Sei sulla pagina 1di 15

Lezione 11 | Immunologia | 04/04/2017

Docente: Sox
Revisione: Dov

Argomenti: Complesso TCR e trasduzione del segnale, cinetica dell'espressione genica, IL-2 e suo recettore,
proteine costimolatorie, sinapsi immunologiche, citochine e differenziamento dei Th, risposte Th1 e Th2.

Nella lezione precedente sono stati considerati i seguenti argomenti: la maturazione delle cellule dendritiche
e il corredo di recettori che esprimono; la struttura di un linfonodo (con particolare attenzione alle HEV e al
loro significato funzionale) e la segregazione dei linfociti T e B al suo interno; il reclutamento leucocitario; gli
organi linfoidi secondari; la maturazione dei linfociti T naive in T effettori e in cellule della memoria
(quest’ultima distinta in centrale e periferica); il ruolo della sfingosina 1-fosfato nel determinare la
fuoriuscita dei linfociti T dal linfonodo; l’espressione delle addressine da parte dei linfociti T attivati e la
trasmigrazione degli stessi nei tessuti in cui è richiesta la loro azione.

TRASDUZIONE DEL SEGNALE DA PARTE DEL COMPLESSO RECETTORIALE DEI LINFOCITI T

[ndr: il docente si dilunga in un ripasso della lezione precedente]


Come già visto nelle precedenti lezioni, i linfociti T (a seconda del loro grado di attivazione e di
specializzazione) vanno a distribuirsi in diversi distretti anatomici. La selettività della distribuzione dei
linfociti è determinata da due classi di molecole:
- le molecole di adesione
- i fattori chemiotattici.
Solo il linfocita che presenta la doppia combinazione della giusta molecola di adesione e del giusto recettore
chemiotattico potrà fuoriuscire dal torrente ematico ed entrare in un tessuto.
Dopo aver terminato la maturazione timica, i linfociti T naive fuoriescono dal timo ed entrano in modo
selettivo nel linfonodo tramite le HEV (High Endotelial Veins/Venule ad endotelio alto), che costituiscono
una sorta di barriera. I linfociti T naive, infatti, hanno una specificità vantaggiosa per l'ospite e sono alla
continua ricerca dell'incontro con l'antigene, che risulta essere la dimostrazione della loro utilità.
Il passaggio del linfocita T vergine attraverso l'endotelio delle HEV e l'ingresso dello stesso nel linfonodo
sono resi possibili poiché il linfocita T naive esprime delle specifiche molecole, definite addressine
linfonodali o molecole di accasamento (homing) linfonodale. Queste sono:
- la L-selectina, una molecola di adesione che riconosce due controrecettori sulla superficie
dell’endotelio delle venule alte:
o GlyCAM-1
o CD34;
- CCR7, un recettore chemiotattico il quale riconosce sulla superficie dell’endotelio i ligandi:
o MIP-3β (o CCL19)
o SLC (o CCL21).
A differenza dei T naive, i neutrofili, i monociti e i linfociti T effettori non riescono a fuoriuscire dal torrente
ematico tramite le HEV dal momento che sono prive delle addressine linfonodali.

L’interazione fra linfocita T ed endotelio alto delle venule è un evento indispensabile perché avvenga il
processo di extravasazione il quale si svolge in 3 fasi principali:
- il rotolamento
- l’interazione con il fattore chemiotattico
- l’adesione ferma.
Ciascuna fase dipende da specifiche proteine.
L’interazione tra linfocita T naive e APC (Antigen-Presenting Cell) avviene nelle regioni paracorticali a livello
del linfonodo [ndr: nella struttura interna del linfonodo si distinguono i follicoli, la corteccia midollare e le
regioni paracorticali].

1 / 15
Le High Endothelial Venules sono localizzate
prevalentemente nell'area paracorticale; i
linfociti T naive (che arrivano mediante il
torrente circolatorio) e le cellule dendritiche
(che arrivano tramite il vaso linfatico
afferente) co-localizzano nelle aree
paracorticali del linfonodo perché,
esprimendo lo stesso recettore
chemiotattico (CCR7), rispondono alle
medesime chemochine CCL19 e CCL21,
prodotte in quest'area linfonodale (Se tali
chemochine fossero prodotte in un’altra area
del linfonodo, i linfociti T e le cellule
dendritiche co-localizzerebbero in quell’altra
area).
Una volta effettuato l'ingresso nel linfonodo,
quindi, i linfociti T naive e le APC migrano seguendo gli stimoli chemiotattici.
Nell'area paracorticale ha inizio il processo di interazione fra le due cellule: il linfocita T sonda sulla
superficie dell’APC la presenza dell’antigene per cui è specifico.

Affinché abbia inizio l'interazione fra linfocita T e APC:


1) deve avvenire il riconoscimento specifico dell'antigene da parte del TCR, ma ciò da solo non è
sufficiente;
2) devono entrare in gioco altre molecole, tra cui le molecole co-stimolatorie e le molecole di
adesione.
L'interazione tra linfocita T e APC è finemente regolata e dipende dal tipo di linfocita T coinvolto.

MOLECOLE CO-STIMOLATORIE: il riconoscimento dell'antigene da parte del TCR deve essere associato
(affinché il linfocita T si attivi) all'azione di CD4 e CD8 [ndr: “tali proteine, espresse dai linfociti T, operano in
sinergia con il TCR nel riconoscimento delle molecole MHC e nell'attivazione dei linfociti, e sono per questo
definite corecettori” tratto dall'Abbas]:
 il linfocita CD8 riconosce esclusivamente i peptidi presentati da molecole MHC di classe I,
 il linfocita CD4 riconosce dei peptidi presentati da molecole MHC di classe II.
Il motivo alla base di tale specificità, per cui un linfocita CD4 riconosce soltanto complessi MHC di classe II e
non di classe I, è il seguente: l'MHC di classe I in una regione non polimorfa viene riconosciuto dal CD8,
mentre l’MHC di classe II in una regione non polimorfa viene riconosciuto dal CD4. Un linfocita T può
esprimere o CD4 o CD8 oppure nessuna delle due molecole, ma mai entrambe. Invece, le APC esprimono sia
molecole MHC di classe II che molecole MHC di classe I.

