elas surgem como produto da exposição dos polissacarídeos semelhantes a
ABO que são vistas em micro-organismos, sementes, plantas e outras fontes exógenas. Substâncias
com atividade antigênica de A, B e H estão amplamente distribuídas nas hemácias, bem como em
secreções e glândulas mucosas dos tratos gastrointestinal, respiratório e genital.
Enzimas
A especificidade A, B ou H de uma hemácia é determinada pela atividade de enzimas geneticamente
determinadas durante o desenvolvimento celular.
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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA
Antígenos ABO
Os antígenos A e B estão localizados na superfície externa da membrana da hemácia.
Vários antígenos têm especificidade A. A mais frequente é A1; 80% dos indivíduos do grupo A são
A1 e 20% são A2. A2 e outras variantes reagem mais fracamente com soros de tipagem anti-A que as
hemácias A1. São conhecidas também variantes mais fracas do grupo A, entre elas A3, Ax, Am, Aend, Ae1
e outros, e elas constituem menos de 1% do fenótipo do grupo A .
Existem também variantes fracamente reativas do antígeno B, como B3, Bx e Bm1, mas elas ocorrem
com menor frequência que as variantes do grupo A.
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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
2. Interpretação
Testes pré-transfusionais
a. Testes pré-transfusionais realizados com o sangue do doador
O sangue total e seus componentes não podem ser transfundidos antes da obtenção
de resultados finais não reagentes, nos testes de detecção para Hepatites B e C, HIV-
1 e HIV-2, Doença de Chagas, Sífilis, HTLV-I e HTLV-II.
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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA
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Capítulo 2
Sistema Rh
Na prática transfusional, o sistema do grupo Rh só perde em importância para o ABO, sendo que foi
descrito pela primeira vez por Levine e Stetson, em 1939.
O termo Rh veio dos resultados de Landsteiner e Wiener que, em 1940, demonstraram que coelhos
imunizados com hemácias de macacos rhesus produziam um anticorpo que reagia com hemácias
humanas.
O sistema Rh é um dos mais polimórficos dos grupos sanguíneos humanos. Os genes Rh estão
localizados no cromossomo 1. Até o momento, não tem sua estrutura bioquímica totalmente
elucidada. Trata-se de uma proteína com importante papel na integridade da membrana eritrocitária.
De acordo com este modelo, três genes intimamente ligados determinam a especificidade das
estruturas antigênicas responsáveis pelo tipo Rh das hemácias. Três alelos codominantes são D e
d; C e c; e E e e, com o complexo gênico inteiro sendo herdado como uma unidade. Os antígenos
resultantes são denominados D, C, c, E e e. Um antígeno com atividade d nunca foi descrito e o alelo
d é considerado amórfico.
Anticorpos relacionados com esse antígeno são importantes na prática transfusional, pois o D é
altamente imunogênico; o anti-D pode resultar em graves reações hemolíticas se constituindo uma
importante causa de DHRN grave.
Determinação do fator Rh
O teste mais comum para se determinar o fator Rh é o Teste de Coombs, efetuado com o soro de
mesmo nome. Pode ser direto ou indireto.
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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA
Caso o resultado seja negativo, devem-se acrescentar ao tubo de reação duas gotas de hemácias
humanas sensibilizadas com IgG e verificar se houve aglutinação. A positividade na prova de
Coombs direto indica que a hemácia está sensibilizada e é recomendada a identificação da classe e
do anticorpo. Para identificação de que o anticorpo é contra algum antígeno do sistema eritrocitário,
este deve ser eluído dos antígenos do paciente e do eluato analisado (Figura 4).
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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
Um teste de Coombs direto utilizando anti-soro contra IgG é quase sempre positivo
em:
Resposta durante o curso, em nossas conversas on-line. Procure textos que te ajudem
a encontrar a resposta!
Descrição da técnica:
Quando o Coombs direto for negativo com a leitura imediata, deixar 15 minutos em temperatura
ambiente, centrifugar e ler novamente.
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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA
Os testes positivos devem ser encaminhados para laboratório especializado para realização de
estudos. A presença de aglutinação indica que as hemácias podem estar sensibilizadas por anticorpos
ou por componentes do complemento. Para se definir a especificidade do anticorpo devem ser
aplicados testes de eluição.
No caso do receptor, é importante o teste, pois, caso esse tenha algum anticorpo irregular, é aconselhável
a identificação por duas razões:
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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
Sempre que a PAI é positiva, deve-se proceder à identificação da especificidade do(s) anticorpo(s)
irregulares encontrado(s) no soro/plasma. A identificação de anticorpos irregulares deve incluir,
obrigatoriamente, o meio no qual a PAI foi reativa.
A identificação de anticorpos irregulares (IAI) é realizada com o soro do paciente utilizando um painel
de hemácias. Geralmente esse painel apresenta 11 hemácias, em suspensão de 3-5%, numeradas
de 1 a 11. As hemácias do painel são do tipo O e possuem os antígenos contra os anticorpos mais
frequentes em bancos de sangue. Acompanhando o painel vem um diagrama contendo o perfil
fenotípico de cada uma das hemácias. A presença de aglutinação diante dos diferentes eritrócitos
permite a identificação do anticorpo. Como exemplo: houve aglutinação nos tubos 1, 2, 3, 8, 10 e 11.
Basta procurar em cada uma das colunas do diagrama o perfil de aglutinação obtido.
Fonte: http://pt.scribd.com/doc/54611627/Controle-Imuno-hematologico-Transfusoes.
<http://www.biomedicinapadrao.com/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html>
<http://www.biomedicinapadrao.com/2010/11/teste-de-coombs-direto.html>
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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA:
Não se esquecer
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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
Fonte: <lucianecantalicebiologia.blogspot.com>.
Há certos procedimentos que a mãe de Rh negativo pode realizar a fim de evitar a doença hemolítica
do neonato. Pode-se destacar o cuidado no contato com sangue de Rh positivo, o diagnóstico do
fator Rh do feto através da técnica denominada Reação em Cadeia de Polimerase, a realização do
Teste de Coombs para saber se a mãe já está imunizada e ainda o uso de medicamentos como o
MATERGAM e RHOGAM, que são imunoglobulinas (IgG) Anti-D usadas profilaticamente na
prevenção de anticorpos contra eritrócitos Rh positivos em pessoas Rh negativas que estão sob risco
de serem sensibilizadas por esses eritrócitos.
Normalmente hemácias RhD positivas possuem uma densidade antigênica variando entre 15.000
a 30.000 antígenos/célula, dependendo do haplótipo. Isto não é regra, pois alguns fenótipos foram
identificados com densidade variando entre 70 e 5.200 antígenos RhD sendo denominados de
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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA
D fracos. Estes são causados pela substituição de aminoácidos nas porções transmembranosas e
intracelulares da proteína RhD devido à mutação no gene RHD. Hemácias com fenótipo D fraco
expressam um antígeno RhD intacto ocorrendo em 0,2% a 1% dos caucasianos.
Hoje em dia temos mais de 40 tipos de D fracos identificados em nível molecular, nos quais o D
fraco tipo 1 e 2 são os mais frequentes. Somado a isso, o fenótipo D fraco carrega o antígeno RhD
intacto, o que diminui a probabilidade de formar aloanticorpo anti-D.
A distinção entre D fraco e D parcial não deve ser feita pela produção de anti-D. Foi proposto o índex
Rhesus para a predição do risco de imunização em indivíduos D fraco. Esse índex foi baseado na
densidade antigênica de diferentes anticorpos monoclonais dependendo da 1) quantidade de sítios
antigênicos; e 2) afinidade do anticorpo e pode teoricamente variar de 1 (risco baixo, exemplo: RhD
normal) a 0 (alto risco exemplo: parcial RhD faltando epítopos ).
