UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

FACULTAD DE ZOOTECNIA

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CARACTERISTICAS SEMINALES E INTEGRIDAD DE LA MEMBRANA

ESPERMATICA POST REFRIGERACION EN CARNEROS BLACKBELLY Y

ASSAF DEL BANCO NACIONAL DE SEMEN – LA MOLINA

**********************************************************************************************

TESIS

PRESENTADA POR

JAVIER ANGEL ORELLANA CHIRINOS

PARA OPTAR EL TÍTULO DE

INGENIERO ZOOTECNISTA

HUANCAYO – P E R Ú

2009

1
A MIS PADRES, CARMEN CHIRINOS PEINADO

Y MANUEL ORELLANA MENDOZA

POR SU ABNEGADA LABOR,

AMOR Y COMPRENSIÓN.

A MIS HERMANOS, JENNY, BETO, SOFÍA,

MARCO, MANUEL, JULIA Y LUÍS, CON

MUCHO CARIÑO

2
 AGRADECIMIENTOS

Dejo constancia de mi sincero agradecimiento al Ing. Mg.Sc. Próspero Cabrera

Villanueva, por haber brindado todas las facilidades para la ejecución del presente

trabajo de tesis; por sus acertados consejos y enseñanzas para que la investigación se

desarrolle adecuadamente.

A mis profesores de la Universidad Nacional del Centro del Perú – Facultad de

Zootecnia, quienes con sus sabias enseñanzas, han permitido que logre un escalón

más en el mundo académico científico.

Al Banco Nacional de Semen – PMA UNALM, institución que brindó todas las

facilidades para la realización del presente trabajo de tesis.

A mis compañeros de estudios, con quienes compartí experiencias y muchas

vivencias.

A mis familiares y a todas las personas que de una u otra forma han colaborado

conmigo para que el trabajo de tesis llegue a un final feliz

3
 INDICE

Página
RESUMEN 7
I. INTRODUCCIÓN 8
II. REVISIÓN DE LITERATURA 10
2.1 Ovinos Blackbelly y Assaf 10
2.2 Características seminales de carneros y evaluación del semen 13
2.2.1 Evaluación macroscópica 14
2.2.2 Evaluación microscópica 18
2.3 Prueba de funcionalidad espermática 22
2.3.1 Test de endósmosis 25
2.4 Dilución del semen 28
2.4.1 Composición de los dilutores 28
2.4.2 Tipos de dilutores 34
2.5 Algunos trabajos de evaluación seminal en ovinos 34
III. MATERIALES Y MÉTODOS 37
3.1 Lugar y duración del proyecto 37
3.2 Diseño de investigación 37
3.3 Población y muestra de estudio 38
3.4 Variables del estudio 38
3.4.1 Variables independientes 38
3.4.2 Variables dependientes 38
3.5 Procedimiento de colección se semen y evaluación 39
3.5.1 Colección de semen 39
3.5.2 Parámetros a Evaluar 40
3.5.2.1 Macroscópicos 40
3.5.2.1 Microscópicos 40
3.5.3 Solución hiposmótica 44
3.5.4 Medio de lavado 45
3.5.5 Evaluación de la integridad funcional de la membrana espermática 46
3.5.6 Dilutor utilizado 46
3.5.7 Elaboración del diluyente para conservar semen de carnero 47
3.5.8 Método de dilución 47
3.5.9 Descenso de temperatura y tiempo de estabilización 48
3.5.10 Evaluación del semen post refrigerado 48
3.6 Técnica de procesamiento y análisis de datos 50

4
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 51

4.1 Características macroscópicas del semen fresco 51

4.2 Características microscópicas del semen fresco 52

4.3 Características del semen refrigerado 54

V. CONCLUSIONES 56
VI. RECOMENDACIONES 57
VII. BIBLIOGRAFIA 58
ANEXO 65

5
 INDICE DE CUADROS

Pagina
1 Composición química de diluyente para Refrigerar semen de ovino 33

2 Composición química de diluyente para semen fresco de ovino 34

3 Composición química de diluyente para refrigerar semen de ovino 34

4 Sistema de valoración de la onda de movimiento 42

Composición química de la solución hiposmotica a 100 mOsmol/L con

5 45
citrato de sodio y fructuosa
Composición química del medio de lavado con citrato de sodio al 2.9 %
6 46
con 2 % (v/v) de FBS
7 Composición química del dilutor tris 47

8 Características macroscópicas del semen fresco 52

9 Características microscópicas del semen fresco 53

Características microscópicas del semen refrigerado con diluyente

10 55
Tris - Fructuosa - Yema de Huevo.

INDICE DE FIGURAS

Pagina
Motilidad individual y progresiva del semen congelado de carneros de 20
1
diferentes razas.

2 Croqui experimental 37

Obtención, procesamiento y conservación de semen refrigerado de ovinos

3 49
Assaf y Blackbelly

6
 RESUMEN

Con el objetivo de determinar las características seminales, la integridad de

las membranas espermática (Host) y la Motilidad Individual Progresiva (MIP),

luego del refrigerado del semen por un periodo de dos horas; de carneros

Blackbelly y Assaf del Banco de Semen del Programa de Mejoramiento

Genético de la UNA La Molina, empleándose 6 carneros (03 Blackbelly y 03

Assaf) de 3,5 años de edad. El semen colectado con vagina artificial fue

evaluado macro y microscópicamente y luego diluido y conservado en

refrigeración. Se utilizo tris – fructuosa – yema de huevo como dilutor.

Realizándose las evaluaciones del semen post refrigeración. Se analizó los

datos empleando el SAS. Los valores de las características microscópicas del

semen fresco fueron: motilidad masal de 77% para Assaf y 73% para

Blackbelly, no encontrándose diferencias significativas (P>0,05). Concentración

de 2 694,72 x 106 para Assaf y 2 458,89 x 106 para Blackbelly, no

encontrándose diferencias significativas (P>0,05). Porcentaje de

espermatozoides vivos de 81,89 para Assaf y 80,19 para blackbelly, no

encontrándose diferencia significativas (P>0,05). Porcentaje de

espermatozoides anormales de 7,11 % para Assaf y 6,94 % para Blackbelly,

no encontrándose diferencias significativas (P>0,05). La Motilidad Individual

Progresiva del semen de carneros Assaf, refrigerado con Tris, fue 83,50%.

Para el semen de ovinos Blackbelly, los valores fue 82,56%, no registrándose

diferencias (P>0,05). En ovinos de la raza Assaf, los valores de HOST del

semen Refrigerado, con Tris como diluyente, fue 82,36%. Para el semen de

ovinos Blackbelly, los valores fue 83,30%, no registrándose diferencias

significativas (P>0,05).

7
 I. INTRODUCCION

La población nacional de ovinos es de aproximadamente 15’686 310 cabezas

(Ministerio de Agricultura, 2002) compuesto principalmente de ganado Criollo en 66%

y 34 % de otras razas como el Corriedale, Junín, Blackbelly, Assaf, Hampshire Down,

entre otras; de manera que la producción ovina no solo esta dirigida a animales

productores de lana, carne o pelo, sino de doble y hasta triple propósito, lo cual es de

importancia porque la producción ovina no solo se realiza en la zona de la Sierra, sino

en la Selva y en la Costa, debiendo tener reproductores de alta calidad genética para

cada uno de los sistemas de producción.

La crianza de ovinos Criollos y sus cruzamientos con ovinos de raz a de buena

rusticidad y adaptabilidad al medio, tiene como fin mejorar la producción y la

productividad de los animales, especialmente de los cruces con razas altamente

prolíficas; para alcanzar este fin, se deben implementar programas de mejoramiento

genético que a través del uso de la inseminación artificial con semen de reproductores

de diferentes razas, permitiendo un mejoramiento acelerado de las características

productivas y reproductivas, para lo cual se debe caracterizar adecuadamente el

semen para garantizar la reproducción.

El carnero reproductor es parte fundamental del proceso reproductivo y entre razas

presentan diferencias en cuanto a sus características seminales, las mismas que

deben conocerse adecuadamente para decidir la mejor utilización ya sea en fresco,

refrigeración o congelamiento.

8
En nuestro país, se han introducido razas de ovinos de pelo y leche, los cuales están

poco difundidos en la Selva y la Costa, e inclusive a la Sierra peruana, entre ellas

destacan las razas Blackbelly y Assaf, los cuales se están adaptando positivamente y

sus características productivas y reproductivas deben ser adecuadamente evaluadas;

siendo un aspecto importante la evaluación seminal con fines de tener tecnologías

apropiadas como inseminación artificial, cuyo éxito depende, entre otras cosas, de la

calidad del semen, evaluada a través de parámetros macro y microscópicos.

Considerando la problemática arriba indicada.

El objetivo general de la investigación es determinar las características

seminales en fresco y post refrigeración de carneros Blackbelly y Assaf criados en el

Banco Nacional de Semen del Programa de Mejoramiento Genético de la UNA La

Molina.

Los objetivos específicos del presente trabajo de investigación son:

1. Determinar las características macroscópicas y microscópicas, del semen

fresco de carneros Blackbelly y Assaf.

2. Determinar la Integridad de las Membranas espermática (Host) y la Motilidad

Individual Progresiva (MIP) del semen, luego del refrigerado por un periodo

de dos horas, de carneros Blackbelly y Assaf con diluyente Tris, para su uso

en inseminación artificial.

9
 II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 OVINOS BLACKBELLY Y ASSAF

Calle (2000) informo que, la introducción al Perú de los ovinos tropicales, significa que,

con estos animales, se inicia en el Perú una nueva etapa en la evolución de la crianza

ovina. Esta nueva fase se proyecta promisoria para el desarrollo socio-económico del

campo rural. Está sustentada esta fase en el enunciado de la FAO de que la raza

Blackbelly (BBB) tiene el mejor potencial genético que cualquier otro ovino del mundo

y que los cruces de BBB con Assaf son adecuados para la producción de leche, carne

y lana.

La investigación del cruzamiento interracial de la raza "lechera" Assaf (de Israel) con la

raza de "alta tasa reproductiva" Blackbelly de Barbados, se ha desarrollado desde sus

inicios dentro del campus de la UNA La Molina, a fin de lograr el ovino Assblack;

investigaciones que se han realizado exitosamente en la continuación de los distintos

grados de cruzamiento de Assaf/BBB, como también, en la distribución de los

productos cruzados a otras regiones del país (Calle, 2000).

A. Raza Blackbelly (BBB)

El ovino Blackbelly fue introducido al Perú en 1984 y ha demostrado una buena

capacidad de adaptación, especialmente en la Costa y en la Selva, debiéndose

conocer, entre otras cosas, sus características reproductivas y dentro de ellas las

características seminales. Esta raza de ovino de pelo es originaria de la isla de

10
Barbados en América Central y se caracteriza por su buena prolificidad, poliestricidad

anual y precocidad reproductiva. Los carneros presentan un peso vivo entre 50-55 kg y

las ovejas entre 40 a 45 kg. Las ovejas son multíparas, presentando un 20% de partos

simples, 40% de partos dobles y 30% de partos triples. Se encuentra muy difundida a

nivel de la Selva, Costa Norte y Centro del Perú (MINAG, 2007).

El BBB, es una raza que por primera vez se utilizó en el Valle de Pichis y Palcazo

dentro de un programa de producción acelerada para cruzarla con ovinos criollos de

Piura (Basualdo, 1990; Calle, 1994).

Fenotípicamente, manifiesta su pureza en la uniforme distribución del color de su

pelaje, que varía de pardo claro a rojo oscuro, con las partes inferiores del cuerpo y de

su cabeza de color negro (Capuñay, 1985).

Calle (2000), refiere a los BBB como animales de alto interés zootécnico no sólo por el

éxito alcanzado por su "alta tasa reproductiva" (precocidad, multiparicidad y

poliestricidad), sino muy particularmente por las observaciones que la FAO ha hecho

de estos animales, quienes indicaron que lo más interesante de esta raza, es su alto

potencial genético para transmitir por cruzamiento a la descendencia con cualquier

otra raza, sus características de "alta tasa reproductiva", manteniendo el producto

cruzado a su vez, la mayor parte de sus características de producción lechera de la

otra raza (doble propósito).

B. Raza Assaf

El ovino Assaf, originario de Israel, se caracteriza por su aptitud cárnica y producción

lechera. Tiene una prolificidad media y poliéstrica estacional. Fue introducida al Perú

con el fin de utilizarla en la formación de la raza Assblack. Las ovejas presentan una

ubre con buen desarrollo, en la cual se produce de 3,1 a 3,3 litros/día durante 120

11
días. La leche contiene un alto porcentaje de grasa (5,7%) y sólidos totales (17,8%),

resultante en un alto rendimiento quesero. Se caracteriza por presentar una cabeza de

perfil convexo, orejas largas y colgantes, vellón grueso y color variado, una cola

gruesa en su base debido a que contiene una reserva de grasa. Presenta una buena

conformación muscular, de cuerpo largo, ancho y profundo. Se pueden ubicar

ejemplares puros de Assaf en la Universidad Nacional Agraria La Molina y en el

rebaño de Rigoranch (MINAG, 2007).

Calle (2002) dijo que, el Assaf es un ovino mejorado 7/8 de sangre Awassi (raza

aborigen de la zona circunvecina a Israel) y fue obtenida genéticamente en Israel,

cruzando el Awassi (de alta especialidad lechera) con las razas de ovino frisonas (de

alta prolificidad) de Alemania.

