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Lezione n° 10 del 29/03/2017

Materia: Immunologia

Revisore: Raffelli Alberto

Argomenti: traffico leucocitario, maturazione delle cellule dendritiche, segregazione dei linfociti T e B nei
linfonodi, reclutamento leucocitario, organi linfoidi secondari, ricircolo leucocitario, attivazione e
trasmigrazione dei linfociti T, uscita dei linfociti T dai linfonodi.

Nella lezione precedente sono state descritte le citochine.

TRAFFICO LEUCOCITARIO
Il circolo linfatico è complesso, ben articolato ed è intercalato dalla presenza di stazioni linfonodali.
Le cellule dendritiche sono deputate alla cattura dell'antigene nei tessuti periferici e alla presentazione
dello stesso ai linfociti. Una volta catturato l’antigene, le cellule dendritiche entrano in un vaso linfatico
afferente (che drena la linfa ai linfonodi), giungono al linfonodo e al suo interno si collocano in aree definite
in cui potrà avvenire l’interazione tra antigene specifico e linfocita T naive. Diversamente dalle cellule
dendritiche, i linfociti T arrivano ai linfonodi tramite i vasi ematici.
Le cellule dendritiche non giungono al linfonodo in modo casuale. I responsabili della migrazione e della
collocazione delle cellule dendritiche nel linfonodo stesso sono dei fattori chemiotattici, prodotti in
specifiche aree del linfonodo.

MATURAZIONE DELLE CELLULE DENDRITICHE


Le cellule dendritiche immature si trovano nei tessuti periferici ed esprimono un corredo di recettori per le
chemochine che vengono persi in fase di maturazione. Questi recettori sono CCR1, CCR5, CCR6 e
riconoscono chemochine prodotte nei tessuti periferici o in modo omeostatico o in situazioni
infiammatorie.
Quando le cellule dendritiche maturano, l’espressione di CCR1, CCR5 e CCR6 viene spenta (down regolata) e
subentra l’espressione del recettore CCR7, che è cruciale per la migrazione delle cellule dendritiche ai
linfonodi.
[ndr: i nomi delle chemochine e di altre molecole sono stati riportati sia con la vecchia che con la nuova
nomenclatura; la vecchia nomenclatura può essere più agevole nella memorizzazione, ma il docente non ha
espresso particolare preferenza. Nella nuova nomenclatura viene indicata per prima la famiglia delle
chemochine, CXC o CC, a cui segue la lettera L per la chemochina ligando o la R per il recettore e dei numeri
finali]

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 CCR1 riconosce 3 chemochine: RANTES, MIP-1α e MCP-3 nella vecchia nomenclatura;
rispettivamente CCL5, CCL3 e CCL7 nella nuova.
 CCR5 riconosce 3 ligandi: MIP-1α, MIP-1β e RANTES nella vecchia nomenclatura; rispettivamente
CCL3, CCL4 e CCL5 nella nuova.
CCR5 è coinvolto nelle infezioni da HIV: somministrando ad una cellula le 3 chemochine
riconosciute da CCR5 è possibile inibire l’infezione. Infatti, il recettore CCR5 risulterà impegnato nel
riconoscimento dei suoi ligandi e non potrà essere utilizzato dal virus.
 CCR6 riconosce MIP-3α (noto nella nuova nomenclatura come CCL20) ed è cruciale per la
distribuzione di cellule dendritiche nella cute.
 CCR7 riconosce due chemochine: MIP-3β e SLC, anche note rispettivamente come CCL19 e CCL21.
[ndr: si vedano le tabelle riassuntive a pag.2]

Dove vengono prodotti i ligandi per CCR7?


Secondo quanto emerso dagli studi della ricercatrice italiana Mariagrazia Uguccioni, quando nei tessuti
periferici vengono prodotte delle citochine infiammatorie (quali il TNF) viene stimolata la produzione dei
ligandi di CCR7.
Quindi, quando si riscontra un microambiente infiammatorio nei tessuti periferici la cellula dendritica
comincia a maturare e a esprimere CCR7, e allo stesso tempo le cellule dell’endotelio dei vasi linfatici
cominciano a produrre i ligandi per CCR7 (CCL19 e CCL21) i quali, diffondendosi, indirizzeranno le cellule
dendritiche dal sito d'infiammazione verso l’apertura del vaso linfatico. Le cellule dendritiche sono così
trasportate mediante il flusso della linfa al linfonodo, in cui entrano tramite il vaso linfatico afferente.

Recettori per le chemochine presenti sulle Chemochine riconosciute (chemochine


cellule dendritiche immature omeostatiche e principalmente chemochine
infiammatorie)
CCR1 RANTES / CCL5
MIP-1α / CCL3
MCP-3 / CCL7
CCR5 MIP-1α / CCL3
MIP-1β / CCL4
RANTES / CCL5
CCR6 MIP-3α / CCL20

Recettore per le chemochine presente sulle Chemochine riconosciute


cellule dendritiche mature (migrazione al
linfonodo)
CCR7 MIP-3β / CCL19
SLC / CCL21

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SEGREGAZIONE NEI LINFONODI

[ndr: breve riferimento alla struttura di un linfonodo. Il linfonodo è organizzato in un seno sottocapsulare e
in strutture rotondeggianti, dette follicoli. Le regioni sottostanti ai follicoli sono la regione paracorticolare e
la regione midollare. Dalla zona midollare il drenaggio avviene attraverso un vaso efferente]

Arrivata al linfonodo tramite il vaso afferente, la linfa (con le cellule dendritiche cariche di antigeni in essa
presenti) si distribuisce nella regione sub-corticale e comincia a penetrare all’interno del linfonodo
mediante le venule ad alto endotelio o HEV (High Endothelial Venules), condotti rivestiti da una struttura
reticolare formata da fibroblasti. Le cellule dendritiche penetrate si localizzano così nell’area paracorticale,
in vicinanza alle HEV. Le venule ad alto endotelio sono strutture uniche e caratteristiche dei linfonodi e in
condizioni fisiologiche non sono presenti in altri distretti anatomici.
Le HEV sono così definite in quanto caratterizzate da un endotelio
molto alto, compatto, spesso e cubiforme: queste caratteristiche
rispondono ad un preciso significato funzionale. Normalmente, invece,
un vaso presenta un endotelio piatto e molto basso. Anche i linfociti T
naive, come le cellule dendritiche, penetrano nel linfonodo tramite le
HEV.
NDS In realtà dopo dice che le cellule dendritiche entrano tramite il
circolo linfatico.

