Molecular Markers Volume 1 Es

Prefacio
El uso de los marcadores moleculares puede facilitar y hacer más eficaces el uso y la
conservación de la diversidad biológica. Con ellos pueden determinarse relaciones
filogenéticas, pueden identificarse redundancias en un banco de germoplasma, y es
posible también descubrir genes nuevos. Aunque este módulo titulado Tecnologías de
Marcadores Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de
Aprendizaje tiene la intención de promover el desarrollo de capacidades y estimular la
investigación en recursos fitogenéticos en todo el mundo, está especialmente dirigido a
los países cuyo acceso a la bibliografía científica actualizada y a las tecnologías de
investigación es limitado.
El uso de los marcadores moleculares es costoso y por tanto los recursos financieros
deben usarse de la manera más sensata posible. En consecuencia, tiene una
importancia crucial la actitud del investigador hacia el uso de la tecnología: no la
adoptará simplemente porque puede hacerlo o porque es la de última moda, sino
porque la eligió concienzudamente como la más apropiada para responder las
preguntas biológicas que quiere resolver.
Nuestra ilusión es que este módulo en línea le dé a usted, su usuario, el contexto,

conocimiento y herramientas para tomar decisiones correctas al usar sus recursos.
Prólogo
Los recursos fitogenéticos son un componente clave del desarrollo sostenible de la
agricultura y la silvicultura. Su contribución al desarrollo viene dada por las
posibilidades de aumentar la producción de alimentos, erradicar la pobreza y proteger el
ambiente. La pérdida de los recursos genéticos y, en consecuencia, de la diversidad
genética que representan, es una realidad generalizada. Es, por tanto, de vital
importancia que desarrollemos estrategias adecuadas y eficaces para conservar estos
recursos genéticos. Necesitamos primero ampliar nuestro conocimiento de la
diversidad genética, e introducir enfoques nuevos y potentes que conduzcan, con el
tiempo, a la identificación de genes útiles en el germoplasma. Asimismo, la efectividad
en el uso de los recursos genéticos será un prerrequisito importante de su conservación
sostenible.
Las tecnologías de marcadores moleculares son el medio más avanzado y,

posiblemente, el más eficaz para entender los fundamentos de la diversidad genética.
Son herramientas eficientes y exactas con las cuales se puede identificar y evaluar la
variación genética de manera rápida y minuciosa. Cuando se aplican tecnologías
moleculares para responder a las preguntas biológicas que sirven de base a la
comprensión de la diversidad genética, podemos hacer progresos notables en la
velocidad y en la profundidad para lograr una conservación adecuada y, en
consecuencia, la disponibilidad de los recursos genéticos para el mejoramiento de los
cultivos. Ahora bien, dado que la investigación con marcadores moleculares es costosa
y que los recursos financieros son limitados, éstos deben usarse tan razonablemente
como sea posible.
Este conjunto de módulos de entrenamiento pretende contribuir al desarrollo de

capacidades en el uso de las tecnologías de marcadores moleculares, con el propósito
de que los recursos humanos formados y las instituciones capaces de "seguirle el ritmo
al progreso científico" sean la clave de la conservación de los recursos genéticos. Las
autoras, muy conscientes de esta necesidad de capacitación, han desarrollado este
conjunto de módulos, el primero de los cuales, titulado Tecnologías de Marcadores
Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de Aprendizaje,
se concentra en el desarrollo de las habilidades de manejo de las tecnologías
moleculares. Este módulo permitirá que, quienes trabajen en recursos fitogenéticos,
tomen decisiones apoyados en información más sólida sobre los métodos que deben
emplear para comprender mejor y, por tanto, proteger efizcamente los recursos
genéticos que son la base de nuestra misma existencia.
Jan Engels
Director
Grupo de Ciencia y Tecnología de los Recursos Genéticos
IPGRI
Lo que usted debe saber sobre este módulo
Tenemos la firme convicción de que usted, como estudioso de la diversidad fitogenética,
debe conocer sus objetivos, sus limitaciones y los resultados que quiere conseguir. Por
consiguiente, hemos querido tratar los siguientes temas:
• Los principios fundamentales de la diversidad genética.

• Las cualidades de los marcadores empleados para medir esa diversidad.
• Las tecnologías que más se usan, entre ellas las que se basan en el estudio
de las proteínas, en el análisis del ADN y en la reacción en cadena de la
polimerasa.
Los procedimientos experimentales más importantes se explican con gráficos

ilustrativos y fotografías, y se dan ejemplos reales de la aplicación de las tecnologías a
casos concretos del estudio de la diversidad genética o del manejo del germoplasma.
Con estos ejemplos esperamos contribuir a que el módulo se use como un elemento
educativo, es decir, como una herramienta de autoayuda o como componente de un
programa de estudios universitario.
Comparamos también las diversas técnicas, es decir, evaluamos sus ventajas y sus
inconvenientes, así como el costo relativo de cada procedimiento; de este modo
ayudamos al investigador principiante a entender los componentes clave para que elija
los procedimientos que más se adapten a su investigación.
Puesto que el módulo fue diseñado como una ayuda en la capacitación o como
herramienta de referencia, trae también listas de referencias clave, de referencias sobre
aplicaciones adicionales a las presentadas, y del equipo necesario.
Este módulo está dirigido a científicos que tengan no sólo una formación mínima en
genética y en biología molecular de las plantas, sino también un conocimiento práctico
de los recursos fitogenéticos y de los asuntos relacionados con su conservación y
manejo. Esperamos que sea de especial utilidad para aquellos que trabajan en países
en desarrollo, donde los materiales impresos o no están disponibles, o son costosos o
están desactualizados. Deseamos también que sea útil para los profesores de ciencias
que quieran acceder a una síntesis global de las tecnologías actuales del ADN y de la
aplicación que pueden tener en la conservación y en el uso de la diversidad biológica.
Para que los usuarios puedan seleccionar sólo aquellas secciones de su interés, el
módulo está dividido en submódulos complementarios e independientes. Exceptuamos
la Introducción, que tiene relevancia para todas las secciones y que siempre debe
considerarse. Por tanto, el módulo en su conjunto puede usarse como referencia, como
un instrumento de renovación o de actualización para el científico que necesita tomar
nuevas decisiones en su investigación, o como una guía para desarrollar talleres
técnicos de corta duración.
La actualización y la información de retorno tienen una importancia crítica en campos

que evolucionan rápidamente, como la genética molecular (y sus tecnologías asociadas)
y los recursos fitogenéticos. Confiamos, por ello, que podremos actualizar este módulo
a intervalos relativamente frecuentes.
Para dar una respuesta eficaz a nuestros colaboradores y atender las necesidades de
otros usuarios, agradeceríamos mucho su opinión sobre la organización, el contenido y
la utilidad del módulo. Puede escribirnos a: cdevicente@cgiar.org; tf12@cornell.edu
o a las siguientes direcciones de correo postal:
International Plant Genetic Institute for Genomic Diversity