Interpretação
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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
Antígeno D parcial
O antígeno D é composto de numerosos epítopos e sua expressão parcial foi originalmente definida
por indivíduos D apresentando formação de anti-D. Estudos com anticorpos monoclonais resultaram
em mais de 30 epítopos altamente conformacionais, envolvendo várias alças extracelulares.
Hemácias D parciais são definidas pela ausência de um ou mais epítopos causados pelos rearranjos
dos genes RHD e RHCE. Essa configuração genética possibilita microconversões e trocas
unidirecionais de fragmentos de gene RHD e RHCE, ou parte deles, levando a formação de alelos
RHD-CE-D ou RHCE-D-CE respectivamente. Esses novos alelos aberrantes de Rh não produzem
proteínas híbridas, regiões de RhD unidas com RhCE levando à perda de epítopos de D, gerando
novos antígenos.
Quais seriam os outros sistemas sanguíneos e suas funções? Que tal fazer uma busca
e incorporar este conhecimento?
Sistema ABO e Rh
http://www.youtube.com/watch?v=1LG5lTkgP0g
http://www.youtube.com/watch?v=mPOIZKCorCI
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IMUNOLOGIA Unidade iI
CLÍNICA
Capítulo 1
Anticorpos
Classes de anticorpos
Anticorpo é caracterizado por uma GLOBULINA sintetizada de linfócitos B e principalmente por
plasmócitos, após receber estímulo de um imunógeno, e que possui propriedade de interagir com
este de maneira específica.
Imunógenos x Antígenos
No início da Imunologia, o anticorpo só era reconhecido por suas propriedades, como a de neutralizar
a toxina correspondente ou provocar aglutinação de glóbulos vermelhos e a de promover lise de
bactérias e provocar choque anafilático em pessoas ou animais sensibilizados.
O conhecimento atual nos mostra que as moléculas de anticorpos são constituídas basicamente de
duas subunidades proteicas chamadas cadeias leves (L) e duas subunidades designadas cadeias
pesadas (H) do inglês heavy.
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
globulinas com a estrutura básica da molécula de anticorpo, usando a sigla Ig seguida das maiúsculas
A, G, M, D e E para as cinco classes até agora conhecidas.
As cinco classes (ou isotipos) diferem entre si (sequência primária de aminoácidos) das cadeias
pesadas, sendo as cadeias leves iguais para todas as classes imunoglobulinas. Há, no entanto, dois
tipos de cadeias leves com diferentes sequências de aminoácidos. As cadeias pesadas, específicas
para cada classe, são também designadas por letras gregas que simbolizam a sua estrutura.
Cada cadeia ou subunidade possui uma porção aminoterminal e na porção oposta é a carboxiterminal.
Cada Molécula de IgG possui dois sítios de combinação específicos para o determinante antigênico
que induziu sua síntese, a sequência de aminoácidos dessas porções é altamente variável e específica
para cada imunógeno, apresentando grupos de aminoácidos, característicos do indivíduo que
sintetiza a molécula (Figura 7).
Fonte: <http://www.pediatriasaopaulo.usp.br/index.php?p=html&id=253>
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Nas respostas imunes de primeiro contato com Antígeno (Ag), encontramos imunoglobulinas
predominantes como IgM e IgD (na superfície da célula B) , que apresenta como principal
característica principal ser mais lenta e menos intensa. Por sua vez, as respostas imunes de segundo
contato com o antígeno (Ag), encontramos predominância de IgA, IgE e IgG, e respostas mais
rápidas, intensas e especifica.
Estrutura
Todos os anticorpos são Igs, mas nem todas as Igs são classificadas como anticorpos: anticorpo
constitui uma ação e um evento que é característico do funcionamento de uma molécula que se
chama Ig. Contudo, também produzimos imunoglobulinas que não tem nenhuma atividade de
anticorpo. Em suma, as Igs fazem parte das proteínas do sangue (são proteínas solúveis no sangue),
embora possamos encontrar Igs em muitos fluidos e líquidos corporais também.
Descobrimento das Igs: foi por meio da análise da mobilidade eletroforética das proteínas do sangue
de acordo com o peso molecular de cada uma delas, onde se verificou a presença de um grupo
de proteínas que correspondem às albuminas e um grupo que corresponde às globulinas. Dentro
das globulinas, proteína que tem forma globosa, existem as globulinas alfa, beta e gama. Assim,
as Igs fazem parte do grupo das Gama Globulinas e, na sua formação, é glicoproteica (proteína +
polissacarídeo).
Produzidas pelas células plasmáticas (LB maduro, únicas células a produzir Ig), esse processo
normalmente é de resposta a um imunógeno. Existem eventos casuais e patológicos em que há
produção de Ig sem a presença de um imunógeno (processos neoplásicos de células B, por exemplo)
e a formação de grupos de células produtoras de Ig sem nenhum estímulo, ou seja, não são moléculas
de anticorpos, são apenas Ig.
28
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
imunoglobulinas de uma mesma classe têm regiões constantes de cadeia pesada muito similares.
Essas diferenças podem ser detectadas por estudos de sequências ou por meios sorológicos (i.e. pelo
uso de anticorpos dirigidos a essas diferenças) (Figura 8).
IgG
Estrutura: Todas IgGs são classificadas como monômeros (imunoglobulina 7S). As subclasses
diferem no número de pontes dissulfeto e comprimento da região da dobradiça.
Propriedades: É a mais versátil imunoglobulina porque é capaz de realizar todas as funções das
moléculas de imunoglobulinas.
IgM
Estrutura: IgM é encontrada na sua forma pentâmera (imunoglobulina 19S), mas ela pode também
existir como um monômero. Na forma pentâmera todas as cadeias pesadas são idênticas e todas as
cadeias leves também se apresentam idênticas. Assim, a valência é máxima e teoricamente 10. IgM
tem um domínio extra na cadeia mu (CH4) e ela tem outra proteína covalentemente ligada via uma
ponde S-S chamada cadeia J. Esta cadeia funciona em polimerização da molécula a um pentâmero.
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Propriedades:
b. IgM é a primeira Ig a ser feita pelo feto e a primeira Ig a ser feita por uma célula B
virgem quando é estimulada pelo antígeno.
f. Ig de superfície de célula B
IgM de superfície existe como um monômero e não tem cadeia J, mas tem 20 aminoácidos extras
na região C-terminal para se ancorar na membrana. Essas Igs funcionam como receptores para
antígeno ou células B e também estão associadas não covalentemente com duas proteínas adicionais
na membrana da célula B (Ig-alfa e Ig-beta). As proteínas adicionais, por sua vez, agem como
moléculas de transdução de sinal, uma vez que a cauda citoplasmática da molécula de Ig por si
mesma é muito curta para transduzir um sinal. O contato entre a superfície da imunoglobulina e
um antígeno é necessário antes da transdução do sinal pelas cadeias Ig-alfa e Ig-beta. Os antígenos
T-independentes realizam contato entre o antígeno e a superfície da imunoglobulina com expressão
suficiente para ativar as células B a se diferenciarem em plasmócitos secretores de anticorpos. Já os
antígenos T-dependentes, é necessário um segundo sinal fornecido pelas células T auxiliares para
ativar as células B.
IgA
Estrutura: Em forma de dímero, uma cadeia J se associa a ela. Por outro lado, se IgA for encontrada
em secreções identificamos outra proteína associada a ela chamada de peça secretora T; sIgA é, às
vezes, referida como imunoglobulina 11S. Ao contrário do resto da IgA que é feito no plasmócito, a
peça secretora é feita nas células epiteliais e é adicionada à IgA à medida que esta passa através das
secreções. A peça secretora ajuda a IgA a ser transportada através da mucosa e também a protege
da degradação nas secreções.