Nell’area paracorticale dei linfonodi si localizzano i linfociti T e le cellule dendritiche; l’area paracorticale è
vicina ma chiaramente distinta dai follicoli, regioni nelle quali si collocano i linfociti B.
Quello che entra nel linfonodo vi arriva tramite le HEV o i vasi linfatici afferenti. Ciò che entra mediante i
vasi afferenti fuoriesce dal linfonodo tramite il vaso efferente, che farà da vaso linfatico afferente per la
stazione linfonodale successiva.

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Domanda: i linfociti B entrano nel linfonodo attraverso le venule ad alto endotelio (come i linfociti T)?
I linfociti B e i linfociti T naive entrano nel linfonodo attraverso il circolo sanguigno, quindi mediante le HEV;
le cellule dendritiche, invece, arrivano mediante il circolo linfatico

Nella sezione istologica di un linfonodo umano riportata a lato, la zona paracorticale, posta subito al di
sotto della zona corticale, appare ricca di linfociti non organizzati in follicoli.
Infatti, nel linfonodo è presente una netta distinzione tra zone B e zone T.
La ragione di questa segregazione è stata compresa per mezzo di studi condotti con la tecnica
dell’ibridazione in situ. Applicando ad un campione una colorazione per le chemochine CCL19 e CCL21 e
osservando quali cellule nel linfonodo producevano l’RNA per i 2 ligandi del recettore CCR7, si è notato che
le due chemochine di interesse sono prodotte in quasi tutte le aree del linfonodo, tranne nelle regioni
follicolari. Eseguendo il medesimo esperimento con una colorazione
per la chemochina CXCL13, si è osservato che questa chemochina è
prodotta e si localizza nelle aree che erano state precedentemente
escluse dalla produzione di CCL19 e CCL21: i follicoli, appunto.
La localizzazione dei linfociti B nei follicoli e la distribuzione delle
cellule dendritiche e dei linfociti T nelle regioni paracorticali non è
un evento casuale, ma dipende da una specifica distribuzione delle
chemochine.
Infatti, i linfociti B esprimono il recettore CXCR5, che riconosce la
chemochina CXCL13. Questa chemochina è nota nella vecchia
nomenclatura come BCA-1, B cell-attracting chemokine 1.
Sia le cellule dendritiche che i linfociti T naive, invece, esprimono il
recettore CCR7 e si distribuiscono nella regione paracorticale del
linfonodo per gradiente chemiotattico, in quanto a questo livello si localizzano i ligandi CCL19 e CCL21.
Rispondendo allo stesso segnale, le cellule dendritiche e i linfociti T naive colocalizzano perciò nella stessa
area, e ciò consente l’incontro tra linfocita T naive e antigene specifico caricato dalla cellula dendritica.
All’interno del linfonodo il gradiente di concentrazione di chemochine corrisponde ad una precisa
localizzazione dei linfociti e delle cellule dendritiche.
Le chemochine sono dei segnali patologici, proinfiammatori, delle proteine
Chemochine omeostatiche
inducibili che vengono espresse quando necessario. Tuttavia, esiste un subset
BCA-1 / CXCL13
di chemochine che viene prodotto in condizioni fisiologiche.
MIP-3β / CCL19
Le chemochine omeostatiche o costitutive sono prodotte sempre (anche in
SLC / CCL21
assenza di risposta attiva) e determinano la presenza omeostatica di linfociti
T e B nei vari distretti e la loro segregazione in essi. Tra le chemochine costitutive sono da ricordare CXCL13,
CCL19 e CCL21. Il linfonodo di un topo knockout per la chemochina CXCL13 (che richiama i linfociti B) o per il
suo recettore CXCR5 non presenta più i follicoli, ma linfociti T e B mescolati tra loro. L’osservazione di un
linfonodo di un topo knockout per il CCR7 è analoga

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RECLUTAMENTO LEUCOCITARIO
Fino ad oggi, parlando di reclutamento leucocitario ci siamo soffermati sulla risposta infiammatoria,
dicendo che in condizioni patologiche vi è il richiamo dai vasi al tessuto infiammato delle cellule
dell’immunità innata:
- neutrofili,
- monociti,
- eosinofili
- e successivamente linfociti.
In realtà il reclutamento leucocitario avviene anche in condizioni fisiologiche; è un fenomeno di entità
minore e coinvolge solo alcune delle popolazioni cellulari sopra elencate. I neutrofili, ad esempio, non
sono coinvolti nel reclutamento leucocitario fisiologico [ndr:il docente precisa che in condizioni fisiologiche
si potrebbero trovare dei neutrofili marginati a livello degli alveoli, ma questo rappresenta un caso
particolare]
In condizioni omoestatiche, invece, si possono trovare:
- dei monociti che vengono reclutati e che diventano dei macrofagi tissutali,
- delle cellule dendritiche,
- alcuni linfociti T. Ad esempio, i linfociti T λδ sono una piccola popolazione presente a livello dei
tessuti mucosali, all’interfaccia con l’ingresso degli antigeni.