Mercado (2006), recientemente informó que, en el Valle del Mantaro se ha iniciado la

crianza de ovinos lecheros de la raza Assaf de Israel, que pueden competir con la

ganadería vacuna en mejores condiciones de costos. Cada oveja produce hasta 2,5

litros de leche al día, con una calidad muy superior a la de los vacunos, incluso a la de

cabra, porque tiene mayores cantidades de proteínas, fósforo, calcio, y vitaminas A, B,

B2 y B3. Además, los ejemplares machos llegan a pesar hasta 100 kilogramos y las

hembras hasta 70 kilogramos, lo cual significa un excelente rendimiento de carne de

muy buen sabor. Otra de las ventajas de la crianza de esta raza de ovinos, en

comparación con otras, es la reproducción de más de dos crías por parto, y que se

reproducen cada ocho meses, en comparación con los 18 meses de las otras razas.

La raza se ha adaptado a la alimentación del Mantaro, como pasto fresco, alfalfa,

tallos de maíz y restos de los cultivos de alcachofa, ricos en concentrados y sales

minerales; y puede desarrollarse entre los 3 300 y 4 000 metros de altura. El queso

elaborado con leche de oveja de esta raza contiene oligoelementos como hierro y

12
también tiene zinc, cobre y magnesio; y aporta mayor cantidad de proteínas, fósforo y

calcio, comparado con el queso de la leche de vaca

2.2 CARACTERÍSTICAS SEMINALES DE CARNEROS Y EVALUACIÓN DEL

SEMEN

Rodríguez-Martinez (2000) al referirse a la capacidad fecundante del semen, dice que

es afectada por la criopreservación. El espermatozoide es una célula terminal, cuyo rol

principal es el transporte de un paquete, constituido por el genoma nuclear y el centriolo,

hasta el ovocito. Para realizar esta tarea, el espermatozoide está equipado con una

batería de estructuras especializadas (una membrana plasmática que muestra áreas

delimitadas, organelos con disposición específica tales como la vaina mitocondrial, y

especializaciones de los mismos, tales como el flagelo y el acrosoma) los que

garantizan la interacción particular con el tracto genital femenino y el ovocito en sus

envolturas. La viabilidad celular espermática decrece rápido y sustancialmente luego de

la eyaculación. La criopreservación, cuyo propósito es garantizar su sobrevivencia,

ocasiona sin embargo daño irreversible a la membrana plasmática, causando muerte

celular (Hammerstedt et al., 1990), o cambios parecidos a los que se ven durante la

capacitación espermática (Cormier et al., 1997), que dificultan o previenen su capacidad

para interactuar con el ovocito durante la fertilización.

Para conocer el potencial reproductivo del carnero reproductor se debe realizar una

evaluación del semen (Borque y Sagüez, 1992), la misma que considera diferentes

aspectos macroscópicos y microscópicos (Balbir et al., 1976; Pérez y Pérez, 1982;

Evans y Maxwell, 1990; Sumar, 1991 y Hafez, 1996).

McDonald (1991) afirma que, las características seminales están influenciadas por una

serie de factores, entre ellos la frecuencia de eyaculación, nutrición, manejo del

animal, estación, edad, estado de salud, tiempo de preparación sexual, método de

13
colección de semen, manejo del eyaculado durante y después de la eyaculación,

técnicas de análisis y variación entre técnicos. Así por ejemplo, Durán (1982) reporta

que la colección con electroeyaculador logra un mayor volumen que cuando se colecta

con vagina artificial, aunque menor concentración espermática por mm 3 y una ligera

disminución en la motilidad masal.

2.2.1 Evaluación macroscópica

a) Color

Gibbons et al. (2004), en el examen del semen, dice que, en primera instancia se

observa el color, debiendo el mismo ser blanco-lechoso o cremoso pálido. El color

rojizo indica la presencia de sangre, así como los colores grises o marrones indican

contaminación o infección, debiéndose en estos casos desechar el eyaculado y

proceder a la revisión del macho.

Hafez (1996), manifiesta que, el semen debe tener un aspecto opaco y relativamente

uniforme indicativo de alta concentración de células espermáticas. Las muestras

translucidas contienen pocos espermatozoides. Para esta evaluación, la muestra debe

estar libre de pelos, suciedad y otros contaminantes.

Pérez y Pérez (1982), dice que, el eyaculado del carnero, aparece en el colector, como

una masa cremosa, muy densa, riquísima en zoospermos y de color blanquecino con

tendencia mate. En este sentido puede admitirse una relación directa entre la

intensidad de su color y la riqueza zoospérmica. Los eyaculados claros y verdosos son

de escasa concentración, por tanto, con pocas posibilidades fecundantes. Por lo tanto,

es evidente que la relación entre el color y el volumen del eyaculado esta en

dependencia del régimen alimenticio. La alimentación concentrada y seca proporciona

eyaculados blanquecinos y muy concentrados. Por el contrario, las tonalidades verdes

significan régimen alimentario a base de forrajes de buena calidad y ricos en vitamina

14
A, por lo que el esperma es de las mejores cualidades biológicas. Cualquier variación

de las tonalidades del eyaculado, fuera de la blanquecina, amarillenta y verdos a deben

ser motivo de revisión para descubrir el origen de tales variaciones.

Hafez (1996), manifiesta que, algunos ovinos secretan semen de color amarillo debido

a la presencia del pigmento Riboflavina, inocuo y que no debe confundirse con orina,

la cual tiene su olor característico.

b) Aspecto

Evans y Maxwell (1990), mencionan que, el aspecto del semen depende de la

relación de contenidos de dos constituyentes, espermatozoides y plasma seminal. Las

muestras de alta consistencia contienen más espermatozoides que las muestras que

tienen menor consistencia o más acuosas. El examen del aspecto es un método muy

rápido y simple que estima la concentración del semen.

Pérez y Pérez (1982), afirman que, las variaciones de .la viscosidad en el eyaculado

de los pequeños rumiantes son del orden siguiente: En el esperma recién colectado,

los valores de viscosidad son mínimos a las 4-6 horas, incrementándose ligeramente

para estabilizarse; mas adelante vuelve, a variar esta condición física a medida de que

se establece la descomposición del esperma (necrosis del esperma), sin embargo es

preciso tener en cuenta que la viscosidad del esperma en los rumiantes depende, mas

de su contenido en zoospermos, que de las reacciones biológicas entre los

componentes líquidos del eyaculado, determinado por la acción de ciertos fermentos

de origen prostático sobre el liquido procedente de la glándulas vesiculares

c) Volumen

Gibbons et al. (2004), para la evaluación del volumen del semen, dicen que se mide

utilizando un tubo de recolección graduado. Cuando la recolección se realiza con

15
vagina artificial normalmente se obtienen eyaculados de aproximadamente 1 ml, que

varían según la edad, tamaño y condición corporal del animal, frecuencia de colec ción

y destreza del operador.

Hafez (1996), manifiesta que, la raza de ovino OSSINI produce un eyaculado con

rangos de 0,94 – 6,7 ml con una concentración de 3,9–10,3 millones de

espermatozoides por mm 3, mientras que en la raza RAHMANI, los valores encontrados

fueron de 1,17-6,10 ml de eyaculado con una concentración de 3,3-10 millones de

espermatozoides por mm 3. En ovinos los volúmenes de eyaculados pueden admitirse

como normales cuando sus rangos van de 0,5 a 2,0 ml con una media de 0,8 ml; los

volúmenes escasos y subnormales obedecen muchas veces a eyaculados

incompletos integrado por secreciones de algunas glándulas sin que merezcan la

denominación de eyaculado. Así también los grandes volúmenes son consecuencia de

hipersecreción glandular, frecuentemente en sementales con libido exagerado y gran

excitación sexual.

Pérez y Pérez (1982), afirma que, en primavera y cuando los sementales se

encuentran en régimen verde se obtienen los mayores volúmenes de eyaculado. Las

cópulas reiteradas a intervalos demasiado cortos disminuyen el volumen recolectado

del esperma y, por el contrario, la excitación acentuada aumenta. En relación a la edad

el rendimiento eyaculatorio varía estrechamente. Otis y Cerril en 1948, publicaron una

serie de observaciones, llegando a la conclusión de que los mayores rendimientos

eyaculatorios se encuentran en sementales de 2 a 5 años de edad; de modo que en

animales menores de un año y mayores de 6-7 años el volumen del eyaculado

disminuye entre 66 a 82 %.

Evans y Maxwell (1990), manifiestan que, el volumen del eyaculado, en carneros

jóvenes es menor que en los adultos; varia también con el tiempo transcurrido entre

16
colecciones. En ovinos es recomendable recolectar cada 2 días, cuando el semen se

obtiene por electro- eyaculación, el volumen depende mucho de la destreza del

operario así como la respuesta del semental.

Balbir et al. (1976) dicen que, las variaciones en el volumen se debe a diferencias

individuales y raciales. Por su parte, Pérez y Pérez (1982), indican que, entre otros

factores que hacen variar el volumen del eyaculado están el nivel de alimentación, los

intervalos en la colección se semen y la excitación del carnero frente a las hembras en

celo.

d) pH

Evans y Maxwell (1990), manifiestan que, la reacción alcalina, es característica de

una escasa fertilidad y muchas veces acompañada de una disminución en la

concentración y en la motilidad.

Pérez y Pérez (1982), afirma que, los valores de pH son la resultante de la

neutralización entre las reacciones glandulares de acción tampón y la concentración

iónica del material de las ampollas de Henle y del epidídimo, en ovinos el pH tiende a

la acidosis, en cuyo fenómeno radica la capacidad fecundante; de modo que, tan

pronto como se inicie la alcalinización en el eyaculado aparece necrospermia,

desapareciendo la capacidad fecundante. En términos generales, el pH del eyaculado

del ovino es de 6,2 a 6,5 de acuerdo con las investigaciones de Milovanov (1990). No

obstante, Letard (1986) considera como anormal el pH inferior a 7; los pH de 7; 7,2;

7,6 pueden interpretarse como consecuencia de reacciones tardías establecidas in

vitro en el eyaculado. Los valores de pH superiores a 7,6 corresponden, por lo general,

a seria alteraciones en las reacciones genitales.

17
Calle (1994) y Ascue (1985), trabajando en ovinos de la sierra central reportarón un

rango de 6,3 a 6,8 en el pH del semen, rangos similares a los reportados por otros

autores.

Ramírez, et al. (2001), reportan valores de pH de 6,27 con dilutor tris-fructuosa-yema

de huevo y pH de 6,24-6,27 con citrato-glucosa-yema de huevo.

2.2.2 Evaluación microscópica

a) Motilidad masal

Gibbons et al. (2004) al referirse a la evaluación de la motilidad de los

espermatozoides, recomiendan homogenizar el eyaculado por agitación del tubo de

recolección y luego retirar una gota de semen con una pipeta Pasteur entibiada y se

coloca sobre el portaobjetos temperado bajo observación microscópica a 100

aumentos. Se podrá tener una idea de la calidad seminal por la veloc idad con que se

hacen y deshacen las ondas (motilidad masal). La motilidad se estima por el vigor del

movimiento de las ondas a una escala subjetiva entre 0 y 5 (0, mínimo y 5 máximo).

Para proceder al congelamiento de un eyaculado se recomienda que su motilidad

masal sea mayor igual a 3.

Hafez (1996), afirma que, la capacidad de movimiento progresivo del espermatozoide,

se desarrolla conforme madura su morfología, maquinaria metabólica y la motilidad

ayuda al transporte de los espermatozoides desde el sitio en que se depositan, hasta

el sitio de la fecundación. La motilidad espermática per se es crucial para facilitar el

paso a través del cuello uterino y unión uterotubárica y, lo mas importante, es que

hace posible la penetración real de las células de la corona radiata y la zona pelúcida

del óvulo.

18
Malmgren (1997) refiere que, la motilidad espermática da un mejor criterio para la

valoración de la fertilidad y consiste en determinar el movimiento progresivo y la

proporción de espermatozoides mótiles.

Evans y Maxwell (1990), dicen que, la motilidad se valora mediante la característica

onda de movimiento del semen o según la proporción de la motilidad progresiva de los

espermatozoides de la muestra.

b) Motilidad Individual

Ramírez et al. (2001), mencionan que, los porcentajes de motilidad individual que se

obtuvieron en diferentes investigaciones fueron de 85,2% ± 4,33 con Tris-Fructuosa-

Yema de huevo, 84,2% ± 1,44 con Citrato-Glucosa-Yema de huevo y de 85,8% ± 5,2

con leche Descremada, la motilidad individual disminuye a mayor tiempo de

refrigeración (5 ºC ) obteniéndose valores de motilidad a las 48 horas post

refrigeración de 75,0% ± 9,01 con tris-fructuosa-yema de huevo, 77,5% ± 2,50 con

citrato-glucosa-yema de huevo y de 67,5% ± 15,21 con leche Descremada.

Mellisho y Flores (2004), reportan que, la motilidad individual y progresiva obtenida al

descongelar el semen de los carneros de las diferentes razas fue mayor a 55%

(Figura 1). Además, la respuesta fue similar (entre razas) utilizando el dilutor tris-

glucosa-glicerina y como técnica de congelamiento el método rápido utilizando hielo

seco. Quispe et al. (1998) y Quinn et al. (1968) reportan 36,9% de motilidad y 37,0%

de motilidad individual y progresiva, para el semen congelado utilizando tris-yema-

glicerina, respectivamente.