MOLECOLE DI ADESIONE: LFA-1 è una β-integrina espressa sui linfociti, ed è un recettore che riconosce il
ligando ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1). ICAM-1 è una molecola di adesione espressa dall'APC;
la funzione della molecola di adesione è quella di stabilizzare il legame, di “appiccicare” due cellule in modo

2 / 15
da rendere possibile la comunicazione fra di loro.

Nell'immagine seguente è rappresentata la fase iniziale dell'interazione fra un linfocita T e una APC:
 l’APC esprime il complesso MHC di classe I/II (su cui è assemblato il frammento peptidico) e ICAM-1
 il linfocita T esprime il TCR, l'integrina LFA-1 e, essendo un linfocita T helper, il CD4.

L'interazione della molecola di adesione con il rispettivo recettore non è sufficiente da sola ai fini
dell'attivazione, ma risulta indispensabile. Le integrine sono espresse in modo costitutivo su un leucocita in
una conformazione a bassa affinità; in condizioni omeostatiche anche ICAM-1 è espresso a livelli basali dalla
cellula dendritica che si è attivata. È proprio questa condizione di bassa interazione (in cui LFA-1 a bassa
affinità interagisce con i ridotti livelli di ICAM-1 presenti sull'APC) a indurre il primo contatto fra linfocita T e
cellula dendritica. Questa prima adesione non è particolarmente efficace, ma permette al recettore TCR di
verificare la presenza o meno del peptide specifico sul complesso MHC.

Se ha luogo il riconoscimento specifico del complesso MHC/peptide, allora il TCR invia dei segnali
biochimici di attivazione all'interno della cellula, determinando:
1) l'attivazione dello stato di alta affinità del linfocita. Infatti il TCR, agendo in modo simile a quanto
abbiamo visto fare dai recettori chemiotattici, induce l'attivazione dello stato di alta affinità delle
integrine β2 facendo sì che l’adesione diventi ferma;
2) la clusterizzazione delle catene del complesso TCR e la trasduzione del segnale attivatorio del TCR. Il
riconoscimento dell'antigene da parte del recettore TCR determina la clusterizzazione, ovvero il
raggruppamento delle catene del complesso TCR [ndr: da ricordare che il complesso TCR è costituito
dal TCR, da un insieme di proteine transmembrana definite CD3 e dalle catene ζ (zeta)]. La
clusterizzazione induce l'avvicinamento di Lck alle catene del CD3 e alle catene ζ. Lck (Lymphocyte-
specific protein tyrosine-kinase) è un'isoforma di tirosin-chinasi presente esclusivamente nei
linfociti, ed è costitutivamente associata alla coda citoplasmatica del CD4 o del CD8. In seguito al
riconoscimento dell'antigene e a clusterizzazione, Lck fosforila i domini ITAM presenti sulle code
citoplasmatiche del CD3 e delle catene ζ. I domini ITAM (spesso descritti come dei “salsicciotti” sulle
catene CD3 e ζ del complesso TCR) sono particolarmente ricchi in tirosine, le quali diventano tirosine
fosforilate. Il segnale di attivazione proveniente dal TCR viene così trasdotto ad altre molecole,
innescando una cascata di reazioni.

3 / 15
Le tirosine fosforilate sono riconosciute da domini -SH2, e costituiscono dei punti di legame per proteine che
esprimono tali domini. Una fra le prime proteine ad intervenire è ZAP70, o Zeta chain Associated Protein
kinase 70. Tale chinasi è di 70 kDa, è caratterizzata da due domini -SH2 ed è normalmente presente nel
citoplasma. In presenza di tirosine fosforilate sulle catene ζ, ZAP70 trasloca dal citoplasma alla membrana e
si associa a questi domini. In questa sede ZAP70 viene fosforilata da Lck e va incontro ad attivazione.
ZAP70 attivata comincia a sua volta, essendo dotata di attività tirosin-chinasica, a fosforilare delle molecole
adattatrici:
 LAT e
 Grb-2, che è in complesso con SOS.

Le molecole adattatrici non hanno funzione biologica (non sono enzimi, né


chinasi né fosfatasi); le proteine adattatrici fosforilate rappresentano delle
bitte d'ormeggio, dei dock site per altre proteine che presentano domini -SH2.
Una proteina importante che viene reclutata (per azione delle molecole
adattatrici) dal citoplasma alla membrana è la fosfolipasi C γ-1 (PLC γ-1), ossia
l'isoforma γ-1 della fosfolipasi C. Le fosfolipasi sono degli enzimi che
idrolizzano i fosfolipidi: la fosfolipasi C si differenzia dalla fosfolipasi A2 (PLA2)
e dalla fosfolipasi B in quanto taglia il fosfolipide in posizione C3. PLC γ-1 viene
quindi reclutata e fosforilata; dal momento che la fosforilazione costituisce un
segnale di attivazione, la fosfolipasi comincia a scindere i fosfolipidi di membrana, producendo:

Inositolo Trifosfato (IP3) + Diacilglicerolo (DAG).

L'IP3 promuove la liberazione di ioni Ca2+ da vescicole di deposito nel citoplasma, con conseguente
aumento del calcio citosolico.
Il DAG attiva la proteina chinasi C (PKC), una serina/treonina chinasi Ca2+ dipendente. Sia il calcio che le
chinasi attivano ulteriori reazioni, e la cascata di trasduzione del segnale porta alla trascrizione genica a
valle, cioè all'attivazione dei fattori di trascrizione.
Da quanto detto si comprende ancor di più l'importanza della funzione del TCR: questo singolo recettore è il
responsabile di tutta una serie di vie di attivazione che inducono a valle la trascrizione genica. L'attivazione
del recettore TCR induce in breve tempo una cascata di eventi e di reazioni che a partire da un segnale di
trasmissione porta ad un segnale di amplificazione del messaggio.