Resources Institute 130 Biotechnology Building
Via dei Tre Denari 472/a Cornell University
00057 Maccarese (Fiumicino) Ithaca, NY 14583
Roma, Italia
Nuestro mayor deseo es que el módulo sea usado de muchas maneras y que, junto con un
módulo acompañante sobre el análisis de datos moleculares para estudios de diversidad
genética (que aparecerá a principios del 2004) sean para muchos lectores, especialmente los
de los países en desarrollo cuyo acceso a la tecnología de vanguardia es limitado, una
oportunidad de hacer investigación avanzada en el campo de la diversidad fitogenética. De
este modo, esos módulos harán un aporte al conocimiento global de estos recursos tan
valiosos.
M. Carmen de Vicente Theresa Fulton

IPGRI IGD, Cornell University
Objetivos del módulo
En relación con los usuarios del módulo, nuestras metas son las siguientes:
• Que comprendan tanto los conceptos científicos básicos en que se apoyan los
marcadores moleculares y las tecnologías de secuenciación del ADN, como su
uso en el área de los recursos fitogenéticos
• Que desarrollen la habilidad de comparar y contrastar las ventajas y

limitaciones de cada tecnología, y que esa información les permita tomar las
decisiones más acertadas respecto a situaciones específicas de sus trabajos de
investigación
• Que tengan a mano una lista actualizada de recursos bibliográficos sobre cada
tecnología
Tecnologías de marcadores moleculares para
estudios de diversidad genética de plantas:
Módulo de aprendizaje
Introducción
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 1

Contenido
Diversidad genética
Recursos fitogenéticos
Medición de la variación genética
Marcadores genéticos:
• Descripción
• Tipos
• Propiedades deseables
Comparación de las técnicas principales:
• Tecnologías
• Costos

La diversidad genética se refiere a la variación

en:
• la secuencia del ADN,
• la cantidad de ADN por célula, o
• el número y la estructura de los cromosomas
La diversidad genética es el resultado de la

selección, la mutación, la migración, la deriva
genética o la recombinación (solas o en
conjunto). Estos fenómenos ocasionan cambios
en las frecuencias génicas y genotípicas, lo que
conduce a la evolución de las poblaciones
La diversidad genética se refiere a la variación de los genes de las especies, o sea, a la

variación hereditaria dentro y entre poblaciones de organismos. En realidad, todas las
variaciones provienen de la secuencia de los cuatro pares de bases que componen la
molécula de ADN y que constituyen el código genético. Es posible encontrar otros tipos de
diversidad genética en otros niveles de organización del núcleo celular, por ejemplo, en la
cantidad de ADN por célula, en el número de cromosomas y en la estructura del ADN.
La generación de nueva variación genética se produce continuamente en los individuos a

causa de las mutaciones cromosómicas y génicas, las cuales se propagan, en los organismos
de reproducción sexual, mediante la recombinación. La variación genética recibe también el
influjo de la selección. Las consecuencias de estos fenómenos son los cambios en las
frecuencias genotípicas y alélicas, que son los responsables de la evolución de las
poblaciones. El fitomejoramiento y otros procesos de selección artificial pueden originar
cambios similares en la variación genética.
Recursos fitogenéticos
Entre los recursos fitogenéticos se incluye la

variación genética actual, con utilidad potencial
para el futuro de la humanidad
Los recursos fitogenéticos comprenden:
• Parientes silvestres de las especies cultivadas
• Especies silvestres
• Variedades tradicionales o razas locales
• Cultivares comerciales, híbridos o líneas de
mejoramiento
Debemos conservar los recursos fitogenéticos

para su uso eventual
Los recursos fitogenéticos comprenden la variación genética presente y potencialmente útil

para el futuro de la humanidad. Estos recursos incluyen las variedades tradicionales y las
razas locales; los cultivares comerciales, los híbridos y otros materiales desarrollados
mediante el fitomejoramiento; los parientes silvestres de las especies cultivadas; otros
materiales que podrían usarse en el futuro para la agricultura o en beneficio del ambiente. En
consecuencia, los recursos fitogenéticos deben conservarse, siendo el motivo fundamental su
posible utilización como fuente de variación genética potencialmente útil.
Medición de la variación genética
La conservación y el uso eficaz de los recursos

fitogenéticos requieren de una evaluación
minuciosa de la variación genética que
contienen
La variación genética puede medirse en dos

niveles:
• En el fenotipo: es la combinación de los caracteres
individuales que resultan de un genotipo y de su
interacción con el ambiente
• En el genotipo: es la constitución genética
particular de un organismo
Para poder conservar y usar la variación genética, primero hay que evaluarla, es decir, es
preciso determinar su extensión y distribución. La variación puede evaluarse a nivel tanto
fenotípico como genotípico. La evaluación de la variación fenotípica se concentra en los
rasgos morfológicos, o sea, en aquellas características que definen la forma y la apariencia
de un conjunto de individuos. Algunos de estos caracteres pueden considerarse ‘genéticos’ si
su presencia en individuos emparentados es hereditaria y no depende del ambiente. Esto
quiere decir que esos caracteres están asociados con una secuencia específica de ADN.
La evaluación de la variación genotípica se hace al nivel de la molécula de ADN, que es la

responsable de la transmisión de la información genética. La molécula de ADN está
compuesta por nucleótidos organizados en una configuración de doble hélice, cuyo nivel de
complejidad aumenta hasta constituir los cromosomas.
Marcadores genéticos: Descripción
Los marcadores genéticos identifican en un

individuo las características del fenotipo, del
genotipo o de ambos
El seguimiento de la herencia de los marcadores

puede realizarse de generación en generación
Un marcador genético es un carácter cuantificable que puede detectar variación ya sea en

una proteína o en una secuencia de ADN. Una diferencia, bien sea fenotípica o genotípica,
puede actuar como marcador genético si identifica en un individuo características del
genotipo, del fenotipo, o de ambos y si, además, puede hacerse seguimiento a su herencia a
través de varias generaciones.
Es posible que un carácter genético no tenga efectos observables en el comportamiento de

un individuo. A veces, sin embargo, este carácter puede estar ligado a otros caracteres (o
correlacionado con ellos) que son más difíciles de medir y afectan, ciertamente, el
comportamiento del individuo. En tales casos, estos caracteres genéticos no observables
pueden usarse como marcadores genéticos de caracteres que están ligados a ellos, porque
indican indirectamente la presencia de una característica de interés (o en estudio). Puede
haber una correlación entre los dos tipos de caracteres, y ésta se conoce mediante un
análisis de herencia, es decir el estudio de la distribución de la característica tanto en los
progenitores como en su descendencia.
Marcadores genéticos: Tipos
Marcadores morfológicos
Marcadores proteicos (o bioquímicos)
Marcadores de ADN (o moleculares)