Propriedades:
30
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
IgD
Propriedades:
a. IgD é encontrada em baixos níveis no soro; seu papel no soro é não está totalmente
estabelecido.
IgE
Estrutura: IgE existe como um monômero e tem um domínio extra na região constante.
Propriedades:
a. IgE é a Ig sérica menos comum, uma vez que se liga fortemente com receptores de
Fc em basófilos e mastócitos mesmo antes da interação com o antígeno.
c. IgE também participa em doenças parasitárias por helmintos. Uma vez que os níveis
sorológicos de IgE aumentam em doenças parasitárias, a quantificação dos níveis
de IgE auxilia no diagnóstico de infecções parasitárias. Eosinófilos têm receptores
de Fc para IgE e a ligação de eosinófilos a helmintos cobertos por IgE resulta na
morte do parasita.
31
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
b. Aglutinação
32
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
dependent cell mediated cytotoxicity), que pode ser mediado por granulócitos. Há
experimentos in vitro que descrevem a morte de esquistossomos após opsonização
por anticorpo IgE e atividade ADCC mediada por eosinófilos.
e. Lise
f. Quimiotaxia
h. Efeitos inflamatórios
Além dos efeitos inflamatórios causados pela inflamação dos mastócitos e basófilos,
a ação de vários outros produtos do complemento contribuem para a inflamação
local induzindo o aumento do fluxo sanguíneo já estava aumentado, aumentando
o extravasamento de proteínas a partir dos capilares e a favorecendo a coagulação
de proteínas nos espaços teciduais, evitando assim a movimentação do organismo
invasor através dos tecidos.
33
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Anticorpos monoclonais
Por definição anticorpos monoclonais (mAbs, na sigla em inglês) são anticorpos produzidos por um
único clone de um linfócito B parental, sendo idênticos em relação em suas propriedades físicas,
químicas e biológicas. Foi descrito pela primeira vez em 1975, em artigo na revista Nature por
César Milstein e Georges Köhler que dividiram o Prêmio Nobel de Medicina no ano de 1984 com o
dinamarquês Niels Kaj Jerne.
Os mAbs são produzidos em ambiente laboratorial com linfócitos B gerados por camundongos
com sistemas imunológicos estimulados pelos antígenos de interesse. São chamados de anticorpos
murinos que usados de forma continuada durante uma terapia, estimulam uma reação imunológica
ao anticorpo próprio. Dessa forma, o uso dos mAbs ficou limitado durante duas décadas à produção
de kits para diagnósticos ou à pesquisa científica (Figura 9).
Esse problema foi resolvido com a humanização dos anticorpos murinos por modernas técnicas
de engenharia genética. Na técnica, os genes responsáveis pela produção dessas proteínas são
modificados de forma a eliminar essa reação imunológica do organismo humano. O processo de
humanização não deve alterar a afinidade do anticorpo com o respectivo antígeno e possibilita
assim a sua aplicação continuada em procedimentos terapêuticos.
Os mais significativos avanços no uso de mAbs se encontram na área de oncologia, uma vez uma nova
geração de medicamentos em desenvolvimento está baseada na capacidade dos mAbs em reconhecer
antígenos específicos de tumores e induzir uma resposta imune contra as células cancerosas. Mais
ainda, os mAbs podem ser modificados e atuarem como portadores de radioisótopos ou toxinas às
células tumorais ampliando, assim, seu espectro de aplicação terapêutica.
Fonte: <biologia12eportefolio.blogspot.com>
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Capítulo 2
Reação de precipitação e aglutinação
Título do anticorpo
A produção de anticorpos contra um determinado antígeno pode ser correlacionada às diluições dos
soros utilizadas para a realização do teste, já que os ensaios não são quantitativos. Nestes ensaios, as
partículas antigênicas são misturadas com seriadas diluições do soro do paciente e como resultado
de produção de anticorpos considera-se a maior diluição em que ocorre a visualização (precipitação
ou aglutinação) da reação antígeno-anticorpo. Esta diluição é chamada de título do anticorpo.
Por exemplo, se estudarmos a produção de anticorpos contra espécies de Leishmania, que causam
calazar, em uma população de área endêmica do Brasil é comum ser observada aglutinação de
formas promastigotas de Leishmania até a diluição de 1:600 (título) na maioria das pessoas. Este
resultado é porque a infecção com diversos parasitas (Trypanosoma, Schistosoma, Plasmodium,
Leishmania que causa a forma mucocutânea) induz a produção de anticorpos que apresentam
reação cruzada com Leishmania donovani. De forma contrastante, o soro de pacientes infectados,
que apresentam calazar, aglutina as formas promastigotas até a diluição de 1:6400 (título). Como
pode ser observado, o título de anticorpos contra Leishmania nas pessoas da região endêmica é de
1:600 enquanto nas pessoas infectadas este aumenta mais de dez vezes.
Imunoprecipitação
As técnicas de imunoprecipitação permitem identificar e até quantificar precipitações resultantes
da interação antígeno-anticorpo, ambos inicialmente solúveis. Nessa técnica é necessário que
a molécula antigênica seja multivalente quanto ao numero de epítopos e, preferencialmente, os
anticorpos sejam policlonais. Para anticorpos monoclonais, a especificidade única exige que o
epítopo esteja acessível e presente em quantidade grande na molécula.
35
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
A curva de precipitação clássica pode ser obtida quando ao anticorpo e concentração constante se
adiciona o antígeno em diferentes concentrações apresentando aspecto parabólico (Figura 10). A
precipitação será máxima na zona de equivalência ou de proporções ideais de antígeno e anticorpo,
e à medida que se adiciona mais antígeno, o imunocomplexo se dissolve. A zona de excesso de
anticorpo (ou falta de antígeno) é chamada de pró-zona e proporciona resultado falso-negativo para
a pesquisa de anticorpo. Essa falha é inaceitável, pois justamente quando há mais anticorpos o
resultado será negativo. Para solucionar esse problema, devem ser utilizadas diferentes diluições do
anticorpo diante da concentração fixa do antígeno.
A visualização de precipitados em meio líquido é difícil, pois tanto as amostras de soros com
anticorpos quanto às soluções antigênicas apresentam turvação e coloração próprias e variáveis.
As técnicas manuais de precipitação atualmente e uso são realizadas em meio gelidificado, o que
facilita a leitura e reduz os volumes necessários para a interação. No entanto, requerem períodos de
horas a dias para a migração molecular e a formação do imunocomplexo.
Imunoaglutinação
Fundamento básico das técnicas de aglutinação é similar ao princípio das técnicas de precipitação,
diferindo na adsorção do antígeno ou do anticorpo a micropartículas insolúveis ou células e permitindo
leitura visual e rápida. A técnica não permite discriminar frações dos componentes antigênicos
como a imunoprecipitação, mas permite a utilização de antígenos purificados e complexos fixados a
micropartículas ou células. Além disso, pode ser mais sensível que a imunoprecipitação e permite a
detecção de pequenas quantidades de anticorpos, especialmente nas técnicas de microaglutinação.
36
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
A execução da técnica pode ser determinada em tubo, lamina ou placa de micro cavidades, sempre
com o envolvimento de diferentes fatores na formação dos agregados, tais como:
»» tempo e temperatura;
»» elevada sensibilidade;
»» baixo custo;
»» leitura visual;
»» facilidade de execução;
37
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
38
Capítulo 3
Quantificação da concentração
antigênica ou de anticorpos
Radioimunoensaio (RIA)
O radioimunoensaio é considerado um método de alta sensibilidade na análise quantitativa das
reações antígeno-anticorpo. Ele permite medidas rápidas e precisas mesmo em preparações não
purificadas. Também apresenta limiar de detecção na ordem de nanogramas ou picogramas. Entre
as limitações do ensaio destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional.
