Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Métodos de análisis

Docente responsable de la práctica:

Olguín Ruiz Gabriela Edith

Alumno:
López Portillo Felipe de Jesús

Práctica:
“Determinación de proteínas por el método de Lowry y Bradford”

Grupo: 5QM2 Sección: 3

Fecha de entrega: 06 de marzo, 2018.

Objetivos.
 Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método
fotométrico.
 Determinar el efecto de algunas sustancias no proteínicas, que pueden interferir en el método.
 Determinar si hay evidencia estadísticamente significativa en la precisión y exactitud en el método de
Bradford respecto al de Lowry
 Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry, con respecto a otros métodos (bradford)
para la cuantificación de proteínas.

Resultados: Método de Lowry.

En la práctica se determinó las absorbancias de los tubos duplicados (1-5) para la elaboración de la
curva de calibración de albumina.

Tabla 1. Absorbancias a 590 nm de los tubos duplicados para la elaboración de la curva de calibración de
albumina.
Absorbancia (590 nm)
Tubo Cantidad de proteína (μg/mL)
Serie A Serie B
1 25 0.075 0.085
2 50 0.139 0.151
3 75 0.211 0.202
4 100 0.255 0.262
5 125 0.303 0.323
Se usó 0.25mg/mL de solución de proteínas.

Cálculos.
Se realiza el siguiente ejemplo para la determinación de cantidad de proteína en microgramos/ mililitro para
cada tubo.

(0.25mg)0.1mL mg
𝐓𝐮𝐛𝐨 𝟏 = = 0.025
1mL mL
𝟏 𝐌𝐢𝐥𝐢𝐠𝐫𝐚𝐦𝐨 = 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝐌𝐢𝐜𝐫𝐨𝐠𝐫𝐚𝐦𝐨𝐬
Una vez obtenidas las absorbancias, estas se grafican para obtener diferentes parámetros.
Grafica 1. Obtención de la curva tipo para la determinación de proteínas, regresión lineal, coeficiente de
determinación y coeficiente de correlación.

0.35

0.3

0.25
Absorbancia (590 nm)

0.2
y = 0.0023x + 0.0268
0.15 R² = 0.9921
R = 0.9960
0.1

0.05

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Cantidad de proteina (μg/mL)

Calculos.
Una vez obtenida la regresión lineal se procede a determinar la cantidad de proteínas que contiene
cada tubo, los resultaos quedan expuestos en la tabla 2, Mientras que la tabla 2.1 se ve reflejado el
análisis estadístico de acuerdo al manual.

Determinación de la cantidad de proteínas mediante la regresión lineal.

Absorbancia (A) = 0.0023(cantidad) + 0.0268
Por lo tanto:
Cantidad = (A) - 0.0268 / 0.0023
Por lo que, para el tubo uno:
Tubo 1 = (0.197 − 0.0268) ÷ 0.0023 = 74.00
Tabla 2. Análisis estadístico: determinación de la cantidad de proteínas en cada tubo mediante la regresión
lineal de la gráfica 1
Tubo Absorbancia (590 nm) Cantidad de proteínas (μg/mL)
1 0.197 74.00
2 0.213 80.95
3 0.232 89.21
4 0.201 75.73
5 0.197 74.00
6 0.202 76.17
7 0.205 77.47
8 0.192 71.82
9 0.197 74.00
10 0.200 75.30

Tabla 2.1. Analisis estadistico: Obtencion de la media aritmetica, desviacion estandar varianza, coeficiente de
variacion y los limites de confianza a partir de los datos obtenidos en la Tabla 2.

n gL X S S2 %C.V. µ
10 9 76.86 4.98 24.86 6.47 73.3 ≤ µ ≤ 80.42

Formulas empleadas para la tabla 2.1:

𝑆 4.98
%𝐂. 𝐕 = (100) = (100) = 6.47
𝑋 76.86
𝑡𝑆 (2.262)4.98
µ =x ± √𝑛
= 76.86 ± √10
= 76.86 ± 3.56

