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Introdiuccion
Los neutrófilos juegan un papel importante en la defensa del organismo de las infecciones, una
persona con un nivel bajo de estas células en sangre (neutropenia) tiene un riesgo elevado de
desarrollar una infección.
Proceso de producción
Recuperar y lavar
Cosechar y lisar las
Fermentacion los cuerpos de
células producidas
(biorreactor) inclusión:
(disruptor celular)
(centrifugacion)
Pegilación del
purificacion
rHuG-CSF
(cromatografia)
(biorreactor)
Biorreactor
las células, llamadas también biomasa, consumen nutrientes para crecer, así como para producir
más células y el producto de interés, en este caso rHuG-CSF. En el caso de producción de rHuG-CSF
las células producidas permanecen dentro de la célula, formando agregados proteínicos que se
conocen como cuerpos de inclusión La producción del producto de interés no empieza hasta que las
células alcanzan la etapa estacionaria.
En un proceso industrial interesa conseguir la máxima producción del producto deseado, de rHuG-
CSF en este caso, por litro de medio fresco alimentado al biorreactor. En la siguiente tabla se reporta
el estudio realizado donde se obtuvo una concentración máxima de 1100 mg/l de rHuG-CSF con el
medio M9 modificado.
En la tabla siguiente se muestra la composición del medio de cultivo utilizado para la producción
industrial de rHuG-CSF que se reporta en la bibliografía y que ya ha sido optimizado para obtener la
máxima producción por litro de cultivo.
Condición Unidad
pH 7
Temperatura 37°C
O.D. 25 %
Agitación 400 Rpm
Medio selectivo Ampicilina mg/L
Tabla 6. Condiciones de operación
En biorreactor después de ser inoculado se hacen crecer las células 18 horas hasta alcanzar el
principio de la fase estacionaria de crecimiento de las células. Una vez inducido el cultivo, se deja
fermentar por 68 horas más aproximadamente, durante este tiempo las células no crecerán más
porque su metabolismo estará encargándose de expresar la proteína de interés.
La utilización de E. coli como medio de expresión para la producción de rHuG-CSF es el medio más
utilizado debido al bajo coste de producción y alto rendimiento que se obtiene. Sin embargo la
proteína producida no es excretada al medio de expresión, permanece en el citoplasma de la célula
formando conglomerados de agregados de proteínas insolubles conocidos como cuerpos inclusión
(IB). Por eso la purificación de rHuG-CSF de divide en dos grandes bloques. Obtención de la proteína
de los cuerpos de inclusión y purificación de la proteína.
Los pasos a seguir para solubilización del rHuG-CSF de los cuerpos de inclusión son los siguientes:
Cosechar y lisar las células producidas: Se debe separar la biomasa celular y compuestos
insolubles del caldo de fermentación. Para ello se lleva a cabo una centrifugación de alta
velocidad. La centrifugación es una operación en la que se separan sustancias por medio de
la fuerza centrífuga.
Recuperar y lavar los cuerpos de inclusión: La lisis celular libera los cuerpos de inclusión, y
estos se deben recuperar por centrifugación. Las impurezas interfieren en la
renaturalización del G-CSF y afectan negativamente en el rendimiento del proceso y la
pureza del proceso. Las impurezas se eliminan mediante un seguido de lavados de
detergentes iónicos y no iónicos que eliminan un gran porcentaje de ellas, pero no eliminan
los restos de DNA de la célula (que deben ser eliminados en etapas posteriores).
Solubilizar el rHuG-CSF de los cuerpos de inclusión: Se deben solubilizar los IB para
recuperar el rHuG-CSF. Se trabaja en condiciones suaves para no alterar la estructura
original de la proteína y aumentar al máximo su recuperación.
Renaturalizar la proteína recombinante: El rHuG-CSF recuperado debe ser renaturalizado
y este es un paso esencial para alcanzar su actividad biológica. El rHuG-CSF requiere un
procedimiento de plegamiento oxidativo para recuperar su actividad biológica.
Una vez purificado el rHuG-CSF se debe pegilar para obtener PEGFilgrastim. La pegilación es la unión
covalente entre una o más moléculas de PEG (polietilenglicol) con una proteína. El PEG es un
polímero neutro soluble en agua, así como también en muchos disolventes orgánicos (cloruro de
metileno, etanol, acetona, cloroformo), presentando un nivel de hidratación más elevado cuando
se encuentra disuelto en agua.
Purificación PEGFilgrastim
La purificación de proteínas pegiladas envuelve la remoción de todas las especies moleculares que
no sean parte del producto de interés, que pueden incluir a la proteína no modificada y a la proteína
con diferentes grados de pegilación (mono-, di-, tri-, etc.). Actualmente los procesos de purificación
de proteínas pegiladas están dominados por la cromatografía de exclusión molecular e intercambio
iónico.
Potencial activo
Mecanismo de acción. El factor humano estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) es una
glucoproteína que regula la producción y liberación de neutrófilos desde la médula ósea.
Pegfilgrastim es un conjugado covalente del G-CSF humano recombinante (r-metHuG-CSF) con una
molécula de polietilenglicol (PEG) de 20 kd. Pegfilgrastim es una forma de duración sostenida de
filgrastim como consecuencia de un menor aclaramiento renal. Pegfilgrastim y filgrastim presentan
el mismo mecanismo de acción, se unen a los receptores específicos para el G-CSF humano
presentes en los neutrófilos y precursores de neutrófilos de la médula ósea y sangre periférica
estimulando su proliferación y diferenciación causando un aumento marcado de los neutrófilos en
la sangre periférica en 24 horas, con elevaciones mínimas de los monocitos y/o linfocitos
. Conclusiones
Referencias
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http://gruposdetrabajo.sefh.es/genesis/genesis/Documents/Pegfilgrastim_HCAB_1108.pdf
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http://scielo.sld.cu/pdf/vac/v22n2/vac06213.pdf