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4.2.

7 Adicionar 500 µL de lisozima (20 mg mL-1 preparada en TE 1X) y llevar los tubos a
incubación en baño termostatado por 1 hora a 37 °C.
La lisozima: sirve para hacer lisis (proceso de ruptura de la membrana celular de células o bacterias
que produce la salida del material intracelular,)
Se incuba para: básicamente el proceso de incubación se realiza para que ella puede cumplir su
función la cual consiste en romper la membrana plasmática
4.2.9 Agregar 6,25 µL de proteinasa K (20 mg mL-1 ), agitar suavemente y llevar a incubación
en baño termostatado por 1 hora a 37°C.
Esta enzima muestra amplia especificidad de corte en proteínas nativas y desnaturalizadas y es
ampliamente empleada en purificación de RNA y DNA nativos de tejidos o líneas celulares.
Función proteínasa k en la práctica: Tiene dos funciones facilitar la lisis y además es para
degradar todas las proteínas, las que puedan degradar el DNA y las que no, de esta forma
"limpias" la solución (las proteinas quedan reducidas a peptidos pequeños)
SIRVE PARA: Obtener una muestra mucho más pura. Ya que la proteína K tiene la función
de degradar las proteínas y/o enzimas que potencialmente pueden degradar al ADN
4.2.10 Retirar los tubos del baño termostatado y mantener sobre hielo
Debido a que el periodo de incubación es de 1 hora, si se prolonga más, puedo llegar a deteriorar el
ADN, por eso uso Hielo, para frenar el proceso de las enzimas o detener la reacción enzimática o no
enzimática.
4.2.11 Adicionar 300 µL de NaCl 5 M, 188 µL de CTAB 10% y aplicar vortex fuerte por 30s
Este procedimiento se realiza para purificar mi muestra de ADN
4.2.12 Incubar por 20 minutos en baño termostatado a 65°C.
El baño termostatado se utiliza habitualmente para atemperar los medios de cultivos,

4.2.13 Retirar los tubos del baño termostatado y mantener sobre hielo.
El proceso se torna repetitivo, nuevamente se busca frenar el proceso de las enzimas o detener la
reacción enzimática o no enzimática.
4.2.14 Agregar igual volumen de cloroformo - alcohol isoamílico (24:1), agitar vigorosamente
por30s
Esta solución ya se había preparado. El cloroformo - alcohol isoamílico permite purificar mi
muestra de adn, su agitación debe ser fuerte por lo tanto se realiza en el vortex
4.2.15 Centrifugar a 8000 rpm por 20 minutos.
Este proceso se realiza para acelerar la decantación o la sedimentación de sus componentes o fases
(generalmente una sólida y una líquida.
4.2.16 Transferir la capa superior a otro tubo falcón de 15 mL.
En esta sección, se me forman tres capaz. Debo transferir la parte superior de mi muestra la cual es
de nuestro interés ya que el ADN va estar solubilizado en la parte de arriba. Debo realizar la
transferencia con mucho cuidado y evitar contacto con las demás porque puede contaminarse.
4.2.17 Agregar 3 µL de RNAsa (10 mg mL-1) e incubar por 1 hora a 37°C en baño
termostatado. Adicionar igual volumen de cloroformo, agitar vigorosamente por 30s y
centrifugar a 8000 rpm por 20 minutos.
RNAsa: Es una enzima y su función básicamente consiste en degradar el ARN. En este proceso
pueden haber quedado restos de ARN, los cuales debo eliminar ya que nuestro principal objetivo
es la obtención de ADN, es por eso que cualquier sustancia diferente al ADN debe ser eliminada.
Cloroformo: permite la separación de 2 fases, el ADN queda en la fase acuosa y en la fase orgánica
quedan las proteínas y otros contaminantes
4.2.18 Transferir la capa superior a otro tubo falcón de 15 mL.
Nuevamente se transferimos la capa superior, donde va estar solubilizada mi muestra de ADN
4.2.19 Precipitar el ADN con 0,6 volúmenes de isopropanol frío*. Agitar suavemente.

El isopropanol precipita el DNA porque compite con este por el agua, deshidratándolo y llevándolo
al fondo del tubo. Para precipitar DNA a partir de pequeños volúmenes de muestra, se recomienda
hacer la extracción en frío para poder recuperar la mayor cantidad de DNA posible

El DNA es menos soluble en isopropanol, por lo que al usar este solvente precipitará antes y a una
menor concentración, aunque con el inconveniente de que las sales también precipitarán al mismo
tiempo.

4.2.20 Centrifugar a 10000 rpm por 20 minutos.


Se repite el proceso y se busca obtener una fase solida de una liquida
4.2.21 Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet obtenido con 200 µL de etanol.
El lavado con etanol también sirve para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular tales
como sales y detergentes.
El etanol, limpia el ADN de otras biomoléculas por un proceso llamado "precipitación". EN este
proceso, el etanol hace que el ADN se deshidrate, es decir, pierda contacto con las moléculas de
agua que lo rodean, y lo aisla de la solución acuosa para dejarlo libre de impurezas.
4.2.22 Centrifugar nuevamente a 10000 rpm por 5 minutos.
Lo mismo
4.2.23 Eliminar el sobrenadante y secar a temperatura ambiente por 6 horas.
4.2.24 Resuspender el ADN obtenido en 250 µL de TE 1 M.
De no observarse nuestra muestra de ADN es necesario dejar los tubos a -20°C por 12 a 18 horas y
continuar con el procedimiento