Na rotina pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos
e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Encontramos inúmeras variações deste ensaio,
contudo o princípio utilizado é o mesmo, ou seja, a quantidade de reagente marcado (antígeno ou
anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra (Figura 13).
Radioimunoensaio Direto
No radioimunoensaio direto, coloca-se uma quantidade fixa e limitada de anticorpo que é ligada
a um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada
com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contêm concentrações conhecidas do
antígeno não-marcado. O antígeno não ligado é removido após um período de incubação e faz-se a
39
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Radioimunoensaio de competição
No radioimunoensaio de competição, coloca-se uma quantidade fixa do antígeno em um suporte
sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra
em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. O
anticorpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel é removido por lavagem,
após um período de incubação, e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. De acordo com a
resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.
Radioimunoensaio de captura
No radioimunoensaio de captura, coloca-se uma quantidade fixa de anticorpo imobilizada em um
suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções padrão, com
concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. Após um período de incubação remove-se
o antígeno não ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de
ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não ligado é removido
por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. De acordo com a resposta obtida, a
concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.
»» o anticorpo;
»» o antígeno marcado;
40
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Aplicações
»» pesquisa;
Os testes de ELISA podem ser classificados em testes Homogêneos e Heterogêneos. Nos testes
homogêneos, a atividade enzimática é alterada como parte de uma reação imunológica. Neste tipo
de ensaio não há necessidade de separar o imunocomplexo formado dos imunoreagentes livres. As
técnicas homogêneas são especialmente elaboradas para a dosagem de drogas e haptenos, mas não
tiveram seu uso difundido nos laboratórios de análises clínicas, já que este apresenta problemas
na dosagem de proteínas. Por outro lado, os ensaios heterogêneos são amplamente empregados
na imunologia. Neste tipo de ensaio, a atividade enzimática do imunoreagente marcado não está
diretamente envolvida na reação propriamente dita; no entanto, os reagentes ligados e os reagentes
livres devem ser separados uns dos outros.
A técnica de ELISA heterogênea é feita com algumas etapas de lavagem, como forma de separar os
imunoreagentes ligados dos que não estão ligados.
Esta técnica permite ainda se fazer uso de ensaios competitivos e não competitivos, podendo ainda
dosar antígenos ou anticorpos, neste último caso, todos os isotipos de anticorpos podem ser dosados,
tudo depende da especificidade do anticorpo usado.
41
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
fonte: <www.liaccentralsorologica.com.br>.
Ensaios competitivos
Rotineiramente este tipo de ensaio é usado para se dosar antígenos, neste caso eles possuem fixados
ao suporte sólido anticorpos ou antígenos específicos. Estes métodos são também chamados de
métodos de reagente limitados, pois o antígeno e o anticorpo são usados em quantidades limitadas.
Quando o ensaio usa um anticorpo específico fixado na fase sólida, adiciona-se a amostra do paciente
contendo o antígeno mais o antígeno marcado, com isso eles irão competir pelo anticorpo fixado na
fase sólida. Com a dosagem da amostra do paciente procede-se a um controle do reagente, onde se
adiciona apenas o antígeno marcado com um tampão na fase sólida, com isso tem-se o parâmetro
negativo para, assim, poder comparar com o resultado obtido com a amostra do paciente. Isto é
necessário, pois o sinal detectado na amostra do paciente é inversamente proporcional à quantidade
de analito presente na amostra, ou seja, quanto mais analito na amostra, menor o sinal. Existem
variações do ensaio competitivo em que o antígeno é fixado na fase sólida e o ensaio pode ser realizado
em duas etapas. Nesse caso, numa primeira fase adiciona-se o soro do paciente no suporte, incuba-
se, posteriormente procede-se à lavagem para a remoção de tudo que não ficou ligado ao suporte
sólido, e então adiciona-se o conjugado e procede-se à nova incubação. Nesta etapa, o conjugado
irá se ligar ao antígeno livre do suporte sólido, posteriormente, procede-se a uma nova lavagem e
executa-se a fase de revelação e leitura (Figura 15).
Os ensaios competitivos são ideais para dosagem de moléculas relativamente pequenas que podem
ser obtidas com relativa pureza em grandes quantidades, a fim de serem marcadas com uma enzima.
Como os ensaios competitivos requerem pequenas quantidades de anticorpo, eles são ideais para o
uso em sistemas que há pequenas quantidades de anticorpo.
42
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Fontes: <http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html> e
<http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html>.
Para este tipo de teste, pode-se usar suporte de microplacas de poliestireno, nitrocelulose, esferas
e microesferas.
Quando um anticorpo é ligado à fase sólida, estes ensaios são classificados de ensaios de captura ou
sanduíche, pois o antígeno presente na amostra, que pode ser um anticorpo também, será capturado
pelo anticorpo fixado ao suporte sólido. Posteriormente adiciona-se um anticorpo marcado para um
epítopo diferente do antígeno em questão, que completará o sanduíche. Existem inúmeras variações
deste tipo de ensaio. O antígeno capturado pode ser uma imunoglobulina qualquer, uma proteína
viral ou um antígeno qualquer que tenha, no mínimo, dois epítopos diferentes. Este tipo de ensaio
requer que uma grande quantidade de anticorpo esteja fixada na fase sólida, no entanto, oferece
uma grande sensibilidade.
Os ensaios de ELISA não competitivos podem ser modificados para incorporar camadas adicionais
de reagentes imunes, com isso se obtém o aumento na sensibilidade do ensaio, no entanto, isto acaba
influenciando no custo e no tempo de execução do teste. A aplicação mais comum é o complexo
avidina-biotina, que proporciona um aumento significativo na sensibilidade do teste. O anticorpo
43
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
biotinilado é normalmente usado como o segundo anticorpo do sanduíche. Ele então é posto para
reagir com uma mistura previamente preparada de avidina e peroxidase biotinilada. Esta peroxidase
pode ser desenvolvida com agentes quimioluminescentes como forma de aumentar a sensibilidade.
Fonte: http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html
http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html.
Densidade ótica do controle negativo elevado. Bloquear os sítios da fase sólida que
não
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Controle positivo com valores baixos. Tenha certeza de que o suporte usado é o
correto.
Western Blot
Atualmente, a técnica de Western Blot (WB) tem sido utilizada para estudos detalhados de uma
série de microrganismos incluindo bactérias, vírus e protozoários.
Para cada microrganismo há pequenas variações no tocante ao preparo dos reagentes, mas o
fundamento da reação é o mesmo. Encontramos muita semelhança com o ELISA, mudando apenas
o suporte antigênico que é feito em papel de nitrocelulose.
Como padrão, daremos o exemplo da obtenção dos reagentes, montagem e utilização do teste para
Vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV). Com este exemplo, a compreensão do teste ficará bem
clara.
A técnica de Western Blot teve sua origem na metodologia desenvolvida em 1975 por E.M.
Southern, que ao utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida realizou a separação de proteínas
por peso molecular em um estudo de hibridização DNA-RNA. Este trabalho foi acompanhado, em
1977, pela demonstração por Van Raamsdork de uma técnica para a detecção de determinantes
antigênicos, em moléculas separadas por peso molecular, em gel de poliacrilamida, através de
um teste imunoenzimático utilizando a enzima peroxidase. Finalmente Harry Towbin, em 1979,
demonstrou a possibilidade de transferir as moléculas separadas em gel de poliacrilamida para
folhas de nitrocelulose, facilitando a manipulação das proteínas em uma matriz mais resistente. A
união destas três metodologias formam a técnica de Enzyme-Linked Immunoelectrotransfer Blot
Assay ou técnica de Western Blot.
