UNIVERSIDAD NACIONAL

PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Área de Microbiología y Parasitología

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS II

INVESTIGACIÓN DE HONGOS Y MOHOS PATÓGENOS

DE FRUTAS Y VERDURAS

Alumnos
Ravines Arriaga C. Alejandra
Ortega Regalado Charly
Yuriko Saavedra

Lambayeque, Junio del 2018

 I. INTRODUCCIÓN
El diverso grupo de levaduras y mohos microscópicos transmitidos por alimentos, incluye
varios cientos de especies. La capacidad de estos organismos para atacar a muchos
alimentos se debe en gran parte a sus requerimientos ambientales de relativa versatilidad.
A pesar de que todas las levaduras y mohos son aerobios obligatoriamente (requieren
oxígeno libre para su crecimiento), su requerimiento de ácido/alcalino para crecer es
bastante amplio; fluctuando de pH 2 a más de pH 9. Su rango de temperatura (10°C a 35°C),
también es amplio, con pocas especies capaces de crecer debajo o sobre este rango.
Los requerimientos de humedad de mohos transmitidos por alimentos son relativamente
bajos; la mayoría de especies crecer en una actividad de agua (aw) de 0,85 o menos, aunque
las levaduras requieren una mayor actividad del agua.
Tanto las levaduras como los mohos causan varios grados de deterioro y descomposición
de alimentos. Pueden invadir y crecer en cualquier tipo de alimento en cualquier momento;
pueden invadir campos de cosecha, tales como granos pequeños, nueces, frijoles, tomates
y manzanas en el campo antes de la cosecha y durante el almacenamiento. También crecen
en alimentos procesados y en mezclas alimenticias. Su detectabilidad en los alimentos
contaminados pueden estar ligeramente manchados, fuertemente manchados o
completamente descompuestos, con el crecimiento real manifestado por manchas de
descomposición de varios tamaños y colores, escaras de aspecto desagradable, limo,
micelio blanco algodonoso o moho esporulante altamente coloreado. También pueden
producirse sabores y olores anormales. Ocasionalmente un alimento parece estar libre de
moho pero luego de un examen micológico se encuentra que está contaminado. La
contaminación de alimento por levaduras y mohos también puede tener como resultado
pérdidas económicas sustanciales para el productor, procesador y consumidor.
Varios mohos transmitidos por alimentos y posiblemente las levaduras pueden ser
peligrosos para la salud humana y de animales debido a su capacidad para producir
metabolitos tóxicos conocidos como micotoxinas. La mayoría de micotoxifrás son
compuestos estables que no son destruidos durante el procesamiento de alimentos o
cocción doméstica. A pesar de que los organismos generadores no pueden sobrevivir a la
preparación de alimento, la toxina preformada aún puede estar presente. Ciertos mohos y
levaduras transmitidos por alimentos también pueden producir reacciones alérgicas o
pueden causar infección. Aunque muchos hongos transmitidos por alimentos no son
infecciosos, algunas especies pueden causar infección en grupos de población vulnerables,
tales como ancianos, personas debilitadas o individuos que están recibiendo quimioterapia
o tratamiento con antibióticos.

II. OBJETIVOS
 Realizar la numeración de mohos y levaduras presentes en mandarina y
coliflor.
 Aplicar los diferentes métodos que se utilizan para determinar la numeración
mohos y levaduras.
 Evaluar la viabilidad para el consumo de los alimentos estudiados.
III. MATERIALES
 Muestra: Mandarina y Coliflor del Mercado Modelo de Lambayeque.
 Equipo Utilizado: Licuadora, incubadora y balanza analítica.
 12 placas de Agar Sabouraud.
 Pipetas estériles de 10ml y 1ml.
 Espátula estéril.
 Láminas y Laminillas.
 Tubos de dilución.

IV. MÉTODOS
Recuento en Placa
El recuento en placa es el método más utilizado para la determinación del número de
células viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento. Los
recuentos totales deben hacerse en función de uno de los siguientes factores:

 Método de muestreo utilizado.

 Distribución de los microorganismos en la muestra.
 Naturaleza de la microflora del alimento.
 Naturaleza del alimento.
 Antecedentes del alimento.
 Adecuación nutricional del medio de cultivo.
 Temperatura y medio de incubación.
 pH, aw, potencial de óxido – reducción del medio.
 Tipo de diluyente utilizado.
 Número relativo de microorganismos en la muestra.

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se

desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e
incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden
considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos
microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir
una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmósfera, la composición
del medio y el tiempo de incubación.

En el grupo de los mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras
capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se
estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad
sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de
la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la
ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no
significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por
fermentación, no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede
significar:

 Excesiva contaminación de la materia prima.

 Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración.
 La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos.
 La inmediata alteración del producto.
Método de Siembra de Superficie
 Se usa el mismo número de placas pero con agar servido y controlado.
 También se usa dos placas por dilución.
 El inóculo de la solución va a ser 0.1 mL en la superficie de la placa y luego se la
expande usando la espátula de Drigalsky.

Pasamos

9 mL. 9 mL. 9 mL. 9 mL. 9 mL.

