BIOQUÍMICA

AMBIENTAL

Guía de Laboratorio

A. Vélez & R. Salas

BIOQUÍMICA AMBIENTAL

Guía de Laboratorio

Autores:

- ARMANDO VÉLEZ AZAÑERO

- RAMSES SALAS ASENCIOS

Ilustraciones:

- NICK SOTO

2017

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A.Vélez & R. Salas
 INDICE

1. Informe de laboratorio

2. Normas de laboratorio

3. Espectrofotometría

4. Análisis cuantitativo de la actividad enzimática de la amilasa salival

5. Factores ambientales que afectan la actividad enzimática

6. Respiración celular. Alteración por metales pesados

7. Actividad enzimática de la catalasa en suelos contaminados

8. Cuantificación de azucares reductores en plantas sometida a estrés

salino

9. Cuantificación de proteínas totales en plantas sometidas a estrés

abiótico

10. Pigmentos fotosintéticos asociados a cambios ambientales

11. Determinación de triglicéridos en microorganismos de origen lagunar

12. Influencia de los xenobióticos en la integridad del ADN

13. Bibliografía

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A.Vélez & R. Salas
 INFORME DE LABORATORIO

De forma práctica y concreta, un informe de laboratorio es una síntesis específica de las

experiencias realizadas en cada sesión de laboratorio, y debe responder con facilidad al
qué, cómo y para qué se desarrollaron cada uno de los trabajos. Un informe es de suma
importancia, pues lejos de ser un documento formal, nos ayudará afianzar nuestra
capacidad analítica y a contrastar cada uno de los resultados con la teoría aprendida en
clase, además de modelar nuestro lenguaje técnico y científico, logrando cada vez una
comunicación más fluida y eficaz.

La estructura principal de un informe de laboratorio es la siguiente:

 Carátula
Su función es facilitar la identificación del trabajo, por lo tanto, el título
deberá ser el texto más resaltante. Es importante colocar el logo de la
universidad, los autores, colaboradores y el año en curso.
 Introducción
Esta sección no debe abarcar más de una página, y en ella deberán estar
comprendidos: los objetivos, la problemática y el marco teórico referido
al tema, redactados de forma continua.
 Materiales y métodos
o Materiales
o Métodos
 Procedimientos
 Resultados
Presentación de gráficas, tablas y datos obtenidos en cada experiencia,
con una explicación (interpretación) clara y precisa. Es necesario detallar
al máximo los productos de cada actividad realizada durante la práctica.

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A.Vélez & R. Salas
  Conclusiones
Esta sección sirve para reafirmar los conocimientos de cada práctica en
función a los resultados. Las conclusiones son generales y pueden incluir
comentarios acerca de las destrezas y actitudes aprendidas, sin embargo,
deberán presentarse como afirmaciones categóricas.
 Recomendaciones
Reportar incidentes y accidentes ocurridos en cada práctica, a fin de
evitar problemas futuros. También es importante colocar algunas
sugerencias en los procedimientos que permitan realizar los trabajos con
mayor eficiencia.
 Bibliografía
Todo trabajo práctico experimental requiere de una serie de soportes
bibliográficos como: libros, revistas, notas, manuales, etc., los cuales
deben citarse de manera adecuada.
Ejm:
 Vélez-Azañero, Armando & Lizárraga-Travaglin, Alfonso. 2013.
Diversidad de Carabidae (Coleoptera) asociada a la cuenca baja del río
Lurín, Lima, Perú. The Biologist-Lima, 11: 97-106.
 Yllanes, Paola; Vélez-Azañero, Armando; Lozano, Sebastián. 2014.
Efecto fitotóxico del plomo en plantas de maís híbrido Dekalv (Zea mays)
en suelo arenoso y limoso. The Biologist-Lima, 12: 337-348.

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A.Vélez & R. Salas
 NORMAS DE LABORATORIO

INTRODUCCIÓN

El trabajo en el laboratorio debe respetar un conjunto de medidas preventivas, cuya

finalidad es proteger a los operadores, de los riesgos inminentes de cada experiencia.
Por tanto, la seguridad en el laboratorio es una labor colectiva entre los estudiantes, los
docentes y el personal técnico de apoyo. Los agentes potencialmente dañinos para la
salud presentes en el laboratorio son los siguientes:

 Agentes Biológicos: virus, bacterias, hongos y parásitos.

 Agentes físicos y mecánicos: temperaturas extremas, radiaciones ionizantes,
conexiones eléctricas defectuosas y/o inadecuadas e instrumentos dañados o
rotos.
 Agentes químicos: Compuestos corrosivos, inflamables, comburentes,
irritantes, dañinos para el ambiente, etc.

OBJETIVOS

 Proteger al estudiante de la exposición innecesaria contra agentes

potencialmente dañinos (químicos, físicos y/o biológicos) que puedan poner en
riesgo su salud.
 Garantizar la integridad de la muestra contra la degradación o contaminación
cruzada.
 Identificar los desechos tóxicos y almacenarlos en ambientes adecuados hasta
su eliminación.

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A.Vélez & R. Salas
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL TRABAJO EXPERIMENTAL

 Conocer el manejo de los accesorios y equipos a utilizar. No debe manipularse

ningún instrumento si no se le conoce.
 El trabajo en el laboratorio debe realizarse con cuidado, precisión y bajo la
supervisión de un profesional competente.

A. PARA INGRESAR AL LABORATORIO

 Está prohibido el ingreso a laboratorio sin el mandil correspondiente, el cual
deberá ser largo y permanecer completamente abrochado.
 Se prohíbe el ingreso al laboratorio con bolsos, maletines o mochilas. Los
estudiantes y docentes deberán adecuar sus pertenencias en los casilleros
ubicados en cada pasadizo.
 Algunos equipos como computadoras y calculadoras están permitidos, bajo la
entera responsabilidad de cada estudiante.
 Revisar los antecedentes conceptuales y el protocolo de trabajo experimental
presente en la guía de prácticas de cada curso, donde además cada estudiante
colocará la información pertinente a su grupo sanguíneo, alergias, contactos en
casos de emergencia, entre otros.
 El tiempo de tolerancia para cada una de las sesiones de prácticas será de 10
minutos luego de los cuales, el estudiante no podrá ingresar al laboratorio.
 Revisar el estado de la mesa de trabajo, del material y de los equipos recibidos.
Reportar cualquier falla o irregularidad al responsable del laboratorio. El
material se debe lavar y secar antes de ser usado.

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A.Vélez & R. Salas
 B. DURANTE EL TRABAJO DE LABORATORIO
 Seguir las medidas de seguridad necesarias para la conservación de cada equipo
y accesorios con el que se está trabajando, incluyendo a los bancos metálicos,
los cuales permanecerán bajo las mesas cuando no sean usados.
 Tomar sólo las cantidades de reactivos necesarios para el trabajo experimental y
colocarlas en material de vidrio limpio y seco.
 Etiquetar y rotular todos los recipientes donde se coloquen reactivos, productos
y residuos, indicando principalmente: nombre, concentración y fecha de
preparación. Seguir las medidas de contingencia dadas por el personal del
laboratorio en caso de accidente.
 No recibir visitas en el interior del laboratorio. Evitar las distracciones para no
ocasionar accidentes.
 Informar al profesional responsable cuando se requiera abandonar
temporalmente el laboratorio, o reincorporarse.
 No ingerir alimentos ni bebidas en el interior del laboratorio, a menos que lo
indique el protocolo.
 No fumar en el interior del laboratorio. Todas las fuentes de fuego o calor deben
estar controladas.

C. AL CONCLUIR LA SESION
 Disponer de los residuos y de los reactivos de la manera indicada por las normas.
Los reactivos no usados no deberán devolverse a los frascos originales. Los
frascos de reactivos puros deben regresarse al almacén.
 Es obligación de cada grupo de trabajo, el correcto lavado del material utilizado,
el mismo que será entregado limpio y seco en orden y esperando su turno.
 Dejar limpio y seco el lugar de trabajo. Colocar los bancos junto a las mesas o
invertidos sobre éstas.
 “El mandil es de uso exclusivo para el laboratorio”. Retirarse el mandil y demás
equipo de seguridad, guardarlo en una bolsa de plástico exclusiva para este uso.
El mandil deberá lavarse al final de cada sesión.

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A.Vélez & R. Salas
MATERIAL DE USO OBLIGATORIO

 Mandil largo (a la rodilla o pantorrilla) de algodón 100% y manga larga, con

botones de color blanco
 Encendedor para mechero y/o cerillos
 Franela de algodón limpia
 Cinta para encubrir (masking tape) de 1.27 cm de ancho
 Marcador indeleble, preferentemente negro

RECOMENDACIONES GENERALES:

 No se debe probar ninguna sustancia química, pues la mayoría de ellas son

tóxicas y/o venenosas. Observar y leer cuidadosamente cada etiqueta antes de
usar una sustancia.
 No se debe oler directamente el contenido de un frasco porque muchas
sustancias líquidas emiten vapores tóxicos; estos deben llevarse a la nariz con la
agitación de las manos.
 Se debe tener cuidado al transportar los líquidos calientes o al calentarlos porque
algunos se proyectan.
 Cuando se calienta un recipiente de vidrio o un tubo de prueba que contiene una
solución, se debe tener la precaución de orientar la boca del tubo hacia un lugar
en que no se encuentren otras personas, pues el líquido al hervir puede
causando lesiones muchas veces severas.
 Cuando se calienta un material de vidrio debe tenerse en cuenta su calidad y su
resistencia a la temperatura. De preferencia debe tener marca reconocida.
 Todo residuo que queda en un recipiente o tubo de prueba debe ser arrojado a
un tacho o al lavatorio haciendo fluir gran cantidad de agua. No se debe arrojar
al suelo ni sacudir el tubo.
 Al calentar un material de vidrio se debe verificar que no esté rajado, porque con
el calor puede romperse provocando accidentes al operador.