45
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
46
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Imunoeletroforese
Este ensaio é a combinação da eletroforese de dupla difusão em gel de agar, que se realiza em duas
etapas. Neste particular aplica-se uma corrente elétrica no sistema (Figura 18).
b. difusibilidade;
c. especificidade imunoquímica.
Este é um método que foi utilizado em larga escala em todos os ramos da Biologia, por seu alto poder
de resolução, bastando mencionar que a eletroforese do soro do indivíduo nos permite evidenciar
30 componentes. Há uma combinação de sensibilidade e de poder de identificação dos diferentes
componentes.
Por outro lado, a quantidade de soro é mínima, com apenas 5 μl, pode-se fazer uma análise ampla do
material a ser identificado. No soro humano encontramos, pela eletroforese, 5 componentes: albumina,
alfa 1, alfa 2, beta e gamaglobulina. Estas frações se separam de acordo com as cargas elétricas.
Em uma 2ª fase, aplicando um soro imune específico paralelo a cada uma das frações e fazendo
atuar a corrente elétrica, teremos uma combinação de cada fração antigênica com o soro. Ocorre
uma combinação de cada fração antigênica com o anticorpo correspondente e, por sua vez, dá-se
a separação de outros componentes antigênicos e sua a respectiva combinação com os anticorpos
específicos de cada subfração.
Nesta nova fase podemos proceder à análise de grande quantidade de subfrações combinadas com
os seus anticorpos específicos.
Em Análises Clínicas, a imunoeletroforese foi substituída por uma série de testes modernos, mais
eficientes e de fácil realização, como os testes de imunoenzimático, fluorimétricos e outros que
permitem separação dos componentes como a cromatografia em gel de acrilamida.
47
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Imunodifusão
A metodologia de imunodifusão é realizada em meio semi-sólido, geralmente o ágar ou agarose,
permitindo uma difusão mais homogênea que em meio líquido, mas que tem o inconveniente de
demorar entre 18 e 24 horas para que seja observada a precipitação. A difusão dos imunoprecipitados
no gel depende do tamanho destes; quando são grandes ficam maiores que o diâmetro dos poros, o
que impede a sua difusão. A imunodifusão pode ser simples ou dupla; sendo que é simples, quando
ou o antígeno ou o anticorpo é fixado a um suporte e o outro componente se difunde no meio, até
ocorrer precipitação; é dupla, quando os dois componentes migram um em direção ao outro.
A imunodifusão dupla é realizada numa lâmina de microscópio revestida de ágar, contendo orifícios
onde são colocadas concentrações de Ag e Ac. Quando o antígeno e os anticorpos específicos
encontram-se, em concentrações correspondentes à zona de equivalência, são formados complexos
precipitantes (Figura 19).
Fonte: http://dc399.4shared.com/doc/VshpHDGY/preview.html.
Na figura acima, observa-se que o antígeno X precipitou próximo ao orifício onde ele foi depositado,
sendo que os antígenos Y e Z precipitaram na região média entre os orifícios onde foram depositados
o antígeno e o anticorpo. O efeito observado com o antígeno X pode ser explicado: 1) o antígeno
pode estar em baixas concentrações e a zona de equivalência ocorreu próximo ao orifício onde foi
depositado ou, 2) o peso molecular ou a carga do antígeno interferiu na sua capacidade de migração.
48
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Em resumo, o método é semiquantitativo, pouco sensivel, mais usado para caracterizar antígenos
em infecções ou anticorpos em doenças autoimunes. O tempo longo requerido para a obtenção dos
resultados (praticamente um dia inteiro) é um fator limitante da técnica, além de detectar apenas
reações Ag-Ac nas quais há formação de precipitados. Os ensaios imunoenzimáticos têm substituído
com frequência os testes de imunodifusão.
Fonte: <http://dc399.4shared.com/doc/VshpHDGY/preview.html>.
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
entre 48-72 horas. O diâmetro do halo que se forma ao redor do orifício onde foram depositadas as
amostras corresponde à concentração da molécula, de acordo com a curva padrão obtida (Figura
21A). Para a obtenção da curva-padrão são utilizadas concentrações conhecidas da solução padrão
e após reação com os anticorpos presentes no ágar, os halos são medidos.
Por exemplo, ao dosar as concentrações de IgM do soro de pacientes para a obtenção da curva
padrão deve-se ter uma solução contendo IgM purificada de concentração conhecida.
Esta técnica é utilizada para quantificar as imunoglobulinas IgG, IgM e IgA e moléculas do sistema
Complemento.
Fonte: <http://dc399.4shared.com/doc/VshpHDGY/preview.html>
Pacientes com sífilis desenvolvem uma resposta de anticorpos contra um hapteno ubiquitário
existente nos tecidos dos mamíferos. Trata-se de um fosfolipídio, que pode ser extraído em alto
grau de pureza do coração de bovino e é denominado cardiolipina.
Infecções pelo Treponema pallidum (sífilis) levam à liberação nos fluídos orgânicos de cardiolipina,
a qual faz parte normalmente da membrana mitocondrial, e à produção de anticorpos. Cardiolipina
sozinha, entretanto, somente se liga a anticorpos, mas não estimula sua produção, isto é, atua como
um hapteno. Para tornar-se imunogênica a cardiolipina deve se ligar a uma proteína carreadora.
50
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
51
Capítulo 4
Identificação de antígenos em células
e antígenos
Imunofluorescência
O ensaio de imunofluorescência nos permite detectar e localizar antígenos em células e tecidos
utilizando anticorpos específicos, marcados com fluorocromos, facilitando a localização dos
antígenos por estes estarem visíveis ao microscópio de fluorescência (Figuras 23 e 24).
De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e localizar anticorpos em fluidos biológicos
usando seu antígeno correspondente.
A imunofluorescência é considerada:
»» Teste qualitativo/semi-quantitativo.
Fluorocromos
Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, ficam
fluorescentes. Em 1941 foi a primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos.
Isotionato de fluoresceína (FITC): se excita com luz azul a 490 nm e emite a 514 nm. Seu
rendimento quântico é de 0,5. Produz Quenching.
52
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Fonte: <www.virtual.epm.br>.
Microscópio de epifluorescência
A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através
da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV).
53
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Figura 25 – Epifluorescência
Imunofluorescência direta
1. O anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se
fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável.
Vantagens
54
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Desvantagens
»» Subjetividade da leitura.
Imunofluorescência indireta
A reação da imunofluorescência indireta, ou técnica de dupla camada (Figura 26), é realizada por
antígenos fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um anticorpo específico não fluorescente
e por último coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinantes
antigênicos do primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antígeno. Esta técnica apresenta
como vantagem a possibilidade de se ter uma fluorescência mais evidente, pelo fato do anticorpo
fluorescente se ligar apenas aos anticorpos primários.
Outra vantagem é que por esta técnica pode-se trabalhar com vários anticorpos primários específicos
para diferentes tipos de antígenos e pode-se identificar qual a classe que o anticorpo pertence.
55
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Vantagens
»» Especificidade.
»» Reprodutibilidade.
»» Sensibilidade.
Desvantagens
»» Subjetividade na leitura.
»» Não automação.
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Citometria de fluxo
História
O nível atual da citometria de fluxo (CF) resultou: 1) da evolução tecnológica que se seguiu à primeira
descrição feita por Coulter, em 1956, de um aparelho que contava e media o tamanho de células
que passavam em corrente através dum feixe de luz; 2) da produção e marcação de anticorpos
monoclonais com fluorocromos, que começou na década de 1970; e 3) dos progressos feitos na
tecnologia dos computadores, os quais permitem a análise e manipulação de toda a informação
eletrônica que o método fornece.