Marcadores morfológicos
Ventajas:
• Fácilmente disponibles
• Su evaluación requiere, generalmente, de equipo
sencillo
• Constituyen la medida más directa del fenotipo
Desventajas:
• Requieren un conocimiento práctico del cultivo o
de la especie vegetal (o de ambos)
• Están sujetos a influencias ambientales
• Su número es limitado
Tradicionalmente, la diversidad que existe dentro y entre las poblaciones se ha determinado

mediante la evaluación de sus diferencias morfológicas. Estas medidas tienen la ventaja de
que son fácilmente realizables, no requieren de un equipo sofisticado y son la apreciación
más directa de un fenotipo; por consiguiente, están al alcance para uso inmediato, lo que es
un atributo importante. Sin embargo, las determinaciones morfológicas deben ser tomadas
por un experto en la especie, están sujetas a cambios debidos a factores ambientales,
pueden variar en las diferentes etapas del desarrollo de las plantas, y su número es limitado.
Marcadores proteicos (o bioquímicos)
Se basan en las propiedades de migración de
las proteínas, las cuales permiten separarlas
mediante electroforesis
Se detectan mediante ensayos histoquímicos
específicos
Ventajas:
• Requieren de un equipo de laboratorio
relativamente sencillo
• Son un valioso complemento de la evaluación
morfológica
Desventajas:
• Están sujetos a influencias ambientales
• Su número es limitado
Para superar las limitaciones de los marcadores morfológicos, se han desarrollado otros tipos
de marcadores, tanto a nivel proteico (del fenotipo) como a nivel del ADN (del genotipo). Los
marcadores proteicos se conocen también como 'marcadores bioquímicos' aunque se les
incluye equivocadamente, y cada vez con más frecuencia, en una clase común bajo la
denominación de ‘marcadores moleculares’.
Los marcadores proteicos (proteínas de almacenamiento de la semilla e isoenzimas) se

obtienen mediante electroforesis, aprovechando las propiedades migratorias de las proteínas
y de los enzimas, y se detectan mediante tinciones histoquímicas específicas de las enzimas
que se quieren analizar.
La detección de polimorfismos —o sea, las diferencias detectables para un marcador

determinado en un grupo de individuos— en los marcadores proteicos es una técnica que
comparte algunas de las ventajas de los marcadores morfológicos. Sin embargo, los
marcadores proteicos están también limitados por la influencia del ambiente y de los cambios
que ocurren en las diferentes etapas del desarrollo. Aun así, los isoenzimas son un
complemento robusto del análisis morfométrico sencillo de la variación.
Marcadores de ADN (o moleculares)
Son polimorfismos detectados en la secuencia

del ADN del núcleo o de los organelos
Ventajas:
• Su número es, potencialmente, ilimitado
• No están sujetos a influencias ambientales
• Son una medida objetiva de la variación
Su desventaja principal es que necesitan de un

equipo técnicamente más complejo
Los polimorfismos del ADN pueden detectarse en el ADN nuclear y en el ADN de los
organelos; este último se encuentra en las mitocondrias y en los cloroplastos. Los
marcadores moleculares afectan a la molécula de ADN como tal y se consideran, por ello,
medidas objetivas de la variación. No están sujetos a las influencias ambientales, las
pruebas con ellos pueden realizarse en cualquier momento del desarrollo de las plantas, y
tienen el potencial de hallarse en número ilimitado porque abarcan todo el genoma, lo que
representa su mejor atributo.
Hay muchos tipos diferentes de marcadores moleculares y cada uno tiene propiedades
diferentes, lo que explicaremos a continuación.
Marcadores genéticos: Propiedades
deseables
Altamente polimórficos
Reproducibles
Codominantes
Distribuidos de manera uniforme en todo el
genoma
Discriminantes
No sujetos a influencias ambientales
Neutrales
De bajo costo
Fáciles de medir
Un buen marcador es:

• Polimórfico, o sea, es variable en un grupo de individuos. El grado de
polimorfismo detectado depende de la tecnología empleada para medirlo.
• Reproducible en cualquier experimento de laboratorio, ya sea en
experimentos hechos en el mismo laboratorio o en diferentes laboratorios que realicen
experimentos idénticos.
• Codominante. Según el tipo de aplicación del marcador, la tecnología elegida debe ser
capaz de detectar las diferentes formas del marcador, es decir, distinguir entre un
homocigoto y un heterocigoto (herencia codominante). Un individuo heterocigótico
muestra simultáneamente la combinación de genotipos de los dos progenitores
homocigóticos.
• Distribuido de manera uniforme en todo el genoma. Cuanto mejores sean la
distribución y la densidad de cobertura del genoma, mejor será la evaluación del
polimorfismo.
• Discriminante, o sea, capaz de detectar diferencias entre individuos estrechamente
relacionados.
• No sujeto a influencias ambientales. La inferencia del genotipo de un marcador debe
ser independiente del ambiente en que vive el individuo o de su etapa de desarrollo.
• Neutral. El alelo presente en el locus del marcador es independiente de la presión de
selección que se ejerce sobre el individuo y no tiene ningún efecto sobre ella. Esta
afirmación suele ser una suposición porque, generalmente, no hay datos disponibles
que confirmen o nieguen esta propiedad.
• De bajo costo. Su detección en numerosos individuos debe ser fácil, rápida y barata.
En la medida de lo posible, el equipo de laboratorio debe ser útil para diversos
experimentos.
Comparación de las técnicas principales
Marcador Número Codominante Polimorfismo Específico Tecnicidad Costo
de locus
Isoenzimas < 90 Sí Bajo Sí Bajo Bajo
RFLP Ilimitado Sí Medio Sí Alto Medio
RAPD Ilimitado No Medio No Bajo Bajo
DAF Ilimitado No Muy alto No Bajo Bajo
AP-PCR Ilimitado No Muy alto No Bajo Bajo
Microsatélites Ilimitado Sí Muy alto Sí Bajoa Bajoa
SCAR b
Ilimitado Sí/No Bajo/Medio Sí Medio Bajo
CAPS Ilimitadob Sí Bajo/Medio Sí Medio Bajo
ISSR Ilimitado No Alto Sí Bajo/Medio Bajo/Medio
AFLP Ilimitado No Alto No Medio Medio
Secuenciación Ilimitado Sí Alto Sí/No Alto Alto
EST Ilimitado Sí Bajo/Medio Sí Medio Medio
SNP Ilimitado Sí Muy alto Sí Alto Alto
a Cuando ya se han identificado los microsatélites y se han diseñado los cebadores
b Dependiendo de otros marcadores que ya estén disponibles
En este cuadro se comparan las técnicas principales que involucran marcadores bioquímicos
y moleculares para identificar la diversidad genética. Los criterios empleados para asignar el
nivel dentro de cada columna (sí/no, bajo/medio/alto, etc.) se basan en la experiencia y en los
resultados descritos en la literatura científica. No se puede asignar un número o un intervalo
a cada marcador y a su tecnología porque los resultados dependen estrechamente de la
especie vegetal en cuestión. Sin embargo, el cuadro presenta objetivamente la forma en que
se pueden comparar las técnicas entre ellas con respecto a una especie dada y a los
elementos contenidos en las columnas.
RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (Restriction fragment