19
Figura 1. Motilidad individual y progresiva (%) del semen

Congelado de carneros de diferentes razas

Fuente: Mellisho y Flores (2004)

c) Concentración espermática

Gibbons et al. (2004), al referirse a la determinación de la concentración espermática

indican que hay varios métodos que permiten determinarla, entre ellos el recuento en

la cámara de Neubauer y el método del fotocolorímetro. Ambos métodos son precisos

y si bien el fotocolorímetro permite un recuento más rápido, su costo es más elevado

que cuando se utiliza la cámara Neubauer.

Evans y Maxwell (1990), refieren que la concentración espermática se refiere al

número de espermatozoides por unidad de volumen. Es muy importante, ya que la

relación de dilución depende de ella. El semen de carnero de buena calidad contiene

3,5 – 6,0 mil millones (3 500 – 6 000 x 106 de espermatozoides/ml).

Hafez (1996), afirma que, la concentración de semen puede ser valorada con el uso de

un Hemocitómetro, el cual es rápido y efectivo, se encontró concentraciones de 1 200

– 2 000 x 106 por ml. Menciona también que si la concentración es 0 se esta frente a

una azoospermia; si es reducido (500 - 1 000 x 106 por ml), se está frente a una

20
oligospermia; se considera concentraciones normales a las de 1 200 - 2 500 x 106 por

ml., lo cual es normazoospermia y si el volumen es superior a los 2 500 x 106 por ml.

se esta frente a una polizoospermia.

d) Anormalidades espermáticas

Hafez (1996); afirma que, este examen es una prueba de control de calidad, cada

eyaculado contiene una serie de espermatozoides anormales, pero si la proporción de

estos es muy alta mayores del 15%, entonces nos encontramos ante un semen de

baja fertilidad, se considera normal los eyaculados con porcentajes de 5-9 % de

anormales, entre las anormalidades mas frecuentes que se encuentran en un

eyaculado tenemos; espermatozoides sin cola, cabeza grande, cabeza pequeña, cola

reducida, cabeza adelgazada, rotura de cuello y acrosoma anormal.

Evans y Maxwell (1990), refieren que el examen morfológico del semen es una prueba

de con trol de calidad, cada eyaculado con tiene un serie de espermatozoides

anormales en un de 5-10 %, pero si la proporción de estos es muy alta nos

encontramos ante un semen de baja fertilidad. Los espermatozoides anormales se

pueden detectan mediante el frotis de semen teñido, preparado sobre un porta objetos

(tinción de eosina-nigrosina).

Illera (1994), manifiesta que el porcentaje de anormalidades en eyaculados normales

es de 10 %. Si la proporción es mayor son indicativos de defectos en el sistema

reproductor de los sementales, Las gotas citoplasmáticas son, por, lo general

indicativos de una fase incompleta de la maduración en el epidídimo y puede sugerir

que las muestras el que las muestras se hayan obtenido con demasiada frecuencia.

Bertha (1999), reporta que la evaluación seminal se realizo con la ayuda de un

microscopio óptico con platina caliente, siendo el porcentaje de espermatozoides

21
anormales de 80 %, siendo evaluados 13 carneros de la raza Assaf con 43 eyaculados

obtenidos con vagina artificial.

e) Porcentaje de espermatozoides vivos

Hafez (1996) indica que, los resultados del porcentaje de espermatozoides vivos

mediante tinción con eosina-nigrosina presenta una correlación estrecha con las

estimaciones visuales de la proporción de espermatozoides con movimiento

progresivo.

Evans y Maxwell (1990), refieren que el semen de un carnero no debe mostrar un

porcentaje mayor de 70 – 85% de espermatozoides vivos. El porcentaje de

espermatozoides vivos se puede determinar mediante el frotis de semen teñido,

preparado sobre una porta objetos (tinción de eosina-nigrosina).

Illera (1994), manifiesta que el porcentaje de espermatozoides vivos en eyaculados

normales es de 70 - 90 %. Si la proporción es menor 65 % de espermatozoides vivos

son indicativos de defectos en el sistema reproductor de los sementales, y se esta

ante un semen de baja fertilidad.

2.3 PRUEBA DE CALIDAD ESPERMÁTICA

Generalmente, la predicción de la calidad del semen se evalúa determinando la

concentración, motilidad y morfología de los espermatozoides; sin embargo estos

parámetros tienen limitaciones como predictores de la capacidad fecundante de los

espermatozoides, observándose bajas correlaciones entre estas variables (Yavetz et

al., 1995).

22
Check et al. (1989) al referirse a la integralidad funcional de la membrana espermática,

dice que es un factor muy importante en la reacción del acrosoma, capacitación

espermática, metabolismo espermático y el encuentro del espermatozoide con la

superficie del óvulo. Este factor no puede medirse, pero puede ser evaluado usando el

test de resistencia hipoosmótica (HOST), el cual permite predecir el éxito de la

concepción.

Stornelli (2005) dice que, durante el proceso de congelación-descongelación se pierde

aproximadamente el 50% de la población inicial de espermatozoides debido a los

efectos de la criopreservación sobre las membranas, citoesqueleto, aparato motor y

núcleo del espermatozoide. Watson (1995) considera que el principal sitio de daño

asociado a los cambios de temperatura son las membranas espermáticas. La

reducción en la fertilidad del semen congelado está asociada en gran parte a la

alteración de la estructura y función de las membranas durante los procesos de

refrigeración, congelación y descongelación. Por lo tanto es de suma importancia

evaluar la integridad de las membranas, variable que esta asociada con la fertilidad.

Hammerstedt et al. (1990), manifiestan que, la membrana espermática es una

estructura dinámica que participa en el reconocimiento y transporte de moléculas.

Estas funciones permiten que el espermatozoide adapte su metabolismo al medio

circundante, proporcionando así un sistema molecular para el reconocimiento del

ovocito.

Guyton (2000), indica que, la membrana celular que reviste la célula es delgada,

flexible y elástica y como toda membrana está formada por proteína y una bicapa de

lípidos, y su integridad es vital para la viabilidad del espermatozoide. La fluidez o

viscosidad de la membrana depende de la naturaleza de los lípidos y la temperatura,

aumentando la fluidez los ácidos grasos de cadena corta.

23
La integridad de la membrana espermática es afectada por una serie de fac tores,

principalmente por la acción de la temperatura durante el congelado y descongelado;

así, Coorea y Zavos (1994) dicen que el proceso de congelado y descongelado altera

la fase de hidratación del espermatozoide, lo cual conlleva a una alteración de la

integridad estructural de la membrana.

Liu y Foote (1998) informa que en un estudio en espermatozoides de bovinos,

encontraron que todos los espermatozoides mótiles tienen íntegras las membranas

celulares, y por el contrario todos los espermatozoides con membranas desintegradas

no tuvieron motilidad; por lo tanto la motilidad espermática está íntimamente ligada a la

integridad de las membranas celulares, siendo un criterio importante en la evaluación

de la calidad del semen.

Jeyendran et al. (1984), afirman que, la evaluación de la integridad de membrana

constituye una información importante en la evaluación de la fertilidad del macho.

Además, esta integridad no solo es fundamental para el metabolismo espermático,

sino que también lo es para una adecuada capacitación y reacción acrosómica, y por

ende para la fertilidad del macho.

Yanagimachi (1993), señala que, un grupo de pruebas de funcionalidad espermática

que ha centrado un gran interés por su simplicidad y su valor predictivo son las de

resistencia osmótica. Estas pruebas se basan en los estudios de Drevius y Eriksson

(1966), quienes demostraron la capacidad del espermatozoide de toro, conejo y

hombre para captar agua en un medio hipoosmótico. Estos autores observaron que la

hinchazón osmótica esta asociada con el enrollamiento de la cola del espermatozoide,

que se desdobla cuando la célula era devuelta a un medio isoosmótico. Estos cambios

fueron confirmados por otros autores que relacionaron este fenómeno con la

capacidad funcional de la membrana del espermatozoide humano observando una alta

24
correlación entre la capacidad de hinchamiento del espermatozoide humano en un

medio hipoosmótico y su capacidad de penetración al oocito de hámster libre de zona

pelúcida (Foote y Bredderman, 1969; Jeyendran et al., 1984). Dentro de las pruebas

desarrolladas a partir de este fenómeno destacan dos: el test de endósmosis y el test

de resistencia osmótica.

2.3.1 Test de endósmosis

Calonge et al. (2002) dicen que, la integridad y actividad funcional de la membrana

plasmática son cruciales para la viabilidad y, en suma, por los cambios fisiológicos que

tienen lugar en la superficie del espermatozoide durante el proceso de fertilización,

incluyendo capacitación, reacción acrosómica y unión en la zona pelúcida y oolema.

Por eso, indican que, la comprobación del estado funcional de la membrana

plasmática puede utilizarse como predictivo de fertilidad.

Jeyendran et al. (1984) desarrollaron un método simple llamado test hipoosmótico

(HOS Test). Cuando espermatozoides vivos con integridad funcional de la membrana

son expuestos a una solución de baja osmolaridad (150 mOsm/L), los flagelos se

enrollan debido al influjo de agua. Este test se correlaciona con la concentración

espermática, movilidad, morfología y particularmente con la vitalidad con eosina.

Pérez – Llano et al. (2003), mencionan que el test de endósmosis (Hypoosmotic

Swelling test, HOST) consiste en someter a los espermatozoides a un medio de

presión hiposmótica mas baja que la fisiológica, lo que causa una entrada de agua en

la célula en un intento de equilibrar la presión osmótica interna con la del medio

externo. Para que esta respuesta se produzca, la membrana plasmática del

espermatozoide debe de estar integra y con los mecanismos de intercambio de fluidos

funcionando correctamente. La entrada de agua provoca en estas células un

hinchamiento y enrollamiento del flagelo. Las células con la membrana física

funcionalmente dañada no experimentarán cambios en la forma del flagelo. Los

25
valores obtenidos en esta prueba se correlacionan con otros parámetros de calidad

seminal, como la motilidad, viabilidad o la morfología (Zaneveld y Jeyendran, 1990;

Van den Saffele et al., 1992).

Jeyendran et al. (1984), informan que se presenta una elevada correlación con el test

de penetración en ovocito de hámster en semen humano. En humanos se ha

encontrado una correlación elevada entre los resultados de HOST y los obtenidos en

fecundación “In Vitro” (Van Der Ven et al., 1986). En cerdos, si la presión osmótica es

demasiado baja, la membrana plasmática se rompe y el flagelo aparece de nuevo

recto, por lo que se confundiría con un espermatozoide que aun no ha reaccionado. El

HOST detecta una subpoblación de espermatozoides viables que no reacciona al test,

siendo así una prueba más sencilla a la hora de evaluar la viabilidad que la tinción de

eosina-nigrosina o las tinciones fluorescentes (Pérez- Llano et al., 2003). En la especie

humana. El test HOST parece ser un buen método predictivo de la capacidad

fecundante “In Vitro” e “In Vivo” del semen (Zaneveld y Jeyendran, 1990; Verheyen et

al., 1997); sin embargo, no todos los autores avalan estos resultados (Rogers y

Parker, 1991).

Hammerstedt et al. (1990); observaron que, en los espermatozoides funcionalmente

alterados no se produce la captación selectiva de agua de forma adecuada

alcanzándose así un equilibrio pasivo entre los medios intra y extracelular que no

provoca cambios morfológicos apreciables. Por otra parte, el hinchamiento de las

células se puede provocar mediante otras vías distintas al descenso de la osmolaridad

del medio que rodea a las células. Soluciones isoosmóticas de solutos polares como el

glicerol puede provocar el hinchamiento celular debido a la capacidad de estas

sustancias de arrastrar agua cuando atraviesan la membrana celular, alterando así el

equilibrio de las presiones osmóticas internas y extremas; de esta manera, las

alteraciones celulares atribuidas al glicerol parecen estar mas relacionadas con el

26
shock osmótico que con la toxicidad química (Gao et al., 1993). A pesar de todo ello,

todavía existe un gran desconocimiento sobre los mecanismos sobre los mecanismos

moleculares específicos que el espermatozoide utiliza para reaccionar frente a un

medio hipoosmótico.

Hafez (1996), afirma que, el Test de HOS es una prueba sencilla y económica

empleada como herramienta adicional para evaluar la capacidad fecundante de los

espermatozoides del ser humano (Jeynedran et al., 1985) y la integridad funcional de

la membrana espermática. A fin de aplicarla, 0,1 ml de eyaculado no diluido se mezcla

con 1 ml de solución consistente en cantidades iguales de fructuosa y citrato de sodio

a 150 mOsm en agua. Después de la incubación por 30 a 60 minutos a 37ºC, los

espermatozoides se observan por microscopia de contraste de fase, y se determina la

proporción de células que exhiben expansión (hinchamiento) de la cola.

Ramsey (1980), dice que, en ciertas circunstancias, las proteínas y otras

macromoléculas pueden ser absorbidos o secretados por células en tal forma, que no

requiere de la ruptura de la membrana celular. Por lo tanto, al considerar los procesos

responsables del transporte de sustancias a través de la membrana, debe tomarse en

cuenta el movimiento de moléculas cuyo tamaño y complejidad varían en un rango

muy amplio que va desde el agua, iones o simples moléculas de gases hasta

macromoléculas tales como proteínas o ácidos nucleicos.