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A.Vélez & R. Salas
ACCIONES A SEGUIR EN CASO DE ACCIDENTES E INCIDENTES

 Si hubo inoculación accidental, cortes o rasgado de piel, o alguna quemadura por

agente químico, la persona afectada debe quitarse de inmediato el mandil
protector, lavarse las manos y la zona afectada del cuerpo, aplicarse el
desinfectante tópico presente en el Botiquín del laboratorio y dirigirse a un
Servicio Médico donde informará detalladamente la causa de la herida y sobre
los agentes infecciosos, químicos o mecánicos implicados.
 Si ocurriese una ingestión accidental de material o reactivo posiblemente
peligroso, la persona debe ser trasladada inmediatamente a un Servicio Médico
después de quitarse el mandil, informando al médico de turno el reactivo
ingerido y seguir estrictamente las instrucciones.
 Si hay una emisión de un aerosol posiblemente peligroso o la emanación de
vapores tóxicos, todas las personas deben evacuar el laboratorio, informando al
responsable del mismo. Nadie podrá entrar al ambiente afectado hasta que los
responsables lo indiquen, esperando que los aerosoles puedan salir y que se
depositen las partículas más pesadas. Si es necesario, debe colocarse una señal
de prohibición para no ingresar al Laboratorio.
 Si se estuvo trabajando con muestras biológicas posiblemente infectadas, las
cuales se derramaron accidentalmente, cubrir con papel periódico toda la zona
afectada, humedecer sobre el papel con fenol al 5% y dejar que este reactivo
actúe durante 30 minutos como mínimo antes de limpiar el área.

10
A.Vélez & R. Salas
 PRACTICA Nº1
“ESPECTROFOTOMETRIA”

Lo Lt

La

OBJETIVOS

 Identificar el pico máximo de absorción de Azul de metileno y Permanganato de

potasio, para determinar la concentración de una muestra desconocida a través
de una curva de calibración.

11
A.Vélez & R. Salas
 CONCEPTOS PREVIOS

Fotocolorimetría
______________________________________________________
______________________________________________________
Absorbancia
______________________________________________________
______________________________________________________
Transmitancia
______________________________________________________
______________________________________________________
Espectro de absorción
______________________________________________________
______________________________________________________
Curva de calibración
______________________________________________________
______________________________________________________
Coeficiente de extinción molar
_______________________________________________________
_______________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

 Gradilla para tubos  Pizeta con agua destilada

 Gradilla para pipetas
 Azul de Metileno 1% (25mL)
 Permanganato de Potasio 1%
(25mL)
 Tubo de ensayo (10)
 Bombilla de succión (2)
 Gotero descartable (2)
 Espectrofotómetro
 Cubetas de Esp. (8)
 Crayón marcador
 Pipeta 1ml (2)
 Pipetas de 5ml (2)

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A.Vélez & R. Salas
INTRODUCCION

La espectrofotometría es una técnica utilizada para determinar la concentración de una

sustancia, que tenga la capacidad de absorber fotones de luz a una (o más) longitud de
onda determinada. La interacción entre los fotones absorbidos y reflejados define el
color de cualquier elemento, el cual es discriminado por nuestros sentidos.

Esta propiedad puede ser aprovechada en el laboratorio de Bioquímica Ambiental para

determinaciones cuantitativas, generando reacciones químicas coloreadas y estables,
cuya intensidad estaría directamente relacionada con la concentración del soluto o
muestra problema.

Estas determinaciones cuantitativas se basan en la Ley de Lambert, que establece que

la proporción de luz incidente (Io) absorbida por el medio es independiente de su
intensidad y que cada estrato adicional de solución absorbe una fracción igual de la luz
que pasa a través de ella (la absorción de luz es directamente proporcional a la longitud
de la celda o tubo). Por otro lado, la Ley de Beer nos dice que la intensidad de un haz
de luz que recorre una cierta distancia a través de una solución es proporcional a la
concentración de la solución. Al combinar ambas leyes, se obtiene:

Lo
Log  A B C
Lt
Donde:

Lo : Intensidad de luz incidente

Lt : Intensidad de luz transmitida.

A : Coeficiente de Extinción Molar (constante para cada soluto a una

determinada longitud de onda).

B : Longitud o diámetro del recipiente atravesado por la luz.

C : Concentración de la Solución.
La relación log (Lo/Lt) es conocida también como Densidad Optica (D.O.), Absorbancia o
Extinción y tiene valores que van de 0 a 2. Otra forma de medición es la Transmitancia,
definida como el porcentaje de luz transmitida: %T = (Lt/Lo) x 100, con valores que van
de O a 100. Los valores de D.0. y %T son inversos.

Los espectrofotómetros son dispositivos que permiten medir la absorción de Luz por
una sustancia; mediante una célula fotoeléctrica, compuesta por un metal que por
acción de la luz genera una corriente eléctrica proporcional a la intensidad de luz que
incide sobre él (fenómeno fotoeléctrico).

La longitud de onda en la cual haya máxima absorción de luz (pico máximo de absorción)
permite obtener valores de absorbancia aún a bajas concentraciones, por lo que un
primer paso en el análisis espectrofotométrico está relacionado con la obtención de un
espectro de absorción (barrido espectral).

14
A.Vélez & R. Salas
PROCEDIMIENTO

EXPERIENCIA Nº1: PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

1. Preparar una solución Stock de Permanganato de Potasio 1% y una solución stock

de Azul de Metileno 1%.
2. A partir de cada solución stock, realizar las siguientes disoluciones:
a. Permanganato de Potasio 1:10
b. Azul de Metileno 1:250
3. Con las disoluciones obtenidas, realizar una batería de concentraciones para
cada compuesto, como lo indican la tabla 1 y la tabla 2.

Tabla 1. Batería de tubos con Permanganato de Potasio (KMnO4). Tubo B: Blanco de

lectura.

Tubo B Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Agua destilada (ml) 5 4.8 4.6 4.2 4

Solución de Trabajo de
0 0.2 0.4 0.8 1
KMnO4 (ml)

Concentración

Tabla 2. Batería de tubos con Azul de Metileno. Tubo B: Blanco de lectura.

Tubo B Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Agua destilada (ml) 5 4.5 4.6 4.8 4.9

Solución de Azul de
0 0.5 0.4 0.2 0.1
Metileno (ml)

Concentración

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A.Vélez & R. Salas
 Experiencia N° 2: ESPECTRO DE ABSORCIÓN

1. Utilizando el Tubo N°3 y el tubo Nº1 de Permanganato de Potasio y Azul de

Metileno respectivamente, realizar un barrido en el espectrofotómetro, desde
400nm hasta 800nm (Tabla 3).

Tabla.3. Barrido espectral de Azul de metileno y Permanganato de potasio, entre

400nm y 800nm.
Longitud de Onda Absorbancia Absorbancia
(nm) Azul de Metileno Permanganato de Potasio

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

640 -

660 -

680 -

700 -

720 -

740 -

760 -

780 -

800 -

16
A.Vélez & R. Salas
 2. Con los valores obtenidos en la tabla 3, graficar el espectro de absorción en papel
milimetrado, y determinar el pico de máxima absorción (Figura 1 y Figura 2).

0.7

0.6

0.5
Absorbancia

0.4

0.3

0.2

0.1

0
380 430 480 530 580 630 680 730
Longitud de Onda (nm)

Figura 1. Espectro de Absorción de Azul de Metileno.

0.19
0.17
0.15
0.13
Absorbancia

0.11
0.09
0.07
0.05
0.03
0.01
-0.01
360 410 460 510 560 610 660
Longitud de onda (nm)

Figura 2. Espectro de Absorción de Permanganato de Potasio.

17
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº3: CURVA DE CALIBRACIÓN

1. Realizar lecturas de Absorbancia para cada tubo a la longitud de onda elegida en

la Experiencia Nº2 (ambas baterías).
2. Con los datos obtenidos, trazar una Gráfica: Densidad Óptica (eje Y) vs
Concentración (eje X).
3. Esta gráfica se denomina Curva de Calibración y representa el rango de longitudes
de Onda en el cual la intensidad de la luz absorbida es directamente proporcional a
la Concentración de una solución. Utilizar esta Curva de Calibración para calcular la
concentración de una muestra desconocida (Muestra Problema) cuando se cuente
con más de dos estándares.
4. Para determinar la concentración de la muestra problema, con menos de tres
estándares, utilizar la siguiente fórmula:

 St   DO(MP)
 MP 
DO (St)

Donde:
MP : Muestra problema
St. : Estándar
DO : Densidad óptica o Absorbancia

18
A.Vélez & R. Salas
RESULTADOS

 Realiza la descripción detallada de las actividades realizadas durante la experiencia

práctica
 Incluir como figuras, los espectros de absorción, y las curvas de calibración de los
compuestos químicos evaluados en clase.

DISCUSIÓN

 Explicar y comparar los resultados obtenidos en clase con otros autores.

RECOMENDACIONES

 Establece recomendaciones que podrían mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué es necesario conocer el espectro de absorción de un compuesto determinado?

2. ¿Es importante el uso de un blanco de lectura en espectrofotometría? Explique.
3. ¿Qué tipos de espectrofotómetro existen? Realizar un cuadro comparativo.
4. ¿Cuál es la utilidad de una curva de calibración?

19
A.Vélez & R. Salas
 PRACTICA Nº2
“ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
DE LA AMILASA SALIVAL”

OBJETIVOS

 Calcular la actividad enzimática de la Amilasa salival en diferentes tiempos.