Para observer las posibles interferencias de sustancias no proteicas en el metodo de lowry se procede a
determinar la cantidad de proteinas de acuerdo a las absorbancias obtenidas a 590 nm dichos resultados se
comparan con los limites de confianza para decidir que tipo de interferencia es cada compuesto.
Tabla 3. Efecto de algunas sustancias no proteinicas en el metodo de lowry.
Tubo Sustancia Absorbancia Cantidad de proteínas (μg/mL) Tipo de interferencia

1 Fenol 2.099 900.95 Positiva

2 Mercaptoetanol 0.205 77.47 Sin interferencia
3 Tris pH 10 0.161 58.34 Negativa
4 Urea 0.231 88.78 Positiva
5 NH4SO4 0.270 105.73 Positiva

Calculos.
Determinación de la cantidad de proteínas mediante la regresión lineal.
Absorbancia (A) = 0.0023(cantidad) + 0.0268
Por lo tanto:
Cantidad = (A) - 0.0268 / 0.0023
Por lo que, para el tubo uno:
𝐓𝐮𝐛𝐨 𝟏 = (2.099 − 0.0268) ÷ 0.0023 = 900.95

Resultados: Método de Bradford.

En la práctica se determinó las absorbancias de los tubos duplicados (1-5) para la elaboración de la
curva de calibración de albumina.

Tabla 4. Absorbancias a 590 nm de los tubos duplicados para la elaboración de la curva de calibración de
albumina.
Tubo Cantidad de proteína (μg/mL) Absorbancia (590 nm)
Serie A Serie B
1 25 0.082 0.149
2 50 0.249 0.282
3 75 0.396 0.358
4 100 0.432 0.484
5 125 0.522 0.504
Se usó 0.25mg/mL de solución de proteínas.

Cálculos.
Se realiza el siguiente ejemplo para la determinación de cantidad de proteína en microgramos/ mililitro para
cada tubo.

(0.25mg)0.1mL mg
𝐓𝐮𝐛𝐨 𝟏 = = 0.025
1mL mL
𝟏 𝐌𝐢𝐥𝐢𝐠𝐫𝐚𝐦𝐨 = 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝐌𝐢𝐜𝐫𝐨𝐠𝐫𝐚𝐦𝐨𝐬

Una vez obtenidas las absorbancias, estas se grafican para obtener diferentes parámetros.
Grafica 2. Obtención de la curva tipo para la determinación de proteínas, regresión lineal, coeficiente de
determinación y coeficiente de correlación.

0.6

0.5
Absorbancia (590 nm)

0.4

0.3
y = 0.0039x + 0.0568
0.2 R² = 0.9502
R = 0.9747
0.1

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Cantidad de proteina (μg/mL

Cálculos.
Una vez obtenida la regresión lineal se procede a determinar la cantidad de proteínas que contiene
cada tubo, los resultaos quedan expuestos en la tabla 5, Mientras que la tabla 5.1 se ve reflejado el
análisis estadístico de acuerdo al manual.

Determinación de la cantidad de proteínas mediante la regresión lineal.

Absorbancia (A) = 0.0039(cantidad) + 0.0568
Por lo tanto:
Cantidad = (A) - 0.0568 / 0.0039
Por lo que, para el tubo uno:
Tubo 1 = (0.197 − 0.0568) ÷ 0.0039 = 74.00
Tabla 5. Análisis estadístico: determinación de la cantidad de proteínas en cada tubo mediante la regresión
lineal de la gráfica 2.
Tubo Absorbancia (590 nm) Cantidad de proteínas (μg/mL)
1 0.449 100.56
2 0.410 90.56
3 0.352 75.69
4 0.434 96.71
5 0.298 61.84
6 0.367 79.53
7 0.383 83.64
8 0.374 81.33
9 0.401 88.25
10 0.384 83.89

Tabla 5.1. Analisis estadistico: Obtencion de la media aritmetica, desviacion estandar varianza, coeficiente de
variacion y los limites de confianza a partir de los datos obtenidos en la Tabla 5.