La quantità di cellule che entrano in gioco varia se si considera il reclutamento leucocitario fisiologico o il
reclutamento in condizioni patologiche; tuttavia, i meccanismi responsabili del reclutamento sono identici
in entrambe le condizioni e anche le molecole coinvolte nei due tipi di reclutamento sono le stesse.
Anche nel reclutamento fisiologico è necessario l’intervento:
 delle molecole di adesione, come le selectine (che inducono il rolling della cellula sull’endotelio) e
le integrine (che inducono l’adesione ferma e poi la trasmigrazione),
 e dei fattori chemiotattici.

Tutti i nomi di recettori e chemochine nominati sono utili per comprendere il seguente concetto: i vari
eventi considerati non avvengono in modo casuale, ma dipendono da precise molecole prodotte in modo
regolato nei vari tessuti.
Fino ad ora abbiamo capito come fanno le cellule dendritiche a lasciare il tessuto periferico, ad entrare nei
vasi linfatici, ad arrivare nel linfonodo e a posizionarsi in certe aree dello stesso.
Gli stessi eventi di mobilitazione e migrazione delle cellule dendritiche hanno luogo anche in altre
strutture, come gli organi linfoidi secondari.
Va inoltre specificato che all’interno del linfonodo è presente una popolazione residente di cellule
dendritiche, le quali possono catturare nuovi antigeni che arrivano direttamente tramite la linfa.

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ORGANI LINFOIDI SECONDARI
PLACCHE DEL PEYER

Nell’intestino ci sono delle strutture specializzate, le placche del Peyer, che si trovano al di sotto
dell'epitelio e sono organizzate come dei veri e propri linfonodi. Nelle placche del Peyer, infatti, si possono
riconoscere delle regioni B che formano delle aree discrete follicolari e una regione T in cui sono presenti
sia cellule dendritiche che linfociti T.
Le placche del Peyer si trovano nella lamina propria, e in corrispondenza di esse l’epitelio accoglie cellule
specializzate chiamate cellule M. Le cellule M sono diverse dalle altre cellule epiteliali e hanno la funzione
di catturare gli antigeni presenti nel lume intestinale e di portarli all’interno delle placche del Peyer, dove
verranno esaminati per determinare una risposta immunitaria oppure un atteggiamento di tolleranza
(tollerogenico). Le placche del Peyer drenano ai linfonodi mesenterici (dei linfonodi regionali) e proprio in
questi si attiveranno la risposta T e in particolare la risposta B. L’immunità a livello delle mucose si basa in
massima parte sulla produzione di anticorpi di classe IgA. A livello dei linfonodi mesenterici vengono attivati
i linfociti B a produrre delle IgA, che saranno poi reclutate nelle mucose e secrete nel lume intestinale.

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MILZA
La milza svolge un ruolo simile a quello dei linfonodi; tuttavia, non raccoglie
gli antigeni che penetrano tramite gli epiteli. Al contrario, il compito della
milza è raccogliere gli antigeni presenti nel circolo ematico. È organizzata
in modo simile ai linfonodi e presenta un vaso, attraverso cui arrivano i
linfociti, che si dirama in arteriole. Le arteriole delimitano una zona tramite
i seni marginali (le arteriole laterali). Ognuna di queste zone identifica un
piccolo linfonodo, in quanto presenta una regione T che si trova a ridosso
dell’arteriola centrale (il manicotto periarteriolare di linfociti T) e delle
aree B in cui sono presenti i follicoli. A ridosso del seno marginale ci sono
dei macrofagi specializzati, che intervengono sia nella risposta immunitaria
sia per eliminare immuno-complessi o altre strutture che arrivano tramite il
sangue alla milza.

Domanda: Se la milza non presenta le HEV, come entrano i linfociti T all’interno di essa?
La milza presenta un’organizzazione anatomica che rispecchia quella dei linfonodi in quanto sono presenti
delle aree T e delle aree B, però per l’ingresso dei leucociti nella milza avviene l’esatto opposto di quello che
accade nei linfonodi. Mentre in questi le venule ad endotelio alto sono estremamente selettive per la
trasmigrazione delle molecole, nella milza i vasi sono sprovvisti di endotelio alto e le molecole presenti nel
sangue arrivano nella milza senza alcuna selezione [ndr: il professore paragona la fuoriuscita di tutto quello
che da un vaso ematico si riversa nella milza alla foce di un fiume].
Per questo motivo sono di notevole importanza le funzioni svolte da una popolazione di macrofagi nella
zona marginale, che rimuovono immuno-complessi, detriti e antigeni e cominciano a riconoscere le molecole
contro le quali è necessaria una risposta.
Una tossina batterica (come la tossina della pertosse) blocca i recettori chemiotattici e arresta l’entrata dei
linfociti nei linfonodi ma non nella milza; infatti, i linfociti T continueranno ad entrare nella milza perché in
questa struttura arrivano in ogni caso, senza alcuna selezione.

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RICIRCOLO LINFOCITARIO

Nel processo di maturazione, i linfociti T naive subiscono un riarrangiamento dei geni che codificano per le
regioni variabili delle catene α e β dei T-cell receptor, per cui i linfociti vanno incontro ad una mutazione
somatica. Ciò origina specificità del tutto casuali e diverse l’una dall’altra.
Secondo tale ragionamento, tutti i linfociti T avrebbero un recettore diverso; in realtà, si sa che il recettore
varia, ma la frequenza di una certa specificità in condizioni non reattive è abbastanza rara (può avere valori
di 1 cellula/1.000, o addirittura 1 cellula/10.000).
Queste centinaia o poche migliaia di linfociti T naive presenti in circolo devono riconoscere l’antigene per
cui sono specifiche.
I linfociti T naive si trovano nel circolo ematico, mentre gli antigeni si localizzano a livello dei tessuti
periferici.