20
A.Vélez & R. Salas
 CONCEPTOS PREVIOS

Actividad Enzimática:
______________________________________________________
______________________________________________________
Amilosa:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Enlace α-1,6:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Almidón sintasa:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Amilopectina:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Isozima:
_______________________________________________________
_____________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

 Espectrofotómetro  Suero Fisiológico (100mL)

 Beaker 100mL (2)
 Bombillas (3)
 Matraz E. 100mL (2)
 Pizeta con agua destilada
 Tubos de ensayo (20)
 Gradillas
 Almidón 1% (100mL)
 Cubetas de Esp. (7)
21
 Parafilm
 Lugol (gotero)
 Buffer Fosfato pH 7 (100mL)
 Bagueta
 Pipetas de 10mL (2)
 Pipetas de 20mL (2)
 Pipetas de 5mL (2)
A.Vélez & R. Salas
INTRODUCCION

Las enzimas son proteínas que aceleran o disminuyen la velocidad de una reacción
química dentro de la célula, sin sufrir alguna alteración durante el proceso. Estas
moléculas son sumamente específicas, y participan en la gran mayoría de reacciones
químicas que ocurren en los organismos vivos. Su presencia dentro del sistema
bioquímico reduce la energía de activación de una reacción, generando la formación de
uno o más productos a través de un sustrato determinado con menor gasto energético.
La acción enzimática es dependiente de las condiciones del medio como: temperatura,
pH, concentración de sustrato, etc., y son susceptibles a las variaciones de estos
componentes.

El acoplamiento correcto de una enzima y el sustrato generan el complejo Enzima-

Sustrato, donde la enzima transformará este componente en un producto de terminado
sin que ninguna parte de su estructura proteica se haya visto dañada o modificada al
final de la reacción. La parte estructural de la enzima que toma contacto con el sustrato
y hace el trabajo final es llamada SITIO ACTIVO. Los residuos de este sitio están en la
conformación tridimensional correcta como para que realicen el trabajo enzimático. La
nomenclatura enzimática sigue dos pautas:

a. Según su sustrato: (sustrato-asa). Por ejemplo, lactasa, enzima que cataliza la

reacción:

Lactosa  Glucosa + Galactosa

b. Según su Función: (actividad-asa). Por ejemplo, desoxiribonucleasa, o DNAasa,

enzima que cataliza la reacción

DNA  Monofosfatos de desoxirribonucleótidos (dNMP)

Las amilasas son isoenzimas que degradan moléculas hidrocarbonadas complejas en
componentes más pequeños. Estas enzimas son producidas por el páncreas exocrino y
las glándulas salivales para ayudar a digerir el almidón, pudiéndose encontrar también
en el hígado y en el revestimiento de las trompas de Falopio. La amilasa humana se
denomina α-amilasa (endoamilasa) por su capacidad de hidrolizar los enlaces α-1,4,
siendo el producto final de la acción de la enzima sobre el polisacárido la formación de
dextranos, maltosa y algunas moléculas de glucosa. Los enlaces α-1,6 de los puntos de
ramificación no se alteran.

La amilasa salival o ptialina tiene un papel secundario en la digestión de polisacáridos

como el almidón, quizá participando también en eliminar los azucares de los dientes
(desechos). Esta enzima se puede inactivar fácilmente a pH 4.0, por lo que el tiempo de
acción sobre el almidón del alimento es reducido.

Fundamento (Método de Caraway, 1959): En este método, se mide la hidrólisis de un

sustrato de almidón por la α-amilasa del suero, orina o saliva en condiciones
estandarizadas, midiendo la disminución del color azul en el tubo problema después de
añadir iodo, se comparan las lecturas colorimétricas con un testigo o blanco en el cual
no ha habido hidrólisis enzimática. La unidad de actividad enzimática de amilasa se
define como la cantidad de enzima que en las condiciones establecidas hidroliza 10 mg
de almidón en 30 minutos, hasta no producirse color con el yodo.

23
A.Vélez & R. Salas
PROCEDIMIENTO

EXPERIENCIA Nº1: PREPARACION DE LA MUESTRA

1. Agregar 60ml de agua destilada en un beaker de 100ml.

2. Tomar un sorbo de agua destilada y realizar enjuagues dentro de la boca
durante cinco segundos.
3. Devolver el agua al recipiente utilizado y rotularlo como muestra.
4. Luego, disponer dos matraces como se muestra en la tabla 3.

Tabla.3. Preparación del blanco y la muestra, para análisis de actividad

enzimática de la alfa amilasa salival.
BLANCO MUESTRA

NaCl 0.025 M 10 mL 10 mL

Sustrato de almidón 1 % 15 mL 15 mL

Buffer fosfato pH 7.0 10 mL 10 mL

Agua destilada 15 mL 13.5 mL

Pre-incubar: 37ºC/5 minutos

Homogenizar y extraer la muestra correspondiente al tiempo cero

Muestra - 1.5mL

5. Incubar a 37°C y extraer 5mL de cada matraz a los tiempos siguientes: 1, 2, 4,

6, 8, y 10 minutos.
6. A estas muestras extraídas, incluyendo el tiempo 0, agregar inmediatamente 7
ml de agua destilada y tres gotas de solución de Yodo.
7. Mezclar por inversión y dejar en reposo por 10 min.
8. Determinar la absorbancia a una longitud de onda de 660nm.

24
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº2: CALCULOS

Los valores hallados en el matraz denominado BLANCO no deben cambiar a medida

que pasa el tiempo (no hay enzima), por lo que servirá como control de la cantidad de
almidón inicial en el matraz de MUESTRA; aunque en ciertos casos podría evidenciar
el efecto de los factores ambientales sobre la muestra.
Los cálculos se realizarán comparando la DO del Blanco, con la DO de la muestra en
cada unidad de tiempo, considerando la concentración del Blanco como la cantidad
inicial de almidón en la muestra.
1. Graficar concentración de almidón versus tiempo.
2. Luego, restar del Blanco la concentración de almidón de cada una de las
muestras para obtener la cantidad de almidón que ha sido digerido. Con estos
datos, graficar la concentración de almidón digerido versus tiempo.
3. Por último, realizar restas de la cantidad de almidón digerido al primer minuto
con la de cero minutos, la de 2 minutos menos la de 1 minuto, la de 4 minutos
menos la de 2 minutos y dividirlo entre dos, la de 6 minutos menos la de 4
minutos y dividirlo entre dos, y así sucesivamente, para obtener valores de
actividad enzimática (o velocidad enzimática), expresados en cantidad de
almidón digerido por unidad de tiempo. Realizar una tercera gráfica velocidad
enzimática versus tiempo.

25
A.Vélez & R. Salas
RESULTADOS

 Realiza la descripción detallada de las actividades realizadas durante la experiencia

práctica
 Incluir como figuras: Concentración de almidón vs. Tiempo, Concentración de almidón
digerido vs. Tiempo, y la gráfica de Actividad enzimática de la amilasa salival.

DISCUSIÓN

 Explicar y comparar los resultados obtenidos en clase con otros autores.

RECOMENDACIONES

 Establece recomendaciones que podrían mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO

1. ¿Cómo se clasifican las enzimas? Explicar e indicar ejemplos.

2. ¿Qué factores ambientales podrían desnaturalizar enzimas? Explique.
3. En el Perú, qué actividades podrían estar generando desnaturalización de proteínas; y
cuáles serían los impactos.

26
A.Vélez & R. Salas
 PRACTICA Nº3
“FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA”

1 7

2 8

3 9

4 10

5 12

6 14

pH
OBJETIVO

 Conocer los factores ambientales que afectan la actividad enzimática de la alfa

amilasa salival.

27
A.Vélez & R. Salas
 CONCEPTOS PREVIOS

Inhibidor enzimático:
______________________________________________________
______________________________________________________
Suero Fisiológico:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
pH:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Buffer:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Sustrato:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Desnaturalización proteica:
_______________________________________________________
_______________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

 Buffer fosfato pH 7 (100mL)  Goteros (4)

 NaCl 0,9% (100mL)  Crayón marcados
 Almidón 1% (100mL)  Masking tape
 Lugol débil  Bagueta de vidrio
 Pizeta con agua destilada  Pipeta 20mL (1)
 Parafilm  Pipeta 1mL (5)
 Tubos de ensayo (12)  Pipeta 5mL (4)
 Espectrofotómetro  Bombilla (4)

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A.Vélez & R. Salas
INTRODUCCION

Las enzimas o catalizadores biológicos son proteínas que aceleran la velocidad de las
reacciones químicas sin alterar el equilibrio de la reacción. Además, estas moléculas no
modifican su estructura a lo largo del desarrollo. Las enzimas actúan disminuyendo la
energía de activación, de tal forma que aumenta el número de sustratos que se
encuentran en un estado favorable para la reacción (estado de transición o de
activación).

La generación de un producto determinado dentro de nuestras células se realiza en

función a un proceso, la necesidad de una serie de pasos para una reacción, se resuelve
por la complejidad de las reacciones bioquímicas. De esta manera, algunas reacciones
endergónicas en una sola fase, se tornarían demasiado lentas, siendo incompatibles con
los sistemas biológicos. Muchas reacciones exergónicas liberarían demasiada energía,
la cual se podría expresar en calor intenso que podría dañar el correcto funcionamiento
celular. Por tal razón, estás reacciones liberan energía lentamente en cada proceso, de
manera que esta energía sea utilizada sin perjudicar la integridad celular. Los pasos
consecutivos que ocurren en nuestro organismo y que pueden reemplazar una sola
reacción química se denominan rutas metabólicas.