length polymorphism)
RAPD Polimorfismo de ADN amplificado al azar (Random amplified polymorphic DNA)
DAF Amplificación de la huella de ADN (DNA amplification fingerprinting)
AP-PCR Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar (Arbitrarily primed
polymerase chain reaction)
SCAR Región amplificada caracterizada por una secuencia (Sequence-characterised
amplified region)
CAPS Secuencia de restricción amplificada y polimórfica (Cleaved amplifiedpolymorphic
sequence)
ISSR Secuencia entre repeticiones simples (Inter-simple sequence repeat)
AFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (Amplified fragment length
polymorphism)
EST Marcador de secuencia expresada (Expressed sequence tag)
SNP Polimorfismo de un solo nucleótido (Single nucleotide polymorphism)
Costos: Diferencias entre las principales
tecnologías
Procedimiento Material Costo aprox. para RFLP SSR RAPD AFLP Comentarios
96 muestras
(USD,2002,est.)
Extracción de ADN 5.40-101.40 5.40 5.40 5.40 96 micropreparaciones vs. 96

preparaciones grandes
Tubos de centrífuga o de microcentrífuga 2.40
O, placa de 96-pocillos 3.50
O, tubos de 50 ml (preparaciones grandes) 24.00
Tampón de extracción 2.00-50.00 96 micropreparaciones vs. 96

preparaciones grandes
Insumos diversos (alcohol, tampón de lisis, 1.00-25.00

puntas de pipeta, etc.)
Electroforesis en geles de 23.00 [23.00] 23.00 [23.00] [ ] = opcional, sólo para control de
agarosa calidad
Agarosa 10.00 (2 geles)
Tampón 13.00 (2 geles)
Electroforesis en geles de 1.50 1.50

acrilamida
Acrilamida 0.75 (1 gel)
Urea 0.75 (1 gel)
Tampón a
Electroforesis en geles de 4.06 4.06

secuenciación
Cebadores marcados con fluorescencia 2.56
Gel (ver electroforesis en geles de 1.50

acrilamida)
Método de visualización con 0.20-2.00 0.20-2.00 0.20-2.00

bromuro de etidio
Bromuro de etidio
Fotografía del gel 0.20-2.00 (2 geles) Papel de alta densidad vs. polaroid
a = costo despreciable (continúa en la siguiente)

Costos: Diferencias entre las principales
tecnologías (continuación)
Procedimiento Material Costo aprox. RFLPa SSR RAPD AFLP Comentarios
para
96 muestras
(USD,2002,est.)
PCR 74.30 74.30 74.30
Taq polimerasa 50 1.5 U/reacción. El costo se reducirá

considerablemente cuando expire la
patente
dNTP 24
Cebadores 0.30-0.40
Tampón con MgCl2 para PCR
Digestión con enzimas de 0.30-30.00

restricción
Enzimas 0.30-30.00 ~10 unidades/muestra, precios muy

variables
Transferencia por “Southern” 30.50
Tampones (HCl, NaOH) 4 (2 geles)
Membrana de nilón 24 (2 geles) El costo se reduce con cada reutilización

del filtro
Papel secante 2.50 (2 geles)
Hibridación 3.35 Sonda de hibridación para 96 muestras
Tampón b
ST ADN (u otro bloqueador) 0.30
Mezcla LS para marcaje 0.30
Radioisótopo (32P) 2.50
Otros reactivos, tubos 0.25
TOTAL 62.75-190.25 85.16-110.26 104.40-106.20 83.76-106.76
(para 96 muestras) (MAS vs. mapeo)

a = No se necesita PCR en el procedimiento de RFLP. Sin embargo, se pueden amplificar las sondas mediante PCR para ahorrar tiempo con un costo mínimo
b = costo despreciable

Costos: Estimación de costos generales
Costo aprox. por muestra
Procedimiento Material Costo (USD,2002,est.) Comentarios
(USD,2002,est.)
Extracción de ADN
Tubos de centrífuga o de microcentrífuga $25/1000 0.075
O, placa de 96-pocillos $3.50 0.04
Tampón de extracción ($2/litro) 0.02-0.50 Micropreparación vs. preparación grande
Tris $270/5 kg
Sorbitol $70/5 kg
Varios (EDTA, etc.)
Insumos varios (alcohol, tampón de lisis, puntas, etc.) 0.01-0.25
Taladro y maza de mortero (opcional) $100
“Genogrinder” (opcional) $8000
Machacador de hojas (opcional) $500
Electroforesis en geles de agarosa
Agarosa $365/500 g 0.11 6 g/gel, ~40 muestras/gel
Tampón (Tris, EDTA, NaAc) $6.50/litro 0.05
Unidad de gel horizontal $400
Fuente de energía eléctrica $400 (2 enchufes)
Electroforesis en geles de acrilamida ~96 muestras/gel
Acrilamida $30/100 ml
Urea $42/500 g
Unidad de gel vertical $1000
Fuente de energía eléctrica $400 (2 enchufes)
Secador de geles $1500
Electroforesis en geles de secuenciación
Cebadores marcados con fluorescencia $40/1500 muestras 0.03
Gel $3
Patrones de tamaño $12/gel
Programa informático para analizar geles < $100,000
Equipo de secuenciación $100,000
(continúa en la siguiente)
Los costos presentados aquí asumen la existencia de un laboratorio básico equipado con
cristalería, contenedores de plástico, calentadores con agitador, medidores de pH, balanza,
refrigerador, congelador, agua destilada, pipetas y puntas, y centrífuga.
Estos costos varían de un país a otro y se han calculado basándose en los precios de los
Estados Unidos. Debido a que en muchos países estos costos serán más altos, deben
tomarse como un indicativo y usarse para comparar las diferentes tecnologías y el equipo
alternativo.
Costos: Estimación de costos generales (continuación)
Procedimiento Material Costo (USD,2002, est.) Costo aprox. por muestra Comentarios
(USD,2002,est.)
Método de visualización con bromuro
de etidio
Bromuro de etidio $100/10 g a Se puede reusar por mucho tiempo
Transiluminador $1000-$2000
Equipo de fotografía $3000-$12,000 Tipos altamente variables
Foto del gel $0.10-$1.00 0.0025-0.025 Papel de alta densidad vs. polaroid; ~40 muestras/gel
PCR
Termociclador $7000-$23,000 Tétrada de 96-pocillos (cuatro placas de 96-pocillos)
Taq polimerasa $170/500 unidades 0.51 1.5 U/reacción. El costo se reducirá drásticamente cuando expire la
patente
dNTP $250/grupo de 4 0.25
Cebadores $15-$25 0.0025-0.0042
Tampón de PCR con MgCl2
Digestión con enzimas de restricción
Enzimas $0.003-$0.30/unidad 0.03-3.00 ~10 unidades/muestra, precios muy variables
Incubador $500-$1000
Transferencia por "Southern"
Tampones (HCl, NaOH) $1.00/litro (promedio)
Membrana de nilón $180/rollo 6.00/membrana (20x10 cm)
Papel secante $124/paquete de 100 láminas grandes
Unidad de transferencia (esponjas, cubeta) $15
Hibridación
Tampón
ADN ST (u otro bloqueador) $306/10 g 0.30 0.15/ml. 1 ml usado/50 ml tampón de hibridación
Mezcla de marcaje LS $125/50 unidad 0.30
Incubador con agitación $2500
Radioisótopo (32P) $120/100 l 2.40
Reactivos varios
Gastos ambientales
Recogida de la basura $500/mes
Protección $300/estación
a = costo despreciable