Princípio
A amostra observada em CF é constituída por uma suspensão de células ou de partículas, as quais,
incluídas na corrente em fluxo laminar de um líquido condutor, serão forçadas a passar uma a uma
através da câmara de fluxo. Esta câmara é atravessada por um feixe de raios laser com comprimento
de onda preestabelecido. Sempre que o raio laser choca com uma célula, a radiação vai sofrer
desvios que, depois de convertidos pelo citômetro em sinais electrônicos, vão ser reconhecidos pelos
sensores.
Um dos sensores é designado por Forward Angle Light Scatter (FS ou FSC), porque se encontra
colocado no sentido da direção do feixe luminoso. Outro situa-se sensivelmente a 90º dessa direção,
designando-se por isso Ortogonal ou Side Scatter (SS ou SSC). Simplificadamente poderá dizer se
que o sensor FS dá informação sobre o tamanho da célula, baseado na difração e refração da luz,
enquanto o sensor SS, que mede a luz dispersada, avalia a granulosidade intracelular, constituída
pelo núcleo, cromossomos, mitocôndrias e outras organelas ou partículas.
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Fonte: <http://www.labmed.pt/NotasTecnicas05.asp>.
Figura 28 - Histograma de células do sangue periférico, obtido em função da positividade CD45 lida no scatter SS
Fonte: <http://www.labmed.pt/NotasTecnicas05.asp>.
58
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Figura 29 - Após fusão com o receptor CD4 da membrana, o HIV entra no linfócito T onde, por ação de uma
transcriptase reversa, o seu RNA é convertido em DNA, que vai integrar-se no DNA nuclear. Esta célula ficará
infectada durante o seu período de vida e será a fornecedora da energia gasta com a reprodução do HIV. O DNA
viral passa de novo a partículas de RNA, que se agrupam para originar novos vírus. Estes vão reentrar em circulação
aptos a infectar mais linfócitos T, e a célula de onde saíram ou morreu ou morrerá mais tarde ou mais cedo.
< https://www.youtube.com/watch?v=ZeyEYymuacg>
Como todos os leucócitos apresentam nas suas membranas o antígeno CD45, começa por se incubar
o sangue total com um anticorpo marcado específico para esse antígeno, que de maneira geral existe
em maior quantidade nas membranas dos linfócitos. Após passagem do sangue pelo citômetro,
59
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
os variados tipos de leucócitos vão ser agrupados virtualmente num histograma semelhante ao
representado na Figura 28 (gating eletrônico).
Os linfócitos assim agrupados (gated) vão ser agora separados nas suas variadas subpopulações,
após incubação com um painel adequado de anticorpos marcados.
Embora para o estadiamento da infecção por HIV, como veremos, tenha interesse quantificar,
sobretudo, os linfócitos T CD4+ e CD8+, é prática frequente em muitos laboratórios utilizar também
anticorpos contra os antígenos CD3, CD5, CD14, CD16, CD19 e CD56.
Com esta prática, além de se excluírem monócitos que porventura se encontrem entre as células
estudadas, podem-se separar e quantificar especialmente os linfócitos T, os linfócitos B e as
células Natural Killer (NK). Se a soma T+B+NK (no seu conjunto designada por imunossoma)
for aproximadamente igual a 95%, temos a garantia de que não se perderam durante a separação
quantidades significativas de células linfocitárias.
Pelo contrário, o número de linfócitos T CD4+, fundamentais na reação imunológica contra agentes
infecciosos, desce progressivamente, por razões já referidas, após a entrada do HIV no organismo.
Quando atingem as 400-500 células por µL ou menos, o doente, que se manteve durante meses ou
anos assintomático, tem maior probabilidade de adquirir uma ou mais doenças oportunistas que
definem a AIDS (Figura 30C).
60
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Figura 30A
Figura 30B
Figura 30C
Fonte: <http://www.labmed.pt/NotasTecnicas05.asp>.
61
Capítulo 5
Metodologias com uso de biologia
molecular
3. extensão dos primers pela ação da Taq DNA polimerase através da adição de
nucleotídeos livres complementares à fita de DNA original. A seguir, a nova dupla
fita de DNA formada serve como fita original para os subsequentes ciclos, gerando
assim uma escala geométrica de amplificação.
Análises moleculares
A genotipagem molecular pode ser realizada sempre que a sequência de um gene for conhecida
e que as mutações responsáveis por um antígeno ou fenótipo de grupo sanguíneo tenham sido
determinadas.
Atualmente tem merecido destaque também a técnica de Microarray ou tecnologia Chip, por
possuir uma plataforma rápida de genotipagem (diversas amostras ao mesmo tempo) com excelente
descriminação alélica, redução no número de procedimentos isolados (execução de um único PCR
multiplex) e resultado altamente automatizado.
62
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Eles podem não ser eficientes quando dois alelos diferem em apenas um nucleotídeo. Este método
tem grande aplicação na tecnologia Chip.
Figura 31: Produto de PCR alelo específico após eletroforese em gel agarose
Fonte: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-05962008000300002>
Técnica de PcR-RflP
Já a técnica de PCR-RFLP é adequada quando a mutação polimórfica estiver associada à produção
ou remoção de um sítio de enzima(s) de restrição. A vantagem deste procedimento é possibilitar a
amplificação ao mesmo tempo de ambos alelos com um único par de primers. Assim, uma reação
positiva (produto de PCR amplificado) é observada com ambos os alelos, que servem como um
controle interno. A diferenciação dos alelos é feita depois da digestão do produto de PCR com uma
enzima de restrição, capaz de identificar a mutação de ponto e, após eletroforese, para a melhor
visualização do tamanho dos fragmentos (Figura 34).
Fonte: <http://www.ufpe.br/biolmol/aula7_PCR-RAPD-aplicar.htm>,modificado.
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Painel A
Painel B
Pista 1
Pista 2
Pista 3
Pista 4
Pista 5
Técnica de Microarray
A técnica de Microarray utiliza um PCR multiplex que possibilita a análise de vários polimorfismos
simultaneamente e sondas de oligonucleotídeos depositadas em uma placa (vidro, sílica ou outros
suportes) marcadas com fluorescência e hibridizadas com DNAs alvo (amplificados através do PCR
multiplex), gerando um espectro de cor (caso haja a hibridização) que é detectado e interpretado
por um sistema automatizado capaz de avaliar a intensidade das hibridizações e fornecer resultados
que podem ser visualizados na forma de gráficos ou tabelas de genótipos (Figura 33).
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Fonte: <http://www.biotools.eu/arrays.html>.
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
10. Testes em medicina legal – Paternidade e testes forenses podem ser realizados
através da genotipagem molecular com maior chance de resolução.
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Capítulo 6
Diagnósticos laboratoriais
(Ministério da Saúde)
Doença de Chagas
Aspectos clínicos
Destacam-se por sua importância epidemiológica as formas agudas (indício de transmissão ativa),
indeterminadas (mais frequentes), cardíacas e digestiva (gravidade clínica). Estima-se que as formas
agudas aparentes se manifestam em 3% dos casos em área endêmica; as formas indeterminadas em
50%; as formas cardíacas em 30%; e as digestivas em 7 a 8%.
Diagnóstico laboratorial
Parasitológico
»» Exame a fresco
»» Gota espessa
»» Esfregaço corado
»» Creme leucocitário
»» Xenodiagnóstico
»» Métodos Imunológicos:
›› Hemaglutinação indireta
›› Imunofluorescência
›› ELISA
Todos os métodos parasitológicos acima destacados, na prática, são utilizados para diagnóstico da
fase aguda, quando a parasitemia é intensa. As sorologias que detectam IgM (imunofluorescência e
hemaglutinação) também são utilizadas para diagnóstico da fase aguda, entretanto só deve firmar
diagnóstico de forma aguda com o encontro de parasitas no sangue periférico. Já na fase crônica,
utilizam-se mais com mais frequência os métodos de detecção de anticorpos circulantes (IgG) e os
métodos imunológicos (ELISA, a imunofluorescência e a hemaglutinação indireta).