Hafez (1996), indica que, la célula espermática esta cubierta por completo por una

membrana llamada plasmalema o membrana plasmática. El acrosoma es una

estructura delgada, de doble pared, situada entre la, membrana plasmática y la

porción anterior del núcleo. Un cuello corto conecta la cabeza del espermatozoide con

su larga cola, dividiéndola en tres porciones: media, principal y terminal.

27
Santiani et al. (2004), mencionan que, los espermatozoides están clasificados en

positivo o negativo. Se considera de "reacción positiva" aquellos espermatozoides que

presentan cambios morfológicos en la cola (con integridad de su membrana

espermática) y de "reacción negativa" aquéllos que no presentan cambios

morfológicos (con alteración de su membrana). Para tal efecto, se contaran un mínimo

de de 200 espermatozoides por lamina, expresando los resultados en porcentaje de

espermatozoides con reacción positiva a la prueba de HOST.

Jeyendran et al. (1984), Artiga (1994) y Rota et al (2000), concuerdan con indicar que,

es suficiente contar 100 espermatozoides para validar el HOST.

Boretto et al. (2002), concluyeron que, los valores de reacción positiva al test

hiposmotico es de 35,5 %, siendo evaluados 10 carneros, con un promedio de 8

eyaculados por animal.

2.4 DILUCIÓN DEL SEMEN

Evans y Maxwell (1990), manifiestan que, cuando se utiliza IA en ovejas, tanto el

volumen de inseminación como el número de espermatozoides que contiene se

reduce sustantivamente al compararlo con la monta natural, sin embargo agregando

dilutores al semen, los cuales no afecten su capacidad fecundante, se puede

inseminar un gran número de hembras con un eyaculado.

2.4.1 Composición de dilutores

Salamon y Maxwell (1995), dicen que, los dilutores deben tener portadores

energéticos para que los espermatozoides tengan la suficiente fuerza de atravesar la

membrana plasmática, utilizándose preferentemente glucosa y fructosa; por otro lado

el espermatozoide del ovino tolera una alta concentración de glucosa debido a su

capacidad de penetrar la célula espermática y de este modo igualar el gradiente

28
osmótico. Estos mismos investigadores recomiendan utilizar glucosa en el Tris, por ser

más adecuado que la fructosa, lactosa o rafinosa.

McDonald (1991) refiere que las diferencias en la motilidad individual esta influenciada

por la composición de los dilutores utilizados; por lo que Hafez (1996) sugiere hacer

una determinación exacta de la concentración de espermatozoides por milímetro de

semen dependiendo del tipo de dilutor empleado.

Borque y Sagües (1992) refieren que, la fructosa es necesaria para la supervivencia

de los espermatozoides en condiciones anaeróbicas y está estrechamente relacionado

con la motilidad inicial de los espermatozoides.

Algunos investigadores también refieren que los espermatozoides pueden utilizar otros

compuestos energéticos como la manosa, maltosa (Pérez y Pérez, 1985), sorbitol y

glicerilfosforilcolina (Bearden y Fuquay, 1982), pero que todavía no se han reportado

sus usos como componentes de dilutores en el semen refrigerado.

Otro componente de los dilutores para la refrigeración se semen de ovinos es la leche

entera, descremada o reconstituida, pues su contenido proteico actúa como buffer del

pH y como quelante de algunos metales pesados y puede proteger parcialmente al

espermatozoide durante la reducción de la temperatura de conservación (Salamon y

Maxwell, 2000).

Evans y Maxwell (1990) dicen que, la leche ultrapasteurizada, además de ser estéril,

tiene las características necesarias para incorporarse en un buen dilutor, pues se

almacena a temperatura ambiente por varios meses en envases herméticamente

cerrados.

29
Foote (1978) indica que, la leche tiene resultados comparables en mantener la

fertilidad con respecto al citrato-yema de huevo; sin embargo, Tiwari et al (1977) indica

que la leche hace que se acumule rápidamente ácido láctico, disminuyendo el pH y por

lo tanto ocasiona una mayor mortalidad de espermatozoides y consecuentemente se

afecta la fertilidad.

Evans y Maxwell (1990), refieren que, la leche, por su alto contenido de grasa puede

interferir en la observación de los espermatozoides en la evaluación seminal.

Pérez y Pérez (1985), dice que, otro ingrediente utilizado en los dilutores es la yema

de huevo, debido a su acción protectora sobre los espermatozoides, pues aumenta el

metabolismo de la glucosa, de manera que los espermatozoides ahorren fructosa y

tendrán mayor energía durante su conservación. Estos mismos investigadores

mencionan que, Jones y Martin (1973) reportaron que la yema de huevo conserva la

motilidad espermática e integridad de la membrana espermática.

Por su parte, Hafez (1996) observa que la yema de huevo al 20% tiene una adecuada

capacidad amortiguadora para mantener el pH neutro y evitar la acidificación del

medio y por lo tanto la mortalidad espermática.

Vishwanath (2000) dice que los fosfolípidos de la yema de huevo protegen al esperma

contra el shock por frío. No obstante las características positivas indicadas con

respecto a la yema de huevo, Pérez y Pérez (1985) dicen que, los dilutores a base de

yema de huevo provocan mortalidad espermática a causa de una acumulación de

ácido pirúvico y recomienda la adición de soluciones buffer a fin de mantener el pH del

medio.

30
Salamon y Maxwell (1995) también señalan como otro componente de algunos

dilutores al ácido cítrico, el cual neutraliza los productos de desecho del metabolismo

de los espermatozoides, en especial del ácido láctico; es decir desempeña una acción

buffer efectiva neutralizando la acidez del medio causado por los catabolitos;

adicionalmente, Holy (1983) destaca la importancia del ácido cítrico por su acción en la

fijación del calcio, que junto con los iones de sodio y potasio mantienen el equilibrio

osmótico, favoreciendo la motilidad de los espermatozoides (Borque y Sagües, 1992)

por participar en la activación de la fosfatasa ácida presente en el plasma seminal.

Cortés et al. (1995) hace referencia al empleo del Tris (hidroximetil) aminometano,

más conocido como Tris, por su acción de buffer y proteger al acrosoma de los

espermatozoides. Este buffer orgánico tiene mayor capacidad amortiguadora que el

citrato o fosfato y es menos tóxico para los espermatozoides y penetra las células

espermáticas para actuar como buffer intracelular (Visser, 1975); de manera que

(Evans y Maxwell, 1990), por su acción osmótica y su poder neutralizante de los

productos de desecho metabólico, en particular del ácido láctico, es recomendado

para su uso en dilutores de semen de ovinos.

Hafez (1996), refiere que, entre otras sustancias empleadas en la composición de los

dilutores se encuentran los antibióticos, los cuales actuarían en la prevención de

transmitir enfermedades y reducir la carga bacteriana del medio que rodea al

espermatozoide; pues, tal como lo refiere Pérez y Pérez (1985) reporta que,

frecuentemente, el material colectado es contaminado y recomienda utilizar dosis de

500 a 1 000 UI/ml de penicilina/ml de dilutor y de 500 a 1 000 ug de estreptomicina/ml

de dilutor.

31
Sumano (1997) indica que la penicilina impide la transpeptidación de la pared celular,

interrumpiendo la regeneración de la pared, destruyendo así a las bacterias, siendo su

principal acción en los microorganismos grampositivos.

Merck (1993), señala que, la estreptomicina tiene rápida acción contra los

microorganismos gramnegativos, a nivel del ribosoma bacteriano interfiriendo en la

síntesis proteica del microorganismo.

Gibbons et al (2004), al referirse al congelamiento del semen, recomienda para la

elaboración del diluyente para congelar semen de carnero, utilizar la fórmula

presentada en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Composición química de diluyente para refrigerar semen de ovino.

INSUMO CANTIDAD

Tris 3,63 g

Glucosa 0,50 g

Ácido cítrico 1,95 g

Yema de huevo 15 ml

Estreptomicina 0,1 g

Penicilina 100 000 UI

Agua destilada apirógena hasta completa 100 ml

Fuente: Evans y Maxwell (1987)

Mellisho et al (2004), al referirse a la inseminación artificial vaginal o cervical con

semen fresco , el semen debe tener motilidad masal mayor e igual grado 3, se

recomienda realizar una taza de dilución de 1:1 ó 1:2 (semen – dilutor), agregando el

dilutor al semen, ambas a temperatura de 30 a 35 ºC. Recomienda para la elaboración

del diluyente para semen fresco utilizar la siguiente formula en el Cuadro 2.

32
Cuadro 2. Composición química de diluyente para semen fresco de ovino.

Dilutor Tris Dilutor Citrato

Tris (g) 3,634 Citrato de Sodio (g) 2,9
Fructosa (g) 0,5 Fructosa (g) 0,08
Acido Cítrico (g) 1,99
ABD, enrasar a 100 ml ABD, enrasar a 100 ml

Fuente: Evans y Maxwell (1987)

Mellisho et al (2004), al referirse a la inseminación artificial vaginal o cervical con

semen refrigerado, tener encuentra que el dilutor debe contener un protector ( yema

de huevo) de la membrana del espermatozoide contra el shock frio durante la

refrigeración de 4 – 5 ºC. Se recomienda utilizar semen con motilidad masal mayor e

igual a grado 3. La conservación del semen en refrigeración será por un tiempo

máximo a 60 horas, para garantizar una buena taza de preñez. Recomienda para la

elaboración del diluyente para semen refrigerado utilizar la siguiente formula en el

Cuadro 3.

Cuadro 3. Composición química de diluyente para refrigerar semen de ovino.

Dilutor tris-fructosa-yema Dilutor citrato- glucosa-yema

Tris (g) 3,634 Citrato de Sodio (g) 2,9

Fructosa (g) 0,5 glucosa(g) 0,8

Acido Citrico (g) 1,99 Yema de Huevo (ml) 20
Yema de Huevo (ml) 14

ABD, enrasar a 100 ml ABD, enrasar a 100 ml

Fuente: Evans y Maxwell (1987)

Nota: Antes de Inseminar, calentar el semen diluido en baño maría a 30 – 35ºC

33
2.4.2 Tipos de dilutores

Evans y Maxwell (1990), indica que, las principales funciones del dilutor son, conservar

la fertilidad de las células espermáticas y aumentar el volumen total siendo estos

medios isotónicos. Además protege a los espermatozoides del shock hipotérmico

cuando se enfrían y conservan así o contra las injurias de la congelación cuando se

congela el semen.

a) Diluyentes sintéticos

Evans y Maxwell (1990); manifiestan que, los diluyentes sintéticos mas comunes

utilizados para diluir semen de carnero, para inseminación artificial vaginal o cervical,

contiene como amortiguador Tris o Citrato, glucosa o fructuosa como fuente de

energía y yema de huevo para proteger la membrana de los espermatozoides contra

el shock hipotérmico.

b) Diluyentes naturales

Evans y Maxwell, 1990); manifiestan que, en condiciones de campo el diluyente del

semen mas fácilmente asequible es la leche de vaca, que se puede utilizar tanto

entera como descremada o en polvo para reconstituir, siempre que se vaya a proceder

a la inseminación artificial vaginal o cervical. Para esto se debe utilizar leche fresca,

del mismo día que se vaya utilizar, procedente de una vaca sana.

2.5 ALGUNOS TRABAJOS DE EVALUACIÓN SEMINAL EN OVINOS ASSAF

Y BLACKBELLY

Epstein (1985) indica que el promedio de la raza Assaf en EE.UU. muestra valores

extremos de concentración espermática, que fueron 1 780 a 3 990 x 10 6

espermatozoides por centímetro cúbico.

34
Quispe (1998), evaluando semen de carneros Blackbelly, en la UNALM, reporta 83,6%

de motilidad individual; 3 730 x 106 de espermatozoides/cc de semen y 1,46 cc de

volumen de semen.

Mohamed (1996) utilizando el método de colección de semen por electroeyaculador

reporta en ovinos Blackbelly, un 66% de motilidad individual, 700 x 106 de

espermatozoides/cc de semen; 1,0 cc de volumen de eyaculado y 18,5% de

anormalidades espermáticas.

Guillén (2002), en carneros Blackbelly - INIA La Molina, reporta 84,9% de motilidad

individual, 3 140 x 106 de espermatozoides/cc de semen; 0,97cc de volumen de

eyaculado y un pH entre 6,6 a 6,8. Los rangos del volumen fueron 0,96 a 1,0 cc; los

del pH 6,6 a 6,8. El porcentaje de anormalidades no superó el 1%. La motilidad estuvo

entre 83,0 a 85,5%.

Louda et al. (1981), en ovinos Finnsheep, reporta un volumen espermático de 0,97 a

1,16 cc, una motilidad de 75% y una concentración espermática de 5 660 x 10 6 por cc.

Carmenate y Hernández (1982) en carneros Pelibuey, reportan un volumen promedio

de eyaculado de 0,57 + 0,28 cc, con una motilidad de 87,62 + 5,82% y una

concentración espermática de 4 110 x 106 por cc.

Akourki et al. (2004) al evaluar diferentes diluyentes de semen sobre la fertilización in

vitro (FIV) utilizando semen congelado de carnero Assaf, reporta que el tipo de

diluyente (diluyente de Fisher) no influyó sobre los porcentajes de FIV; sin embargo la

adición de 0,7% de Orvum Paste (detergente) mejoró significativamente (P<0,05) la

calidad del semen congelado (33,93% vs. 22,57% de motilidad individual; 27,72% vs.