DAP DAP DAP DAP DAP

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

10 g de muestra
+ 90 mL de
diluyente AP al Primero agregamos a las placas el agar PC y esperar a que solidifique
0.1%

0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL

Luego agregamos el inóculo y lo esparcimos

SIEMBRA POR AGOTAMIENTO Y ESTRÍA

La técnica de siembra en estría es usada

para aislar cepas puras en una placa
Petri a partir de un inóculo o muestra
con diferentes especies. La técnica
consiste en, mediante un asa de siembra
previamente esterilizada, rayar la
superficie de cultivo de una placa Petri
de forma que en cada pasada sea menor
el número de células depositado, las
últimas pasadas deberán
depositar un número tan bajo de células
que, una vez incubadas, se formen
colonias puras.
 V. PROCEDIMIENTO
Mandarina
1. Con mucha asepsia, retirar la cáscara de la mandarina.
2. Cortar trozos de mandarina y pesar 50 gramos.
3. Llevar a la licuadora y agregar el agua estéril, el resultado sería la primera dilución
10-1.
4. Tomar un tubo de dilución con 5 ml de agua estéril y agregar 1 ml de la primera
dilución. Esta sería la dilución 10-2.
5. Ahora llevar 1ml de la segunda dilución a un nuevo tuvo, esta sería la dilución 10-3.
6. Con ayuda de una pipeta tomar 0.1ml de cada una de las tres diluciones y sembrar
cada dilución en dos placas de agar sabouraud diferentes.
7. Rotular las placas con su número de dilución correspondiente y llevar a incubación
durante 24h.
8. Realizar el conteo con ayuda de un contador de colonias.
9. Comparar resultados con valores permitidos según la “NORMA SANITARIA QUE
ESTABLECE LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS DE CALIDAD SANITARIA E
INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO HUMANO’’ del Perú.
10. Reportar los resultados.

PROCEDIMIENTO |

1 2 3

4 5
Figuras. 1) Muestra de Mandarina. 2) Muestra agregada al vaso estéril dela licuadora y se licúa la muestra.
3) Se agrega 5ml de agua estéril en cada tubo de dilución. 4) Se agrega 1 ml de la muestra a cada tubo a partir de
la primera dilución y luego se agrega 0.1 ml a cada placa de agar sabouraud. 5) Placas sembradas con agar
sabouraud, dos por cada número de dilución.
 Coliflor
11. Con mucha asepsia, trozar la coliflor.
12. Pesar 50 gramos.
13. Llevar a la licuadora y agregar el agua estéril. Licuar, el resultado sería la primera
dilución 10-1.
14. Tomar un tubo de dilución con 5 ml de agua estéril y agregar 1 ml de la primera
dilución. Esta sería la dilución 10-2.
15. Ahora llevar 1ml de la segunda dilución a un nuevo tuvo, esta sería la dilución 10-3.
16. Con ayuda de una pipeta tomar 0.1ml de cada una de las tres diluciones y sembrar
cada dilución en dos placas de agar sabouraud diferentes.
17. Rotular las placas con su número de dilución correspondiente y llevar a incubación
durante 24h.
18. Realizar el conteo con ayuda de un contador de colonias.
19. Comparar resultados con valores permitidos según la “NORMA SANITARIA QUE
ESTABLECE LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS DE CALIDAD SANITARIA E
INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO HUMANO’’ del Perú.
20. Reportar los resultados.

PROCEDIMIENTO |

1 22 3

4 5
Figuras. 1) Muestra de Coliflor. 2) Muestra agregada al vaso estéril dela licuadora y se licúa la muestra. 3) Se
agrega 5ml de agua estéril en cada tubo de dilución. 4) Se agrega 1 ml de la muestra a cada tubo a partir de la
primera dilución y luego se agrega 0.1 ml a cada placa de agar sabouraud. 5) Placas sembradas con agar
sabouraud, dos por cada número de dilución.
VI. RESULTADOS
- Después de 24 horas de incubación se hizo el recuento de colonias características
de levaduras, obviándose la primera dilución.

10-1

10-2

10-3

MANDARINA|
Tabla 1. Resultados del conteo de colonias de levadura en agar sabouraud de MANDARINA.
CONTEO x TIEMPO
MÉTODO 24 H 48 H
Promedio Promedio
En Superficie
10-1 Incontables Incontables
10-2 A 460 420 776 736
10-2 B 380 696
10-3 A 130 146 403 409
10-3 B 157 416
Mandarina
De los resultados obtenidos se interpretó de la siguiente manera:

1. Como se puede observar en el cuadro solo se pudo realizar el conteo en las

diluciones 10-2 y 10-3, de las diluciones se sacó el promedio por horas (24 y 48h).
2. En la dilución 10-2 se obtuvo (en promedio) a las 24 h: 420 colonias y a las 48h: 736
colonias.
3. En la dilución 10-3 se obtuvo (en promedio) a las 24 h: 146 colonias y a las 48 h: 409
colonias.
4. Para asegurarnos de haber realizado correctamente el procedimiento, debemos
asegurarnos de que la dilución menor sea dos veces +/- la dilución mayor.