4 / 15
La cascata di reazioni è inoltre caratterizzata dalla presenza di punti di controllo: ognuna delle vie sopra
descritte può essere controllata negativamente da altri enzimi o molecole. In particolare, la causa
eziopatologica della formazione tumorale e delle malattie autoimmuni è la mancata regolazione
(disregolazione) dei processi di attivazione di tali vie. L'introduzione di elementi di controllo ha perciò la
finalità di salvaguardare il sistema.

In conclusione, l'attivazione del TCR e la trasduzione del segnale da esso prodotto determinano l'attivazione
di fattori trascrizionali, tra i quali va menzionato per importanza NFAT [ndr: il termine NFAT, acronimo di
Nuclear Factor of Activated T-cells, indica più estesamente una famiglia di fattori di trascrizione cruciali nella
risposta immunitaria]. NFAT promuove la trascrizione del gene IL-2 che è il fattore di crescita dei linfociti T,
cioè il fattore di trascrizione essenziale per l'espansione clonale.

CINETICA DELL'ESPRESSIONE GENICA


Osservando il grafico riferito alla cinetica dell'espressione genica nei linfociti T stimolati dall'antigene, si
nota che i geni, in seguito all'attivazione del TCR, vengono attivati con tempi diversi: alcuni geni sono attivati
precocemente e tra questi ricordiamo il gene c-Fos, che raggiunge il picco di trascrizione a 15 minuti. Altri
geni, invece, vengono attivati in ore o in giorni. Tra i geni indotti in ore vanno menzionati il gene IL-2 e il
gene che codifica per il recettore di IL-2; questi sono cruciali per l'espansione clonale.

La trascrizione di questi geni precede


sia la sintesi di DNA (l'espansione
clonale, appunto) sia la trascrizione di
geni tardivi, come il gene di VLA-4.
VLA-4 (Very Late Antigen -4, anche
noto come integrina α4β1) è una β1
integrina che lega un controrecettore
espresso sulle cellule dell'endotelio
alto: VCAM-1. Il termine “very late
antigen” deriva dal fatto che la
trascrizione del gene è indotta
tardivamente durante l'attivazione del
linfocita T. Infatti, a differenza dei geni
che raggiungono il picco di
trascrizione in minuti o ore, il gene
VLA-4 raggiunge il picco di trascrizione
in settimane. L'espressione del gene
VLA-4 è così tardiva poiché codifica per una molecola di adesione (VLA-4) che è fondamentale
nell'indirizzare il linfocita T attivato ad extravasare e a dirigersi nei tessuti periferici. Da ciò ne consegue che
la trascrizione del gene interessato è necessaria solo quando il linfocita T ha completato il processo di
attivazione ed è pronto a fuoriuscire dal linfonodo; finché il linfocita è nel linfonodo, la trascrizione del gene
VLA-4 non ha utilità.

5 / 15
IL-2 E IL RECETTORE DI IL-2
L'interleuchina 2 è la citochina chiave per l'attivazione del linfocita ed è riconosciuta dal recettore IL-2R
(R sta per receptor). La struttura di IL-2R presenta 3 subunità:
 la catena α,
 la catena β,
 la catena γc o γ comune, in quanto la catena è comune anche ad altri
recettori per citochine.
In condizioni normali, il linfocita T esprime in modo costitutivo la catena β e
la catena γ. Il complesso IL-2R così formato può legare IL-2 ma mostra
un'affinità molto bassa per il ligando, che deve essere molto concentrato per
potersi legare al recettore.
In caso di attivazione del linfocita T la cellula avvia la sintesi della subunità α,
che associandosi alle catene β e γ costituisce la forma completa del recettore
di IL-2, ovvero un trimero ad alta affinità, per il quale sono sufficienti piccole
quantità di IL-2 per attivare la cellula. La catena α di IL-2R viene espressa solo
sui linfociti attivati dall'incontro con l'antigene.
Quindi, l'attivazione del TCR receptor induce la trascrizione del gene per il recettore di IL-2, ed in particolare
la trascrizione della catena α (che conferisce l’alta affinità al recettore).

Qual è l’importanza dell'espressione di un recettore ad alta affinità da parte del linfocita T naive che ha
appena riconosciuto l’antigene?
I linfociti T presenti nel linfonodo sono inframmezzati da cellule dendritiche, e ognuno di questi ha una
specificità diversa da quella di un altro linfocita. Il linfocita T naive che ha la giusta specificità riconosce un
determinato antigene e così facendo si attiva, cominciando a produrre IL-2 in quanto deve andare incontro
ad espansione clonale.
Se l’IL-2 prodotta dal T attivato andasse ad attivare anche i linfociti T limitrofi non si avrebbe più
un’espansione clonale (con riferimento al singolo clone linfocitario di interesse), bensì un’espansione
policlonale, e comincerebbero a proliferare cellule che hanno una specificità che in quel momento non è
richiesta. È necessario far sì che solo il linfocita con quella determina specificità (con la specificità “giusta”)
possa rispondere a quel certo antigene presentato dall'APC e andare incontro a espansione clonale.
I linfociti T producono costitutivamente basse quantità di IL-2; a differenza di questi, la cellula T attivata
esprime la catena α. Essendo l'unica cellula (nel tappeto di linfociti T sopra descritto) a presentare il
recettore trimerico ad alta affinità per IL-2, questo linfocita T diventa il solo in grado di rispondere a basse
quantità di IL-2.
La cellula T in via di maturazione produce maggiori quantità di fattore di crescita, e questo agisce in modo
autocrino sul linfocita T stesso. Quest'ultimo andrà così incontro ad espansione clonale.
Le cellule T in vicinanza del linfocita in via di maturazione vengono inevitabilmente a contatto con IL-2, ma
dal momento che non presentano il recettore ad alta affinità non hanno la capacità di replicarsi.
L’espansione clonale è attuata dalla cellula attivata, in quanto solo questa è in grado:
- di produrre da sé il fattore di crescita (IL-2) e
- di rispondere alle basse quantità del fattore di crescita.