16,39% de viabilidad; 29,65% vs. 21,26% de endosmosis; 53,57% vs. 35,61% de la

integridad del acrosoma y 56,15% vs. 72,36% de morfoanomalías); sin embargo, esta

35
mejora no se reflejó en la fertilización de los ovocitos, que en promedio 28,91 y

29,76% para el grupo control y con Paste, respectivamente.

Santiani et al. (2004), al estudiar la integridad de membrana en espermatozoides de

ovinos (semen fresco), mediante la prueba de estrés hipoosmótico, reporta que los

valores HOST fueron correlacionados con la motilidad espermática, viabilidad e

integridad acrosomal. Los cambios en los espermatozoides fueron determinados en

microscopía óptica (400x) sin ningún tipo de coloración. La mayoría de

espermatozoides HOS+ (97,7%), mostraron cambios morfológicos a partir de una hora

de incubación. Asimismo, encontraron una mayor relación entre los espermatozoides

HOS+ vs. Los espermatozoides viables con acrosoma, en comparación con la

motilidad espermática. Estos investigadores concluyen indicando que la evaluación de

la motilidad no es indicativa de la funcionalidad de la membrana espermática; por lo

tanto la prueba HOS se constituye en un parámetro importante para estimar la

capacidad fecundante del semen de ovino.

36
 III. MATERIALES Y METODOS

3.1 LUGAR Y DURACIÓN DEL PROYECTO

El presente trabajo de investigación se llevó a cabo en las instalaciones del Banco

Nacional de Semen del Programa de Mejoramiento Animal de la Universidad Nacional

Agraria La Molina, de Mayo a Noviembre del 2007, caracterizado por ser una zona

agroecológica de costa subtropical con una temperatura promedio anual de 18º C y

una humedad relativa anual de 75 % según SENHAMI (2007).

3.2 DISEÑO DE INVESTIGACIÓN

La investigación responde a un estudio experimental en el cual se compararon

las variables de la calidad seminal de dos razas de ovinos: Assaf y Blackbelly. El

diseño de la investigación responde a un experimento en el cual el análisis de datos se

realizó mediante la prueba de “t”. En la Figura 2, se muestra el croquis del

experimento.

FIGURA 2. CROQUIS EXPERIMENTAL

Macho reproductor BBB Macho reproductor ASSAF

Colección de semen:
- Vagina artificial
Evaluación del semen fresco:
- Macroscópica
- Microscópica
Dilución de semen:
- TRIS Glucosa-yema de huevo.
Refrigeración del semen:
- Dos horas
Evaluación microscópica del semen
refrigerado

Se esperan diferencias entre las

características macroscópicas y
microscópicas del semen de
carneros Blackbelly y Assaf

37
3.3 POBLACIÓN Y MUESTRA DE ESTUDIO

En la presente investigación la población experimental estuvo dada por reproductores

de las razas Assaf y Blackbelly, criados en condiciones de confinamiento en

instalaciones del Banco Nacional de Semen.

La muestra estuvo conformada por 06 carneros donadores de semen: 03 de la raza

Blackbelly y 03 de la raza Assaf, cuyas edades fue de 3,5 años.

A cada reproductor se les hizo 12 colecciones de semen (dos recogidas por semana)

para su evaluación macroscópica y microscópica de acuerdo a los objetivos indicados.

Los animales tuvieron el mismo régimen de manejo y alimentación que se utiliza en el

criadero. La alimentación estará basada en una dieta consistente en forraje verde

picado (King grass, maíz chala) más un suplementado concentrado.

Los corrales en donde se ubicaron los reproductores donantes de semen tuvieron una

dimensión de 2,80 x 3,00 x 1,20 (metros), provistos de sombras, comedero y

bebedero así como una adecuada iluminación y ventilación, siendo la densidad por

corral de 2 animales.

3.4 VARIABLES EN ESTUDIO

3.4.1 Variables independientes:

- Eyaculado de carneros Assaf

- Eyaculado de carneros Blackbelly

3.4.2 Variables dependientes:

- Volumen del eyaculado

- Color y aspecto del semen

38
 - pH del eyaculado

- Motilidad masal

- Concentración espermática

- Motilidad individual progresiva

- Integridad de membrana (Host)

3.5 PROCEDIMIENTO DE COLECCIÓN DE SEMEN Y EVALUACIÓN

Para la colección de semen, se empleó un brete de monta que facilito la extracción del

semen de los carneros.

Para la evaluación del eyaculado y dilución del mismo, se utilizó el laboratorio

previamente acondicionado con los equipos y materiales necesarios.

Los pasos seguidos en el presente estudio fueron; la colección de semen, evaluación

de semen fresco, tanto macroscópica y microscópica, dilución del semen, refrigeración

y evaluación del semen después de la dilución y refrigeración (motilidad individual

progresiva e integridad de membrana mediante el test de Hots).

3.5.1 De la colección de Semen

Se utilizaron machos entrenados para la donación de semen con vagina artificial,

compuesta por una funda latex recta, cono de látex fijado a la vagina y, a la funda, un

tubo colector sujetado con cinta masquintype al cono de látex. Para su armado se

utilizó agua entre 48º a 50ºC, a fin de que la temperatura de la vagina artificial,

inmediatamente antes de recoger el semen, estuviera entre 42º a 45ºC. También se

mantuvo una presión adecuada para facilitar la eyaculación. Los movimientos

vigorosos del carnero hacia arriba y hacia adelante significan que se ha producido la

39
eyaculación. Inmediatamente después de la eyaculación, la vagina artificial se cambia

de posición, quedando el tubo de vidrio en la parte inferior, a la vez que se sujeta esta

con la mano. El tubo de recogida del semen será etiquetado, tapado y colocado en

Baño María a 34º C. El régimen de colección de semen será de 2 recogidas por

semana, seguido de un descanso de 2 – 3 días.

3.5.2 Parámetros a evaluar

3.5.2.1 Macroscópicos

a) Volumen

Se expreso en centímetros cúbicos.

b) Color y Aspecto

El color se determino por observación directa.

c) pH

Determinado mediante el método de colorímetro.

3.5.2.1 Microscópicos

Se realizó con la ayuda de un microscopio

a) Motilidad masal (semen fresco)

Valoración cuantitativa del movimiento de los

espermatozoides. Se determinó inmediatamente después

de la colección de semen, dejando caer una gota en el

centro de la lámina portaobjetos mantenida a 38º C y se

lleva al microscopio para poder observar a 10X. La

evaluación de la motilidad masal se realiza empleando una

escala de 0 a 5 (Evans y Maxwell 1987)

40
Cuadro 4. Sistema de Valoración de la Onda de Movimiento.

Valor Clase Descripción

Densa, ondas de movimiento muy rápido. No se puede
90 % Muy Buena observar las células individuales. El 90 % o mas de lo
espermatozoides son activos.
Movimiento vigoroso, pero las ondas y los remolinos no
72 % Buena son rápidos como los del valor 5. Alrededor de 70 a 85 %
de células activas.
Sólo aparecen ondas de movimientos lento. Se puede ver
54 % Regular espermatozoides aislados. El 45 a 65 % de las células son
activas.
No aparecen ondas aunque se observa movimientos de
36 % Pobre espermatozoides. Solo viven el 20 a 40 % de las células
espermáticas y su motilidad es pobre.
Muy pocos espermatozoides (alrededor del 10 %)
18 % Muy Pobre
presentan signos de vida, pero con movimientos débiles.
0% Muertos Ningún espermatozoide presenta movimiento.

Fuente: Evans y Maxwell (1987).

b) De la motilidad individual progresiva

La exanimación se llevó a cabo sobre un porta objetos

templado a 38 ºC para su observación. La muestra es

cargada al porta objetos con la ayuda de una pipeta

Pasteur, colocando luego el cubreobjetos para finalmente

llevar al microscopio para su observación a 25X y

determinar la motilidad individual progresiva, se valoro el

porcentaje de espermatozoides con movimiento

(0-100), repitiendo la observación dos veces

(Evans y Maxwell 1990).

c) Concentración espermática

El número de espermatozoides por unidad de volumen fue

determinado mediante el método de hemocitómetro o

cámara de Neubauer según lo descrito por chimeneau y

Cognie (1991), siguiendo el siguiente procedimiento:

41
1. Preparar la cámara de neubauer situando él cubre

objetos sobre la cámara.

2. Dejar caer una gota de semen pre-diluido sobre

una lamina porta objetos.

3. Aspirar semen con la pipeta volumétrica, hasta la

marca de 0,5, retirar la pipeta del semen.

4. Aspirar el liquido de dilución (puede ser agua

común o destilada) hasta la marca 101. Evitar

que entre burbujas de aire.

5. Tapar con los dedos ambos extremos de la pipeta

y agitar horizontalmente en forma suave para

que se mezcle bien el semen con el agua

destilada.

6. Desechar las 4 o 5 primeras gotas del extremo de

la pipeta, para conseguir muestra de semen

perfectamente diluida.

7. Colocar el extremo de la pipeta en el borde del

cubreobjetos y dejar que la cámara se cargue por

capilaridad. El líquido no debe pasar a los surcos

laterales ni deben quedar glóbulos de aire o

zonas sin cargar.

8. Dejar reposar 5 – 6 minutos antes de la lectura.

9. Colocar la cámara bajo observación microscópica

a 40X aumentos. Si lo espermatozoides no están

repartidos uniformemente por toda la cámara,

debe repetirse la operación de carga.

42
 10. Se cuenta el número de espermatozoides en 5

cuadrados “grandes”. Se debe contar los extremos

y el cuadrado central.

11. Anotar el número total de espermatozoides

contados.

La concentración de espermatozoides/mm 3 de semen, se

calculó de la siguiente manera:

CC. espermática/mm3 = Nº de espermatozoides x 10 000

d) Vivos, muertos y anormales

La morfología de los espermatozoides se determinó

mediante el método de frotis de semen teñido (Evans y

Maxwell 1987), preparado sobre una porta objeto, utilizando

soluciones de eosina al 5 % y nigrosina al 10 %,

procediendo de la siguiente manera:

1. Colocar, primero en lugares separados, 3 gotas de

eosina y 3 gotas de nigrosina, sobre una lámina

porta objetos.

2. Dejar caer una pequeña gota de semen, cerca a la

eosina, mezclar bien uniforme, para finalmente

mezclar con la nigrosina la mezcla semen –

eosina, de manera uniforme para obtener la

mezcla de semen-eosina-nigrosina.

3. Hacer un frotis y colocar en platina caliente

43
 4. Dejar que seque y observar al microscopio con

aumento de 40X.

5. Examinar, por lo menos, 300 espermatozoides de

diferentes campos.

El porcentaje de espermatozoides vivos se determinó mediante

la siguiente formula:

n x 100
X = ----------
N

Donde:

N = número total de espermatozóides contados.

n = número de espermatozoides anormales hallados.

3.5.3 Solución Hiposmótica

Cuadro 5: Composición Química de la Solución Hiposmotica a 100 mOsmol/L con

Citrato de sodio y Fructuosa.

Agente Unid. Cantidad

Citrato de sodio dihidratado g 0,08

Fructuosa g 0,025

Agua destilada ml 10

Osmolaridad mOsmol/L. 100

Fuente: Correa, (1996)

44
3.5.4 Medio de Lavado

Cuadro 6: Composición Química del Medio de Lavado con Citrato de Sodio al 2.9

% con 2 % (v/v) de FBS.

Agente Unid. Cantidad

Solución A

Citrato de sodio dihidratado g 0,29

Agua destilada ml 10

Total ml 10

Solución B

De la Solución A ml 9,8

FBS (Suero bovino fetal) ml 0,2

Total ml 10

Fuente: Correa, (1996).

3.5.5 Evaluación de la integridad funcional de la membrana espermática

Para evaluar la prueba hiposmótica (Test de HOST) se siguió el siguiente

protocolo según Correa y Zavos (1994).

1. Dilución: diluir a una proporción 1:1 (v/v) usando citrato de sodio al 2.9

% con 2 % (v/v) de FBS (suero bovino fetal).

2. Lavado: Centrifugar por 5 minutos (modificado por el investigador) a

1000 rpm. Para al final quedarse sólo con el pellet eliminando el

sobrenadante.

3. Reconstitución del semen al volumen original: agregar al pellet 10 µl.

4. Conteo de espermatozoides anormales en tiempo cero.

45
 5. Prueba Hiposmotica: mezcla de semen con solución hiposmotica a 10

mOsmol/L. en una proporción de 1:10. Seguidamente, incubar en baño

maría a 34º C por 60 minutos. Pasado el tiempo incubación, se procede

a mezclar una gota de la muestra seminal incubada con una gota de

glutaraldehido al 2% para retener la reacción González, (1992).

Finalmente se hizo el contaje en un microscopio de contraste de fase a 40X, los

espermatozoides con reacción positiva, registrándose un total de 200

espermatozoides en un mínimo de 10 campos diferentes.