L’incontro tra linfocita T naive e antigene, dal punto di vista statistico, è un evento molto raro e
improbabile. È per questo, come è stato ribadito più volte, che l’immunità specifica si è evoluta insieme alla
comparsa degli organi linfoidi, siti in cui si concentrano gli antigeni e le cellule dendritiche che arrivano
mediante la linfa. Il meccanismo di riconoscimento è efficiente in quanto nello stesso punto del linfonodo
arrivano in modo selettivo i linfociti T naive, che sono in cerca dell’antigene. I linfociti T naive, se non
trovano l’antigene per cui sono specifici, sono destinati a morire nell’arco di pochi mesi. La loro
sopravvivenza è legata al dimostrare che la loro specificità è utile per l’ospite.

I linfociti T arrivano in modo selettivo e specifico (mediante le HEV) ai linfonodi e qui interagiscono con
l’antigene presentato dalle cellule dendritiche.
In condizioni fisiologiche i linfociti T entrano nei linfonodi e non trovano alcun antigene che ne determini
l’attivazione; non avendo avuto luogo il contatto stabile con l’antigene in quel linfonodo, i linfociti T
lasciano la struttura fuoriuscendo dal vaso linfatico efferente e arrivano ad un altro linfonodo. Qui i linfociti
T cercheranno di nuovo l’antigene, e se non lo troveranno usciranno da quel linfonodo per poi passare alla

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stazione linfonodale successiva. In questo modo, il linfocita T naive passa da un linfonodo all’altro alla
ricerca dell’antigene specifico. Il “percorso” dei linfociti T prosegue poi in questo modo: i vasi linfatici, dopo
essere passati attraverso tutte le stazioni linfonodali, confluiscono in vasi linfatici di calibro crescente fino
ad arrivare al dotto toracico. Mediante tale dotto i linfociti T naive rientrano nel circolo ematico attraverso
la vena cava. Tutto il liquido presente nel circolo linfatico viene così immesso all’interno del circolo venoso.
Dunque, se nelle stazioni linfonodali non trovano l’antigene per cui sono specifici, i linfociti T naive
rientrano a livello sistemico e tramite HEV potranno rientrare nuovamente in un linfonodo e ripetere il
ciclo. Quello appena descritto prende il nome di ricircolo linfocitario e avviene unicamente in cellule non
attivate (naive).
Il ricircolo linfocitario consiste in un pattugliamento molto serrato delle stazioni linfonodali, ed è
indispensabile per le cellule che sono alla continua ricerca dell’antigene specifico.
È stato dimostrato sperimentalmente che un singolo linfocita T naive nell’arco di 24 ore riesce a passare
attraverso tutti i linfonodi presenti nell’organismo. Sempre in 24 ore, nella milza passa il 50% di tutti i
linfociti T naive presenti in circolo.
Invece, se il linfocita T naive incontra l’antigene specifico all’interno di un linfonodo si ferma, si attiva e
fuoriesce dallo stesso come linfocita T effettore (linfocita T attivato), andandosi a distribuire nel tessuto o
nell’organo con la funzione di eliminare il microbo.
Il linfocita T attivato non è coinvolto nel ricircolo linfocitario.

ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI T NAIVE O VERGINI


I linfociti T che entrano nei linfonodi sono definiti naive o vergini. L’ingresso nel linfonodo e l’incontro con
l’antigene per cui è specifico determina l’attivazione del linfocita T. La maggior parte dei linfociti T che
riconoscono l’antigene diventano linfociti T effettori, in quanto acquisiscono la capacità di svolgere precise
funzioni. Una parte dei linfociti T attivati, invece, va a costituire il pool dei linfociti della memoria, linfociti
destinati a sopravvivere nel tempo e ad essere pronti a reagire nel caso di un secondo incontro con lo
stesso antigene.

I linfociti della memoria si suddividono in due classi principali:


 linfociti della memoria periferica o cellule della memoria effettrici: insieme ai linfociti effettori,
perdono la capacità di rientrare all’interno dei linfonodi. Queste cellule hanno il compito di
pattugliare i tessuti periferici alla ricerca dell’antigene per cui sono specifici, per determinare una
risposta rapida.
 linfociti della memoria centrale: sono linfociti T che pur essendo attivati mantengono la capacità di
entrare all’interno dei linfonodi. Il compito delle cellule della memoria centrale è quello di
pattugliare tutti i distretti anatomici, entrando e uscendo dai linfonodi esattamente come fanno i
linfociti T naive.

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Domanda: i linfociti T della memoria centrale si localizzano solo nei linfonodi o anche nei tessuti? E che
funzione hanno nei linfonodi?
I linfociti T della memoria hanno il compito di attivare velocemente una risposta se viene ripresentato un
antigene.
I linfociti della memoria centrale vanno là dove si raccoglie l’antigene, nei linfonodi, e sono deputati ad un
rapido riconoscimento dell’antigene a livello linfonodale. Hanno il compito di attivarsi, di proliferare e
generare (tramite espansione clonale) tante cellule che fuoriescono dal linfonodo come cellule effettrici.
Non sono in grado di produrre citochine.
I linfociti della memoria periferica non stimolano l’espansione clonale dei linfociti, ma sono deputati ad
avviare in tempi rapidi la risposta effettrice. Vanno nei tessuti periferici e se incontrano l’antigene specifico
cominciano a svolgere la funzione effettrice che hanno imparato a fare. Infatti, i linfociti T della memoria
periferica sono caratterizzati dalla capacità di produrre elevati livelli di citochine, e questo è il modo con cui
riescono ad attivare una risposta locale.
Sono due pool di linfociti T diversi che esprimono proteine di membrana diverse, compresi i recettori
chemiotattici che li indirizzano o all’interno del linfonodo o nei tessuti periferici.