En resumen
La definición de estrategias de conservación y

de uso adecuado de los recursos genéticos
requiere la evaluación de su variación
La diversidad fitogenética se puede medir
empleando marcadores genéticos de tres tipos:
morfológico, bioquímico o molecular
Un solo marcador no reúne todas las
propiedades deseadas
La elección de la técnica depende de la
naturaleza del problema biológico que se maneja
Hasta el momento usted debería saber
Qué es la variación genética y cómo puede

medirse
Las principales ventajas y desventajas de los

diferentes tipos de marcadores genéticos
Cuáles son las propiedades deseables de los

marcadores genéticos

Referencias básicas
Ayad, W.G., T. Hodgkin, A. Jaradat y V. Ramanatha Rao. 1997.
Molecular genetic techniques for plant genetic resources.
Reporte de un taller del IPGRI, octubre 9-11 de 1995, Roma.
IPGRI, Roma.
Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for
plant genetic resources conservation. p. 85-93 en Genome
Mapping in Plants (H. Paterson, ed.). R.G. Landes Company,
Georgetown, TX.
Karp, A., K.J. Edwards, M. Bruford, S. Funk, B. Vosman,
M. Morgante, O. Seberg, A. Kremer, P. Boursot, P. Arctander,
D. Tautz y G.M. Hewitt. 1997. Molecular technologies for
biodiversity evaluation: opportunities and challenges. Nature
Biotechnol. 15:625-628.
Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad y T. Hodgkin. 1997.
Molecular tools in plant genetics resources conservation: a
guide to the technologies. Boletín técnico No. 2. IPGRI, Roma.
A continuación
Tecnologías basadas en las proteínas

Nociones básicas sobre las proteínas

• Isoenzimas
Tecnologías basadas en el ADN

Tecnologías complementarias
Consideraciones finales
Glosario


Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Proteínas 1

Contenido
Estructura de las proteínas:
• Primaria
• Secundaria
• Terciaria
• Cuaternaria
Funciones de las proteínas
Enzimas:
• Descripción
• Aloenzimas e isoenzimas

La secuencia de bases del ADN instruye a la
célula sobre el modo de hacer las distintas
proteínas que necesita para funcionar como
parte del organismo en que esa célula existe
Las proteínas pueden tener distintas funciones:

unas son estructurales y otras funcionales
Las proteínas son moléculas complejas hechas

por el ensamblaje de bloques simples (los
aminoácidos) en una cadena (la cadena
polipeptídica)
La información que llevan las bases del ADN se traduce en proteínas. La molécula del
ADN se copia en un tipo distinto de ácido nucleico –el ARN o ácido ribonucleico. El ARN
se mueve en el ribosoma, un organelo que tiene a su cargo la elaboración de las
proteínas. Cada grupo de tres bases del ARN determina el aminoácido que se añade a la
molécula proteica en progreso. La cadena de ARN pasa a través del ribosoma hasta que
se complete la molécula de proteína.
Este proceso se ha llamado el 'dogma central', puesto que es la base de la vida biológica.
Los aminoácidos son compuestos orgánicos bi-funcionales que contienen un grupo básico
amino (-NH2) y un grupo ácido carboxilo (-COOH). En las proteínas se encuentran
comúnmente 20 aminoácidos distintos, con funciones y propiedades variables según la
naturaleza del grupo –R. Por ejemplo, en la alanina el grupo R es
(-CH3), mientras que en la cisteína es (-CH2-SH).
Estructura primaria de las proteínas
La estructura primaria de una proteína es el orden
de los aminoácidos en la cadena polipeptídica
AA = Aminoácido
H2O H2O
R R
NH2 AA COOH NH2 AA COOH NH2 AA COOH
+ 2 H2O
AA AA AA
Adaptado de Griffiths y col. 1996

En las proteínas, los aminoácidos se unen en cadena mediante enlaces peptídicos (de tipo
amido) que forman el pilar de la molécula. Un enlace peptídico se crea entre un grupo
básico amino (-NH2) de un aminoácido y un grupo ácido carboxilo (-COOH) de otro. La
fórmula general de un aminoácido es H2N –CHR –COOH. El grupo R puede ser muy
diverso: desde un átomo a una molécula compleja. El término ‘polipéptido’ indica,
simplemente, a una cadena larga de aminoácidos.
Una vez que la cadena de proteínas se ha terminado, debe plegarse adecuadamente para
poder funcionar. La estructura y el plegamiento de cada proteína son específicos. Todavía
no se comprende plenamente el modo en que la secuencia de los aminoácidos causa el
plegamiento de la proteína. Una proteína puede conformarse con uno o varios polipéptidos
independientes; y puede estar hecha también de láminas (es decir, cadenas de
aminoácidos que se juntan ordenadamente) que contienen estructuras en espiral.
Claramente, las propiedades de los polipéptidos y de las proteínas dependen de la
composición de sus aminoácidos.
Estructura secundaria de las proteínas
La estructura secundaria es el resultado de los
enlaces de hidrógeno locales creados a lo largo
de la base polipeptídica

La estructura secundaria es el resultado de los enlaces de hidrógeno locales que se crean

a lo largo de la cadena polipeptídica. Estos enlaces dan solidez y flexibilidad a la proteína.
Las estructuras secundarias más comunes son:
• Hélice alfa, causada por enlaces de hidrógeno dentro de la cadena polipeptídica;

por ejemplo, proteínas musculares.
• Lámina plegada beta, causada por enlaces de hidrógeno entre cadenas

polipeptídicas adyacentes; por ejemplo, la fibra de la seda.
Estructura terciaria de las proteínas
La estructura terciaria resulta de las interacciones
entre los grupos R de un polipéptido, es decir, de
los enlaces covalentes y no covalentes

La estructura terciaria resulta de las interacciones entre los grupos R de un polipéptido,

tales como los enlaces no covalentes (enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos,
interacciones hidrofóbicas) y los enlaces covalentes débiles (enlaces de tipo disulfuro
entre residuos de cisteína).
Estructura cuartenaria de las proteínas
La estructura cuaternaria resulta de las
interacciones entre dos o más cadenas
polipeptídicas para formar dímeros, trímeros,
tetrámeros, etc.

