CENTRIFUGACIÓN

ASPECTOS TEÓRICOS

Técnica que permite la separación de moléculas por su tamaño

molecular.

Cuando un conjunto de moléculas en suspensión se someten a

un campo gravitatorio suficientemente elevado puede
conseguirse que tales moléculas sedimenten

La velocidad a la que sedimenta una partícula depende:

 Naturaleza de la partícula (tamaño, forma y densidad)
 Naturaleza del medio (viscosidad y densidad)
 Fuerza que se aplica a la partícula

Las partículas más grandes sedimentan más rápidamente

 Sir Gabriel Stokes (1856): La fuerza friccional (F) que actúa sobre
una partícula esférica y rígida de radio rP, que está sedimentando a una
velocidad dr/dt en un medio cuya viscosidad es η, viene dada por la
expresión:

F = 6 π η rP (dr/dt) fuerza en sentido contrario al

movimiento
La partícula se encuentra sometida a otras fuerzas:

Fuerza gravitacional que hace que la partícula sedimente: m x g=

ρP x V x g

Efectos de flotación, Principio de Arquímides: fuerza ascendente

igual al peso del volumen de fluido desplazado por dicho cuerpo: ρm x
Teniendo
Vxg en cuenta ambas fuerzas la ecuación anterior puede
escribirse:
(ρP - ρm) V g = 6 π η rP (dr/dt) ; V = 4 π rP3 /3 (partícula esférica)

2 rP2 g (ρP - ρm) /9 = η (dr/dt)

dr 2 ⋅ rP2 ⋅ g ⋅ (ρ P − ρ m )
Velocidad de sedimentación de una partícula: =
dt 9 ⋅η
El campo centrífugo G viene determinado por la velocidad angular de
giro ω y por el radio de giro (distancia de las partículas al eje de
rotación)
G = ω2 x r

Se suele expresar como múltiplo del campo gravitatorio terrestre:

Campo centrífugo relativo (RCF) y se expresa en unidades conocidas
como “g”
ω2 ⋅ r g=980 cm s-2
RCF = (g )
g
Un campo centrífugo de 100.000 g hace
2π (rpm ) referencia a un campo 100.000 veces
ϖ = (rad / s ) superior al gravitatorio terrestre
60

4π 2 ( rpm )2
×r
RCF = 3600 = 1.119 × 10 − 5 × (rpm )2 × r
980
cidad de sedimentación de una partícula sometida a un campo centrífug

dr 2 ⋅ rP2 ⋅ ω 2 ⋅ r ⋅ (ρ P − ρ m ) Para partículas no esféricas se incluye en

=
dt 9 ⋅ η ⋅ (f/fo ) el denominador la relación entre
coeficiente friccional de la molécula y el de
una esfera con el mismo radio efectivo
(f/f0)

COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN (S): velocidad a la que

sedimentaría una partícula en un campo centrífugo unitario

dr / dt
S= La unidad es el Svedberg = 10-13 s
ϖ 2 ⋅r
 COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN (S)

l valor de S para una partícula o biomolécula depende de varios factores como:

 Características de la macromolécula
 Condiciones experimentales en las que se realizó la medida
 Las propiedades del medio en el que se produce la sedimentación de la partícu

La relación entre el coeficiente de sedimentación y la masa molecular

de una partícula no es lineal, sino que depende de las propias
partículas.
Macromolécula Relación Rango de
Mr
Proteínas S= 0.00242 x M0.67 104-107
RNA S= 2.61 + 0.022 x M0.43
DNA lineal S= 2.8 + 0.0083 x M0.479 106-108
DNA circular S= 2.7 + 0.01759 x M0.445 106-107
DNA S= 7.44 + 0.0024 x M0.58 106-107
superenrollado
DNA sencillo S= 0.0105 x M0.549 106-108
Cromatina S= 0.011 x M0.554
Estandarización del medio para comparar el comportamiento
de las partículas: agua a 20ºC (S20,w).