PROTEINE CO-STIMOLATORIE

Il riconoscimento specifico da parte del linfocita T naive del complesso MHC / peptide (presentato dall’APC)
è associato al riconoscimento delle proteine co-stimolatorie.
Tale riconoscimento è essenziale: se il linfocita T riconosce l’antigene in assenza delle molecole co-
stimolatorie, non solo il linfocita T non si attiva, ma diventa un linfocita T anergico (un linfocita disattivato
permanentemente, che non potrà più funzionare).
Affinché il linfocita T si attivi, produca IL-2 e vada incontro a espansione clonale deve avvenire un doppio
riconoscimento:

6 / 15
- il riconoscimento dell’antigene, e se questo avviene
- il riconoscimento delle molecole co-stimolatorie. Ciò determina uno stato di attivazione dell’APC, la
quale produrrà citochine che andranno a loro volta ad agire sul linfocita T attivandolo.
Così come è necessaria una doppia combinazione per determinare la selettività di ingresso del linfocita T nel
linfonodo, anche nel caso dell'attivazione del linfocita T deve esserci una doppia combinazione: TCR e
molecole co-stimolatorie.
La presenza di due segnali costituisce una modalità di salvaguardia, di controllo affinché non sia innescata
un’attivazione linfocitaria non richiesta [ndr: il docente afferma che ritorneremo su questo punto quando
parleremo di autoimmunità e di tolleranza].

L’APC può esprimere o meno le molecole co-stimolatorie. Quando l'APC si trova nei tessuti periferici ed è
nella sua configurazione immatura, non esprime molecole co-stimolatorie.
L'APC che ha catturato l'antigene e che viaggia verso i linfonodi invece, è soggetta ad un processo di
maturazione che consiste nel cambiamento d'espressione dei recettori chemiotattici, nella perdita della
capacità di catturare l’antigene e nell'espressione delle molecole co-stimolatorie. L'APC matura è in grado di
comunicare con i linfociti T proprio perché esprime tali molecole.

Se una APC è presente in un tessuto sano (non infiammato), non trovando degli antigeni esogeni da
montare sui suoi complessi MHC assembla su questi dei peptidi self. Tale APC, tuttavia, trovandosi in una
condizione immatura non esprime molecole co-stimolatorie: un linfocita T auto-reattivo che riconosce
l’antigene self non si attiverà, in quanto non riceve il segnale delle molecole co-stimolatorie.

Le interazioni che si instaurano nella comunicazione fra cellula dendritica e linfocita T (a livello linfonodale)
consistono in 3 segnali di attivazione / differenziazione:
1. il 1° segnale di attivazione è il riconoscimento specifico dell’antigene da parte del TCR; se il
riconoscimento non avviene, mancano automaticamente i passaggi successivi. Tuttavia, il legame
del TCR con il complesso MHC / peptide non è sufficiente ad attivare il linfocita T ed occorre un
secondo segnale;
2. il 2° segnale è dato dall’interazione delle molecole co-stimolatorie. Una delle principali molecole
co-stimolatorie espressa dal linfocita T in modo costitutivo (anche il linfocita T naive la esprime) è
CD28. CD28 riconosce sull'APC le molecole co-stimolatorie B7-1 e B7-2 (note rispettivamente come
CD80 e CD86). Queste molecole sono espresse sulla cellula dendritica matura. L'interazione delle
molecole co-stimolatorie dà sopravvivenza al linfocita T e genera ulteriori segnali;

3. il 3° stimolo è dato dalla produzione da parte dell'APC di diverse citochine che vanno ad attivare il
linfocita T. Le citochine educano il linfocita T a svolgere determinate funzioni, e a seconda delle
citochine presenti al momento dell'attivazione i linfociti T si differenziano in cellule con funzioni e

7 / 15
caratteristiche distinte.

Molecole co-stimolatorie espresse sul linfocita T Molecole co-stimolatorie espresse sull'APC


CD28 B7-1 / CD80
B7-2 / CD86
ICOS ICOS-ligando
CD40L CD40

Quindi affinché avvenga l’attivazione del linfocita T è necessario il complesso di 3 set di interazioni:
1. TCR (1° segnale),
2. molecole co-stimolatorie (2° segnale),
3. produzione e azione delle citochine (3° segnale).

La presenza di uno solo di questi segnali non è sufficiente.

La molecola co-stimolatoria CD28 con i suoi ligandi è particolarmente importante per l'attivazione dei
linfociti T a livello linfonodale; la proteina attivatoria ICOS, che riconosce un ligando definito ICOS-ligando, è
cruciale per l’attivazione di un particolare pattern di linfociti che si trova all’interno dei follicoli (i linfociti Th
follicolari).

L'interazione fra linfocita T e cellula dendritica è un dialogo di attivazione dinamico e dà luogo ad una
reciproca attivazione. Avvenuto il riconoscimento specifico dell'antigene, il legame tra CD28 espresso dai
linfociti T con le molecole B7-1 e B7-2 presenti sull'APC induce un'ulteriore attivazione del linfocita T, che
comincia a produrre delle citochine le quali vanno, a loro volta, ad attivare l'APC.
L'APC così attivata esprime un'altra molecola co-stimolatoria, il CD40, che riconosce il ligando CD40L
espresso dal linfocita T. L’attivazione dell'APC e del linfocita porta all’espressione di nuove molecole co-
stimolatorie, che possono interagire e innalzare ulteriormente il livello di attivazione delle cellule stesse.
Quindi, l’APC non si limita ad attivare il linfocita T in modo unidirezionale, ma ciascuna di queste cellule
attiva l’altra: si tratta di un'attivazione reciproca, di un vero e proprio dialogo in cui l’APC attiva il linfocita T e
il linfocita T a sua volta attiva l’APC, la quale ritorna nuovamente ad attivare il linfocita T e così via.
Tale dialogo è indispensabile affinché il linfocita T venga attivato completamente.