La actividad enzimática puede ser regulada, siendo activada o inactivada según los
requerimientos celulares en un momento dado. Esta actividad también está
estrechamente controlada por factores ambientales dentro de la célula, tales como la
temperatura y el pH. Las enzimas siempre exhiben una temperatura y un pH óptimo,
características apropiadas para su funcionamiento. Por ejemplo, las enzimas en los
tejidos de mamíferos siempre muestran temperaturas óptimas alrededor de los 37°C,
mientras que las de los peces del Ártico estarán cercanas a los 0°C. Muchas enzimas se
desnaturalizan a 45°C o más, pero en otros organismos (termofílicos), la actividad
óptima se encuentra por encima de este límite.
 PROCEDIMIENTO

EXPERIENCIA Nº1: EFECTO DEL ION CLORURO

Material adicional:

- NaCl 2,5% (100mL)

- NaCl 5% (100mL)

1. Disponer cuatro tubos de ensayo con sus respectivos blancos de reacción, como
se indica en la tabla 4.

Tabla 4. Batería de tubos para la prueba del efecto de la concentración del cloruro de
sodio sobre la actividad enzimática de la alfa amilasa salival.
Tubo 1 Blanco1 Tubo 2 Blanco2 Tubo 3 Blanco3 Tubo 4 Blanco 4

Buffer
fosfato 0.1
1.5mL
M 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL

pH 7

Almidón
0.5mL
1% 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL

NaCl 0.9% -
- - 1mL 1mL - - -

NaCl 2,5% 1mL - -

- - 1mL

NaCl 5% - 1mL
- - - - - 1mL

Agua
12mL
destilada 12.5mL 13mL 11.5mL 12.mL 11.5mL 12mL 11.5mL

Pre-incubar por 5 minutos

Enzima 0.5mL -
- 0.5mL - 0.5mL - 0.5mL

2. Incubar por cinco minutos a 37°C

3. Agregar dos gotas de Solución de Yodo y dejar reposar por cinco minutos
4. Medir la Absorbancia a 660nm en el espectrofotómetro
5. Graficar actividad enzimática versus concentración del ion Cloruro

30
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº2: EFECTO DE LA TEMPERATURA

Material adicional:

- Plancha de calentamiento
- Beaker 500mL (Con agua, 0°C)
- Beaker 500mL (Con agua, 100°C)

1. Disponer cuatro tubos de ensayo con sus respectivos blancos de reacción, como
se indica en la tabla 5.

Tabla 5. Batería de tubos para la prueba de diferentes temperaturas sobre la

actividad enzimática de la alfa amilasa salival.
Tubo Blanco Tubo Blanco Tubo Blanco Tubo Blanco

0ºC 0ºC 20ºC 20ºC 37°C 37ºC 100°C 100ºC

Buffer fosfato
1.5 mL 1.5mL 1.5 mL 1.5mL 1.5 mL 1.5mL 1.5 mL 1.5mL
0.1M pH 6.9

1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL

NaCI 0.025 M 1.5 mL 1.5 mL 1.5 mL 1.5 mL

0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL

Almidón1% 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL

Agua
10.5mL
10 mL 10.5mL 10mL 10.5mL 10 mL 10.5mL 10 mL
destilada

Tabla.5. Efecto de la Temperatura

2. Pre-incubar por cinco minutos a las diferentes temperaturas establecidas

3. Agregar 0.5mL del preparado enzimático (excepto a los Blancos)
4. Incubar a cada temperatura por cinco minutos
5. Agregar dos gotas de Solución de Yodo, dejar reposar por 5 minutos
6. Medir la Absorbancia a 660nm en el espectrofotómetro. Graficar actividad
enzimática versus temperatura

31
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº3: EFECTO DEL PH

Material adicional:

- Buffer acetato pH 4 (100mL)

- Buffer fosfato pH 10 (100mL)

1. Disponer tres tubos de ensayo con sus respectivos blancos de reacción, como se
indica en la tabla 6.

Tabla 6. Batería de tubos para la prueba de diferentes pH sobre la actividad

enzimática de la alfa amilasa salival.
Tubo 1 Blanco 1 Tubo 2 Blanco 2 Tubo 3 Blanco 3

Buffer Acetato 0.1M

1.5mL 1.5mL - - - -
pH 4.0

Buffer fosfato 0.1 M

- - 1.5mL 1.5mL - -
pH 6.9

Buffer fosfato 0.1 M

- - - - 1.5mL 1.5mL
pH 10.0

NaCl 0.025 M 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL

Almidón 1 % 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL

Agua destilada 10mL 10.5mL 10mL 10.5mL 10mL 10.5mL

2. Pre-incubar por cinco minutos a 37°C

3. Agregar 0.5mL del preparado enzimático a todos los tubos a excepción de los
blancos e incubar por cinco minutos
4. Agregar dos gotas de Solución de Yodo y dejar reposar por cinco minutos
5. Medir la Absorbancia a 660nm en el espectrofotómetro.
6. Graficar actividad enzimática versus pH del medio.

32
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº4: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA

1. Disponer cinco tubos de ensayo y un blanco de reacción, como se indica en la

tabla 7.

Tabla 7. Batería de tubos para la prueba de temperatura sobre la actividad enzimática

de la alfa amilasa salival.

BLANCO Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

Buffer fosfato 0.1 M

1.5 ml 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL
pH 6,9

NaCI 0.025 M 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL

Almidón 1% 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL

Agua destilada 10.5mL 10.4mL 10.3mL 10mL 9.5mL 8.5mL

Pre-incubar por 5 minutos a 37°C

Preparado de Enzima - 0.1mL 0.2mL 0.5mL 1mL 2mL

2. Volver a incubar durante cinco minutos

3. Agregar tres gotas de Solución de Yodo y dejar reposar por cinco minutos
4. Medir la Absorbancia a 660nm en el espectrofotómetro.
5. Graficar la actividad enzimática versus concentración de la enzima.

33
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº5: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO

1. Disponer cuatro tubos de ensayo con sus respectivos blancos de reacción, como
se indica en la tabla 8.

Tabla 8. Batería de tubos para la prueba del etemperatura sobre la actividad enzimática
de la alfa amilasa salival.

T-1 B-1 T-2 B-2 T-3 B-3 T-4 B-4

Buffer fosfato 1.5

1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
0.1M pH 6,9 (mL)

NaCl 0,025 M (mL) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Almidón 1 % (mL) 0.2 0.2 0.5 0.5 1.0 1.0 2.0 2.0

Agua destilada 10.8 11.3 10.5 11.0 10 10.5 9 9.5

(mL)

2. Pre-incubar por cinco minutos a 37°C y luego agregar 0.5mL del preparado
enzimático a cada tubo a excepción de los blancos.
3. Incubar por cinco minutos
4. Agregar tres gotas de Solución de Yodo y dejar reposar por cinco minutos
5. Medir la Absorbancia a 660nm en el espectrofotómetro. Graficar actividad
enzimática versus la Concentración de Sustrato.
6. Calcular gráficamente el Km y la Vmax del preparado de amilasa salival.

34
A.Vélez & R. Salas
RESULTADOS

 Realiza la descripción detallada de las actividades realizadas durante la experiencia

práctica
 Incluir como figuras, los gráficos indicados en cada experiencia.

DISCUSIÓN

 Explicar y comparar los resultados obtenidos en clase con otros autores.

RECOMENDACIONES

 Establece recomendaciones que podrían mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO

1. ¿Cómo se reduce la energía de activación en una reacción química, por acción

enzimática?
2. ¿Explique por qué la gráfica de Michaelis – Menten no es aplicable para todas las
enzimas?
3. El 50% del azúcar libre del maíz, se convierte en almidón de 24 a 48hrs después
de la cosecha, perdiendo su sabor dulce y característico. Sin embargo, el sabor
se podría mantener, si las mazorcas se sumergen en agua hirviendo, para luego
enfriarse en agua fría. Explique el mecanismo bioquímico de este proceso.

35
A.Vélez & R. Salas
 PRACTICA Nº4
“RESPIRACIÓN CELULAR. ALTERACIÓN POR METALES
PESADOS”

Acetil-CoA

Citrato

Iso-citrato

Fumarato

Succinil-CoA

OBJETIVOS
 Comprobar el efecto inhibitorio del plomo sobre el ciclo de Krebs.

36
A.Vélez & R. Salas
 CONCEPTOS PREVIOS

Inhibidor:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Piruvato DH:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Acetil CoA:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Mitocondria:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
NADH:
_______________________________________________________
_____________________________________________________Suc
cinato DH:
_______________________________________________________
______________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

 Balanza de precisión  Pipeta 1mL (5)

 Hígado de pollo fresco
 Acetato de plomo 10mM (100mL)
 Azul de metileno 0.1% (gotero)
 Succinato sódico 0,4M (100mL)
 Aceite vegetal (100mL)
 Buffer fosfato pH7 (250mL)
 Tubos de ensayo (5)
 Matraz E. 100mL
 Probeta 100mL
 Pipetas 10mL (1)
 Pizeta con agua destilada
 Mortero 500mL
 Sistema de filtrado
 Gotero descartable
 Crayón marcador
 Masking Tape
 Guantes quirúrgicos (2 pares)
 Gasa 20cm2

37
A.Vélez & R. Salas
INTRODUCCION

El metabolismo celular es la suma de todas las reacciones biosintéticas y catabólicas que

ocurren dentro de la célula. Las reacciones biosintéticas utilizando la energía que se
genera dentro de la célula para formar nuevas moléculas:

A + B + Energía  Z

La reacción catabólica por otro lado degrada componentes o moléculas con la finalidad
de producir energía en forma de ATP:

Z  A + B + Energía

La energía liberada durante las reacciones catabólicas es utilizada para generar

reacciones anabólicas principalmente; los animales y otros organismos no fotosintéticos
no pueden generar energía química a partir de la luz, por lo cual deben consumir una
energía "de segunda mano" a partir de los organismos autótrofos. El carbono y el
hidrógeno que se encuentran dentro de las moléculas que se captan con los alimentos
sirven como combustible puesto que no se encuentran en su forma
termodinámicamente más estable. La forma más estable del carbono en una atmósfera
de oxigeno es el C02 y del hidrógeno es el H2O.