n gL X S S2 %C.V. µ
10 9 84.2 10.97 120.42 13.02 76.36 ≤ µ ≤ 92.04

Formulas empleadas para la tabla 5.1:

𝑆 10.97
%𝐂. 𝐕 = (100) = (100) = 13.02
𝑋 84.2
𝑡𝑆 (2.262)10.97
µ =x ± √𝑛
= 84.2 ± √10
= 84.2 ± 7.84

Para observer las posibles interferencias de sustancias no proteicas en el metodo de lowry se procede a
determinar la cantidad de proteinas de acuerdo a las absorbancias obtenidas a 590 nm dichos resultados se
comparan con los limites de confianza para decidir que tipo de interferencia es cada compuesto.

Calculos.
Determinación de la cantidad de proteínas mediante la regresión lineal.
Absorbancia (A) = 0.0039(cantidad) + 0.0568
Por lo tanto:
Cantidad = (A) - 0.0568 / 0.0039
Por lo que, para el tubo uno:
Tubo 1 = (0.537 − 0.0568) ÷ 0.0039 = 123.12
Tabla 6. Efecto de algunas sustancias no proteinicas en el método de Bradford.
Tubo Sustancia Absorbancia Cantidad de proteínas (μg/mL) Tipo de interferencia

1 Fenol 0.537 123.12 Positiva

2 Mercaptoetanol 0.344 73.64 Negativa
3 Tris pH 10 0.337 71.84 Negativa
4 Urea 0.395 86.71 Sin interferencia
5 NH4SO4 0.294 60.2 Negativa

Resultados: Comparación entre la exactitud y la precisión de ambos métodos.

Tabla 7. Analisis estadistico entre la exactitude de ambos metodos: Obtencion de la Tcalculada.

Cantidad de proteínas (μg/mL)
Tubo Bradford (P) Lowry (R) Di ̅
Di - 𝑫 ̅ )2
(Di - 𝑫
1 100.56 74.00 26.56 19.22 369.40
2 90.56 80.95 9.61 2.27 5.15
3 75.69 89.21 -13.52 -20.85 434.72
4 96.71 75.73 20.98 13.64 186.04
5 61.84 74.00 -12.16 -19.49 379.86
6 79.53 76.17 3.36 -3.97 15.76
7 83.64 77.47 6.17 -1.16 1.34
8 81.33 71.82 9.51 2.17 4.70
9 88.25 74.00 14.25 6.91 47.74
10 83.89 75.30 8.59 1.25 1.56
̅ )𝟐
∑(𝐃𝐢 − 𝐃
∑ 𝑫i = ̅ = ∑ 𝑫 𝐢 /𝐧
𝑫 ̅ )2
∑(𝐃𝐢 − 𝑫 SD = √ ̅ √𝒏
𝐧−𝟏 Tcalc = 𝑫 TTablas.
𝑺𝑫

73.35 7.335 1446.27 12.67 1.83 2.26

P: Metodo de prueba; R: Metodo de referencia.

Tabla 8. Analisis estadistico entre la presicion de ambos metodos: Obtencion de la Fcalculada.

S2 de Bradford S2 de Lowry Fcalculada = S2 mayor/ S2 menor FTablas.