Domanda: Qual è la differenza tra cellule della memoria centrale e cellule effettrici della memoria?
Tale distinzione non ha validità assoluta, ma è accettata per semplificare la comprensione.
Le cellule della memoria centrale e le cellule della memoria effettrici sono cellule a lunga sopravvivenza
(molte sopravvivono qualche anno, alcune tutta la vita). Tuttavia non si è ancora capito il motivo della loro
longevità: secondo alcune ipotesi, troverebbero a livello midollare dei fattori di sopravvivenza. Il loro
compito è quello di distribuirsi nei tessuti periferici (mediante fattori chemiotattici e molecole di adesione) e
dirigersi in qualsiasi tessuto infiammato in base alle addressine che presentano. Ad esempio, una cellula
effettrice della memoria che esprime delle addressine cutanee, ad ogni situazione patologica raggiungerà la
cute. Dopo l’extravasazione, una volta raggiunto il tessuto tale cellula della memoria effettrice cercherà
l’antigene per cui è specifica; se avviene il riconoscimento tra cellula della memoria e antigene questa sarà
trattenuta in quel tessuto. In caso contrario il linfocita effettore della memoria fuoriuscirà tramite la linfa e
andrà in un altro tessuto. La cellula della memoria effettrice produce delle citochine.
La cellula centrale della memoria, invece, presenta le addressine linfonodali e non produce citochine per
indirizzarsi in tessuti specifici, ma viaggia all’interno di tutti i linfonodi. Se avviene il riconoscimento
dell’antigene, la cellula centrale della memoria inizia (anche più rapidamente rispetto ai linfociti T naive) ad
andare incontro al fenomeno dell’espansione clonale, dando origine a molte cellule effettrici.
Le cellule effettrici della memoria e le cellule della memoria centrale rappresentano due pool di cellule, dei
quali uno tampona la situazione nell’immediato (linfociti T della memoria effettori) e l’altro investe in una
risposta più lenta ma massiccia (linfociti della memoria centrale).

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Se un linfocita T viene attivato in un linfonodo, si ferma al suo interno in modo tale che abbia luogo
l’interazione stabile tra cellula dendritica e linfocita T naive; questa deve durare dalle 6 alle 8 ore affinché la
cellula naive riceva abbastanza segnali di attivazione per diventare una cellula effettrice.
Successivamente all’interazione ferma, il linfocita T è ancora presente nel linfonodo e va incontro a
espansione clonale: il linfonodo che drena un tessuto reattivo si ingrossa a causa dell’aumento del numero
di cellule presenti al suo interno. Terminato il periodo di attivazione, i linfociti T effettori lasciano il
linfonodo per dirigersi nei tessuti e svolgere la loro funzione.
Il numero di linfociti T naive presenti nella linfa di un vaso effettore è costante finché non viene
somministrato l’antigene specifico: in tal caso si registra un crollo del numero dei linfociti T che fuoriescono
dal linfonodo a causa della loro attivazione e del trattenimento degli stessi all’interno del linfonodo. La
permanenza può durare fino a qualche giorno, dopodiché i linfociti T attivati escono in massa dal linfonodo
dirigendosi ai tessuti periferici.
La permanenza del linfocita T che si sta attivando nel linfonodo è regolata da precise molecole. La molecola
principale che regola il trattenimento all’interno del linfonodo è un recettore chemiotattico per un lipide
(non è un recettore per chemochine) a 7 domini transmembrana. Tale recettore è associato a proteine G e
lega la sfingosina 1-fosfato (S1P).
Tutti i linfociti T naive esprimono il recettore per la sfingosina 1-fosfato. Questo lipide è presente ad alte
concentrazioni in tutti i fluidi corporei (nel sangue, nella milza, ecc.) e i recettori per la S1P, essendo
esposti per tempo prolungato al loro ligando, vengono desensitizzati. Quindi, il recettore per la sfingosina
1-fosfato funziona come i recettori del gusto o dell'olfatto, con i quali condivide la medesima struttura a 7
domini transmembrana (facendo un paragone, dopo un periodo abbastanza prolungato di esposizione ad
un sapore o ad un profumo, perdiamo la percezione di quel sapore o di quell'odore)
[ndr: la desensitizzazione è una proprietà che determina, in seguito all’attivazione continua del recettore da
parte del ligando, la riduzione della capacità del recettore di andare incontro a quelle modifiche
conformazionali necessarie al suo funzionamento. Tale fenomeno è reversibile appena il ligando si stacca
dal recettore]

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Nel linfonodo, invece, la concentrazione di sfingosina 1-fosfato è mantenuta bassa dall’azione di un
enzima che provvede a degradare il lipide. Proprio la bassa concentrazione di sfingosina 1-fosfato
permette al linfocita T naive (penetrato nel linfonodo) di attivare il recettore chemiotattico per la S1P.
In particolare possono verificarsi due eventi:
 se il linfocita T naive non trova l’antigene a livello linfonodale il recettore (che prima dell’ingresso
nel linfonodo era desensitizzato) in assenza di alte concentrazioni di sfingosina 1-fosfato ritorna
ad essere espresso e a funzionare. Tale recettore riconosce il gradiente chemiotattico del ligando
presente nella linfa e permette la fuoriuscita del linfocita stesso dal linfonodo.
 Se invece il linfocita T riconosce l’antigene e si attiva, viene up regolato il CD69. Questa proteina
va a legarsi fisicamente al recettore della sfingosina 1-fosfato e lo trattiene all’interno della
cellula linfocitaria, impedendo che venga espresso in modo funzionale sulla sua superficie. Il
recettore intrappolato all’interno della cellula risulta insensibile al gradiente di sfingosina 1-
fosfato presente nella linfa, ed il linfocita T rimane all’interno del linfonodo. Al termine del
processo di attivazione, il recettore per la sfingosina 1-fosfato viene riespresso sulla superficie e il
linfocita T attivato potrà fuoriuscire dal linfonodo.