A veces un solo polipéptido es suficiente para que una proteína actúe, y entonces decimos
que la proteína actúa como un monómero. Sin embargo, es necesario a menudo que
interactúen dos polipéptidos para que la proteína ejerza su función particular. Si éste es el
caso, hablamos de un dímero; si interactúan más de dos polipéptidos, decimos que son
trímeros, tetrámeros, etc.
La estructura cuaternaria resulta de interacciones entre dos o más cadenas polipeptídicas

para formar dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. Estas cadenas se mantienen juntas
mediante enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos y, menos comúnmente, interfases
hidrofóbicas y enlaces de tipo disulfuro entre cadenas.
Funciones de las proteínas
La estructura tridimensional de las proteínas es

un resultado directo de las interacciones que
ocurren en su medio interno
La diversidad en las funciones de las proteínas

es el resultado de la complejidad de su
estructura
La estructura tridimensional de las proteínas es el resultado directo de las interacciones

que ocurren en su medio interno. En consecuencia, el conocimiento de la estructura de las
proteínas nos da mucha información sobre el modo en que realizan sus tareas en la célula.
Por ejemplo, en ambientes acuosos, los grupos R hidrofóbicos se colocan hacia el interior
de las proteínas. Los cambios de temperatura o de pH pueden afectar los enlaces no
covalentes causando roturas de la estructura tridimensional y pérdida de actividad en la
proteína. Este proceso se llama 'desnaturalización'. Las proteínas desnaturalizadas
pueden unirse para volverse insolubles en un proceso llamado coagulación.
Entre las diversas funciones de las proteínas, facilitadas por la complejidad de la

estructura de éstas, están las siguientes; se incluyen ejemplos:
• Estructura (colágeno, fibras musculares)

• Almacenamiento (gliadinas del trigo, hordeínas de la cebada)
• Enzimas (hidrolasas, transferasas, isomerasas, polimerasas, ligasas)
• Transporte (transferencia de oxígeno mediante la hemoglobina)
• Mensajería (insulina y ciertas hormonas)
• Anticuerpos (proteínas que se adhieren a partículas foráneas específicas)
• Regulación (proteínas involucradas en la regulación de la síntesis del ADN)
Enzimas: Descripción
Los enzimas son un tipo particular de proteínas

que actúan como catalizadores
Cada enzima es altamente específica respecto

al tipo de reacción química que cataliza y a las
sustancias (llamadas sustratos) sobre los que
actúa

Enzimas: Aloenzimas e isoenzimas
Las múltiples formas que toman los enzimas

permiten agruparlos en dos clases principales
según el modo en que estén codificados:
• Aloenzimas: enzimas codificados por alelos
diferentes en un solo locus
• Isoenzimas: enzimas codificados por alelos diferentes
en más de un locus
Generalmente, el término isoenzimas se aplica a

ambas clases.
A veces, cambios en los aminoácidos resultan en cambios de la estructura primaria del

enzima. Estos cambios generan polimorfismos.
En resumen
Las proteínas son los productos primarios de los

genes
Las proteínas pueden tener diversas estructuras,

que están estrechamente relacionadas con las
tareas que realizan en la célula
Los enzimas son un tipo particular de proteína,

es decir, los que actúan como catalizadores
Los enzimas pueden tener formas múltiples y se

clasifican como aloenzimas o isoenzimas

La naturaleza de una proteína
Los mecanismos que intervienen para dar a las

proteínas diferentes estructuras
La naturaleza de un enzima
La diferencia entre aloenzimas e isoenzimas

Referencia básica
Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M.
Gelbart. 1996. The nature of the gene. p. 345-358 en: An
Introduction to Genetic Analysis (6a. ed.). W.H. Freeman., NY.
A continuación

Isoenzimas
Glosario


Isoenzimas
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Isoenzimas 1

Contenido
Detección de isoenzimas
• Metodología
• Electroforesis
Equipo
Tecnología de los isoenzimas en imágenes
Interpretación de las combinaciones de bandas
Ventajas y desventajas
Ejemplos de aplicaciones
• Lysimachia sp.
• Fríjol Lima
• Cebolla

Detección de los isoenzimas: Metodología
Tratamiento del material vegetal
Electroforesis en geles de almidón o de

acrilamida
Tinción histoquímica
Análisis de los patrones de bandas
Los extractos crudos se someten a electroforesis en geles de almidón o de acrilamida y

se tratan con tinciones específicas del enzima. El resultado es un patrón de bandas
relativamente sencillo.
La variación observada en los patrones de bandas entre los individuos analizados puede
interpretarse genéticamente, tal como se haría con cualquier otro marcador fenotípico.
Detección de isoenzimas: Electroforesis (1)
En este proceso se aplica una corriente

eléctrica que favorece la separación de
moléculas por su carga y por su tamaño
La corriente hace que las moléculas se muevan

a través de los poros del gel
La sustancia que constituye el gel se escoge de

modo que sus poros sean de un tamaño
apropiado para poder separar moléculas de
tamaños y formas específicos
La electroforesis es una técnica cromatográfica que permite separar mezclas de

compuestos iónicos. Se ha adoptado como una herramienta común para el análisis
bioquímico.
Detección de isoenzimas: Electroforesis (2)
-
Cargando las muestras
Corriente eléctrica
+
Gel
Las proteínas son el producto primario de los genes. Cuando cambia la secuencia de
nucleótidos del ADN, también cambian los patrones de bandas de las proteínas. La
electroforesis de los enzimas puede revelar directamente el polimorfismo genético
puesto que exhibe las formas múltiples de un enzima específico.
Equipo
Recursos:
• Agua destilada o desionizada (o ambas)
• Reactivos
Equipo:
• Refrigerador y • Medidor de pH
congelador • Balanzas
• Fuente de energía • Moldes para solidificar
eléctrica el gel
• Hornillo o microondas • Matraces volumétricos
• Guantes gruesos de y de succión
algodón