Inoltre il dialogo fra linfocita T che si sta attivando e APC può contribuire all'attivazione di un'altra cellula.
Si prenda come esempio l'attivazione di un linfocita Th. Tale linfocita T CD4 durante il processo di
maturazione favorisce l'attivazione dell'APC che ha riconosciuto, e tale cellula potrebbe attivare a sua volta
un linfocita T CD8 che è contemporaneamente impegnato nel riconoscimento di un antigene sulla superficie
di quella stessa APC. In aggiunta, le citochine prodotte dal linfocita T CD4 attivato (tra cui IL-2) potranno
attivare o aumentare il grado di attivazione del linfocita T CD8 interessato. Quest'ultima cellula, infatti, non
è “resting” come nel caso dei linfociti T limitrofi esaminati precedentemente, ma risulta sensibile a bassi
livelli di citochine poiché, dal momento che si sta attivando, esprime dei recettori ad alta affinità.
Il processo di attivazione può perciò non riguardare una singola cellula, ma essere esteso ad altre cellule che
si stanno contemporaneamente attivando. Tale caratteristica risulta particolarmente significativa
nell'attivazione dei linfociti T CD8.

L’attivazione da parte di un linfocita T, pur aumentando il grado di attivazione reciproco dell'APC e del
linfocita T stesso, si accompagna all’attivazione di sistemi di controllo negativi. Infatti, un linfocita T che
comincia ad attivarsi ad un certo punto innesca una via che tende a spegnerlo, a terminare l'attivazione e a
riportarlo ad una condizione omeostatica.

8 / 15
A tal proposito un importante recettore inibitorio nei confronti dell'attivazione del linfocita T è
rappresentato dalla molecola CTLA-4, omonimo funzionale di CD28. CTLA-4 e CD28 appartengono ad
un’ampia famiglia di molecole che presentano analogie dal punto di vista biochimico:
 CD28 è una molecola co-stimolatoria espressa dal linfocita T in modo costitutivo: lega i
controrecettori B7-1 e B7-2 presenti sull’APC e invia segnali attivatori;
 CTLA-4 è una molecola che viene espressa dal linfocita T nelle fasi tardive di attivazione: riconosce i
medesimi ligandi di CD28 (B7-1 e B7-2) ed invia segnali inibitori.
CTLA-4 presenta un'affinità di legame maggiore rispetto a CD28.
Le molecole citate sono note come molecole checkpoint della risposta immunologica: costituiscono il
bersaglio delle recenti terapie antitumorali (nel trattamento del carcinoma ai polmoni e dei melanomi, per
esempio) e dei farmaci di ultima generazione. Il tumore esprime una serie di strategie per inibire la risposta
immunitaria: agendo sulle molecole checkpoint della risposta immunologica, inibendo le molecole che
danno segnali negativi o potenziando quelle che danno segnali positivi, è possibile risvegliare il sistema
immunitario dell'individuo [ndr: l'argomento sarà ripreso nelle lezioni successive, quando si parlerà
dell'immunità verso i tumori e delle attuali terapie].

Molecole inibitorie espresse sul linfocita T Ligandi sull'APC


CTLA-4 B7-1 / CD80
B7-2 / CD86
PD-1 PD-L1 (espresso anche dai macrofagi)
PD-L2

Una cellula naive esprime in modo costitutivo CD28. Il riconoscimento dell'antigene specifico e dei ligandi di
CD28 presentati dall'APC induce l'attivazione del linfocita T e l'espressione di CTLA-4 in fasi tardive
dell'attivazione. La stessa cellula, quindi, esprimerà contemporaneamente sia CD28 (che stimola
l’attivazione) che CTLA-4 (che inibisce l’attivazione).
Tuttavia CTLA-4, avendo una maggiore affinità per B7-1 e B7-2, “vince” su CD28.
L’attivazione del linfocita T può essere descritta come un equilibrio fra meccanismi biologici che potenziano
e meccanismi che inibiscono: nelle fasi iniziali l'equilibrio è sbilanciato verso l’attivazione, mentre nelle fasi
finali è sbilanciato verso lo spegnimento.

9 / 15
CTLA-4 ha avuto un ruolo chiave nella comprensione della strategia immunitaria per combattere i tumori;
oggi, invece, i farmaci sono diretti principalmente contro la molecola PD-1. Come CTLA-4, è una molecola
inibitoria e riconosce due ligandi: PD-L1 (o ligando 1 di PD) e PD-L2 (o ligando 2 di PD). A differenza di CTLA-
4, PD-1 compare molto più tardivamente e ha un ruolo più definito nell’inibire la risposta immunitaria. È un
checkpoint della risposta immunologica ed è attualmente il target preferito nella terapia antitumorale: una
nuova classe di farmaci inibitori di PD-1 sono in grado di attivare il sistema immunitario e di indurlo con
successo ad attaccare le formazioni tumorali.

SINAPSI IMMUNOLOGICHE

Le proteine e le molecole che rendono possibile l'interazione fra cellula T e APC sono inizialmente
distribuite in modo uniforme sulla loro superficie; quando le due cellule cominciano ad interagire, tuttavia,
queste molecole si concentrano in specifici punti di contatto posti a distanza ravvicinata fra la membrana
dell'APC e la membrana del linfocita T naive. Questi punti vengono definiti sinapsi immunologiche in
quanto mimano i contatti che avvengono a livello delle terminazioni nervose.
Le molecole di adesione (LFA-1), il TCR con il suo complesso recettoriale e le molecole co-stimolatorie si
raggruppano nel sito di contatto andando ad assumere un’organizzazione ben definita, che prende il nome
di SMAC. Lo SMAC (acronimo per SupraMolecular Activation Cluster) è un cluster costituito da molte
molecole di attivazione. Queste sono disposte in 2 anelli concentrici, andando a formare una placca o
bottone di adesione fra le due cellule:
- nell’anello esterno si distribuiscono le molecole di adesione, con la funzione di stabilizzare i legami
fra le cellule (il linfocita T esprime LFA-1, mentre la cellula dendritica esprime ICAM-1);
- nell’anello interno, invece, si vanno a distribuire:
o il complesso del TCR receptor,
o le molecole co-stimolatorie,
o le molecole responsabili delle prime fasi della trasduzione del segnale. Tra queste è
importante ricordare la proteina-chinasi C teta (PKC-θ), un'isoforma della protein chinasi C.