Por tanto, las células obtienen energía a partir de azúcares u otras moléculas,
permitiendo a sus carbonos e hidrógenos combinarse con el oxígeno de la atmósfera
para producir CO2 y H20 (oxidación biológica). La oxidación celular es similar a la
oxidación que ocurre con los átomos de carbono durante la combustión, siendo la
diferencia de que no ocurre en una reacción de un solo paso, sino utiliza la catálisis
producida por enzimas para tomar las moléculas a través de una gran serie de reacciones
que gradualmente envuelven la fijación del oxígeno atmosférico y la producción de
agua. De esta forma, la energía liberada puede ser más eficientemente almacenada en
una forma química útil disponible para generar trabajo celular (ATP). En el ser humano
en reposo, prácticamente utiliza una cantidad de ATP equivalente a la mitad del peso
corporal. En el sentido biológico, la oxidación se refiere principalmente a la remoción de
electrones de las moléculas orgánicas. En muchos casos, la remoción de electrones
también está acompañada por la liberación de protones:

3H20 + 3CH3CH2OH  3CH3COOH + 12 H+ + 12 e-

Cuando una molécula acepta los electrones, se dice que se ha reducido:

RCHO + 2e- + 2H+ ---------------> RCH2OH

El contenido energético de una sustancia dada es mayor en su estado reducido que en

su estado oxidado por la energía de los electrones adicionales. Por tanto, la combustión
(u oxidación) de los alimentos transforma a los carbonos e hidrógenos presentes en las
moléculas captadas desde un estado rico en energía (forma reducida) a C02 y H2O,
donde se encuentran en su mayor estado de oxidación. Cuando una sustancia está
oxidada, otra sustancia se reduce combinándose con los electrones removidos.

CH4 CH30H  H2C=O  H2COOH  CO2

En la respiración celular, gracias al Ciclo de Krebs, el Succinato se transforma en

Fumarato por acción catalítica de la Deshidrogenasa Succínica ó Succinato
Deshidrogenasa (SDH) una enzima que permite que se reduzca el FAD en FADH2 el cual
libera electrones que son capturados por el oxígeno molecular. La contaminación por
metales pesados como el plomo inhibe en gran medida las enzimas del ciclo de Krebs,
reduciendo el poder reductor que esta ruta metaboliza ofrece para el funcionamiento
de la cadena de transporte de electrones y la producción de energía en los organismos
superiores.

39
A.Vélez & R. Salas
PROCEDIMIENTO

EXPERIENCIA Nº1: RESPIRACIÓN CELULAR

1. Preparar un homogenizado de hígado de pollo al 10% en buffer fosfato 0.1 M pH

7 (o solución fisiológica vegetal), utilizando una licuadora o directamente en un
mortero.
2. Tomar cinco tubos de ensayo rotularlos correctamente y colocar los reactivos
indicados en la tabla 9, mezclando los componentes de forma activa por cinco
segundos.

Tabla 9. Batería de tubos para la prueba de respiración celular.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

Succinato 0.4 M 0.5 mL - 0.5 mL 0,5mL 0.5 mL

Buffer fosfato pH 7.4 1 mL 1 mL 1 mL 1mL 1 mL

Azul de metileno 0,1% 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0,5mL 0.5 mL

Agua destilada 8 mL 8 mL 7.5 mL 7mL 7.5 mL

Homogenizado de hígado - 0.5 mL 0.5 mL 0,5mL 0.5 mL

Acetato de Plomo 10mM - - - 0,5mL -

3. Inmediatamente después, agregar una capa de 0,5cm de aceite vegetal en todos

los tubos excepto el Tubo 5.
4. Tomar el tiempo que demora la decoloración del azul de metileno en cada tubo.
5. Explique los mecanismos de reacción de cada tubo (Figura3).

40
A.Vélez & R. Salas
 Figura.3. Niveles de reducción de Azul de Metileno en función a la respiración
celular de tejido hepático en cinco diferentes tratamientos.

41
A.Vélez & R. Salas
RESULTADOS

 Realiza la descripción detallada de las actividades realizadas durante la experiencia

práctica

DISCUSIÓN

 Explicar y comparar los resultados obtenidos en clase con otros autores.

RECOMENDACIONES

 Establece recomendaciones que podrían mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué rutas metabólicas forman Acetil CoA? Explique.

2. ¿Cuál es la función del plomo en la experiencia?
3. Explique químicamente el cambio de color del indicador (Azul de metileno).
4. ¿Qué contiene el homogenizado de hígado?

42
A.Vélez & R. Salas
 PRACTICA Nº5
“DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS EN
MICROORGANISMOS LENTICOS”

O
CH 2 O C
O
CH O C
O
CH 2 O C

OBJETIVOS
 Extracción de triglicéridos en microorganismos de origen lagunar
 Determinación cuantitativa de triglicéridos por métodos colorimétricos

43
A.Vélez & R. Salas
 CONCEPTOS PREVIOS

Triglicérido:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Ácido graso insaturado:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Molécula apolar:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Enlace éster:
_______________________________________________________
____________________________________________________
Configuración CIS:
_______________________________________________________
____________________________________________________
Anfipático:
_______________________________________________________
_______________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

 Estufa  Cloroformo (20mL)

 Centrifuga
 Micropipeta 100µm
 Micropipeta 1000µm
 Muestras de agua residual
 Pizeta con agua destilada
 Tubo Imhoff (1)
 Soporte de tubo Imhoff (1)
 Cuchara-espátula
 Pipeta 5mL (4)
 Estándar de triglicéridos
 Reactivo enzimático para
trigliceridos
 Metanol (20mL)
 Balde 4.5L
 Goteros descartables (2)
 Tubos de centrifuga 15mL
 Beaker 250mL (1)

44
A.Vélez & R. Salas
INTRODUCCION
Los lípidos constituyen un grupo de moléculas heterogéneas, cuya principal
característica es la insolubilidad en agua. Las funciones de estos compuestos son
igualmente diversas, presentándose como elementos estructurales, de transporte o
reserva energética. Los ácidos grasos son un grupo de compuestos de suma importancia
en la mayoría de los lípidos, gracias a que determinan muchas veces el comportamiento
de éstas biomoléculas. Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos de cadenas
comprendidas entre los 4–36 carbonos, los cuales pueden presentar un número
determinado de dobles enlaces generalmente en la configuración CIS. Los ácidos grasos
que no presentan dobles enlaces toman el nombre de “saturados” y se encuentran
principalmente en tejidos animales, por otro lado los ácidos grasos que presenten uno
o más dobles enlaces en sus cadenas toman el nombre de “insaturados”, y son
encontrados principalmente en tejidos vegetales. Debido a la presencia de dobles
enlaces, los ácidos grasos insaturados no presentan un alto índice de empaquetamiento,
encontrándose en estado líquido a temperatura ambiental, sin embargo, los ácidos
grasos saturados tienen un índice de empaquetamiento muy superior que los convierte
en sólidos a temperatura ambiental.

Las células de los organismos vivos presentan membranas compuestas por una bicapa
lipídica con carácter anfipático (hidrófobo e hidrófilo) uno de los principales causantes
de la permeabilidad selectiva con respecto al medio extracelular. Los principales lípidos
presentes en la membrana están agrupados en función a sus estructuras químicas,
dentro de los que encontramos a los fosfolípidos (Glicerofosfolípidos y Esfingolípidos),
glucolípidos (Galactolípidos, Sulfolípidos y Esfingolípidos) y esteroles (Colesterol).

Por otro lado, tanto los tejidos animales como los vegetales presentan lípidos con
funciones de almacenamiento energético y aislamiento, conocidos como Triglicéridos.
Los triglicéridos comprenden un grupo de lípidos muy simples, compuestos por un
alcohol denominado glicerol unido mediante enlaces de tipo éster a tres ácidos grasos
de cadena variable, quienes determinan su nomenclatura.
La eutrofización es un proceso provocado por un aumento excesivo de nutrientes en un
medio acuático (lagos, mares, ríos, etc.) principalmente nitrógeno y fosforo (Residuos
urbanos, industriales, agrícolas, etc.), como consecuencia de actividades humanas.
Entre las principales, podemos examinar un aumento descontrolado de organismos
como protozoarios y plantas que traen consigo la disminución del oxígeno disuelto en el
agua, y el crecimiento de las poblaciones de microalgas y bacterias relacionadas al mal
olor, disminución de la entrada de luz, desplazamiento y muerte de peces entre otros.
Por tanto, los procesos de eutrofización pueden ser determinados bioquímicamente,
calculando la concentración de triglicéridos presentes en los microorganismos de un
medio acuático, utilizando solventes orgánicos adecuados, que nos permitan desagregar
las interacciones hidrófilas y los enlaces entre los lípidos y proteínas de membrana.

46
A.Vélez & R. Salas
PROCEDIMIENTO

EXPERIENCIA Nº1: PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

1. Identificar una laguna contaminada y registrar las características del contexto

2. Extraer un volumen aproximado de 1.5L de agua de una zona ubicada a un metro
de la orilla con la ayuda de un cucharon de muestreo.
3. Colocar un litro del contenido en un tubo Imhoff, 12 horas previas al inicio de la
práctica.
4. Con la ayuda de un gotero, retirar el agua, con cuidado de no re-suspender el
precipitado.
5. Colocar el precipitado en un tubo de centrifuga de 15mL.
6. Centrifugar a 3000RPM durante 10 minutos y eliminar el sobrenadante.