Muchas biomoléculas no son solubles o estables en el medio

estándar
Coeficiente de sedimentación en el medio y temperatura más
adecuados (St,m)

ηt,m (ρ P + ρ 20,w ) 1 dr ηt,m (ρ P + ρ 20,w )

S 20, w = S t,m = 2 ⋅ ⋅
η20, w (ρ P + ρ t,m ) ω ⋅ r dt η20, w (ρ P + ρ t,m )
INSTRUMENTACIÓN
TIPOS DE CENTRÍFUGAS

Se pueden diferenciar en:

 la velocidad máxima que alcanzan

 la presencia o ausencia de vacío
 posibilidad de controlar la temperatura
 el volumen máximo de muestra

Centrifugas disponibles en el mercado:

 Centrífugas preparativas de gran capacidad y baja velocidad
 Centrífugas preparativas refrigeradas de alta velocidad
 Ultracentrífugas analíticas
 Ultracentrífugas preparativas
 Centrífugas clínicas de escala grande
 Microcentrífugas de laboratorio de pequeña escala

Ultracentrífugas: Deben de incorporar un sistema de vacio. El rotor ha de

girar en una cámara que opere a una presión reducida para facilitar la
función del rotor y disminuir el calentamiento que se produciría por una
rotación a presión atmosférica. La temperatura también debe estar
TIPOS DE ROTORES

Material
 Ultracentrifugación : aleaciones de titanio
 Campos centrífugos menores: aleaciones de aluminio, fibra reforzada,
acero

Rotores flotantes (basculantes): Al actuar el campo centrífugo las

carcasas dónde se introducen los tubos se orientan a favor del campo
pasando a estar colocadas perpendicularmente respecto a la posición de
reposo.

Rotores angulares : Forman un cierto ángulo con la vertical

Rotores verticales: Los tubos se encuentran dispuestos en posición

vertical.
Para un cierto tamaño de rotor en los verticales el campo centrifugo sería
mayor. Separaciones más rápidas ya que la distancia que recorre la
muestra es el diámetro del tubo.
Si el material sedimentado sobre la pared del tubo no esta muy compacto
puede desprenderse
Rotores “casi verticales”
Rotores flotantes (basculantes)
El campo centrífugo que
actúa no es uniforme ya
que la distancia al eje de
giro no es la misma desde
el fondo del tubo que
desde su parte superior. Se
considera referido a la
distancia promedio

No permiten cantidades
grandes de muestra (hasta
aprox. 200 ml)
Rotores angulares
El campo centrífugo no es
tampoco uniforme
Admiten un gran volumen de
muestra (según modelo hasta >5
l)
Rotores verticales
El campo centrífugo es más
uniforme
Al igual que los angulares permiten
mayor volumen de muestra que los
flotantes
Factor k de un rotor

Indica la capacidad centrifugadora de un rotor. Se define como:

rmax
2.53 × 1011 × ln( )
rmin
k max = A menor valor de k, mayor capacidad
( rpmmax )2

Se suele dar para la velocidad máxima de un rotor. Para

cualquier otra velocidad se puede calcular como:
rpmmax 2
k = kmax ( )
rpm

Si se conoce el coeficiente de sedimentación de una partícula, se

puede calcular el tiempo en horas necesario para precipitarla

k max
t=
S
Selección de tubos de centrífugas adecuados:

•Evita pérdidas o filtraciones de la muestra

•Garantiza compatibilidad química
•Permite una fácil recuperación de muestras

Factor de importancia en la selección del material de un tubo (plástico):

•Claridad
•Resistencia química
•Mecanismo de sellado (de ser necesario)
TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN
En función del volumen de muestra:
Analítica
Preparativa

MODOS DE CENTRIFUGACIÓN PREPARATIVA:

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
Sedimentan primero las partículas más grandes, las más
densas o las más esféricas (a igualdad de masa y dr 2 ⋅ r 2 ⋅ ω 2 ⋅ r ⋅ (ρ − ρ )
densidad) = P P m

dt 9 ⋅ η ⋅ (f/fo )
Las diferentes partículas de un homogenado pueden separarse por
centrifugación, precipitándolas mediante etapas sucesivas por incremento
de la fuerza ejercida o del tiempo de centrifugación.
No es un proceso demasiado resolutivo
CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

(lavado)
CENTRIFUGACIÓN ZONAL

Separa las partículas en función de su coeficiente de sedimentación

Se emplean tubos de centrífuga en los cuales se ha formado un
gradiente
 La muestra se aplica en una banda discreta encima del gradiente
Volúmenes de muestra más pequeños que en la centrifugación
diferencial
 la muestra (particulas + disolvente) ha de tener una densidad
menor a la del límite inferior del gradiente
La densidad de las partículas utilizadas no debe ser menor a la de
los gradientes
El tiempo es esencial. Si las centrifugaciones son muy largas las
partículas pueden precipitar en el fondo del tubo
El proceso muestra una buena resolución
 No es aplicable en estadíos iniciales cuando el homogenado
contiene demasiados componentes
 Es ideal para separar partículas que posean un tamaño definido
CENTRIFUGACIÓN ZONAL
CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICA

 La separación se realiza tan solo en base a la densidad de las

partículas.
 La densidad de las partículas utilizadas debe estar dentro de los
límites de las densidades de los gradientes.
Se parte de un sistema homogéneo en el que las partículas se
encuentran suspendidas en disoluciones autoformadoras de
gradientes (CsCl, Cs2SO4, KBr, KI, NaBr, NaI, RbBr, RbCl,
tricloroacetato de Rb o Cs).
 Al aplicar la fuerza centrífuga se genera el gradiente y las
partículas se mueven en función de sus diferencias de densidad con
el medio que las rodea hasta alcanzar un punto en el cual (ρP- ρm) =0.
Una vez que se alcanza este cuasi equilibrio, el tiempo de la
centrifugación ya no influye en la migración de partículas
 El proceso muestra muy buena resolución
 Limitación: efecto de las sales en la viabilidad de las partículas o
sobre la estructura nativa de las biomoléculas
CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICA
Preparación de gradientes

discontinuos
Gradientes lineal
continuos cóncavo
convexo

Gradientes discontinuos: se deposita en un tubo de

centrífuga cuidadosamente y de forma secuencial disoluciones
de densidades decrecientes

Gradientes continuos: se emplea un equipamiento sencillo,

mediante un gradientador o un formador de gradientes
exponencial
Gradientador: Dos recipientes comunicados entre si (vasos comunicantes)

Secciones iguales B>A B<A

lineal cóncavo convexo
APLICACIONES
APLICACIONES
APLICACIONES
Determinación del coeficiente de sedimentación de proteínas

Mediante centrifugación zonal en gradientes de densidad en

condiciones en las que la velocidad de sedimentación es constante a lo
largo del gradiente y proporcional al coeficiente de sedimentación
Gradientes isocinéticos: el mayor campo centrífugo que actúa sobre
una molécula según se va alejando del eje de giro queda compensado
por la mayor resistencia que ofrece el medio al avance
 APLICACIONES
entrifugación isopícnica de muestras de DNA

El DNA circular superenrollado

une menos EtBr.
Cuanto mayor es la cantidad de
EtBr unido la densidad es menor
(la estructura resultante es
menos compacta)
 ULTRACENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA
Determinación de parámetros moleculares
Juzgar el grado de pureza

Precisa de sistemas de observación: se observa lo que ocurre en la

muestra durante la aplicación del campo

Recipiente de muestra: células de centrifugación: cilindros en los que hay

una perforación cuya sección transversal tiene forma de sector circular, dos
laminas de cuarzo adosadas a las bases del cilindro definen la cavidad de la
muestra. La forma del este alojamiento evita que haya sedimentación en las
paredes
ULTRACENTRIFUGACIÓN
ANALÍTICA

The instrument spins the

protein sample under vacuum
at a controlled speed and
temperature while at set times
recording the concentration
distribution. Depending on the
rotor the speed may be as high
as 60,000 rpm (which is
equivalent to 250,000 x g). For
the measurements special cells
are used to withstand the high
gravitational field and which
allow the passage of light
through the sample
 Inicialmente: célula ocupada por la disolución de soluto
Al producirse la sedimentación: surge una discontinuidad en el medio
líquido, habrá una zona en la que sólo haya disolvente y otra en la que
haya disolución. Asimismo habrá soluto que haya sedimentado en el
fondo del tubo.
El sistema óptico de absorción muestra un aumento de absorbancia al
pasar de la zona en la que sólo hay disolvente a aquella en la que hay
disolución

Tomando medidas a diferentes tiempos de

centrifugación se puede determinar la
velocidad de desplazamiento del soluto

El coeficiente de sedimentación viene definido por: dr

S= dt = d ln r 1
ϖ 2r dt ϖ 2
n la representación de lnr vs t la pendiente de la recta es el valor de S
 ULTRACENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA

Experimentos de sedimentación de equilibrio: la velocidad de

centrifugación es menor a la requerida para los experimentos de
velocidad de sedimentación. A medida que el soluto comienza a
sedimentar hacia el fondo de la célula y la concentración en el fondo
aumenta, la difusión se opone al proceso de sedimentación: Después
de un cierto tiempo se alcanza el equilibrio. Se mide la distribución de
concentraciones de soluto en la célula en el equilibrio. Permite
conocer la masa molecular del soluto analizado

Fig. 5. Simulated sedimentation equilibrium

Se cumple que: data for 2 species c1 (40 kD) and c2 (80 kD) at
ln c(r)/c(r0) = M (1-νρ)ω 2(r2-r0)/2RT an angular velocity of 15,000 rpm. The
distrubution of total solute concentration in the
c(r): concentración a la distancia r cell is also shown (c3).
c(r0): concentración de proteína en la interfase
ν: volumen específico parcial