Domanda: Qual è il ruolo di CD69 nell’impedire l’espressione della sfingosina 1-fosfato?


Ci sono delle proteine che non hanno una particolare funzione: CD69 ne è un esempio. Essa non ha
una funzione propria ma regola l’azione di altre proteine, associandosi ad esse. Un linfocita T naive
esprime il recettore per la sfingosina 1-fosfato, ma essendo elevata la concentrazione del suo
ligando nei fluidi corporei il recettore è desensitizzato. Il linfocita T vergine arriva poi nel linfonodo e
inizia a cercare il suo antigene, ma nelle ore di permanenza nel linfonodo si trova in un ambiente
povero di ligando, che viene continuamente degradato. Il linfocita T riesce così ad esprimere il
recettore per la sfingosina 1-fosfato, che gli permetterà di uscire dal linfonodo perché segue il
gradiente di sfingosina 1-fosfato presente nella linfa. Tuttavia, se il linfocita T naive viene attivato
comincia ad esprimere un corredo di proteine diverse. Un linfocita T appena attivato esprime la
proteina CD69, la quale va a legarsi al recettore della sfingosina 1-fosfato e lo trattiene all’interno
della cellula, in modo tale che non venga esposto sulla superficie del linfocita per tutto il processo di
attivazione della cellula. Terminata l’attivazione del linfocita T la produzione di CD69 viene spenta e
il recettore della sfingosina 1-fosfato può tornare in superficie, rispondere al gradiente
chemiotattico presente nella linfa e determinare la fuoriuscita del T effettore dal linfonodo

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TRANSMIGRAZIONE DEI LINFOCITI T

Come già detto, i linfociti T naive si dirigono selettivamente nel linfonodo per aumentare la probabilità di
incontrare l’antigene per cui sono specifici. I linfociti T effettori, invece, hanno perso la capacità di entrare
nel linfonodo. Similmente, altre cellule quali i neutrofili e i monociti non sono in grado di entrare all’interno
di un linfonodo.
Nasce spontanea la seguente domanda: perché i linfociti T naive sono in grado di entrare nei linfonodi
quando altre cellule non lo sono?
Per rispondere bisogna tener presente che l’ingresso dei linfociti T è un evento dettato dall’espressione di
specifiche molecole.

I linfociti T naive entrano nei linfonodi attraverso le venule a endotelio alto. Le venule post capillari
presentano delle cellule endoteliali basse, e una volta attivate tendono ad aprire gli spazi tra cellula e
cellula per favorire la diapedesi; le HEV, invece, presentano cellule endoteliali alte e cubiche. Questa
diversa morfologia è funzionalmente significativa: le HEV costituiscono una barriera che impedisce
l’ingresso casuale di cellule o di molecole all’interno del linfonodo. L’endotelio alto fisiologicamente è
presente esclusivamente nei linfonodi; si può però trovare in tessuti, come la cute, in alcune condizioni di
infiammazione cronica.
Ad esempio, nella cute di un paziente affetto da lupus vi sono dei vasi che hanno le caratteristiche di
endotelio alto e che esprimono i marcatori specifici normalmente espressi dalle cellule dell’endotelio alto.

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Il microambiente quindi che determina la trasformazione di un endotelio normale in un endotelio alto può
instaurarsi in condizioni patologiche in tessuti diversi da quello linfonodale.
I linfociti T naive riescono ad attraversare le HEV, nonostante la loro funzione di barriera, utilizzando due
famiglie di molecole necessarie per il processo di trasmigrazione:

 le molecole di adesione: tra cui le selectine, responsabili del rotolamento del linfocita T naive
sull’endotelio alto; il rotolamento consente il riconoscimento dei fattori chemiotattici o
chemochine presenti sulla superficie dell’endotelio.
 le chemochine (o fattori chemiotattici): riconosciute dopo il rolling, determinano l’attivazione del
linfocita T naive, l’attivazione delle integrine, l’adesione ferma e la trasmigrazione attraverso
l’endotelio alto.

I linfociti T naive riescono a passare attraverso l’endotelio alto in quanto, a differenza di altri tipi cellulari,
sono provvisti di entrambi gli elementi indispensabili per la trasmigrazione (molecole di adesione e
recettori chemiotattici).
Queste molecole e fattori cruciali per direzionarsi in un tessuto e per consentire l'extravasazione del
linfocita sono definite addressine o molecole di accasamento (le addressine linfonodali, per esempio,
dirigono i linfociti T al linfonodo). Quindi, il linfocita T naive comincia a rotolare sulle cellule dell’endotelio
alto, si fermerà e fuoriuscirà dalle HEV per localizzarsi nella regione paracorticale del linfonodo. Il linfocita T
naive fa rolling sull’endotelio alto perché comincia ad esprimere la L-selectina.
Per quanto riguarda le selectine, la E-selectina e la P-selectina sono espresse dall’endotelio, mentre la L-
selectina è espressa dai leucociti, in particolare dai linfociti T naive.
Il ruolo della L-selectina è importante per l’ingresso del linfocita T vergine nel linfonodo, in quanto tale
selectina ha sulla superficie dell’endotelio alto 2 ligandi: GlyCAM1 e CD34.
L’espressione della L-selectina permette al linfocita T naive di interagire con l’endotelio alto e di rotolare.
Dopo questa prima interazione il linfocita T naive esprime il recettore CCR7, che lega le due chemochine
(già considerate) ancorate sulla sulla superficie dell’endotelio:
- SLC / CCL21, chemochina prodotta dalle cellule endoteliali,
- MIP-3β / CCL19, prodotta da cellule dell’area paracorticale (comprese le cellule dendritiche) e che
diffonde, andandosi a legare sulla superficie dell’endotelio.