120.42 24.86 4.84 4.03

Discusión.
La ley de Beer afirma que la absorbancia es proporcional a la concentración de la especie absorbente. Si de
una serie de soluciones de una misma sustancias de la absorbancia de cada una de ellas a la misma longitud
de onda, temperatura y condiciones de disolución, y se representa la absorbancia de cada solución en función
de su concentración, se obtendrá, por lo general una línea recta que pasa por el origen por lo que se dice que
esta línea recta cumple la ley de beer en el margen de concentración investigado.4 Por lo que, las gráficas 1 y
2 cumplen satisfactoriamente con esta ley.
La precisión describe cuán reproducibles son las mediciones de un análisis; en otras palabras, describe cuánto
se repite el resultado de dos o más mediciones cuando dichas mediciones han sido llevadas a cabo
exactamente La exactitud indica la cercanía que existe entre un valor medido y el valor real o aceptado; para
expresar la exactitud, empleamos el error. La precisión, por otro lado, describe la concordancia que existe entre
los resultados de varias mediciones hechas de la misma manera. Se puede determinar la precisión simplemente
haciendo mediciones de las muestras réplica. La exactitud puede resultar más difícil de determinar dado que,
generalmente, el valor esperado es desconocido. En lugar del valor esperado, se sugiere emplear un valor
aceptado. La exactitud se mide ya sea en términos del error absoluto o del error relativo.1 Dado lo anterior y
con respecto a la exactitud al observar los resultados de la tabla 7 se puede observar que el método de prueba
(Bradford) es igual de exacto que el de referencia (Lowry) debido a que la TCalculada es menor que la TTablas por
lo que no hay diferencia entre la exactitud de ambos métodos. El valor aceptado es tomado del tubo 3 con un
valor de 70 μg/mL, por lo que basándonos en la media de las tablas 2.1 y 5.1 se puede obtener el % de exactitud
de ambos métodos, tanto el de prueba como el de referencia, obteniéndose 81% y 90% respectivamente.
A diferencia de la exactitud, si hay evidencia suficientemente significativa entre la precisión de ambos métodos
debido a que, la FCalculada es mayor que al de la FTablas Existen tres términos ampliamente utilizados para describir
la precisión de los datos en un conjunto de réplicas: la desviación estándar, y el coeficiente de variación, las
cuales son una medida de cuánto se aleja un resultado individual xi de la media.1 La desviación estándar es la
medida de dispersión más común, que indica qué tan dispersos están los datos con respecto a la media.
Mientras mayor sea la desviación estándar, mayor será la dispersión de los datos,2 por lo que basándonos en
la desviación estandar de las tablas 2.1 y 5.1 se puede observar que en ambos métodos existe poca variación
en los datos, sin embargo, se puede observar que se trabajó mejor en el método de referencia que en el de
prueba. En caso contrario, el coeficiente de variación que cuanto menor sea, menor será la dispersión y, por
tanto, mayor será la representatividad de la media aritmética;2 de las tablas 2.1 y 5.1 se puede observar que
existe una mejor representatividad de las muestras para Lowry que para Bradford, esta tiene que ser menor o
igual que 5.
El reactivo de Folin-Cioclteu se basa en una reacción REDOX, la reducción, también en medio básico (pH de
10), del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la
mayoría de las proteínas, actuando el cobre del reactivo de biuret como catalizador. El principal constituyente
del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los
grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.3 Por lo que, al añadir más fenol se intensifica la
reacción obteniendo un color más fuerte. Lo mismo ocurre con el mercaptoetanol que al tener un grupo OH se
oxida, sin embargo tiene menos afinidad que el fenol.

Conclusiones.

 Se elaboró una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método

fotométrico.
 Se determinó el efecto de algunas sustancias no proteínicas, que pueden interferir en el
método.
 Existe evidencia significativa que respalda el hecho en que la precisión de Bradford a
diferencia de la de Lowry es menor, en contra parte en exactitud no la hay.
Bibliografía.

1. Scoog, D. West, D. (2015). Fundamentos de química analítica. México: Cengage Learning. Pág(s) 85-
90.
2. Fernandez, S. Cordero, J. (202). Estadística descriptiva. España: ESIC. Pág(s) 200-210.
3. Óscar A. Muñoz-Bernal, Gaspar A. Torres-Aguirre, José A. Núñez-Gastélum, Laura A. de la Rosa.
(2017). Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de folin-ciocalteu con azúcares durante la
cuantificación de polifenoles totales. UNAM: Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas,
20(2): 23-28, 2017. DOI: 10.1016/j.recqb.2017.04.003
4. Connors, K. (1981).Curso de análisis farmaceutico. España: Reverté. Pág(s) 205..