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Departamento de Biotecnología

Efecto del pH en la actividad enzimática

Sergio Huerta Ochoa

UAM-Iztapalapa
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• pH
– También afecta la forma y por lo tanto la tasa de reacción, cada
enzima tiene un pH óptimo.
– Éste está entre pH 6 - 8 para la mayoría de las enzimas.
– Sin embargo, las enzimas digestivas en el estómago están
diseñadas para trabajar mejor a pH 2 mientras las del intestino
tienen un óptimo a pH 8, ambas se ajustan a su medio ambiente.
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Aminoácidos
Las cadenas laterales (grupos R) en aminoácidos pueden ser:
Alanina Leucina Valina Isoleucina

no polares

Prolina Metionina Fenil alanina Triptofano

Glicina Serina Treonina Asparagina Glutamina

Polares

Ác. aspártico Ác. glutámico Cisteína Tirosina

Ácidos
Lisina Argenina Histidina

bases

y éstos determinan el comportamiento en agua

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De los 20 amino ácidos, 13

tienen dos grupos ionizables,
los grupos alfa-carboxilos y los
alfa-amino. Los 7 amino ácidos
restantes tienen tres grupos
ionizables, debido a que su
grupo R también puede ser
ionizado.

El pH del ambiente del amino

ácido y el pK de los grupos
ionizables determinarán la
carga asociada con un amino
ácido.
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Aminoácidos más comunes en el sitio activo

Cisteina
Serina

Histidina
Aspartato
Glutamato
Lisina
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Ionización de las cadenas laterales

Forma que predomina Forma que predomina
pKa
debajo del pKa arriba del pKa
Aspartato
3.9
CH2 COOH CH2 COO
1 3162
Glutamato
4.1
CH2 CH2 COOH C H2 CH2 COO
1 1995

Histidina
HN N
6.0
CH2 CH2
NH NH
1 25
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Ionización de las cadenas laterales

Forma que Forma que
pKa
predomina debajo predomina arriba
del pKa del pKa
Cisteina
8.4
CH2 SH CH2 S

1 10

Tirosin
a
10.1
CH2 OH CH2 O

500 1
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Ionización de las cadenas laterales

Forma que predomina Forma que predomina
pKa
debajo del pKa arriba del pKa

Lisina
10.5
CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 CH2 CH2 CH2 CH2 NH2
1260
1

Arginina
NH2 12.5 NH
CH2 CH2 CH2 NH C CH2 CH2 CH2 NH C
NH2 NH2

125890 1
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Los grupos ionizables en las proteinas frecuentemente tienen valores de pKa

perturbados los cuales corresponden al de la identificación del residuo

La perturbación en los pKa es el resultado del hecho de que los grupos ionizables
están frecuentemente en un ambiente más hidrofóbico dentro de la proteina y están
involucrados frecuentemente en redes de enlaces hidrógeno
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La Quimotripsina es una enzima digestiva que pertenece a la superfamilia de las serin

proteasas. Utiliza un residuo activo de serina para llevar a cabo la hidrólisis en el C-terminal
de los aminoácidos aromáticos de otras proteínas. La Quimotripsina es una proteas que enlaza
el C-terminal de fenilalanina, triptofano y tirosina en cadenas de péptidos. Tiene especificidad
por los aminoácidos aromáticos debido a su bolsa hidrofóbica.
El estudio de su cinética proporciona evidencia de Mecanismo Ping-Pong
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pH Influences Chymotrypsin Activity

Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.162

Relative Activity

5 6 7 8 9 10 11
pH
Charge Relay in Active Site
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H
O
C

=
C–O - H–N N H–O–CH2 Ser
195
C C

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158
Asp 102 H
CH2

His 57

H Active Ser
O
C
=

C–O–H N N–H - O–CH Ser

2
195
C C
Asp 102 H
CH2

His 57
Imidazole on Histidine
Planta Piloto Is Affected by pH
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Adapted from Dressler & Potter (2000) Discovering Enzymes, p.163

pH 6 H H pH 7
C + C
H–N N–H H–N N
H+
C C C C
H H

H
O Inactive
C +
=

C–O - H–N N–H H–O–CH2 Ser

195
C C-H
Asp 102
CH2

His 57

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158
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http://glencoe.mheducation.com/sites/dl/free/0078759864/383930/BL_11.html
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Actividad (pH óptimo) Estabilidad

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El efecto de pH sobre la cinética enzimática en solución
K1 K2
−H + −H +
 → −   → 2 −
E E E
← 
+H + ← 
+H +

donde: E- denota la forma activa de la enzima

E y E2- son formas inactivas obtenidas por protonación y desprotonación
del sitio activo.

El equilibrio ácido base entre las tres especies E, H+, y E-, requiere
h+e−
= K1
e
h + e 2−
= K2
e−

Si e0 denota la concentración total de enzima

e0 = e + e − + e 2−

e−
la fracción activa y− = y está dado por
e0
− e−
y ≡
e + e − + e 2−
e−
y− = + −
h e − K 2e −
+e +
K1 h+
1
y− = +
h K
1+ + +2
K1 h
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Tomando logaritmos
−  h+ K 
log y = − log  1 + + +2 
 K1 h 
− e−
Vmax esta definida como: V max = e 0 k cat , además sabemos que y = , por lo tanto
e0
k cat e 0
V max = k cat e 0 y − =
h+ K
1+ + +2
K1 h
Por lo tanto graficando log Vmax versus pH debe exhibir el mismo comportamiento que
log y- versus pH.
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Estimación de pK1 y pK2 más importantes del sitio activo de
forma gráfica
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Estimación de pK1 y pK2 más importantes del sitio activo por
POLYMATH Results regresión no-lineal
06-26-2007 k cat e0
Vmax = k cat e0 y − =
h+ K2
Nonlinear regression (L-M)
1+ +
Model: vmax = kcat*0.003/(1+pH/pk1+pk2/pH)
K1 h +
Variable Ini guess Value 95% confidence
kcat 2.0E+04 1.998E+04 29.947656
pk1 4.2 3.3031477 0.0064151
pk2 6.2 8.4916206 0.0164501

Nonlinear regression settings

Max # iterations = 64

Precision
R^2 = 0.9999999
R^2adj = 0.9999999
Rmsd = 6.776E-05
Variance = 5.624E-08

General
Sample size =7
# Model vars =3
# Indep vars =1
# Iterations =7
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Ho-Shing Wu, Ming-Ju Tsai. 2004. Kinetics of

tributyrin hydrolysis by lipase. Enzyme and
Microbial Technology 35: 488–493.