3.5.6 Del dilutor utilizado

La dilución de semen tuvo como propósito aumentar el volumen del eyaculado

para poder inseminar el mayor número de hembras posible. Manteniendo

fértiles y motiles a los espermatozoides el mayor tiempo posible. El dilutor de

semen utilizado en el estudio fue el TRIS, cuya composición se muestra en el

Cuadro 7

Cuadro 7. Composición química del dilutor Tris

TRIS -FRUCTUOSA-YEMA DE HUEVO

- Tris (g) 3,63
- Fructuosa (g) 0,5
- Ácido cítrico (g) 1,95
- Yema de huevo (ml) 15
- Penicilina (UI) 100 000

- Estreptomicina (mg) 100

- Agua destilada (ml) 80
TOTAL (ml) 100

Fuente: Evans y Maxwell (1990)

46
3.4.7 Elaboración del diluyente para refrigerar semen de carnero

Se preparo los diluyentes indicados en el cuadro 04, las sustancias químicas se

pesaron en primer lugar y se disolvieron en una probeta de 100 ml,

adicionando 75-80 ml de agua destilada en vidrio. Se adiciono luego la yema

de huevo y llevo al volumen final con agua destilada en vidrio, el diluyente se

mezcla moviendo la probeta hacia atrás y adelante para obtener una buena

distribución de la yema de huevo. Los huevos que se utilicen, para obtener la

yema, no deben de tener más de 4 a 5 días. La cáscara del huevo debe ser

lavada con agua caliente, esterilizada después, pasando por ella una porción

de algodón o papel empapado de alcohol y dejándola secar. Una vez quebrado

el huevo y separada la clara, la yema se sitúa sobe un papel filtro de tal forma

que no se rompa sus membranas. Los restos de clara se pueden eliminar

enrollando el papel sobre la yema, luego la yema se vierte en un baso estéril

mediante plegamiento y deslizado sobre el papel. Las membranas de yema

quedaran sobre el papel y se desechan. Antes de adicionarla al diluyente, la

yema de huevo se debe batir con la ayuda de una varia de vidrio estéril,

especialmente cuando procede de más de un huevo. El diluyente indicado

debe ser preparado recientemente cada día que se colecta semen. Es

recomendable volver a medir el pH (6,5 – 7) al momento de utilizarlo (Evans y

Maxwell 1990).

3.5.8 Método de Dilución.

La dilución del semen se hizo tan pronto como se pueda una vez recolectado y

analizado de forma rutinaria. Tanto el semen como el diluyente se colocaron en

baño de agua a 34 ºC para que en el momento de la dilución tengan la misma

temperatura. El dilutor se coloco en el baño antes que el semen. La dilución se

realiza pipeteando una cantidad adecuada de diluyente (depende del grado de

47
 dilución) y adicionándola lentamente al recipiente donde se encuentra el

semen. Siempre adicionar el diluyente al semen, nunca al contrario, ya que

pueden alterarse los espermatozoides con lo que se reduce la motilidad.

Después de adicionar el diluyente se agita todo convenientemente y se

examino al microscopio para comprobar la motilidad de los espermatozoides

(Evans y Maxwell 1990).

3.5.9 Descenso de temperatura y estabilización

Agregado el total de diluyente se inicio el descenso de temperatura, para lo

cual se lleva el semen a refrigeración en un vaso con agua a 36 ºC,

acompañado con un termómetro de fácil lectura. El semen debe descender

desde 36 ºC a 5 ºC en 30 – 35 minutos. A un ritmo de 2 ºC cada 3 minutos

aproximadamente. Este proceso se logra agregando gradualmente trocitos de

hielo al baño de agua que acompaña al semen, en la parte final de la curva de

enfriamiento (Evans y Maxwell 1990).

A la fase del descenso de temperatura le sigue la de equilibrio, en esta fase, el

semen debe permanecer en la refrigeradora a 5 ºC durante 60 minutos.

3.5.10 Evaluación del semen post refrigerado

La exanimación se lleva a cabo en un portaobjetos templado 38 ºC, para su

observación al microscopio (25X - 40X). Se determinara la motilidad Individual

progresiva al post refrigerado, repitiendo la observación de 1 – 2 veces (Evans

y Maxwell 1990).

48
 Figura 3. OBTENCION, PROCESAMIENTO Y CONSERVACION DE SEMEN
REFRIGERADO DE OVINOS ASSAF Y BLACKBELLY

Elaboración del diluyente

(TRIS)

Evaluación Evaluación
Maroscópica Colección de Semen Microscópica
* Volumen (Vagina Artificial * Motilidad masal 38 Cº
* Color y Aspecto * Concentración
* pH * Vivos y Muertos
* Anormales
*Integridad de Membrana
(Host)

Pre- Dilución Dilución del Semen Dilución Final

01:01 34 Cº Tener en consideración
Evaluación microscópica

Descenso de temperatura Refrigeración del Semen Estabilización

34 Cº - 5 Cº 30 - 35 min. 5 Cº 45 a 60 minutos
a razón 2 Cº / 3 min aprox.

Evaluación Post-Refrigeración

* Motilidad 25 a 40 X 1 - 2 veces
* Motilidad individual progresiva (MIP) Post refrigeración 38 Cº
* Integridad de membrana espermática (Host)
* Manipulación y Almacenamiento de Semen Refrigerado 5 Cº

49
3.6 Técnica de procesamiento y análisis de datos

Para la determinación de las diferencias estadísticas entre los parámetros

evaluados entre las razas Assaf y Blackbelly, se realizaron pruebas para

diferencia de medias, mediante una prueba de “t”. Para tal fin los valores

porcentuales, previamente fueron transformados a raíz cuadrada, de acuerdo a

Steel y Torrie (1985).

Los porcentajes de 80 y 100 por ciento deberán restarse de 100 antes de hacer

la transformación

√ Y + 1/2

En el procesamiento estadístico se utilizó el software estadístico SAS

(Versión 8,0).

50
 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Características macroscópicas del semen fresco

En el Cuadro 8 se resume la característica macroscópica del semen fresco

utilizado en la investigación, siendo 36 eyaculados para ambas razas Assaf y

Blackbelly, con un volumen promedio de 1.94 ± 0,69cc y 1,43 ± 0,58cc

respectivamente encontrándose diferencias significativas (P≤0,05). Los

eyaculados fueron de color blanco cremoso, con un pH de 7,0 para ambas razas.

Cuadro 8. Característica macroscópica de los eyaculados por raza

Raza Variable N Promedio D.E. C.V. % Min. Max.

Assaf Volumen, ml 36 1,94a 0.69 35.57 0.5 3.3

Blackbelly Volumen, ml 36 1.43b 0,58 40.52 0.5 2.5

a,b, valores promedio con letras diferentes varían estadís ticamente (P≤0,05)

El volumen promedio determinado en la presente investigación se encuentra en el

rango normal de eyaculados en ovinos, tal como lo refiere Hafez (1996), quien

reporta valores entre 0,94 a 6,7 ml; obviamente los valores varían dependiendo

del método de colección de semen, que en el presente caso fue empleando

vagina artificial. Resultados que guardan relación con otros reportes de

investigación, como el de Quispe (1988), quien para ovinos Blackbelly reporta un

volumen de semen de 1,46cc; similarmente Guillén (2001) reporta un volumen de

0,97cc.

En todos los casos el pH fue neutro, siendo 7,0. Este resultado es indicativo de un

adecuado pH seminal, pues si se hubiera detectado valores mayores (alcalinidad)

51
 se considera como semen de escasa fertilidad y baja concentración y motilidad, tal

como lo reporta Evans y Maxwell (1990). Al respecto, Letard (1986) considera

como anormales valores inferiores a 7,0 y lo valores superiores a 7,6 están

asociados con alteraciones en las reacciones genitales. Por su parte Guillén

(2002), en carneros Blackbelly del Programa de Crianzas Familiares del INIA,

reporta pH entre 6,6 a 6,8; valores ligeramente más bajos que el registrado en el

presente trabajo.

4.2 Características microscópicas del semen fresco

En el Cuadro 9 se observa que la motilidad masal de los 36 eyaculados evaluados

para la raza Assaf y 36 eyaculados para la raza Backbelly fue de 77 + 8.18% y

73 + 6 % respectivamente. No evidenciándose diferencias significativas entre los

promedios (P>0,05). Estos resultados son indicativo de una alta motilidad,

evaluada en una escala subjetiva entre 0 y 100 %, tal como lo recomienda

Gibbons et al (2004); de manera que el semen utilizado en el presente trabajo

tuvo una alta motilidad masal luego de su colección.

Cuadro 9. Característica microscópica de los eyaculados por raza

Raza Variable N Promedio D.E. C.V. % Min. Max.

% Motilidad Masal 36 77a 8.18 10.62 72 90

Concentración 36 2 694,72a 763,7 28,34 1 260 4 600

Assaf
% Vivos 36 81,89a 5,97 7,29 67 90

% Anormales 36 7,11a 2,05 28,83 4 12

Motilidad Masal 36 73b 6 8,22 54 90

Concentración 36 2 458,89a 903,65 36,75 1 320 4 760

Blackbelly
% Vivos 36 80,19a 5,87 7,32 70 94

% Anormales 36 6,94a 1,55 22,33 5 11

a,b, Valores promedio con letras diferentes varían estadísticamente (P ≤ 0,05)

52
La concentración espermática promedio, por centímetro cúbico de eyaculado,

para la raza Assaf, fue 2 694,72 x 106 + 763,7 x 106, con un mínimo y

máximo de 2 1260 x 106 y 4 600 x 106; y para la raza Blackbelly, fue

2 458,89 x 106 + 903,65 x 106, con un mínimo y máximo de 1 320 x 106 y

4 760 x 106, no evidenciándose diferencias significativas entre los promedios

(P>0,05). Estos valores se encuentran dentro del rango reportado por Epstein

(1985), quien en carneros de la raza Assaf informa de valores entre 1780 x 10 6

a 3 990 x 106. Similares valores determinó Quispe (1998) en carneros

Balckbelly, reportando un promedio de 3 730 x 106 espermatozoides por cc.

Asimismo, Guillén (2001) en carneros Blackbelly reporta concentraciones

espermáticas promedio de 3 140 x 106.

Los porcentajes de espermatozoides vivos y anormales fueron 81,89 y 7,11%

en el semen de carneros Assaf y de 80,19 y 6,94% para los de la raza

Blackbelly, respectivamente, no habiendo diferencias significativas entre dichos

valores (P>0,05).

Estos resultados fueron indicativos de que inicialmente el semen colectado fue

de buena calidad. No solo por sus características macroscópicas sino por las

microscópicas Estos valores que se encuentran dentro del rango reportado por

Hafez (1996), quien considera normal eyaculados de 5 – 9 % de anormales, ya

que el porcentaje de espermatozoides vivos se considera alto y guarda relación

con el movimiento progresivo, tal como lo reporta Hafez (1996).

53
4.3 Características del semen refrigerado

En el Cuadro 10 se muestran los resultados descriptivos de las características

microscópicas del semen diluido y refrigerado con diluyente tris – fructuosa-

yema de huevo.

Cuadro 10. Características microscópicas del semen refrigerado con diluyente

tris – fructuosa- yema de huevo.

Raza Variable N Promedio D.E. C.V. % Min. Max.

% MIP-Tris (refrigerado) 36 83,50a 2,77 3,32 78 89
Assaf
% Host (refrigerado) 36 82,36a 6,66 8,09 55 94

% MIP-Tris (refrigerado) 36 82,56a 3,78 4,58 70 89

Blackbelly
% Host (refrigerado) 36 83,30a 4,92 5,91 71 91,24

a,b, Valores promedio con letras diferentes varían estadísticamente (P≤0,05)

El HOST del semen refrigerado fue 82,36 + 6,66% para la raza Assaf, mientras

que para los de la raza Blackbelly fue 83,30 + 4,92%. Estas evaluaciones

indicarían que el semen utilizado en el presente estudio tuvo una adecuada

integridad funcional de la membrana espermática, lo cual guarda relación con

su capacidad fecundante, pues así lo manifiestan Hafez (1996), quien al

referirse al Test de HOST dice que es una herramienta adicional que permite

predecir la capacidad fecundante de los espermatozoides.

El porcentaje de motilidad individual progresiva (MIP) del semen refrigerado

con Tris fue 83,50 + 2,77% para los carneros de la raza Assaf y 82,56 +

3,78%para los de la raza Blackbelly. A la prueba de “t” para diferencia de

medias, estas no evidenciaron diferencias significativas (P>0,05).

54
Mientras otros resultados, como el reporte de Quispe (1998), evaluando semen

de carneros Blackbelly, en UNALM, reporta 83,6% de motilidad individual

progresiva, Mohamed (1996) utilizando el método de colección de semen por

electroeyaculador reporta en ovinos Blackbelly, un 66% de motilidad individual

progresiva. Asi mismo Guillen (2002), también carneros Blackbelly en el

programa de crianzas del INIA reporta Motilidad individual progresiva entre

83 – 85,5%.

55
 V. CONCLUSIONES

Considerando los objetivos y resultados obtenidos en el presente trabajo de

investigación, se llegan a las siguientes conclusiones:

1. Los valores de las características macroscópicas del semen fresco fueron:

color blanco cremoso, pH 7,0; para ambas razas, mientras en la característica

de volumen se encontró 1,94 cc para Assaf y 1,43 cc para Blackbelly, siendo

las diferencias significativas (P<0,05).

2. Los valores de las características microscópicas del semen fresco fueron:

motilidad masal de 77% para Assaf y 73% para Blackbelly, no encontrándose

diferencias significativas (P>0,05). Concentración de 2 694,72 x 106 para Assaf

y 2 458,89 x 106 para Blackbelly, no encontrándose diferencias significativas

(P>0,05). Porcentaje de espermatozoides vivos de 81,89 para Assaf y 80,19

para blackbelly, no encontrándose diferencia significativas (P>0,05).