47
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº2: CUANTIFICACIÓN

1. Agregar 2mL de agua destilada y homogenizar

2. Agregar 4mL de Metanol y agitar durante dos minutos
3. Agregar 2mL de cloroformo y agitar durante dos minutos
4. Agregar 2mL de cloroformo, homogenizar y dejar en reposo durante un minuto
5. Agregar 2mL de agua destilada, homogenizar y dejar en reposo durante un
minuto
6. Centrifugar el contenido a 3000RPM durante 15 minutos
7. Extraer 2mL de la zona basal del tubo
8. Colocar en la estufa durante cinco minutos a 65 grados Celsius
9. Realizar la cuantificación de triglicéridos mediante el método enzimático, según
se indica en la tabla 10.

Tabla 10. Método enzimático para la determinar la concentración de

triglicéridos en microorganismos lenticos.

BLANCO ESTÁNDAR MUESTRA PROBLEMA

ESTÁNDAR - 0.1mL -

MUESTRA PROBLEMA - - 0.1mL

REACTIVO ENZIMÁTICO 1.0mL 1.0mL 1.0mL

10. Incubar cinco minutos a 37°C

11. Leer absorbancias a 520nm y determinar la concentración de la muestra
problema

48
A.Vélez & R. Salas
RESULTADOS

 Realiza la descripción detallada de las actividades realizadas durante la

experiencia práctica
 Los resultados pueden complementarse con figuras y tablas citadas en el informe

CONCLUSIONES

 Establece tus conclusiones en base a los resultados obtenidos en la práctica.

RECOMENDACIONES

 Establece recomendaciones que podrían mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO

1. ¿Dónde se encuentran principalmente los triglicéridos en plantas y animales?

2. Explicar la naturaleza anfipático de los lípidos.
3. ¿Cuál es la relación entre los lípidos y los xenobióticos orgánicos – sintéticos?

49
A.Vélez & R. Salas
 PRACTICA Nº6
“ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA EN SUELOS
CONTAMINADOS”

OBJETIVOS

 Determinar la Actividad Enzimática de la Catalasa (AC) en diferentes usos de

suelos.

50
A.Vélez & R. Salas
 CONCEPTOS PREVIOS

Coenzima:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Catalasa:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Agroforestería:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Grupo Hemo:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Peroxisomas:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Titulación:
_______________________________________________________
______________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

 Balanzas Analítica  Magnetos (3)

 Matraz Erlen. 100mL (6)
 KMnO4 1% (100mL)
 Parafilm
 Pizeta con agua destilada  Beaker 100mL (3)
 H 2 SO4 1,5M (50mL)  Probeta 25mL (1)
 Pipetas 5mL (3)
 H 2O2 30% (1/100, 100mL)  Clorofilómetro
 Sistema de filtrado  Picnómetro
 Agitador magnético (3)  GPS
 Gotero (2)  Pala
 Bombilla de succión (3)  Pico
 Pinza mariposa (1)  Wincha 50m
 Buretas 25mL (1)  Cilindro de muestreo

51
A.Vélez & R. Salas
INTRODUCCION

Las enzimas son proteínas con actividad catalítica, favoreciendo las reacciones químicas
de los procesos biológicos. La actividad de la enzima ocurre sobre una molécula en
particular denominada sustrato, la cual finalmente queda transformada en uno o varios
productos. Para que ocurra la reacción enzimática, es necesario que el sustrato se asocie
de manera específica con el sitio activo, región que presenta una forma parcialmente
complementaria al sustrato (ajuste inducido). Por tanto, la reacción queda descrita en
la siguiente fórmula para resaltar la necesidad de la formación de un complejo Enzima –
Sustrato, luego del cual se podrá generar la reacción química:

E+S  [E-S]  E+P

La actividad enzimática puede cuantificarse en función de la cantidad de sustrato

digerido por unidad de tiempo, o la cantidad de producto generado por unidad de
tiempo. Debe tomarse en cuenta que, en muchos casos, las enzimas necesitan de algún
compuesto de naturaleza orgánica o inorgánica, el cual actúa como adyuvante,
favoreciendo de manera significativa la generación de la reacción. Estos compuestos
reciben el nombre de cofactores enzimáticos (si son de naturaleza inorgánica) o
coenzimas (si son compuestos orgánicos).

Las enzimas del suelo, son generadas por procesos de secreción y lisis celular, atribuidas
principalmente a microorganismos como las bacterias, y en menor grado a la presencia
de tejido vegetal. De todas las enzimas liberadas por estos procesos, un pequeño
porcentaje queda inmovilizado y estabilizado por algún tipo de agregación o asociación
(covalente o no covalente) con las partículas (orgánicas o inorgánicas), cuyo grado se
relaciona de forma directa con la textura del suelo y la capacidad de intercambio
catiónico presente. Este pequeño porcentaje se explica por el hecho que generalmente
ocurre un fenómeno de “lavado” por efecto del agua de regadío o lluvias o, en muchos
casos, por el hecho que las condiciones extracelulares del suelo (pH, fuerza iónica,
temperatura, etc.) son totalmente agresivas para las enzimas, causando su inactivación,
desnaturalización o degradación.

Para los fines prácticos, no es necesario identificar las especies microbianas presentes
en el suelo, sino conocer la actividad metabólica del grupo como una unidad; las pruebas
pueden clasificarse como generales, si hacen referencia a procesos globales (catalasa o
peroxidasa) o específicas si evalúan reacciones particulares (carbohidrasas, glucosidasa
y galactosidasa para analizar el ciclo del Carbono, fosfatasas para analizar el ciclo del
Fósforo, ureasa y proteasas para el ciclo del Nitrógeno, arilsulfatasa para el ciclo del
Azufre, quitinasa, etc.).

La catalasa es una enzima que rompe el peróxido de Hidrógeno para liberar Oxígeno
molecular y agua,

2H 2O2  2H 2O+O2

en realidad, se considera que esta actividad tiene que ver con dos tipos de enzimas
diferentes, las peroxidasas y las catalasas, aunque el último término es mucho más
genérico y describe mejor a las enzimas presentes en los microorganismos aerobios y en
la mayoría de los anaerobios facultativos. En el suelo, la AC depende de muchos factores
como la estación, la vegetación presente, el contenido de materia orgánica, la
profundidad del suelo, el uso de suelo, etc. También se ha observado que esta actividad
enzimática disminuye en el suelo debido al tratamiento con herbicidas, insecticidas y
nematicidas.

La actividad enzimática en suelos, se relaciona con los procesos de mineralización,

humificación de materia orgánica, y a la dinámica de compuestos xenobióticos,
brindando información importante sobre su estado de conservación. La AC, también es
importante para conocer y verificar la riqueza del suelo, la que se asocia a un correcto
manejo y gestión de los diversos cultivos. En la selva peruana, la AC se relaciona de
forma directa con el “Stock de Carbono” (SC) en los suelos, presentando niveles altos de
actividad en ambientes con cargas considerables de carbono.

53
A.Vélez & R. Salas
El SC varía también en función a los diferentes usos de suelo, siendo mayor en zonas de
bosque secundario, y presentando las menores concentraciones en zonas de
monocultivo (la agroforestería, ocupa un lugar intermedio). Además, estos usos de
suelo, se asocian a los tamaños de cada individuo en un cultivo vegetal, encontrado
menores índices de homogeneidad (en tamaños) en bosque secundario, y mayores
índices en monocultivos.

La determinación de la actividad catalasa en suelo se medirá utilizando el método de

Johnson y Temple (1964), cuya base es la reducción en medio ácido del permanganato
de potasio debido al peróxido de hidrógeno que queda en el suelo por acción de las
enzimas microbianas.

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A.Vélez & R. Salas
PROCEDIMIENTO

EXPERIENCIA Nº1: OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

1. Identificar tres diferentes usos de suelo, en una finca cafetalera del distrito de
Villa Rica.
2. Determinar las coordenadas geográficas en el centro de cada sitio de muestreo.
3. Realizar un cuadrante de 50m2, colocando estacas de señalización en cada
esquina.
4. Realizar una calicata de 1mx1mx1m en el centro de cada cuadrante.
5. Con el método del cilindro metálico, obtener muestras a los 10cm, 50cm y a los
90cm de profundidad, conservar las muestras en bolsas de muestreo
correctamente rotuladas.
6. Realizar la medición de la totalidad de árboles y arbustos involucrados en el
cuadrante con la ayuda de un clinómetro.
7. Realizar un corte diagonal en el cuadrante de estudio, y elegir una planta
representativa cada 5m, con la finalidad de medir la concentración de clorofila
por el método SPAD (las plantas elegidas deberán corresponder a la misma
especie).
8. Medir la temperatura promedio del suelo en cada cuadrante.

