INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

GRUPO : 5QM2 SECCIÓN: 3

Alumno:

Silva Villanueva Martha Celia

Profesor:

Cabrera Martínez Rosa Martha

Práctica

Separación de Grupos Usando Cromatografía por Exclusión

25/05/18
OBJETIVOS

 Determinar algunos parámetros que caracterizan al lecho cromatógrafo.

 Efectuar la desalación de la albumina, utilizando la técnica de cromatografía por exclusión.

FUNDAMENTO

Se basa en la diferencia en el tamaño y la forma de las moléculas componentes de la mezcla. Las

moléculas que puedan penetrar la estructura del gel serán retardadas en este, mientras que aquellas
mayores que el tamaño del poro del gel serán excluidas, por lo tanto, serán arrastradas a través de la
columna por la fase móvil, eluyendo primero.

RESULTADOS

Tabla 1. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna.

Numero de Tubo Volumen de elución (mL) A615

1 3 Blanco

2 6 0

3 9 0

4 12 0

5 15 0

6 18 0.207

7 21 1.640

8 24 0.178

9 27 0.017

10 30 0

11 33 0

12 36 0

13 39 0

14 42 0
15 45 0
 1.8

1.6

1.4

1.2

1
A615nm

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 2 4 6 8 10 12
-0.2
Volumen de elución (mL)

Gráfico 1 . Perfil de elución de la dextrana azul 2000.

a)¿Cuál fue el volumen total de la columna (VT)?

h= 21 cm
r= 1.1 cm
r2=1.2 cm 2
𝑉𝑇 = (𝜋)(𝑟 2 )(ℎ)
𝑉𝑇 = (𝜋)(1.12 )(21) = 𝟕𝟔. 𝟎𝟐 𝒎𝒍

b)¿Cuál fue el volumen vacío (Vo) de la columna? ¿Qué importancia tiene determinarlo?
Vo= 21 cm
Para conocer el volumen del gel, ya que este dato varía según el tipo de columna que se utiliza y
también para saber cuánto gel se está empacando.

c)Determine el volumen que ocupa en la columna el líquido que se encuentra en el interior de

la estructura del gel (Vi) y el volumen del gel solo (Vg)

Calculo de Vi Vi=(15.2 x 2.5ml ) = 30.01 ml

1g  5ml Vt =Vo+Vg+Vi
X Vt (76.02)
Despejando
X=15.2 g Vg =Vt- (Vo+Vi)
Vg= 76.02-(21+30.01)= 17.01 ml
Tabla 2. Separación del sulfato de amonio y la albumina.

Volumen de Masa del tubo Masa del tubo

elución (mL) A280 vacío (g) con precipitado (NH4)2SO4 (mg)
seco (g)
3 0 6.5203 - -
6 0 6.2962 - -
9 0 7.5765 - -
12 0 5.1703 - -
15 0 6.2092 - -
18 0.124 8.5298 - -
21 0.481 6.4323 - -
24 0.197 6.3081 - -
27 0.001 8.5614 - -
30 0 8.5453 - -
33 0 8.5506 - -
36 0 8.5644 - -
39 0 7.5500 - -
42 0 6.0828 6.1045 21.7
45 0 6.2794 6.3206 41.2
48 - 6.7251 6.7866 6.15
51 - 6.4154 6.4496 34.2
54 - 6.3159 6.3288 12.9
57 - 8.5220 8.5299 7.9
60 - 7.4812 - -
63 - 8.6530 - -
66 - 6.7060 - -
69 - 7.4074 - -
72 - 7.4637 - -
75 - 7.5155 - -
 0.6 120

0.5 100

0.4 80

0.3 60
A280

Albumina
0.2 40 BaSO4

0.1 20

0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

-0.1 -20
Volumen de elución (mL)

Gráfico 2. Perfil de elución de la albumina y el sulfato de amonio.

A)¿Qué sustancia eluyó primero y cual después? Explique por qué.

Eluyo primero la albumina debido a que su estructura química es más grande que la molécula de
dextrana azul lo que permite la rápida elución de esta , después el sulfato de amonio eluye después,
al ser el azul de dextrana pequeño se queda en los poros del gel lo que permite el paso de la molécula
de albumina.

B)¿Qué es un gel? ¿Qué características debe tener el que es cromatográficamente útil?

Un gel es un sistema coloidal donde la fase continua es sólida y la dispersa es líquida.
El gel está constituido por partículas esféricas que tienen poros de un determinado tamaño.