I due anelli sono ben apprezzabili in un'immagine a immunofluorescenza: visualizzando in verde le molecole
di adesione e colorando in rosso la PKC-θ, l'anello esterno presenta fluorescenza verde mentre l'anello
interno (in cui si localizza PKC-θ) presenta fluorescenza rossa.

CITOCHINE E DIFFERENZIAMENTO DEI LINFOCITI Th

Il contatto tra linfocita T e cellula dendritica richiede delle ore. Infatti, deve essere un contatto prolungato in
quanto:
- deve avvenire un dialogo, una reciproca attivazione;
- la cellula APC deve produrre dei fattori solubili che attivino il linfocita T.
Le cellule dendritiche sono contraddistinte da una differente cinetica di funzione. La capacità dell’APC di
produrre citochine diverse in relazione al tempo risponde all'esigenza di regolare la risposta immunologica:
un’APC recentemente attivata produce un pattern di citochine non prodotte in fase tardiva, e viceversa.
Un’altra caratteristica delle APC è la produzione di citochine diverse da parte di classi differenti di cellule
dendritiche:
- le cellule mieloidi producono principalmente citochine IL-12;
- le cellule plasmacitoidi producono IFN-1.

I fattori solubili prodotti dalle APC costituiscono il 3° segnale di attivazione e di differenziazione dei linfociti
T. Le citochine prodotte dalle cellule dendritiche istruiscono il linfocita T in questa fase dell'attivazione e lo
indirizzano, ad esempio, a diventare un linfocita Th1, Th2 piuttosto che Th17. Questo fenomeno è stato
studiato nei linfociti T helper, ma avviene in certa misura anche nei linfociti T citotossici (che diventeranno
CTL1, CTL2, ecc). Ad ogni stadio di attivazione e ad ogni attivazione diversa del linfocita T corrispondono set

10 / 15
di citochine (e quindi istruzioni) differenti.

L’APC produce determinate citochine sulla base dei Pattern Recognition Receptors attivati; l'attivazione
specifica di un PRR, a sua volta, dipende dal microbo che deve essere eliminato. Ciò ha lo scopo di attivare
la risposta più appropriata a combattere quel tipo di patogeno.

I linfociti T helper regolano, attivano e aiutano le cellule dell’immunità innata (come neutrofili, macrofagi e
cellule NK) e le cellule dell’immunità specifica (come i linfociti T CD8). Per svolgere la loro azione, i linfociti
Th producono dei messaggeri solubili, le citochine. La differenza fra i vari stadi di attivazione di un linfocita
Th (tra linfocita Th1 e linfocita Th2, per esempio) è dovuta alla capacità di produrre peculiari citochine:
 il linfocita Th1 produce dei segnali pro-infiammatori e diverse citochine tra cui IL-2 (essendo un Th
che prolifera molto, ha una richiesta considerevole di IL-2). Tuttavia, il segno distintivo che
caratterizza il linfocita Th1 rispetto agli altri stadi di polarizzazione linfocitaria è la produzione di IFN-
γ;
 il linfocita Th2 produce diverse citochine, tra cui ricordiamo IL-4 e IL-5.

Un linfocita Th1 non produrrà mai IL-4, così come un linfocita Th2 non produrrà mai IFN-γ.

In aggiunta, la produzione di IFN-γ da parte di un linfocita Th1 inibisce la polarizzazione dello stesso verso
Th2; similmente, la produzione di IL-4 inibisce la polarizzazione del linfocita verso Th1.
A seconda del contesto di citochine in cui viene attivato, un linfocita T naive (con il suo TCR receptor che ha
una specificità ben definita e unica) può diventare un linfocita Th1 o Th2, andando a produrre citochine di
un certo tipo.

Questi stadi di polarizzazione funzionale costituiscono dei casi estremi, ma in realtà possono esserci delle
variazioni. È stato osservato che alcune patologie tipicamente Th1 generano, per lo più nelle fasi tardive
della malattia, anche cellule Th2; d'altra parte, in alcune malattie tipicamente Th2 è stata riscontrata la
presenza (in fasi tardive) di cellule Th1. Dall'esempio appena descritto si intuisce che la risposta immunitaria
è regolata durante la sua evoluzione: la regolazione è a carico di specifici meccanismi di feedback.

Quando in una patologia Th1 cominciano ad essere prodotte cellule Th2, si assiste ad un'inibizione della
risposta Th1. I cloni linfocitari Th2, infatti, producono IL-4 e inibiscono la polarizzazione verso Th1, cercando

11 / 15
di riportare l'omeostasi. In modo simile, i cloni Th1 prodotti in certe fasi di una patologia tipicamente Th2
andranno ad inibire la risposta Th2, con lo scopo di ristabilire l’omeostasi.

Se un linfocita T CD4 naive viene attivato da una APC che produce IL-12 o in presenza di interferone (IFN-γ o
interferone di tipo 1), questa cellula diventerà un linfocita Th1 e produrrà citochine funzionali per
l'attivazione di altre cellule. Tra queste citochine menzioniamo l'IFN-γ e la LT-α o linfotossina alfa.
Proprio l’IFN-γ è responsabile della super attivazione dei macrofagi. IFN-γ e LT-α migliorano la fagocitosi e la
digestione delle sostanze da parte dei macrofagi; l’IFN-γ promuove anche l’attivazione delle cellule NK e
attiva la promozione di linfociti T.
L'attivazione della risposta Th1 è un meccanismo fondamentale per combattere i patogeni intracellulari,
batteri e virus che hanno invaso la cellula.
L'IFN-γ è prodotto anche da cellule dell'immunità innata, quali le cellule NK attivate.