55
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº1: PREPARACIÓN DE MATERIALES

1. Muestra:
o Colectar una muestra de suelo. Tamizar (2mm) y colocarla en dos bolsas
de papel (0,5g en cada una)
o Conservar una bolsa, y someter la otra a la estufa, a una temperatura de
65°C al menos dos horas previas a la práctica para obtener el Peso Seco
(SS)
2. Preparar ácido sulfúrico 1.5M:
o Medir 8mL de ácido sulfúrico concentrado y colocarlo en una fiola de
100mL
o Agregar agua destilada hasta la marca de aforo
3. Permanganato de Potasio 1%.
o Medir un gramo de Permanganato de Potasio y colocarlo en un matraz
Erlenmeyer de 250mL
o Agregar 80mL de agua, y llevar a una plancha de calentamiento con
agitador magnético.
o Someter la mezcla a una temperatura de 60°C y agitar mediante un
magneto durante cinco minutos
o Filtrar el contenido en una fiola de 100mL y enrasar con agua destilada.
4. Peróxido de Hidrógeno 1/100
o Agregar 1mL de una solución de Peróxido de Hidrógeno al 30% en una
fiola de 100mL y enrasar con agua destilada hasta la marca de aforo
o Preparar esta solución inmediatamente antes de su uso

56
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº2: ANÁLISIS DE LA MUESTRA

1. Pesar 0.5 g de suelo tamizado

2. Colocarlo en un matraz Erlenmeyer y agregar 40mL de agua destilada
3. Tapar con parafilm y llevar al agitador magnético por un lapso de 30 minutos
(600 vueltas por minuto).
4. Agregar 5mL de solución de peróxido de hidrógeno
5. Tapar nuevamente y agitar exactamente por 10 minutos (600 vueltas por
minuto).
6. Añadir 5mL de ácido sulfúrico 1.5 M para detener la reacción enzimática y
estabilizar el H2O2 residual.
7. Filtrar en un beaker de 100mL.
8. Medir 25mL del filtrado con la ayuda de una probeta de 50mL, y verter en un
matraz Erlenmeyer.
9. Titular lentamente con el permanganato de potasio 1%, con agitación constante,
hasta que se genere un color rosado permanente.
10. Preparar los siguientes controles:
o Control de peróxido: Se prepara una batería exactamente igual,
remplazando el peróxido de hidrógeno por 5 ml de agua destilada, el
suelo debe ser exactamente el mismo que se va a analizar.
o Control de suelo: Se prepara una batería exactamente igual, pero sin los
0.5 g de suelo.

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A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº3: CÁLCULOS

1. Para calcular la actividad de la catalasa del suelo, se emplea la siguiente formula:

(CS-(M-CP))  N 12
 Actividad de la Catalasa  =
SS
Donde:

CS : Gasto de Permanganato obtenido en el Control de suelo.

M : Gasto de Permanganato obtenido en la muestra problema.

SS : Peso seco del suelo (previo a la práctica, se toman 0.5 g de la muestra

de suelo húmedo, y se deja en estufa a 70°C mínimo por 2 horas).

CP : Gasto de permanganato obtenido en el Control de peróxido.

N : Normalidad exacta del permanganato de Potasio (se obtiene titulando

el permanganato con oxalato de sodio 0.1 N).

2. La actividad de catalasa se expresa en milimoles de peróxido consumidos por

gramo de suelo seco y por hora (mmoles/g.h)

OBSERVACIONES:

- Apoyar los resultados con análisis de textura de suelo, CIC, y Stock de Carbono.

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A.Vélez & R. Salas
RESULTADOS

 Realiza la descripción detallada de las actividades realizadas durante la experiencia

práctica

DISCUSIÓN

 Explicar y comparar los resultados obtenidos en clase con otros autores.

RECOMENDACIONES

 Establece recomendaciones que podrían mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las características más representativas en los usos de suelo

evaluados?
2. ¿Por qué el SC se relaciona con la AC?
3. ¿Cuál es la importancia de evaluar la homogeneidad en el tamaño de las plantas?

59
A.Vélez & R. Salas
 PRACTICA Nº7
“CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES EN
PLANTAS SOMETIDAS A ESTRÉS SALINO”

CH 2OH

CH 2OH H
H H
H
OH H H OH
OH CH 2OH

H OH OH H

OBJETIVOS
 Determinar cuantitativamente la concentración de azucares reductores en
plantas de tomate sometidas a estrés salino.

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A.Vélez & R. Salas
 CONCEPTOS PREVIOS

Azúcar reductor:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Enlace glucosídico:
______________________________________________________
______________________________________________________
Oligosacárido:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Cetona:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Maltosa:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Pentosa:
_______________________________________________________
_____________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

 Espectrofotómetro  Tubos de micro-centrifuga 1.5mL

 Micromipeta 10l - 100l
 Micromipeta 100l - 1000l
 Centrifuga
 Microcentrifuga
 Balanza de precisión
 Muestras: plantas de tomate
sometidas a estrés salino y control
 Tijera
 Gradilla (1)
 Tubos de centrifuga 15mL (2)
(3)
 Mortero (1)
 Embudo 5cm (1)
 Pizeta con agua destilada
 NaCl 0,8% (100mL)
 Hidróxido de bario 0,1N (100mL)
 Sulfato de Zinc 0.1N (100mL)
 Estándar de carbohidratos
 Reactivo enzimático para Glucosa

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A.Vélez & R. Salas
INTRODUCCION

Los carbohidratos también conocidos como azucares o glúcidos, son compuestos de

carbono polihidroxilados, estructuralmente: aldehídos o cetonas simples
(monosacáridos) o complejos (oligosacáridos y polisacáridos). Los azúcares simples se
pueden clasificar por el grupo funcional, por tanto, si presentan un doble enlace al
oxígeno en uno de los extremos de la cadena, el azúcar recibe el nombre de ALDOSA,
por otro lado, si el doble enlace al oxígeno no se presenta en alguno de los extremos, el
azúcar recibe el nombre de CETOSA. Los azúcares de importancia biológica y fisiológica
son aldosas en su mayoría.

Los monosacáridos también pueden clasificarse en función al número de carbonos de

su cadena, principalmente desde tres a siente componentes por cada estructura en
particular. Los carbohidratos de tres carbonos reciben el nombre de triosas como: el
GLICERALDEHIDO y la DIHIDROXIACETONA, con cuatro carbonos, TETROSAS, y así
sucesivamente PENTOSAS, HEXOSAS, y HEPTOSAS. Desde el punto de vista fisiológico y
bioquímico, los azúcares más importantes son las hexosas dentro de las que
encontramos a la Glucosa, Fructosa y Galactosa además de una pentosa denominada
Ribosa. Sin embargo, existen azúcares de cuatro carbonos (Eritrulosa) y de siete
(Sedoheptulosa) que sólo participan en el organismo como intermediario en la vía de las
Pentosas.

Un tipo importante de estrés es generado por la salinidad (factor limitante para la

productividad agrícola), afecta alrededor de 9 x 108 hectáreas de la superficie cultivable
sobre la tierra; éste, puede reducir el crecimiento de la planta por déficit de agua,
toxicidad por iones, desbalance por iones o por combinación de estos factores. Las
plantas en estrés salino sufren de un complejo de síntomas con dos principales
componentes: el estrés hídrico y el estrés osmótico, debido a que una elevada
concentración de sal en el medio genera una pérdida de agua en las células vegetales,
una acumulación interna de iones en niveles tóxicos, la reducida disponibilidad de agua
debido al efecto osmótico y una alteración de la nutrición mineral. En respuesta a este
cuadro, las células de la planta responden de manera diversa, expresando proteínas
específicas de respuesta al estrés (como la osmotina) o acumulando compuestos
osmoreguladores (osmolitos) tales como aminoácidos y sus derivados (principalmente
prolina y betaína), alcoholes polihidroxilados (como manitol, arabitol y glicerol) y
azúcares (como sacarosa, rafinosa, glucosa y fructosa). Estos mecanismos moleculares
pueden estar relacionados a las adaptaciones fisiológicas que se observan, como el
adelanto del tiempo de floración, patrones elevados del crecimiento relativo de la raíz
con respecto a la porción aérea de la planta, la generación de una apariencia cerosa de
las hojas, la habilidad de excluir sal manteniendo el flujo hídrico a través de la planta, y
la capacidad de compartamentalización de iones dentro de vacuolas. Estos mecanismos
de respuesta al estrés salino han sido observados en diversas familias de plantas de
interés económico, sobre todo en las solanáceas. Esta familia agrupa quizá a las
principales plantas de interés para el hombre, como por ejemplo la papa, el pimiento, el
rocoto, el tabaco y el tomate.

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A.Vélez & R. Salas
PROCEDIMIENTO

EXPERIENCIA Nº1: MUESTRAS

1. Lavar arena fina repetidas veces, hasta no observar burbujas

2. Desinfectar la arena con lejía al 10%
3. Colocar la arena limpia sobre una almaciguera y agregar 20 semillas de tomate
por cada grupo, cuidando que el sustrato siempre se mantenga húmedo
4. Cubrir las bandejas con un plástico negro hasta que al menos hayan emergido el
30% de las plántulas
5. Retirar el plástico y separar el 50% de las muestras
6. A partir de este momento regar un grupo de plántulas con solución hidropónica
(Muestras control) y otro grupo con solución hidropónica salina 125mM
(Tratamiento)
7. Mantener estos cultivos como mínimo por cuatro semanas previas a la clase

64
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº2: PROCESAMIENTO

1. Retirar por separado las plantas de tomate de ambos cultivos (Tratamiento y

Control).
2. Pesar un gramo de hojas de cada cultivo, lavarlas cuidadosamente y colocarlas
en un mortero.
3. Homogenizar el material en 10mL de buffer fosfato 0.1 M pH 7,0 o en 10mL de
solución salina vegetal hasta conseguir una muestra completamente líquida.
4. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos y almacenar el sobrenadante.

65
A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº3: CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

1. Colocar 100µL de cada sobrenadante en tubos de micro-centrifuga (Tratamiento

y Control).
2. Agregar 700µL de agua destilada a cada tubo y homogenizar.
3. Agregar 100µL de Hidróxido de Bario a cada tubo y homogenizar por 30
segundos.
4. Finalmente agregar 100µL de Sulfato de Zinc, agitar y dejar en reposo por 5
minutos.
5. Centrifugar a 6000rpm durante 10 minutos cada una de las muestras.
6. Tomar 100µL de cada sobrenadante y colocar en tubos de micro-centrífuga.
7. Agregar 1000µL de Reactivo enzimático y mezclar por inversión.
8. En otro tubo de micro-centrífuga, agregar solo 1000µL de Reactivo enzimático,
el cual servirá de blanco para las lecturas en el espectrofotómetro.
9. Reposar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiental.
10. Leer absorbancias a 505nm.
11. Determinar la concentración de Glucosa en función a una curva de calibración
entre 100µg/mL y 500µg/mL de glucosa

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A.Vélez & R. Salas
RESULTADOS

 Realiza la descripción detallada de las actividades realizadas durante la experiencia

práctica

DISCUSIÓN

 Explicar y comparar los resultados obtenidos en clase con otros autores.