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
HIV/AIDS
Diagnóstico laboratorial
O diagnóstico laboratorial do HIV é realizado por meio da utilização de métodos que permitam
investigar anticorpos anti-HIV, antígenos, material genético ou que possam isolar o vírus em cultura.
Para os infectados menores de 18 meses de idade, investiga-se o DNA ou RNA viral, uma vez que
poderia haver reação cruzada com os anticorpos maternos nas crianças. Desta forma, as técnicas
utilizadas são o PCR para DNA viral e RT-PCR para RNA viral.
Os indivíduos com mais de 18 meses de idade, utilizam testes que pesquisam os anticorpos como os
métodos de ELISA, Western Blotting, Imunofluorescência Indireta.
No entanto, deve ser levado em consideração que os anticorpos anti-HIV somente serão detectáveis
em torno de 30 dias após a infecção em indivíduos imunologicamente competentes.
Esse intervalo entre a infecção pelo patógeno e a detecção dos anticorpos por metodologias
laboratoriais é denominado janela imunológica. Nesse período, podemos encontrar provas
sorológicas falso-negativas e por isso, há a necessidade de realizar testes em tempos diferentes.
Na rotina, o método de ELISA é usado amplamente como teste inicial para a detecção de anticorpos
anti-HIV no sangue dos pacientes. Se o resultado for positivo, o indivíduo deverá realizar outros
testes adicionais confirmatórios como a Imunofluorescência Indireta e Western Blot.
Febre amarela
Diagnóstico sorológico
Existem vários testes empregados no diagnóstico sorológico de febre amarela, sendo os mais
frequentemente utilizados:
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Na infecção primária, anticorpos IgG específicos são encontrados regularmente e anticorpos IgM
são altamente específicos e usualmente presentes.
69
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Definição de caso
Caso suspeito
Paciente com quadro febril agudo (há menos de 7 dias), de início súbito,
acompanhado de icterícia e que apresente pelo menos um dos seguintes achados
clínicos e/ou laboratoriais ou paciente com quadro (há menos de 7 dias), de início
súbito, procedente de área endêmica para febre amarela silvestre e/ou de ocorrência
de casos de febre amarela:
»» sinal de Faget;
»» albuminúria;
»» oligúria.
Todo caso suspeito que tenha pelo menos uma das seguintes condições:
É o caso suspeito de febre amarela que evoluiu para óbito em menos de 10 dias,
sem confirmação laboratorial, no curso de surto ou epidemia em que outros casos já
tenham sido comprovados laboratorialmente.
Caso descartado
Caso suspeito com diagnóstico laboratorial negativo, desde que se comprove que
as amostras foram coletadas e transportadas adequadamente, ou caso suspeito com
diagnóstico laboratorial de outra doença.
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Leptospirose
A leptospirose humana é considerada uma antropozoonose (em que a participação humana no ciclo
do parasito é apenas acidental) de distribuição mundial, com maior incidência em áreas pobres ou
regiões afetadas por catástrofes naturais.
Os sintomas da leptospirose humana são pleomórficos, muitas vezes brandos, parecendo uma gripe.
A Leptospira produz toxinas e enzimas responsáveis pelos quadros mais graves, depois à icterícia.
Dores musculares geralmente estão presentes.
O diagnóstico tem importância para que a terapêutica antimicrobiana seja instituída, reduzindo a
morbidade e a letalidade da doença.
A pesquisa de anticorpos específicos utilizando testes mais sensíveis pode contornar essas
dificuldades. Vale lembrar que o período curto de incubação da infecção aos sintomas mantém a
maioria dos pacientes na janela imunológica por até uma semana já apresentando sintomas. Testes
de detecção de anticorpos IgM por ELISA ajudam a reduzir esse período de janela.
Malária
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Raiva
De acordo com dados clínicos e epidemiológicos, a suspeita da doença se instala e, assim, faz-se
necessária a confirmação laboratorial.
No caso da raiva, por ser uma doença de período de incubação curto, ou seja, apresenta um intervalo
de tempo curto entre a infecção e o aparecimento da doença, também é realizado o diagnóstico pós-
morte através da análise de fragmentos do cérebro pela técnica de Imunofluorescência Direta.
Hepatites A-E
No Brasil, as hepatites virais mais comuns são as causadas pelos vírus A, B, C e D. Existe, ainda, o
vírus E, contudo é mais frequente na África e na Ásia. Milhões de pessoas no Brasil são portadoras
dos vírus B ou C e não sabem, portanto, correm o risco de as doenças evoluírem (tornarem-se
crônicas) e causarem danos mais graves ao fígado como cirrose e câncer. Por isso, é importante ir ao
médico regularmente e fazer os exames de rotina que detectam a hepatite.
A progressão das hepatites varia conforme o tipo de vírus. Os vírus A e E apresentam apenas formas
agudas de hepatite (não possuindo potencial para formas crônicas). Isso nos leva a apontar que,
após uma hepatite A ou E, o indivíduo pode recuperar-se completamente, eliminando o vírus de
seu organismo. Já as hepatites causadas pelos vírus B, C e D podem apresentar formas agudas e
crônicas de infecção, que é o quadro de a doença persistir no organismo por mais de seis meses.
Hepatite A
Diagnóstico laboratorial
Exames:
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Hepatite A Resultados
Condição Anti-HAV IgM Anti HAV IgG
Aguda + - ou +
Imunidade - +
Obs: (-) = Não reagente (+) = Reagente
Hepatite B
Diagnóstico laboratorial
Exames:
Hepatite B Resultados
Condição Anti-HBcT Anti-HBcM Anti-HBcG HBsAg Anti-HBs HBeAg Anti-HBe HBV DNA
Incubação - - - + - + - +
Aguda + + - ou + + - + - +
Crônica + - + + - - ou + - - ou +
Portador + - + + - - + -
Recuperação + - + - + - + -
Imunização - - - - + - - -
Infecção pregressa + - + - + - - ou + -
Obs: (-)=Não reagente (+)=Reagente
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
Hepatite C
Diagnóstico laboratorial
Exames:
Hepatite C Resultados
Condição Anti-HCV HCV RNA
Aguda + +
Crônica + - ou +
Obs: (-) = Não reagente (+) = Reagente
Hepatite D
Diagnóstico laboratorial
Exames:
Hepatite D Resultados
Condição Anti-HDV
Ausência de Infecção -
Infecção +
Obs: (-) = Não reagente (+) = Reagente
Hepatite E
Diagnóstico Laboratorial
Exames:
Hepatite E Resultados
Condição Anti-HEV IgM Anti HEV IgG
Aguda + - ou +
Imunidade - +
Obs: (-) = Não reagente (+) = Reagente
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Sífilis
Diagnóstico laboratorial
Pesquisa de Treponema
Existem alguns meios de pesquisar o treponema tanto para casos de sífilis congênita como em
situações recentes e tardias da doença.
Faz-se a coleta adequada, retirando-se a camada de material que recobre a lesão com cuidado para
que não sangre e, em seguida, coloca-se uma lâmina em contato com a superfície de ulceração para
coletar a gota de exsudato (líquido com alto teor de proteína resultante de processo inflamatório)
que aí se forma. Então, a lâmina é observada por microscopia logo após a coleta do material.
Seco e fixado ao calor brando, o material pode ser corado pela prata. Para material de lesões mucosas
da boca é preferível uma coloração por imunofluorescência, pois podem existir neste material
treponemas que não são patogênicos, mas que possuem uma morfologia semelhante àqueles que
provocam a doença.