La tecnología de isoenzimas en imágenes
Las siguientes fotografías ilustran las etapas de

laboratorio necesarias para detectar isoenzimas

Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España
El técnico de laboratorio está pipeteando la solución tampón de extracción sobre una

sección de hoja. Cada muestra se coloca en una bandejita plástica, de las que suelen
usarse para pesar productos químicos. Se pueden usar otros utensilios como placas de
vidrio, siempre y cuando estén muy limpios y no permitan la absorción del tejido
macerado.
Una vez el tampón de extracción se ha colocado sobre la muestra, ésta se machaca con
una varilla de metacrilato para lograr la rotura completa del tejido y su homogeneización
con la solución tampón. Esta operación debe hacerse lo más rápidamente posible para
evitar un aumento de temperatura. Mientras se machacan todas las muestras, las
bandejitas plásticas se van colocando sobre una capa de hielo.
Se corta un pequeño trozo rectangular de papel poroso y se mete en la bandejita en

contacto con la solución, hasta que el papel absorba la muestra.
Se vierte la solución caliente de almidón en el molde para el gel. A medida que el gel se
enfríe, adquirirá una consistencia gelatinosa. En ese momento ya estará listo para recibir
las muestras. El gel puede almacenarse en un refrigerador hasta el momento de su uso.
Un gel de almidón, preparado con antelación, se ha cortado con un bisturí,

aproximadamente a un tercio desde el extremo del molde. Luego se colocan
verticalmente, con ayuda de unas pinzas, los trozos de papel contra uno de los lados del
corte hecho en el gel.
Un aparato generador de energía eléctrica debe controlar el voltaje y la intensidad de la

corriente que requiere la electroforesis. Hay muchos modelos comercialmente disponibles,
que son equivalentes tanto en sus propiedades como en su capacidad. En el aparato de
nuestra foto pueden enchufarse simultáneamente dos unidades de electroforesis. El
generador de energía puede incluir un cronómetro para detener el proceso de
electroforesis en un momento dado.
El gel se coloca en una unidad de electroforesis y ésta dentro de una cámara frigorífica o
de un refrigerador. La unidad tiene un recipiente de solución reguladora en dos lados
opuestos (cátodo y ánodo) y el contacto entre la solución reguladora y el gel se logra con
un trozo de esponjilla delgada o de gasa. Sobre la unidad se coloca una envoltura de
plástico para evitar que la superficie del gel se seque durante el proceso y para
garantizar una buena transferencia entre los recipientes de solución reguladora. El
recorrido de las muestras puede seguirse observando un colorante azul que actúa como
control o marcador.
Cuando el proceso de electroforesis termina (se observa entonces, generalmente, una

sombra parduzca en el extremo opuesto a aquél en que se colocaron las muestras en el
gel), el gel se corta en tajadas. En la parte frontal de la foto vemos un gel listo para ser
cortado, el cual debe transferirse a un soporte de metacrilato (centro de la foto). Al fondo
puede verse el recipiente en que se colocarán las tajadas para teñirlas.
El gel está ahora sobre el soporte y unas guías delgadas (en la foto, de color negro) se
colocan en cada lado para definir el espesor de las tajadas. En la esquina superior
derecha del gel se hace un corte en diagonal que sirve de guía para determinar el orden
de las muestras una vez que las tajadas se hayan teñido.
Se coloca una placa de vidrio sobre el gel para ejercer presión mientras se hace el corte,
lo que garantiza que las tajadas sean semejantes. El gel se corta empleando una sierra
de marquetería equipada con una cuerda de guitarra.
Los enzimas diferentes requieren, para ser visualizados, de distintas soluciones de tinción.
En la foto, una solución de tinción amarillenta se vierte en un recipiente de metacrilato
antes de transferir una tajada del gel.
Una tajada de gel se está transfiriendo al recipiente que contiene la solución de tinción
deseada. Dada la fragilidad de las tajadas, se debe tener cuidado al transferirlas al
recipiente. Si una tajada se rompe, es frecuente que los pedazos rotos puedan
reorganizarse y que los enzimas puedan aún visualizarse en el gel.
Después de cierto período de incubación, una tajada de gel teñida se ve como en la

fotografía, la cual muestra la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) de la hoja de
esparceta (Onobrychis viciaefolia), un cultivo forrajero.
Interpretación de los patrones de bandas
Los principales aspectos relacionados con la

interpretación son:
La estructura cuaternaria de los enzimas (si es
monomérico, dimérico, etc.)
La condición homocigota o heterocigota de la
planta en cada locus
El número exacto de loci (isoenzimas)
El número de alelos por locus
El tipo de herencia de los genes
Los aloenzimas están controlados por alelos codominantes, lo que significa que los
homocigotos (en que todos los alelos en el locus son similares) pueden distinguirse de
los heterocigotos (en que los progenitores del individuo han contribuido con diferentes
alelos a este locus).
En el caso de enzimas monoméricos (los que constan de un solo polipéptido), las plantas
homocigóticas para un locus dado producirán una banda, mientras que las
heterocigóticas producirán dos bandas. En el caso de enzimas diméricos (los que
constan de dos polipéptidos), las plantas homocigóticas para ese locus producirán una
banda, mientras que las heterocigóticas producirán tres bandas en razón de la
asociación aleatoria de los polipéptidos.
Hay también enzimas multiméricos en los que los polipéptidos son producidos por
diferentes loci. La formación de heterómeros isoenzimáticos puede complicar
considerablemente los patrones de bandas.
Estas relaciones complejas y la importancia de interpretar los patrones de bandas

correctamente, hacen deseable a veces, e incluso necesario, un análisis genético en que
se haga, a su vez, un análisis de descendencias (F1, F2 y retrocruzamiento) de
cruzamientos artificiales entre individuos cuyo patrón de bandas es conocido.
Ejemplo 1: Formación de homómeros
Aloenzima monomérico:
Homocigoto F1
Aloenzima monomérico:
Heterocigoto F1
Este ejemplo muestra el comportamiento de los enzimas monoméricos en los

cruzamientos. Los progenitores son homocigotos para el mismo alelo en el mismo locus
o heterocigotos. En el primer caso, toda la descendencia F1 será homocigótica y, en
consecuencia, resultará una sola banda. Si los progenitores son heterocigóticos,
resultarán tres posibles fenotipos F1.
Ejemplo 2: Formación de heterómeros
Aloenzima dimérico: un gen con dos alelos
Monómeros Enzima dimérico activo
• Homocigoto
• Heterocigoto
• Homocigoto
En un cruzamiento, los enzimas diméricos pueden comportarse de tres maneras