C)Mencione por lo menos tres aplicaciones diferentes a la usada en la práctica, que puede
tener esta técnica.
 Separación de proteínas
 Separación de ácido grasos
 Estimaciones de masas molares
 Separación de grupos
 D)Escriba las estructuras químicas del Sephadex, Bio-Gel A y Bio-Gel P, indicando donde
y de que forma se da el entrecruzamiento en cada caso y el tipo de enlace que se presenta.

Tipo de enlace:
Covalente C-C

Figura 1. Estructura química del Bio-Gel A, poliacrilamida.

Figura 2. Estructura química del Sephadex, dextrano.

Figura3.Estructura química del Bio-Gel P, Agarosa.

Cadenas repetidas de unidades alternadas β-1,3 D-galactosa y α-1,4 3,6-anhidro-L-galactosa, unidos por
enlaces peptídicos.

DISCUSIÓN

Realizamos la cromatografía por exclusión molecular, se realizó en una columna cilíndrica rellena de
gel de dextrana con enlaces cruzados (Sephadex), este gel está constituido por partículas de un
material esponjoso hidratado, que contiene poros. Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de
distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; las moléculas de mayor tamaño a los
poros no son retenidas y solo podrán moverse por un camino sin penetrar en el gel de dextrana a
través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; por ellos, no se retrasado
su descenso. Por el contrario en aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se verán
retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño.

En la gráfica 1. Se presenta el perfil de elución de la Dextrana azul 2000, en esta grafica se puede
observar claramente el Volumen vacío, que es en donde se presenta una mayor absorbancia, en este
caso la absorbancia fue de 1.640 obtenida en el tubo número 7 con un volumen de elución de 21 mL
(Vol. vacío) . La Dextrana 2000 equivale a 2 millones de daltones por lo cual su tamaño en muy grande
y no va a entrar en los poros. Es por ello que la determinación del volumen vacío es muy importante
ya que es el volumen al que eluyen las moléculas de mayor tamaño.

En la tabla 2 y en el grafico 2 puede apreciarse que la albumina y el sulfato de amonio tienen distintos volúmenes
de elución, lo cual indica que tienen un peso molecular diferente.
La sustancia que eluyó primero fue la albúmina, debido a que es de mayor tamaño que el tamaño del poro del
gel, el volumen vacío se observa precisamente en el tubo 7 con una absorbancia de 0.481 y un volumen de
elución de 21 mL, correspondiente a lo que se había obtenido anteriormente con la Dextrana. A ser de mayor
tamaño que el gel la albumina será excluida, por lo que recorre más rápido la fase estacionaria al tomar una
trayectoria más directa.
El sulfato de amonio es de menor tamaño, este no se determinó directamente, sino que se determinó
a partir del peso de BaSO4, dado que este es proporcional al sulfato de amonio.

Algunos puntos críticos en el método es el no regular adecuadamente el número de gotas por minuto
ya que un goteo menor o mayor produciría un traslape en la elución de las muestras, esto debido a no
empacar bien la columna o que se forme una burbuja al final de la columna,
También puede haber variación en la altura de los picos y esto es debido a que no se llenó los tubos
hasta la marca del aforo lo cual repercute en la cuantificación de la absorbancia por que puede haber
en algunos tubos mayor cantidad de eluyente y o menor y por ello hay variaciones.

La resolución la podemos ver por la separación de cada una de las bandas de los componentes si
están separadas si hubo una buena separación pero si están traslapadas es que la separación no fue
adecuada , en cambio la eficiencia la podemos ver por el anchura del pico, si esta más angosta es que
hubo poca eficiencia y si es más ancha es que hubo mayor eficiencia .

CONCLUSIÓN

 Las moléculas de mayor tamaño pasan más rápidamente que las de menor tamaño.
 El volumen vacío fue de 21 mL
 El volumen de elución de la albumina es de 21 mL
 La molécula que eluyo primero fue la albumina posteriormente el sulfato de amonio .

REFERENCIAS

 Barnard, J. A. and R. Chayen. 1970. Métodos Modernos de Análisis Químico. Ed. Urmo, Bilbao,
pp 218-227.
 BOHINSKI. (1991) bioquímica. 5ed., Editorial Pearson. México. Pp. 213.
 Skoog, D. A.; Principios de Análisis Instrumental, 6ª ed.; Thompson Brooks/Cole: Belmont, CA,
2006, capítulo 28