Porcentaje de espermatozoides anormales de 7,11 % para Assaf y 6,94 %

para Blackbelly, no encontrándose diferencias significativas (P>0,05).

3. La Motilidad Individual Progresiva del semen de carneros Assaf, refrigerado

con Tris, fue 83,50%. Para el semen de ovinos Blackbelly, los valores fue

82,56%, no registrándose diferencias (P>0,05).

4. En ovinos de la raza Assaf, los valores de HOST del semen Refrigerado, con

Tris como diluyente, fue 82,36%. Para el semen de ovinos Blackbelly, los

valores fue 83,30%, no registrándose diferencias significativas (P>0,05).

56
 VI. RECOMENDACIONES

En base los resultados y conclusiones del estudio, se dan las siguientes

recomendaciones:

1. Realizar investigaciones con mayor número de animales, el cual nos permita

determinar con mayor precisión, las características seminales por edad o clase

animal, en machos de las razas Assaf y Blackbelly.

2. Continuar con la realización de estudios que permitan mejorar

significativamente la MIP y el Host en semen de una mayor muestra de ovinos

a fin de ratificar los resultados del presente estudio y garantizar la calidad del

semen para su empleo en la inseminación artificial.

3. Realizar investigaciones sobre MIP y el Host en semen congelado. Para

garantizar su uso en la inseminación artificial.

4. Realizar investigaciones sobre MIP y el HOST en semen fresco, refrigerado y

congelado. Y complementarlos con trabajos de inseminación artificial y

observar los resultados en fertilidad y natalidad.

57
 VII BIBLIOGRAFIA

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64
ANEXO

65
ANEXO 1 DATOS DE LAS VARIBLES EVALUADAS
% Motilidad
Concentración % %
Carnero Eyaculado Color Volumen pH Motilidad Individual HOST
( x 106 ) Vivos Anormales
masal Progresiva
Assaf claro - 01 1 Blanco Cremoso 2.7 7 72.0 2,800 89.00 6.00 80 79.00
Assaf claro - 01 2 Blanco Cremoso 3.3 7 72.0 2,640 87.00 7.00 85 83.00
Assaf claro - 01 3 Blanco Cremoso 2.0 7 90.0 3,400 89.00 7.00 86 80.00
Assaf claro - 01 4 Blanco Cremoso 2.4 7 72.0 2,200 67.00 7.00 80 70.00
Assaf claro - 01 5 Blanco Cremoso 2.2 7 72.0 3,000 87.00 6.00 80 80.00
Assaf claro - 01 6 Blanco Cremoso 2.0 7 72.0 3,600 82.29 8.00 85 85.00
Assaf claro - 01 7 Blanco Cremoso 2.6 7 72.0 2,120 87.00 8.00 88 87.00
Assaf claro - 01 8 Blanco Cremoso 2.3 7 72.0 3,360 82.00 8.00 84 88.00
Assaf claro - 01 9 Blanco Cremoso 2.4 7 72.0 2,530 76.21 6.90 86 80.00
Assaf claro - 01 10 Blanco Cremoso 2.4 7 72.0 2,000 83.00 5.00 86 81.00
Assaf claro - 01 11 Blanco Cremoso 1.8 7 90.0 2,000 88.00 7.00 89 84.45
Assaf claro - 01 12 Blanco Cremoso 2.0 7 90.0 3,940 85.00 10.00 80 87.16
Assaf manchado - 02 1 Blanco Cremoso 1.6 7 72.0 2,000 80.00 8.00 82 81.00
Assaf manchado - 02 2 Blanco Cremoso 2.2 7 72.0 1,360 88.00 8.00 79 83.00
Assaf manchado - 02 3 Blanco Cremoso 2.3 7 72.0 3,200 75.00 11.00 83 76.00
Assaf manchado - 02 4 Blanco Cremoso 1.2 7 72.0 4,000 82.00 12.00 83 94.00
Assaf manchado - 02 5 Blanco Cremoso 1.5 7 72.0 2,800 81.00 10.00 89 86.00
Assaf manchado - 02 6 Blanco Cremoso 3.0 7 72.0 3,000 77.00 6.00 83 81.00
Assaf manchado - 02 7 Blanco Cremoso 2.2 7 90.0 3,200 82.50 9.00 80 83.00
Assaf manchado - 02 8 Blanco Cremoso 3.0 7 90.0 3,460 86.00 5.00 86 90.00
Assaf manchado - 02 9 Blanco Cremoso 3.2 7 72.0 2,980 86.00 6.00 86 92.00
Assaf manchado - 02 10 Blanco Cremoso 2.5 7 90.0 3,400 90.00 5.00 84 88.00
Assaf manchado - 02 11 Blanco Cremoso 1.6 7 90.0 2,460 82.60 5.00 83 80.00
Assaf manchado - 02 12 Blanco Cremoso 2.3 7 90.0 3,100 89.00 5.00 86 85.00
Assaf oscuro - 03 1 Blanco Cremoso 1.4 7 72.0 2,100 85.00 5.00 83 76.00
Assaf oscuro - 03 2 Blanco Cremoso 1.4 7 72.0 1,940 76.00 6.00 80 83.00
Assaf oscuro - 03 3 Blanco Cremoso 1.0 7 90.0 2,400 78.00 11.00 82 55.00
Assaf oscuro - 03 4 Blanco Cremoso 2.0 7 90.0 2,400 80.00 8.00 84 87.00

66
Assaf oscuro - 03 5 Blanco Cremoso 1.6 7 72.0 2,100 77.00 5.00 83 82.00
Assaf oscuro - 03 6 Blanco Cremoso 0.8 7 72.0 2,800 85.00 8.00 83 86.25
Assaf oscuro - 03 7 Blanco Cremoso 0.5 7 72.0 2,800 73.30 5.00 78 76.00
Assaf oscuro - 03 8 Blanco Cremoso 1.4 7 72.0 4,600 75.10 5.00 83 82.00
Assaf oscuro - 03 9 Blanco Cremoso 0.9 7 72.0 1,380 87.00 9.00 83 86.00
Assaf oscuro - 03 10 Blanco Cremoso 1.6 7 72.0 2,740 78.00 5.00 86 80.00
Assaf oscuro - 03 11 Blanco Cremoso 1.0 7 72.0 1,260 85.00 9.00 82 85.00
Assaf oscuro - 03 12 Blanco Cremoso 1.4 7 72.0 1,940 67.20 4.03 86 83.00
BBB INIA – 01 1 Blanco Cremoso 1.8 7 72.0 1,720 81.00 7.00 80 81.00
BBB INIA – 01 2 Blanco Cremoso 1.8 7 72.0 1,720 81.00 7.00 80 81.00
BBB INIA – 01 3 Blanco Cremoso 1.5 7 72.0 3,080 76.00 8.00 83 79.59
BBB INIA – 01 4 Blanco Cremoso 0.8 7 72.0 2,060 79.00 6.00 86 83.06
BBB INIA – 01 5 Blanco Cremoso 0.8 7 72.0 2,060 79.00 6.00 80 83.06
BBB INIA – 01 6 Blanco Cremoso 2.4 7 72.0 1,780 82.00 8.00 89 83.00
BBB INIA – 01 7 Blanco Cremoso 1.5 7 72.0 2,800 70.10 8.00 79 87.00
BBB INIA – 01 8 Blanco Cremoso 1.4 7 72.0 4,600 75.10 5.00 83 82.00
BBB INIA – 01 9 Blanco Cremoso 2.5 7 90.0 3,460 86.00 5.00 79 90.00
BBB INIA – 01 10 Blanco Cremoso 1.0 7 72.0 1,320 79.00 6.00 84 89.00
BBB INIA – 01 11 Blanco Cremoso 2.1 7 72.0 4,760 88.00 8.00 80 81.90
BBB INIA – 01 12 Blanco Cremoso 2.3 7 72.0 2,000 83.00 5.00 80 84.00
BBB UNA - 02 1 Blanco Cremoso 1.4 7 90.0 2,100 82.00 5.00 78 80.00
BBB UNA - 02 2 Blanco Cremoso 1.1 7 72.0 2,400 80.00 6.00 86 81.00
BBB UNA - 02 3 Blanco Cremoso 1.0 7 72.0 2,000 82.00 9.00 86 78.00
BBB UNA - 02 4 Blanco Cremoso 1.4 7 72.0 1,340 89.00 7.00 89 78.00
BBB UNA - 02 5 Blanco Cremoso 1.0 7 72.0 2,500 80.70 11.00 84 71.00
BBB UNA - 02 6 Blanco Cremoso 0.6 7 72.0 1,800 74.00 7.00 70 78.00
BBB UNA - 02 7 Blanco Cremoso 0.9 7 72.0 1,800 74.00 8.00 83 76.00
BBB UNA - 02 8 Blanco Cremoso 1.0 7 72.0 1,320 71.00 6.00 86 89.00
BBB UNA - 02 9 Blanco Cremoso 0.5 7 72.0 1,500 72.00 8.20 82 80.00
BBB UNA - 02 10 Blanco Cremoso 1.7 7 72.0 3,600 79.00 5.00 80 85.00
BBB UNA - 02 11 Blanco Cremoso 0.5 7 72.0 2,680 76.00 7.00 78 83.72
BBB UNA - 02 12 Blanco Cremoso 0.8 7 72.0 2,000 94.00 10.00 86 84.65

67
BBB claro - 03 1 Blanco Cremoso 1.1 7 72.0 2,340 76.00 6.00 83 79.00
BBB claro - 03 2 Blanco Cremoso 0.9 7 72.0 2,000 73.00 5.00 80 76.00
BBB claro - 03 3 Blanco Cremoso 1.0 7 72.0 1,760 80.00 9.00 86 79.00
BBB claro - 03 4 Blanco Cremoso 1.5 7 72.0 2,800 70.10 8.00 83 87.00
BBB claro - 03 5 Blanco Cremoso 2.0 7 72.0 2,640 87.00 8.00 84 89.00
BBB claro - 03 6 Blanco Cremoso 1.6 7 54.0 4,100 80.00 6.00 79 86.00
BBB claro - 03 7 Blanco Cremoso 2.3 7 72.0 1,780 89.00 6.00 80 91.00
BBB claro - 03 8 Blanco Cremoso 1.2 7 72.0 2,940 84.00 8.50 86 90.00
BBB claro - 03 9 Blanco Cremoso 1.5 7 72.0 4,120 78.00 8.00 82 90.00
BBB claro - 03 10 Blanco Cremoso 2.3 7 72.0 2,000 83.00 5.00 86 84.00
BBB claro - 03 11 Blanco Cremoso 2.2 7 72.0 2,600 89.00 5.00 86 91.24
BBB claro - 03 12 Blanco Cremoso 2.0 7 90.0 3,040 85.00 7.00 86 87.57

68
ANEXO 2 DATOS PORCENTUALES TRANSFORMADOS RAIZ CUADRADA
% MOTILIDAD
Motilidad % HOST-
Carnero % VIVOS % ANORMALES REFRIGERADO
masal REFRIGERADO
TRIS
Assaf claro - 1 8.515 3.391 3.831 4.528 4.637
Assaf claro - 1 8.515 3.674 3.980 3.937 4.183
Assaf claro - 1 9.513 3.391 3.980 3.808 4.528
Assaf claro - 1 8.515 5.788 3.980 4.528 5.523
Assaf claro - 1 8.515 3.674 3.831 4.528 4.528
Assaf claro - 1 8.515 4.267 4.115 3.937 3.937
Assaf claro - 1 8.515 3.674 4.115 3.536 3.674
Assaf claro - 1 8.515 4.301 4.115 4.062 3.536
Assaf claro - 1 8.515 4.928 3.966 3.808 4.528
Assaf claro - 1 8.515 4.183 3.663 3.808 4.416
Assaf claro - 1 9.513 3.536 3.980 3.391 4.006
Assaf claro - 1 9.513 3.937 4.351 4.528 3.652
Assaf manchado - 2 8.515 4.528 4.115 4.301 4.416
Assaf manchado - 2 8.515 3.536 4.115 4.637 4.183
Assaf manchado - 2 8.515 5.050 4.458 4.183 4.950
Assaf manchado - 2 8.515 4.301 4.557 4.183 2.550
Assaf manchado - 2 8.515 4.416 4.351 3.391 3.808
Assaf manchado - 2 8.515 4.848 3.831 4.183 4.416
Assaf manchado - 2 9.513 4.243 4.238 4.528 4.183
Assaf manchado - 2 9.513 3.808 3.663 3.808 3.240
Assaf manchado - 2 8.515 3.808 3.831 3.808 2.915
Assaf manchado - 2 9.513 3.240 3.663 4.062 3.536
Assaf manchado - 2 9.513 4.231 3.663 4.183 4.528
Assaf manchado - 2 9.513 3.391 3.663 3.808 3.937
Assaf oscuro - 3 8.515 3.937 3.663 4.183 4.950
Assaf oscuro - 3 8.515 4.950 3.831 4.528 4.183
Assaf oscuro - 3 9.513 4.743 4.458 4.301 6.745
Assaf oscuro - 3 9.513 4.528 4.115 4.062 3.674
Assaf oscuro - 3 8.515 4.848 3.663 4.183 4.301
Assaf oscuro - 3 8.515 3.937 4.115 4.183 3.775
Assaf oscuro - 3 8.515 5.215 3.663 4.743 4.950
Assaf oscuro - 3 8.515 5.040 3.663 4.183 4.301
Assaf oscuro - 3 8.515 3.674 4.238 4.183 3.808
Assaf oscuro - 3 8.515 4.743 3.663 3.808 4.528
Assaf oscuro - 3 8.515 3.937 4.238 4.301 3.937
Assaf oscuro - 3 8.515 5.771 3.476 3.808 4.183
BBB INIA - 1 8.515 4.416 3.980 4.528 4.416
BBB INIA - 1 8.515 4.416 3.980 4.528 4.416
BBB INIA - 1 8.515 4.950 4.115 4.183 4.573
BBB INIA - 1 8.515 4.637 3.831 3.808 4.176
BBB INIA - 1 8.515 4.637 3.831 4.528 4.176
BBB INIA - 1 8.515 4.301 4.115 3.391 4.183
BBB INIA - 1 8.515 5.514 4.115 4.637 3.674