Invece, se l'APC è attivata da PRR che non inducono la produzione di IL-12, il linfocita T naive che prende
contatto con tale APC va incontro ad un altro stato di attivazione. Il linfocita attivato in assenza delle
citochine IL-12 e IFN-γ è interessato dall'azione di IL-4. Questo è un fattore di sopravvivenza prodotto in
modo costitutivo da qualsiasi linfocita T naive: anche il linfocita CD4 del caso precedente (polarizzato verso
Th1) produce IL-4, ma l'espressione contemporanea di IL-12 fa sì che quest'ultima prenda il sopravvento.
La presenza di IL-4 attiva il linfocita T verso la polarizzazione Th2 e induce il linfocita a produrre delle
citochine, tra cui IL-5, IL-10 e una maggiore quantità della stessa IL-4. Tali citochine non attivano i macrofagi
o le cellule NK, bensì i linfociti T e le cosiddette cellule dell'allergia: eosinofili, mastociti, basofili. Le cellule
dell'allergia hanno funzioni non solo di danno tissutale, ma anche di protezione.
L'attivazione della risposta Th2 è necessaria per combattere i parassiti extracellulari.
IL-4 è prodotta non solo dai linfociti T in modo costitutivo, ma anche da cellule dell'immunità innata: infatti,
i mastociti impegnati nella degradazione delle sostanze producono IL-4.

Le funzioni di Th1 e di Th2 descritte hanno uno scopo protettivo. Tuttavia, l'esistenza di profili di attivazione
verso Th1 e Th2 è emersa dallo studio delle patologie in cui questi sono coinvolti: osservate inizialmente nel
topo, le patologie Th1 e Th2 sono state poi estese all'uomo. Il merito della comprensione delle suddette
malattie nel soggetto umano è da attribuire a Sergio Romagnani. L'immunologo italiano, tramite
purificazione dei linfociti da biopsie e coltivazione degli stessi in vitro (per capire se producevano IFN-γ o IL-
4), è stato in grado di definire l'attivazione di Th1 e Th2 nelle patologie umane.

- Malattie autoimmuni quali l'artrite, il morbo di Crohn, l'aterosclerosi, il rigetto dei trapianti d'organo
e l'aborto prematuro sono dettati da un'eccessiva risposta di tipo Th1.
- Altre patologie come la dermatite atopica, la sindrome di Bowen, alcune sindromi da iper-
responsività degli eosinofili sono caratterizzate dalla prevalenza di una risposta di tipo Th2.

L'esistenza di malattie tipicamente Th1 o Th2 costituisce una condizione estrema ma non assoluta: come
detto, è sempre possibile purificare linfociti Th2 da patologie associate a Th1 e viceversa.

L'identificazione di una patologia Th1 o Th2 è utile per due motivi principali: contribuisce alla comprensione
dei meccanismi patogenetici e consente la messa a punto di terapie e farmaci efficaci. Tra questi possiamo
citare i farmaci attualmente somministrati per le forme gravi di alcune malattie autoimmuni (psoriasi,
artrite, lupus, morbo di Crohn).
L'aspirina e i glucocorticoidi hanno fatto la storia della medicina, ma nonostante agiscano in modo valido in
un ampio spettro di condizioni sono farmaci che mancano di selettività, e per questo possono determinare
l'insorgenza di complicanze o effetti indesiderati.

CITOCHINE E MECCANISMI MOLECOLARI


Le diverse citochine prodotte dalla APC sono responsabili dell'indirizzo del linfocita T naive verso Th1 o Th2,
e ci riescono mediante dei meccanismi biochimici e molecolari. Infatti, le citochine presenti nel contesto di

12 / 15
attivazione del linfocita T accendono specifici fattori di trascrizione, che determinano la polarizzazione
funzionale.

Interferone-gamma
L'IFN-γ legato al rispettivo recettore attiva la via di segnalazione delle JAK / STAT, che porta all'attivazione
del fattore trascrizionale STAT1. STAT1 induce la trascrizione di diversi geni, fra cui quello dello stesso IFN-γ.
Eseguendo un knockout di STAT1 non si ha più produzione di cellule Th1.
Tra le attività biologiche di IFN-γ ricordiamo le seguenti.
 stimola i macrofagi nell'uccisione dei microrganismi fagocitati: attiva le funzioni microbicide dei
macrofagi,
 promuove la differenziazione dei linfociti T CD4 in Th1,
 induce delle sottoclassi di IgG che vanno a rivestire il patogeno: promuove quindi la produzione
di anticorpi opsonizzanti,
 stimola le APC, aumentando l'espressione dei complessi MHC di classe I e II e l'espressione delle
molecole co-stimolatorie.
In riferimento al primo punto, l'IFN-γ è responsabile della super attivazione dei macrofagi [ndr: concetto
accennato precedentemente]. I macrofagi così stimolati sono anche definiti macrofagi armati, poiché
particolarmente capaci nella cattura e nell'uccisione del patogeno.

D'altra parte, il fattore di crescita trasformante-β (TGF- β) ha azione opposta rispetto all'IFN-γ: inibisce la
proliferazione cellulare, arresta la differenziazione dei linfociti Th naive in Th1 e blocca l'attivazione dei
macrofagi.