Addressine linfonodali o PLA Funzioni Ligandi


L-selectina Rolling GlyCAM1 (sulla superficie dell’endotelio alto)
CD34 (sulla superficie dell’endotelio alto)
MadCAM-1
CCR7 Adesione ferma e SLC / CCL21, prodotta dalle cellule endoteliali
trasmigrazione MIP-3β / CCL19, prodotta dalle cellule dell’area
paracorticale del linfonodo

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L’espressione di CCR7 e il riconoscimento da parte del recettore dei suoi ligandi determina l’adesione
ferma, e fa sì che la trasmigrazione abbia inizio.
La L-selectina è espressa anche da altre cellule. I neutrofili fanno rolling sull’endotelio alto poiché
esprimono la L-selectina, ma non sono in grado di attuare l’adesione ferma e di attraversare le HEV
perché non esprimono il recettore CCR7.
Anche le cellule che presentano CCR7 ma non esprimono la L-selectina non riescono ad attraversare le HEV.
Per accasarsi, per fuoriuscire dalle venule ad endotelio alto e trasferirsi all’interno del linfonodo è
necessaria la combinazione di due segnali: L-selecitina e CCR7. La presenza di uno solo di essi non è
sufficiente, ed è questo che ne determina la specificità.

Il linfocita T effettore non è in grado di attraversare le HEV perché, una volta attivata, la cellula T non
esprime più la L-selectina e non è in grado di fare rolling sulla superficie dell’endotelio.
Un'eccezione, tuttavia, è costituita dai linfociti T della memoria centrale: questi sono riconoscibili proprio
perché continuano ad esprimere, pur essendo linfociti T effettori, la L-selectina e CCR7. Esprimendo le
addressine linfonodali, i linfociti T della memoria centrale conservano la capacità di rientrare nei linfonodi.
Da ciò si intuisce che il corredo di molecole espresse sulla superficie del linfocita T naive è diverso dal
corredo di molecole espresse dal linfocita T effettore. L’attivazione di un linfocita T non corrisponde solo
all’acquisizione di funzioni effettrici, ma anche ad un cambio delle proteine di membrana che hanno
specifici significati funzionali: un linfocita T attivato non deve rimanere all’interno di un linfonodo ma deve
essere in grado di entrare nei tessuti periferici, mentre il linfocita T naive necessita della L-selectina per
entrare nel linfonodo e cercare l’antigene.
Le differenze principali tra linfociti T naive e linfociti T effettori riguardano:
 l’espressione di L-selectina, caratteristica dei linfociti T naive e assente nei linfociti T effettori. In
particolare, questi ultimi esprimono al posto della L-selectina una β1 integrina definita VLA4 (very
late antigen 4 così chiamata perché si esprime tardivamente nel processo di attivazione).
 CD45, una fosfatasi che entra in gioco nell’attivazione dei linfociti T naive ed è presente in varie
isoforme:
 tutti i linfociti T naive presentano la forma CD45 RA,
 mentre tutti i linfociti effettori della memoria presentano la forma CD45 RO.
Quindi, è possibile analizzare i linfociti che abbiamo in circolo e definire quanti sono naive e quanti
sono stati attivati, ovvero sono linfociti della memoria.

La proporzione tra questi due compartimenti cambia con l’età: nel bambino si ha una
preponderanza di cellule CD45 RA in circolo, mentre nell’anziano la maggior parte delle cellule in
circolo sono CD45 RO. Il motivo di ciò risiede nel fatto che l’anziano produce meno cellule nuove
rispetto al bambino, la maturazione dei linfociti è ridotta e in tale soggetto aumenta il numero di
cellule della memoria che rimangono dopo ogni incontro con gli antigeni.
 Un linfocita T effettore, a differenza di un linfocita T naive, esprime anche maggiori livelli di due
molecole di adesione: LFA1, che è una β2 integrina che lega ICAM-1, e CD44, che non riconosce un
controrecettore specifico ma riconosce delle proteine della matrice extracellulare e garantisce
l’ancoraggio dei linfociti T attivati al tessuto. Inoltre, un linfocita T attivato esprime anche maggiori
livelli di CD2, molecola importante per l’attivazione.

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USCITA DEI LINFOCITI T DAI LINFONODI

Una volta fuoriuscito dal linfonodo, il linfocita T effettore si dirige nel tessuto in cui è penetrato l’antigene,
ovvero nel tessuto in cui è richiesta la sua azione e dove è stato inizialmente riconosciuto l’elemento
infettivo. Ad esempio, se il linfocita T è stato attivato per rispondere ad un antigene riconosciuto a livello
dei polmoni, il linfocita T effettore arriverà a livello dei polmoni e non in altri tessuti periferici.
Come fa il linfocita T effettore fuoriuscito dal linfonodo e immesso nel circolo sanguigno ad essere
indirizzato in quel preciso tessuto?
Negli ultimi 10 anni si è capito che la distribuzione dei linfociti attivati nei vari distretti anatomici è
coordinata da precise molecole: le addressine cutanee, che li indirizzato nella pelle, e le addressine
mucosali, che li indirizzano nelle mucose.

Addressine cutanee
I linfociti T che devono rispondere contro antigeni penetrati attraverso l’epitelio esprimono le addressine
cutanee. Come visto prima, le adressine sono di due classi (molecole di adesione e fattori chemiotattici) e
solamente la combinazione delle due classi determina la specificità.