(imunofluorescência) (fluorescência)
Pela técnica direta, a lâmina é incubada com anticorpo conjugado à fluorescência e específico para
T. pallidum. Na falta deste anticorpo, pode-se proceder à técnica indireta utilizando-se um soro
reagente bem concentrado de um paciente com sífilis. Este soro reagente servirá para provocar,
mais tarde, uma reação no material que se deseja analisar, sendo o resultado dessa reação uma
confirmação ou não da presença do treponema.
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
A partir do soro ou do líquido cefalorraquidiano (LCR), o T. pallidum pode ser isolado por inoculação
em testículo de coelho. Além disso, ele pode ser evidenciado através da identificação de seu segmento
de DNA em tecidos, soros ou líquido cefalorraquidiano.
Testes sorológicos
São divididos em dois tipos, de acordo com os reagentes antigênicos empregados: testes de
cardiolipina e testes treponêmicos.
a. Testes de cardiolipina
Obs.: Para maior entendimento dos testes de cardiolipina, veja o tópico avançado
sobre testes sorológicos na página inicial ou clique em sorologia.
b. Testes treponêmicos
Toxoplasmose
Diagnóstico laboratorial
Classicamente, tem-se baseado na pesquisa de anticorpos contra o parasito (IgG, IgM, IgA, IgE )
1. Isolamento do Toxoplasma
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
2. Pesquisa de antígenos
Dispendioso e exigido controles rigorosos para evitar resultados falsos, este vem
se tornando mais prático, atualmente podendo ser completados em menos de
48 horas.
3. Testes de hemaglutinação
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
aguda) observa-se a presença de IgM, IgG de baixa avidez, IgA e IgE. Posteriormente, evidencia-se o
declínio da IgM, a IgA e da IgE e o aparecimento da IgG de alta avidez (perfil II – fase intermediária).
A terceira fase, caracteriza-se pela presença de IgG de alta avidez em concentração constante (perfil
III – fase crônica).
Dengue
Diagnóstico laboratorial
Os métodos de diagnostico laboratorial empregados hoje em dia para diagnóstico de dengue são
o isolamento viral em culturas celulares (C6/36), o MAC-ELISA, o ELISA de inibição e a inibição
da hemaglutinação. Seja qual for o método, o isolamento viral deverá ser feito até o quinto dia de
doença e a sorologia após este período, sempre com acompanhamento dos órgãos de Saúde.
Tuberculose
É uma doença bacteriana, causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis que, ao se instalar
no organismo (por meio da inalação de gotículas de saliva expelidas pela tosse ou espirro de um
indivíduo com a doença), aloja-se nos alvéolos pulmonares iniciando sua multiplicação no interior
dos macrófagos alveolares, que são as células com função fagocítica.
Métodos sorológicos
Em geral apresentam problema de baixa sensibilidade e especificidade. Pessoas não infectadas que
foram vacinadas ou que já ficaram doentes, uma vez podem ser confundidas com aquelas realmente
infectadas pela presença de anticorpos no seu sangue.
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Avanços no diagnóstico
Não vimos alterações significantes nas últimas décadas no que tange ao diagnóstico exclusivo
da tuberculose, já que os sintomas e os exames clássicos eram suficientes para o tratamento dos
pacientes. Contudo, surgiu a necessidade de técnicas mais avançadas com o crescimento da
associação HIV-tuberculose, e a tuberculose multi-resistente (TBMR). Isto se deve por encontrar
em pacientes portadores do HIV espécies outras de Mycobacterium sp como aquelas do complexo
Mycobacterium avium que também podem ser responsáveis pela manifestação da doença. O uso
de técnicas como o PCR permite que sequências de DNA presentes em poucas cópias possam ser
amplificadas in vitro e quantidades amplificadas de material genético possam ser visualizadas e
identificadas.
Tal fenômeno ocorre através da interação destas hemolisinas com seus anticorpos, ou seja,
anticorpos antiestreptolisina O (ASLO) presentes no organismo do hospedeiro, no caso, no homem.
A elevação de anticorpos antiestreptolisina séricos, na faixa de 166 UI/mL a 200 Ul/mL, é indicador
de um contato prévio com a bactéria estreptococo beta hemolítico do grupo A, atingindo os seus
valores máximos entre quatro a seis semanas. Embora na tuberculose o ASLO também possa se
elevar, neste caso, não está associado à bactéria estreptococo beta hemolítico do grupo A.
Para um correto diagnóstico o ASLO deve ser dosado logo após o jejum de oito horas e a sua detecção
se faz indiretamente por meio de provas que mostram a elevação de anticorpos contra a enzima
estreptolisina O.
A dosagem deste anticorpo pode ser realizada por nefelometria cujo principio está baseado na leitura
da intensidade da luz dispersa (espalhada) pela amostra em ângulo de 90° usando como referência
a direção da luz incidente. Em suma, em reações de precipitação entre antígeno e anticorpo em
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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA
soluções diluídas verificamos aumento da reflexão da luz, que pode ser medida de forma direta pela
dispersão da luz incidente.
A quantidade e a natureza da dispersão dependem tanto da forma como tamanho das partículas, e
mais ainda da concentração, comprimento de onda da luz e do índice de refração do meio.
As substâncias são medidas pela adição de quantidades constantes de anticorpos puros e opticamente
claros a concentrações crescentes da substância em análise. O feixe de luz incide sobre os complexos
formados na solução do tubo ou cubeta e a intensidade de luz dispersada é medida por uma célula
fotométrica como densidade óptica.
a. é totalmente automatizada;
No entanto, como esta técnica tem sido realizada hoje em dia, mais manualmente, a dosagem do
ASLO tem sido realizada também por ELISA, turbidimetria, neutralização da toxina entre outros.
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Para (não) Finalizar
O entendimento dos sistemas sanguíneos apresentados neste caderno (ABO e Rh) é importante por
serem os mais conhecidos na prática de transfusão de sangue. Sendo assim, bancos de sangue, que
lidam rotineiramente com estes processos, necessitam de profissionais habilitados e conhecedores
da prática e, sobretudo, do fundamento teórico embutido nas análises. Lembramos que existe uma
infinidade de outros sistemas sanguíneos, cada qual com sua importância, o que nos leva a motivá-
lo a não estreitar seu centro de conhecimento do assunto. Da mesma forma, entender as implicações
de doenças associadas a reconhecimento de antígenos como a DHRN é importante na análise e
orientação de gestações de risco e se constitui uma ferramenta poderosa, que pode ajudar nos
exames de rotina laboratorial, bem como na correlação com outros exames laboratoriais.
Portanto, fica claro o objetivo deste caderno de estudos no sentido de aprimorar e consolidar os
conhecimentos em Imunohematologia e Imunologia Clínica e auxiliar também nas boas práticas de
rotina laboratorial.
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Referências
ABBAS, A K.; LICHTMAN. A.; PROBER, J. lmunologia celular e molecular. 6. ed. Rio de
Janeiro: Revinter, 2010.
BENNETT, J.C.; PLUM, F. Tratado de Medicina lnterna. 21. ed. Rio de Janeiro: Guanabara-
Koogan, 2001.
Guidelines for the blood transfusion services in the United Kingdom. The Stationary
Office, London. 7th edition 2005
LIMA, A.O; SOARES, J.B; GRECO, J.B; GALIZI, J; CANÇADO, J.R. 8.ed. Métodos de laboratório
aplicados à clínica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
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Referências
www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0104-42302010000600026&lng=en&nrm=i
so>. Acesso em: 29 mar. 2013.
PARSLOW, T.G; STITES, D.P; TERR, A.I; IMBODEN, J.B. Imunologia médica. 10.ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2004
QUINLEY, E.D. Immunohematology – principles & pratice. The Point. 3 edition. USA. 2011
VAZ, A.J, TAKEI, K; BUENO, E.C. Imunoensaios. Fundamentos e aplicações. Guabanara Koogan:
Rio de Janeiro, 2007.
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