Interleuchina 4
L'IL-4 legata al controrecettore attiva il fattore trascrizionale STAT6.
STAT6 induce l'attivazione del fattore di trascrizione GATA-3, che è fondamentale nel promuovere la
produzione di IL-5 e di maggiori livelli di IL-4.
Topi knockout per i geni che codificano per IL-4, STAT6 o per GATA-3 mostrano un deficit dello sviluppo di
linfociti Th2
Alcune attività biologiche di tale interleuchina:
 IL-4 è la principale citochina responsabile della produzione di IgE: nei topi knockout per il gene che
codifica per IL-4 si osserva una drastica riduzione dei livelli basali di IgE. Gli anticorpi della classe IgE
sono i principali effettori della difesa mediata da eosinofili contro le infezioni da elminti o artropodi.
Le IgE rappresentano anche il principale mediatore delle reazioni da ipersensibilità immediata
(allergia),
 IL-4 induce la differenziazione dei linfociti CD4 naive in linfociti Th2, e determina la proliferazione
delle cellule differenziate attraverso un meccanismo di stimolazione autocrino,
 IL-4, insieme a IL-10, induce l'attivazione alternativa dei macrofagi, differente rispetto a quella
classicamente indotta da IFN-γ.
Per tanti anni si è sostenuto che IL-10 e IL-4 inibissero completamente l'attivazione dei macrofagi. Grazie al
lavoro di Simon Gordon (definito il padre della biologia dei macrofagi), invece, oggi si sa che tali citochine
non inibiscono in toto l'attivazione dei macrofagi: inibiscono solo le funzioni che sono attivate normalmente
da IFN-γ, e determinano l'attivazione di altre funzioni [ndr: l'Abbas riporta in sostituzione a IL-10 la citochina
IL-13]

Interleuchina 12
Le interleuchine IL-12 e IL-14 prodotte dalla cellula dendritica costituiscono un importante segnale di
amplificazione.
IL-12 è un eterodimero composto di 2 subunità (p35 e p40), mentre il suo recettore IL-12R presenta una
struttura a doppia catena (β1 e β2).

IL-12 legata al proprio recettore attiva la via di trasduzione del segnale delle JAK / STAT: le chinasi Tyk2 e

13 / 15
Jak2 si associano alle subunità di IL-2R e a valle viene indotta la trascrizione del gene per l'IFN-γ. In assenza
di IL-12, l'IFN-γ non viene prodotto.
Le attività biologiche di IL-12 sono necessarie sia nelle risposte dell'immunità innata che in quelle
dell'immunità specifica, e tale interleuchina ha una complessa capacità di potenziare la produzione di
citochine.
Le funzioni di IL-12 possono essere così riassunte:
 induce la produzione di IFN-γ da parte di cellule NK e di linfociti T,
 IL-12, assieme a IFN-γ, induce la differenziazione dei linfociti T helper in cellule Th1 (anch'esse
produttrici di IFN-γ),
 potenzia l'attività citotossica delle cellule NK e dei linfociti T CD8.
Alla comprensione degli ultimi due punti ha contribuito un gruppo italiano guidato da Giorgio Trinchieri: da
tale ricerca è emerso, appunto, che IL-12 è un fattore di crescita delle cellule NK, in quanto le attiva e le
stimola a produrre IFN-γ.

RISPOSTA Th1
La sintesi di IL-12 è indotta in risposta a stimoli microbici; tale citochina esercita un ruolo notevole nella
risposta alle infezioni da batteri intracellulari (quali Listeria) e alle infezioni virali.
I produttori principali di IL-12 sono i macrofagi attivati e le cellule dendritiche che presentano l'antigene
[ndr: Molti tipi cellulari sono in grado di sintetizzare la subunità p35, ma soltanto i fagociti e le cellule
dendritiche attivati sintetizzano in aggiunta p40, permettendo così l'assemblaggio del dimero
biologicamente attivo].
Si ipotizzi di infettare un topo con Listeria. Se si trasferiscono al topo infettato dei macrofagi attivati in
assenza di IFN-γ o IL-12, questi non sono in grado di uccidere il patogeno.
Tuttavia, se inoculiamo nel topo “naive” (che sta incontrando per la prima volta l'infezione) dei linfociti T
prelevati e purificati da un altro topolino che ha contratto precedentemente l'infezione, ne risulta che i
macrofagi riescono ad uccidere il batterio.

14 / 15
Quello appena descritto è un meccanismo di immunità passiva, basato sul trasferimento di linfociti T della
memoria a delle cellule naive.
Ciò dimostra l'importanza dei linfociti T nel fronteggiare tali infezioni: se eseguissimo il medesimo
esperimento trasferendo al topo “naive” del siero proveniente dal topo già infettato, non osserveremmo
alcun risultato (la risposta anticorpale non è efficace nel combattere l'infezione di interesse).

Quindi, la riposta immunitaria messa in atto è una risposta di tipo Th1: i linfociti T CD4 sono diventati
linfociti Th1 e, tramite la produzione di IFN-γ, hanno determinato una super attivazione dei macrofagi,
rendendoli così in grado di eliminare il patogeno. Esaminando una coltura di questi linfociti T, si nota inoltre
la presenza di linfociti CD8 (citotossici), che adempiono anch'essi alla funzione di eliminazione di Listeria.

Per riassumere:
 i linfociti T (in particolare Th1) sono cruciali in vivo per combattere le infezioni da patogeni
intracellulari,
 ma non costituiscono gli effettori dell'uccisione del patogeno. Infatti, sono i macrofagi attivati dai
linfociti Th e dalle citochine da questi prodotte, gli effettori della risposta.

RISPOSTA Th2
Come detto, la risposta mediata dai linfociti Th2 è fondamentale per combattere i parassiti extracellulari.
Un Th2 attivato produce IL-4, IL-5, IL-10 (quest'ultima caratteristica principalmente dei Th2 del topo), e tali
citochine attivano i mastociti e gli eosinofili. Queste cellule sono deputate a eseguire la risposta Th2.
La produzione di immunoglobuline indotta da IL-4 determina l'espressione su mastociti e eosinofili di
recettori ad alta affinità.
IL-5, poi, attiva la mobilizzazione di indolo e inositolo, aumentando la presenza di eosinofili in circolo.
Le degranulazioni di mastociti ed eosinofili (particolarmente ricche in proteasi caratteristiche, non presenti
in altre cellule fagocitiche) sono efficaci nel combattere i patogeni extracellulari.

15 / 15