A LAS 24H A LAS 48H

10-2 → 420 = 2.8 10-2 → 736 = 1.7
10 →
-3
146 10 →
-3
409

5. En la división de los resultados a las 48h el resultado es igual a 1.7. Redondeando el

resultado nos da 2 (es decir que las diluciones de las 24h lo duplican), por lo tanto
es correcto y procedemos tomando el valor de la menor dilución (10-3): 409 y con
este resultado realizamos los cálculos.

Ufc/gr de = Nº de x Factor de
muestra colonias dilución
Ufc/gr de = 409 x 103 = 41x 104 ufc/gr
muestra

6. Entonces el recuento de aerobios mesófilos viables es igual a 41 x 104 ufc/gr en la

muestra de mandarina obtenida del mercado modelo de Lambayeque.

COLIFLOR|

Diluciones:
10-3 / 10-2 / 10-1
Tabla 2. Resultados del conteo de colonias en agar sabouraud de COLIFLOR.
CONTEO x TIEMPO
MÉTODO 24 H 48 H
Promedio Promedio
En Superficie
10-1 Incontables Incontables
10-2 A 322 320 523 526
10-2 B 318 530
10-3 A 121 127 412 407
10-3 B 133 402

Coliflor
De los resultados obtenidos se interpretó de la siguiente manera:

1. Como se puede observar en el cuadro solo se pudo realizar el conteo en las

diluciones 10-2 y 10-3, de las diluciones se sacó el promedio por horas (24 y 48h).
2. En la dilución 10-2 se obtuvo (en promedio) a las 24 h: 320 colonias y a las 48h: 526
colonias.
3. En la dilución 10-3 se obtuvo (en promedio) a las 24 h: 127 colonias y a las 48 h: 407
colonias.
4. Para asegurarnos de haber realizado correctamente el procedimiento, debemos
asegurarnos de que la dilución menor sea dos veces +/- la dilución mayor.

A LAS 24H A LAS 48H

10 →
-2
320 = 2.5 10 →
-2
526 = 1.2
10-3 → 127 10-3 → 407

5. En la división de los resultados a las 48h el resultado es igual a 1.2. Redondeando el

resultado nos da 1 (es decir que las diluciones de las 24h lo duplican), por lo tanto
es correcto y procedemos tomando el valor de la menor dilución (10 -3): 407 y con
este resultado realizamos los cálculos.

Ufc/gr de = Nº de x Factor de
muestra colonias dilución
Ufc/gr de = 407 x 103 = 41x 104 ufc/gr
muestra

6. Entonces el recuento de aerobios mesófilos viables es igual a 41 x 104 ufc/gr en la

muestra de coliflor obtenida del mercado modelo de Lambayeque.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA|

CARACTERÍSTICAS DE COLONIA

FORMA : Amorfa
TAMAÑO : 5 mm
COLOR : Negro
BORDES : Rugosos
CONSISTENCIA : Dura (Base)
ELEVACIÓN : Convexa

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

Se observaron conidios y esporas.

CARACTERÍSTICAS DE COLONIA

FORMA : Redondeada
TAMAÑO : 2 mm
COLOR : Blanquecino
BORDES : Lisos
CONSISTENCIA : Mucosa
ELEVACIÓN : Convexa

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

Se observaron levaduras, con

ayuda de una tinción gram.
 VII. INTERPRETACIÓN
- Según la NORMA SANITARIA QUE ESTABLECE LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS DE
CALIDAD SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO
HUMANO del Perú, el valor recomendado de Mohos y Levaduras para Frutas y Verduras sin
procesar, no está establecido por un rango específico, por lo que se deduce la escasa
importancia para la salud humana que estos implican.
- Al no encontrarse presencia de hongos o mohos fitopatógenos en Mandarina y en Coliflor
del Mercado Modelo de Lambayeque, queda garantizada la inocuidad de estos alimentos.

VIII. CONCLUSIONES
- Las mandarinas y coliflores del Mercado modelo de Lambayeque, son aptas para el
consumo humano.
- Las mandarinas y coliflores del Mercado Modelo de Lambayeque están libres de
enfermedades causadas por hongos y mohos fitopatógenos.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Aycachi R. 2008. Aislamiento e Identificación de Clostridium perfringens. Lambayeque.
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Disponible en:
http://es.scribd.com/doc/6674027/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-n 14Aislamiento-
e-identificacionde-Clostridium-perfringens
- Gesche E, Vallejos A, Saez M. 2003.Eficiencia de Anaerobios sulfito-reductores como
indicadores de calidad sanitaria de agua. Método de Número Más Probable (NMP). Chile.
Universidad Austral de Chile. P 99- 105. Disponible en:
http://mingaonline.uach.cl/pdf/amv/v35n1/art11.pdf
- Clostridium botulinum. Disponible en: http://www.bvsops.org.uy/pdf/clostridium.pdf
- Alayo G. 2008. Recuento en tubo de anaerobios Sulfito Reductores .Peru. Universidad
Nacional de Trujillo. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/8536988/microbiologia-de-
alimentos-Laboratorios-
- Pascual M, Calderón V.2000.Microbiologia Alimentaria. Madrid-España. Editorial Díaz de
Santos. P 75