69
BBB INIA - 1 8.515 5.040 3.663 4.183 4.301
BBB INIA - 1 9.513 3.808 3.663 4.637 3.240
BBB INIA - 1 8.515 4.637 3.831 4.062 3.391
BBB INIA - 1 8.515 3.536 4.115 4.528 4.313
BBB INIA - 1 8.515 4.183 3.663 4.528 4.062
BBB UNA - 2 9.513 4.301 3.663 4.743 4.528
BBB UNA - 2 8.515 4.528 3.831 3.808 4.416
BBB UNA - 2 8.515 4.301 4.238 3.808 4.743
BBB UNA - 2 8.515 3.391 3.980 3.391 4.743
BBB UNA - 2 8.515 4.450 4.458 4.062 5.431
BBB UNA - 2 8.515 5.148 3.980 5.523 4.743
BBB UNA - 2 8.515 5.148 4.115 4.183 4.950
BBB UNA - 2 8.515 5.431 3.831 3.808 3.391
BBB UNA - 2 8.515 5.339 4.140 4.301 4.528
BBB UNA - 2 8.515 4.637 3.663 4.528 3.937
BBB UNA - 2 8.515 4.950 3.980 4.743 4.096
BBB UNA - 2 8.515 2.550 4.351 3.808 3.981
BBB claro - 3 8.515 4.950 3.831 4.183 4.637
BBB claro - 3 8.515 5.244 3.663 4.528 4.950
BBB claro - 3 8.515 4.528 4.238 3.808 4.637
BBB claro - 3 8.515 5.514 4.115 4.183 3.674
BBB claro - 3 8.515 3.674 4.115 4.062 3.391
BBB claro - 3 7.382 4.528 3.831 4.637 3.808
BBB claro - 3 8.515 3.391 3.831 4.528 3.082
BBB claro - 3 8.515 4.062 4.177 3.808 3.240
BBB claro - 3 8.515 4.743 4.115 4.301 3.240
BBB claro - 3 8.515 4.183 3.663 3.808 4.062
BBB claro - 3 8.515 3.391 3.663 3.808 3.043
BBB claro - 3 9.513 3.937 3.980 3.808 3.596

70
Anexo 3. Estadística descriptiva de los parámetros del semen evaluado de las
razas Blackbelly y Assaf

ASSAF
The MEANS Procedure

__________________________________________________________________________________

Variable N Mean Std Dev Minimum Maximum

__________________________________________________________________________________
Vol 36 1.9361111 0.6941193 0.5000000 3.3000000
ph 36 7.0000000 0 7.0000000 7.0000000
MM 36 77.0000000 8.1766217 72.0000000 90.0000000
CC 36 2694.72 763.6958486 1260.00 4600.00
Vivos 36 81.8888889 5.9655093 67.0000000 90.0000000
Anormales 36 7.1091667 2.0521896 4.0300000 12.0000000
MitA 36 83.5000000 2.7723121 78.0000000 89.0000000
HOST 36 82.3572222 6.6613957 55.0000000 94.0000000
__________________________________________________________________________________

BLACKBELLY
The MEANS Procedure
__________________________________________________________________________________
Variable N Mean Std Dev Minimum Maximum
__________________________________________________________________________________
Vol 36 1.4277778 0.5809407 0.5000000 2.5000000
ph 36 7.0000000 0 7.0000000 7.0000000
MM 36 73.0000000 6.0000000 54.0000000 90.0000000
CC 36 2458.89 903.6553634 1320.00 4760.00
Vivos 36 80.1944444 5.8740079 70.0000000 94.0000000
Anormales 36 6.9361111 1.5541930 5.0000000 11.0000000
MitA 36 82.5555556 3.7754428 70.0000000 89.0000000
HOST 36 83.2997222 4.9211924 71.0000000 91.2400000
__________________________________________________________________________________

71
ANEXO 4: Prueba de “t” para diferencia de medias de las características seminales evaluadas de la raza BLACKBELLY Y ASSAF
The TTEST Procedure - Volumen Seminal

Statistics
___________________________________________________________________________________________________________________

UMPU UMPU
Lower CL Upper CL Lower CL Lower CL Upper CL Upper CL
Variable Class N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Err
___________________________________________________________________________________________________________________

valor A 36 1.3103 1.5 1.6897 0.4547 0.4507 0.5606 0.7237 0.7313 0.0934
valor B 36 1.6826 1.9167 2.1507 0.5611 0.5561 0.6918 0.8931 0.9024 0.1153
valor Diff (1-2) -0.713 -0.417 -0.121 0.5404 0.538 0.6296 0.7506 0.7544 0.1484
___________________________________________________________________________________________________________________

T-Tests
_____________________________________________________________________

Variable Method Variances DF t Value Pr > |t|

_____________________________________________________________________

valor Pooled Equal 70 -2.81 0.0065

valor Satterthwaite Unequal 67.1 -2.81 0.0065
valor Cochran Unequal 35 -2.81 0.0081
_____________________________________________________________________

Equality of Variances
_____________________________________________________________

Variable Method Num DF Den DF F Value Pr > F

_____________________________________________________________

valor Folded F 35 35 1.52 0.2185

_____________________________________________________________
The TTEST Procedure - Concentracion Espermatica

Statistics

___________________________________________________________________________________________________________________
UMPU UMPU
Lower CL Upper CL Lower CL Lower CL Upper CL Upper CL
Variable Class N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Err
___________________________________________________________________________________________________________________

valor A 36 2.1531 2.4589 2.7646 0.7329 0.7265 0.9037 1.1666 1.1788 0.1506
valor B 36 2.4363 2.6947 2.9531 0.6194 0.6139 0.7637 0.9859 0.9962 0.1273
valor Diff (1-2) -0.629 -0.236 0.1575 0.7181 0.7148 0.8366 0.9974 1.0024 0.1972
___________________________________________________________________________________________________________________

T-Tests
_____________________________________________________________________

Variable Method Variances DF t Value Pr > |t|

_____________________________________________________________________

valor Pooled Equal 70 -1.20 0.2357

valor Satterthwaite Unequal 68.1 -1.20 0.2359
valor Cochran Unequal 35 -1.20 0.2397
_____________________________________________________________________

Equality of Variances
_____________________________________________________________

Variable Method Num DF Den DF F Value Pr > F

_____________________________________________________________

valor Folded F 35 35 1.40 0.3241

_____________________________________________________________

The TTEST Procedure - Motilidad Masal

Statistics

_____________________________________________________________________________________________________________________
UMPU UMPU
Lower CL Upper CL Lower CL Lower CL Upper CL Upper CL
Variable Class N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Err
_____________________________________________________________________________________________________________________

valor A 36 9.059 9.1503 9.2416 0.2189 0.217 0.2699 0.3484 0.352 0.045
valor B 36 8.965 9.0948 9.2245 0.3111 0.3083 0.3835 0.4951 0.5003 0.0639
valor Diff (1-2) -0.1 0.0555 0.2114 0.2846 0.2833 0.3316 0.3953 0.3973 0.0782
_____________________________________________________________________________________________________________________
 T-Tests
_____________________________________________________________________

Variable Method Variances DF t Value Pr > |t|

_____________________________________________________________________

valor Pooled Equal 70 0.71 0.4798

valor Satterthwaite Unequal 62.8 0.71 0.4801
valor Cochran Unequal 35 0.71 0.4822
_____________________________________________________________________

Equality of Variances
_______________________________________________________________

Variable Method Num DF Den DF F Value Pr > F

_______________________________________________________________

valor Folded F 35 35 2.02 0.0410

_____________________________________________________________
The TTEST Procedure - Porcentaje de Vivos

Statistics
___________________________________________________________________________________________________________________

UMPU UMPU
Lower CL Upper CL Lower CL Lower CL Upper CL Upper CL
Variable Class N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Err
___________________________________________________________________________________________________________________

valor A 36 4.2237 4.4554 4.6871 0.5554 0.5505 0.6848 0.884 0.8932 0.1141
valor B 36 4.0373 4.263 4.4887 0.5411 0.5363 0.6671 0.8612 0.8702 0.1112
valor Diff (1-2) -0.125 0.1924 0.5102 0.5802 0.5776 0.676 0.8059 0.81 0.1593
___________________________________________________________________________________________________________________

T-Tests
_____________________________________________________________________

Variable Method Variances DF t Value Pr > |t|

_____________________________________________________________________

valor Pooled Equal 70 1.21 0.2312

valor Satterthwaite Unequal 70 1.21 0.2312
valor Cochran Unequal 35 1.21 0.2353
_____________________________________________________________________

Equality of Variances
_____________________________________________________________

Variable Method Num DF Den DF F Value Pr > F

_____________________________________________________________

valor Folded F 35 35 1.05 0.8778

_____________________________________________________________
The TTEST Procedure - Porcentaje de anormales

Statistics
___________________________________________________________________________________________________________________
UMPU UMPU
Lower CL Upper CL Lower CL Lower CL Upper CL Upper CL
Variable Class N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Err
___________________________________________________________________________________________________________________
valor A 36 3.8804 3.9543 4.0281 0.177 0.1755 0.2183 0.2818 0.2847 0.0364
valor B 36 3.8728 3.9678 4.0628 0.2276 0.2256 0.2807 0.3623 0.3661 0.0468
valor Diff (1-2) -0.132 -0.014 0.1047 0.2158 0.2148 0.2514 0.2997 0.3012 0.0593
___________________________________________________________________________________________________________________

T-Tests
_____________________________________________________________________

Variable Method Variances DF t Value Pr > |t|

_____________________________________________________________________
valor Pooled Equal 70 -0.23 0.8201
valor Satterthwaite Unequal 66 -0.23 0.8201
valor Cochran Unequal 35 -0.23 0.8207
_____________________________________________________________________

Equality of Variances
______________________________________________________________

Variable Method Num DF Den DF F Value Pr > F

______________________________________________________________

valor Folded F 35 35 1.65 0.1416

______________________________________________________________

The TTEST Procedure - Motilidad Refrigerado

Statistics
___________________________________________________________________________________________________________________

UMPU UMPU
Lower CL Upper CL Lower CL Lower CL Upper CL Upper CL
Variable Class N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Err
___________________________________________________________________________________________________________________

valor A 36 4.0662 4.2141 4.3621 0.3546 0.3515 0.4372 0.5644 0.5703 0.0729
valor B 36 3.9944 4.1094 4.2245 0.2757 0.2733 0.3399 0.4388 0.4434 0.0567
valor Diff (1-2) -0.079 0.1047 0.2888 0.3361 0.3346 0.3916 0.4669 0.4692 0.0923
___________________________________________________________________________________________________________________

T-Tests
______________________________________________________________________

Variable Method Variances DF t Value Pr > |t|

______________________________________________________________________

valor Pooled Equal 70 1.13 0.2606

valor Satterthwaite Unequal 66 1.13 0.2608
valor Cochran Unequal 35 1.13 0.2644
______________________________________________________________________

Equality of Variances
______________________________________________________________

Variable Method Num DF Den DF F Value Pr > F

______________________________________________________________

valor Folded F 35 35 1.65 0.1412

______________________________________________________________
The TTEST Procedure - Host Refrigerado

Statistics
___________________________________________________________________________________________________________________

UMPU UMPU
Lower CL Upper CL Lower CL Lower CL Upper CL Upper CL
Variable Class N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Dev Std Err
___________________________________________________________________________________________________________________

valor A 36 3.9012 4.1047 4.3081 0.4877 0.4834 0.6013 0.7762 0.7843 0.1002
valor B 36 3.952 4.1985 4.4449 0.5908 0.5856 0.7284 0.9403 0.9501 0.1214
valor Diff (1-2) -0.408 -0.094 0.2201 0.5732 0.5706 0.6679 0.7962 0.8002 0.1574
___________________________________________________________________________________________________________________

T-Tests
_____________________________________________________________________

Variable Method Variances DF t Value Pr > |t|

_____________________________________________________________________
valor Pooled Equal 70 -0.60 0.5532
valor Satterthwaite Unequal 67.6 -0.60 0.5532
valor Cochran Unequal 35 -0.60 0.5551
_____________________________________________________________________

Equality of Variances
_____________________________________________________________

Variable Method Num DF Den DF F Value Pr > F

_____________________________________________________________

valor Folded F 35 35 1.47 0.2613

_____________________________________________________________