RECOMENDACIONES

 Establece recomendaciones que podrían mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué algunas plantas elevan considerablemente la concentración de

monosacáridos y disacáridos dentro de cada célula en respuesta a la salinidad en
el ambiente?
2. ¿Los factores ambientales afectan el metabolismo de los carbohidratos?
Especificar.
3. ¿Cuál es la relación entra las lectinas y los carbohidratos?
4. ¿Por qué son importantes los glucosaminglucanos?
5. Describa cuatro polisacáridos que tengan importancia relevante en los
ecosistemas peruanos.

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A.Vélez & R. Salas
 PRACTICA Nº8
“CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES EN PLANTAS
SOMETIDAS A ESTRÉS ABIÓTICO”

H O COOH

NH2 C C N C H

CH3 H H

OBJETIVOS
 Determinar la concentración de proteínas totales en plantas de tomate
sometidas a estrés salino.

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A.Vélez & R. Salas
 CONCEPTOS PREVIOS

Enlace peptídico:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Aminoácido:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Péptido:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Osmotina:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Proteína:
_______________________________________________________
_____________________________________________________
Proteasas:
_______________________________________________________
______________________________________________________

MATERIAL DE LABORATORIO

 Espectrofotómetro  Tubos de micro-centrifuga 1.5mL

 Micromipeta 10l - 100l (3)
 Micromipeta 100l - 1000l  Mortero (1)
 Centrifuga  Embudo 5cm (1)
 Balanza de precisión  Pizeta con agua destilada
 Muestras: plantas de tomate  NaCl 0,8% (100mL)
sometidas a estrés salino y control  Estándar de Proteínas totales
 Tijera  Reactivo enzimático para Proteínas
 Gradilla (1) totales
 Tubos de centrifuga 15mL (2)

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A.Vélez & R. Salas
INTRODUCCION

Las proteínas son polímeros formados por unión de unidades llamadas aminoácidos. Los
aminoácidos son moléculas simples que poseen un átomo de carbono central alrededor
del cual se asocian un grupo carboxilo, un grupo amino, un átomo de hidrógeno y en el
cuarto enlace, un grupo variable según el tipo de aminoácido. EL carbono central se
denomina carbono α, y los grupos asociados directamente a él, tendrán la misma
denominación. Este carbono es asimétrico, en vista que este carbono posee sus cuatro
enlaces unidos a grupos diferentes. La asimetría del carbono genera isomería óptica,
por lo que los aminoácidos pueden ser de tipo d o l. La isomería óptica es definida
físicamente como la capacidad que tienen las moléculas en solución acuosa de desviar
la luz polarizada hacia la derecha o hacia la izquierda. Esta capacidad está directamente
relacionada con la disposición espacial de los grupos asociados al carbono α. Todos los
sistemas biológicos utilizan l-aminoácidos para la síntesis de proteínas.

Los aminoácidos se unen entre sí a través de un enlace covalente denominado ENLACE

PEPTÍDICO, el cual se genera entre el grupo α-carboxilo del primer aminoácido con el
grupo α-amino del segundo. La cadena de aminoácidos generada se denomina PÉPTIDO,
si la cadena posee hasta cien aminoácidos. Cuando la cadena es mayor que cien
unidades, el nombre cambia a PROTEÍNA.

Entre los aminoácidos, existen algunos que poseen en su región variable grupos amino
o carboxilo adicionales, los cuales les confieren cargas positivas o negativas, según el
caso. Estas cargas permiten que la cadena de aminoácidos se pliegue al generar enlaces
o atracciones entre sí. Este tipo de atracciones generarán diferentes niveles
estructurales en las proteínas. La ESTRUCTURA PRIMARIA está constituida por la
secuencia lineal de aminoácidos, la cual está determinada según la información
contenida en el gen respectivo. Cuando ocurre la síntesis de proteínas en los ribosomas,
la cadena de aminoácidos va creciendo y va generando plegamientos característicos
debido a las interacciones entre ciertos grupos laterales de aminoácidos, que generan
principalmente enlaces de hidrógeno, los cuales definen formas características de la

70
A.Vélez & R. Salas
ESTRUCTURA SECUNDARIA, como el α-HELICE y la HOJA PLEGADA. En la primera, los
aminoácidos van girando hacia la derecha sobre un eje en forma de tirabuzón, mientras
que, en la segunda, los aminoácidos forman una cadena quebrada en forma de zig-zag,
asociándose por enlaces de hidrógeno con otra cadena de similares características,
generando un plano similar al de una hoja de papel plegada en forma de abanico. La
ESTRUCTURA TERCIARIA está formada por un mayor plegamiento de estas estructuras
secundarias, principalmente debido a fuerzas hidrofóbicas (los aminoácidos no polares
se juntan en un centro a fin de estar alejados y sin contacto con el medio acuoso). La
estructura terciaria genera la forma tridimensional final de las proteínas, pudiendo ser
principalmente de tipo GLOBULAR, si la proteína genera una forma esférica, o FIBROSA
si la cadena de aminoácidos mantiene una forma alargada interactuando con otras
cadenas de aminoácidos de similar forma.

Algunas proteínas están compuestas por dos o más subunidades, asociadas por enlaces
covalentes llamados puentes de disulfuro, en los cuales participan los grupos sulfidrilo
de dos cisteínas. Cada una de estas subunidades es una cadena de aminoácidos
independiente, igual o diferente, llamada MONÓMERO. Todas las proteínas tienen
estructura terciaria, pero sólo algunas llegan a tener estructura cuaternaria, cuando
para cumplir su función deben estar conformadas por dos o más monómeros.

Se define al estrés como cualquier alteración de las condiciones ambientales que pueda
reducir o influir de manera adversa en el crecimiento o desarrollo de una planta. Las
respuestas al estrés son típicamente complejas, afectando diversas partes de la planta
e involucrando incluso a hormonas de estrés como el ácido abscísico y etileno. Existen
diferentes factores que pueden ser considerados como estresantes; entre ellos
podemos mencionar como los más importantes, al estrés ambiental y al estrés por
minerales.

Un de las estrategias de algunas plantas en respuesta al estrés hídrico o salino en el

medio externo, es la movilización de carbohidratos a las vacuolas con la finalidad de
reducir el área de interacción de los solutos, y evitar la pérdida excesiva de agua, sin
embargo, cada uno de los solutos requiere de transportadores muchas veces específicos

71
A.Vélez & R. Salas
y estructuras que le permitan realizar este cambio fisiológico y bioquímico. Las
moléculas encargadas de este cometido son las proteínas totales del medio celular, las
cuales van aumentar sus concentraciones en relación directa con el nivel de estrés que
se encuentre sometida cada planta en particular.

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A.Vélez & R. Salas
PROCEDIMIENTO

EXPERIENCIA Nº1: MUESTRAS

1. Lavar arena fina repetidas veces, hasta no observar burbujas.

2. Desinfectar la arena con lejía al 10%.
3. Colocar la arena limpia sobre una almaciguera y agregar 20 semillas de tomate
por cada grupo, cuidando que el sustrato siempre se mantenga húmedo.
4. Cubrir las bandejas con un plástico negro hasta que al menos hayan emergido el
30% de las plántulas.
5. Retirar el plástico y separar el 50% de las muestras.
6. A partir de este momento regar un grupo de plántulas con solución hidropónica
(Muestras control) y otro grupo con solución hidropónica salina 100mM
(Tratamiento)
7. Mantener estos cultivos como mínimo por cuatro semanas previas a la clase.

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A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº2: PROCESAMIENTO

1. Retirar por separado una planta de tomate de cada cultivo (Control y

Tratamiento), teniendo cuidado de no romper las raíces.
2. Lavarlas cuidadosamente y colocarlas en un mortero.
3. Homogenizar con 10mL de agua o solución salina hasta conseguir una muestra
completamente líquida.
4. Centrifugar a 5000 rpm por 10 minutos y almacenar el sobrenadante
(Homogenizado).

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A.Vélez & R. Salas
 EXPERIENCIA Nº3: CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

1. Tomar 100µL de cada sobrenadante y colocar en tubos de micro-centrífuga.

2. Agregar 1000µL de Reactivo enzimático y mezclar por inversión.
3. En otro tubo de micro-centrífuga, agregar solo 1000µL de Reactivo enzimático,
el cual servirá de blanco para las lecturas en el espectrofotómetro.
4. Reposar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiental.
5. Leer absorbancias a 505nm.
6. Con el uso de una curva de calibración calcular la concentración de proteínas
expresadas en µg de proteína/g de peso húmedo, para lo cual preparar una
batería de tubos con estándares entre 1000 y 3000µg de proteínas totales.

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A.Vélez & R. Salas
RESULTADOS

 Realiza la descripción detallada de las actividades realizadas durante la experiencia

práctica

DISCUSIÓN

 Explicar y comparar los resultados obtenidos en clase con otros autores.

RECOMENDACIONES

 Establece recomendaciones que podrían mejorar los futuros trabajos.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué se elevan considerablemente las concentraciones de proteínas

cunado las plantas se encuentran en estrés por salinidad?
2. ¿Cuál es la importancia fundamental de las proteínas en el ambiente?
Ejemplos.
3. ¿Cómo se sintetizan los aminoácidos en las plantas?

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A.Vélez & R. Salas