L’addressina cutanea che appartiene alle molecole di adesione è CLA; questa proteina di adesione lega la E-
selectina presente sulle cellule endoteliali della cute.
I recettori chemiotattici che indirizzano i linfociti T attivati nella pelle sono di due tipi: CCR4 e CCR10,
ovvero due recettori per le famiglie CC delle chemochine.
 CCR4 lega due chemochine: MDC e TARC.
 CCR10 lega CTACK
CLA è espressa da circa il 50% delle cellule della memoria in circolo. Queste sono cellule della memoria per
antigeni che sono stati inizialmente riconosciuti nella pelle. Il restante 50% delle cellule della memoria
circolanti esprime molecole che indirizzano verso i tessuti mucosali.

Addressine cutanee Ligandi


CLA (molecola di adesione) E-selectina
CCR4 (recettore chemiotattico) MDC
TARC
CCR10 (recettore chemiotattico) CTACK

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Addressine mucosali
Per quanto riguarda le addressine mucosali va menzionata l’integrina α4β7, una molecola di adesione che
monta la catena α4 insieme alla catena β7. Senza questa molecola di adesione nessun linfocita riesce ad
andare nei tessuti mucosali.
L’integrina α4β7 riconosce sulle cellule effettrici il ligando MadCAM-1, che è espresso sull’endotelio delle
mucose.
Quando invece facciamo riferimento ad un linfocita T naive, MadCAM-1 può essere riconosciuto dalla L-
selectina che questo linfocita vergine esprime. Ciò permette ad un linfocita T naive di andare a livello
mucosale.
Il recettore chemiotattico appartenente alle addressine mucosali è CCR9 e riconosce TECK, una chemochina
espressa a livello intestinale.

Addressine mucosali Ligandi


integrina α4β7 MadCAM-1

CCR9 TECK

La combinazione di questi due elementi permette l’ingresso nei linfonodi che drenano le mucose intestinali.
Il corredo di molecole di adesione e di recettori chemiotattici che il linfocita T presenta costituiscono le
chiavi di ingresso in un tessuto piuttosto che in un altro.
Si pone un altro problema: cosa “dice” al linfocita di andare nella cute (e quindi esprimere certe molecole)
piuttosto che nell’intestino?
Da studi recenti è emerso che le cellule dendritiche sono cruciali nell’indirizzare l’homing, ossia
nell’accasamento dei linfociti T che si stanno attivando. Quando presenta l’antigene al linfocita T
(stabilendo un’interazione che dura delle ore), la cellula dendritica lo istruisce anche sulla sua destinazione.
Mentre attiva il linfocita, la cellula dendritica produce dei fattori d’indirizzamento che stimoleranno nel
linfocita T l’espressione delle addressine cutanee o delle addressine mucosali.

Esempio: Si prendono dei linfociti T naive e si procede ad attivarli in vitro, ponendoli in contatto con
l’antigene presentato da cellule dendritiche specifiche, purificate dai linfonodi mesenterici. I linfociti T
attivati, rimessi in vivo, si dirigono nell’intestino.
Ancora: se si attivano in vitro dei linfociti T naive con cellule dendritiche che provengono da linfonodi
superficiali che drenano la cute, una volta inoculati in vivo i linfociti T effettori si indirizzeranno a livello della
cute.

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I principali fattori d’indirizzamento prodotti dalle cellule dendritiche sono:
- l’acido retinoico: molecola cruciale per l’indirizzamento dei linfociti attivati nelle mucose
intestinali.
Le cellule dendritiche presenti nei linfonodi mesenterici sono caratterizzate da un’elevata
espressione dell’enzima che sintetizza l’acido retinoico. L’acido retinoico prodotto dalla cellula
dendritica induce, sia nei linfociti T che in quelli B, l’espressione delle addressine intestinali (α4β7
e CCR9);
- la vitamina D: molecola importante per l’indirizzamento a livello della cute. Le cellule dendritiche
che drenano la cute esprimono elevati livelli di vitamina D. La vitamina D prodotta dalle cellule
dendritiche induce nei linfociti T l’espressione delle addressine cutanee (CLA, CCR4 e CCR10).

I fattori che produce una cellula dendritica dipendono dal microambiente linfonodale, che è diverso in
relazione al tessuto in cui si trovano.
In base al contesto citochinico in cui la cellula dendritica si trova all’interno del linfonodo, essa esprimerà
certe molecole piuttosto che altre. Questo determina la specificità della cellula effettrice che entrerà in
circolo.
Per indirizzare i linfociti effettori al polmone sono importanti l’integrina α4β1 e il recettore chemiotattico
CCR4. La selettività in questo caso è più difficile da notare, ma è stato osservato che facendo il knockout di
tali fattori i linfociti non si indirizzano più nel polmone.
Anche i linfociti B necessitano di addressine.
I linfociti B che producono le IgA (anticorpi secreti nelle mucose) esprimono le addressine mucosali α4β7 e
CCR9; i linfociti B che producono le IgG esprimono altre addressine, tra cui α4β1.

Lo stesso indirizzamento che abbiamo compreso per i linfociti T funziona per i linfociti B e determina la
specificità di risposta in un determinato tessuto o organo.
Alla base della distribuzione dei leucociti nei vari distretti anatomici (in condizioni omeostatiche o in
condizioni reattive) vi sono delle regole precise, dalle quali dipendono la selettività del reclutamento e
quindi anche la selettività di funzione. È la combinazione tra i membri di due classi, le molecole di adesione
e i fattori chemiotattici, che determina la griglia di selettività. Degli stessi elementi possono essere condivisi
da più cellule, ma solo alcune cellule hanno il doppio codice per andare in un distretto piuttosto che in un
altro.

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