posibles. Si ambos progenitores son homocigotos para diferentes alelos en el mismo
locus, toda la descendencia será heterocigota, pero a causa de la asociación aleatoria de
los polipéptidos, tres combinaciones son posibles; por consiguiente, tras los procesos de
electroforesis y tinción aparecerán tres bandas.
(continuación)
Aloenzima dimérico: dos genes con dos alelos
Monómeros Enzimas diméricos activos
Dímeros
Gen 1 Gen 2 intragénicos
Dímeros
intergénicos
Dímeros
intragénicos
En este segundo ejemplo con aloenzimas diméricos, los dos polipéptidos son codificados
por loci separados. Los progenitores no comparten ningún alelo. La asociación aleatoria
de los polipéptidos puede conducir a la formación de un total de 10 dímeros, porque se
forman tanto dímeros intragénicos (entre alelos en el mismo locus) como dímeros
intergénicos (entre alelos de diferentes loci).
(continuación)
Tetraploide heterocigótico (un locus, cuatro alelos)
• Monómeros
• Enzimas diméricos activos
En el ejemplo del diagrama, un tetraploide heterocigótico, que tiene cuatro alelos en un

locus, forma diez enzimas diméricos activos gracias a la asociación aleatoria entre los
cuatro monómeros.
Ventajas
• La tecnología es sólida y sumamente reproducible
• Los marcadores son codominantes, es decir,
apropiados para calcular una amplia variedad de
parámetros poblacionales y para construir mapas
genéticos
Desventajas
• Hay relativamente pocas tinciones disponibles para
la detección de enzimas
• El análisis está basado en el fenotipo
El análisis de isoenzimas es, en principio, un método sólido y reproducible. Además, los

isoenzimas son marcadores codominantes y, por tanto, apropiados para calcular todos
los parámetros poblacionales y para construir mapas genéticos.
En las plantas se han empleado hasta 90 sistemas isoenzimáticos, y en muchos casos

esos loci se han localizado en mapas genéticos.
La mayor limitación del análisis con isoenzimas es que suministra un bajo número de
marcadores, puesto que el número de ensayos histoquímicos disponibles para
detectarlos es relativamente bajo. Por tanto, a menudo, el porcentaje de cobertura del
genoma es inadecuado para hacer un estudio comprehensivo de la diversidad genética.
Otra desventaja del análisis con isoenzimas está en que los marcadores se basan en el
fenotipo. Por tal razón, los marcadores pueden estar influenciados por factores
ambientales, y las diferencias de expresión causar confusión en la interpretación de los
resultados. Puesto que la diferente expresión de los genes ocurre en distintos estados
del desarrollo o en diferentes tejidos, es importante usar el mismo tipo de material en
todos los experimentos que estén relacionados.
Flujo de genes o introgresión (o en ambos

casos)
Genética de poblaciones
Estrategias para la conservación ex situ de
germoplasma
Evolución de especies cultivadas
Evaluación y caracterización del germoplasma
Erosión genética
Estabilidad genética del material conservado
Las referencias en color púrpura se explican en detalle en las diapositivas que

vienen a continuación.
Bartsch, D., M. Lehnen, J. Clegg, M. Pohl-Orf, I. Schuphan y N.C. Ellstrand. 1999. Impact of
gene flow from cultivated beet on genetic diversity of wild sea beet populations. Mol. Ecol.
8:1733-1741.
Finkeldey, R. y O. Murillo. 1999. Contributions of subpopulations to total gene diversity. Theor.
Appl. Genet. 98:664-668.
Ibáñez, O., C. Calero, M. Mayol y A. Rosello. 1999. Isozyme uniformity in a wild extinct insular
plant, Lysimachia minoricensis J.J. Rodr. (Primulaceae). Mol. Ecol. 8:813-817.
Ledig, F.T. 2000. Founder effects and the genetic structure of Coulter pine. J. Hered. 91(4):
307-315.
Li, Z. y J.N. Rutger. 2000. Geographic distribution and multilocus organization of isozyme variation
of rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 101:379-387.
Liu, F., R. Von Bothmer y B. Salomon. 1999. Genetic diversity among East Asian accessions of the
barley core collection as revealed by six isozyme loci. Theor. Appl. Genet. 98:1226-1233.
Maquet, A., I. Zoro Bi, M. Delvaux, B. Wathelet y J.P. Baudoin. 1997. Genetic structure of a Lima
bean base collection using allozyme markers. Theor. Appl. Genet. 95:980-991.
Ortiz, R. y Z. Huaman. 2001. Allozyme polymorphisms in tetraploid potato gene pools and the
effect on human selection. Theor. Appl. Genet. 103:792-796.
Rouamba, A., M. Sandmeier, A. Sarr y A. Ricroch. 2001. Allozyme variation within and among
populations of onion (Allium cepa L.) from West Africa. Theor. Appl. Genet. 103:855-861.
Shapcott, A. 1998. The patterns of genetic diversity in Carpentaria acuminata (Arecaceae) and
rainforest history in northern Australia. Mol. Ecol. 7:833-847.
Ejemplo: Lysimachia sp.
Título:
Isozyme uniformity in a wild extinct insular plant,
Lysimachia minoricensis J.J. Rodr. (Primulaceae).
Mol. Ecol. 1999. 8:813-817
Objetivo:
Evaluar la diversidad genética de las entradas de
semilla de Lysimachia minoricensis, conservadas y
suministradas por 10 jardines botánicos europeos
Materiales y métodos:
Se analizaron, en total, 158 plantas respecto a
13 enzimas (22 loci)
Ejemplo: Lysimachia sp. (continuación)
Resultados:
No se detectó ninguna variación electroforética en
ninguno de los 22 loci enzimáticos analizados
Discusión sobre la falta de variación:
• Las técnicas electroforéticas resuelven sólo una porción
pequeña de la variación genética
• ¿La muestra era de tamaño pequeño? La muestra ofrece
un 95.6% de probabilidad de detectar la existencia de
cualquier variante alélica cuya frecuencia global fuera,
por lo menos, de 1%
• ¿Es inesperada esta ausencia de variación? Los
resultados se refieren más a la pregunta de la cantidad
de variación genética preservada ex situ que al nivel de
variación que había antes de la extinción
Ejemplo: Lysimachia sp. (continuación)
Conclusiones:
El sistema de intercambio entre jardines
botánicos no es adecuado para la conservación
eficaz del germoplasma si la variación genética
dentro de una especie está subrepresentada en
las colecciones

Ejemplo: Fríjol lima
Título:
Genetic structure of a Lima bean base collection
using allozyme markers. Theor. Appl. Genet 1997.
95:980-991
Objetivo:
Evaluar la diversidad genética y la estructura de una
colección de base de fríjol lima (Phaseolus lunatus L.),
que contenía varias entradas silvestres y razas
locales, ampliamente distribuidas
Se usaron diez sistemas enzimáticos para analizar
235 entradas de fríjol lima (1-5 semillas cada una)
recogidas en América Latina y en el Caribe
Ejemplo: Fríjol lima (continuación)
Resultados y discusión:
• Los 10 sistemas enzimáticos analizados detectaron 13 loci
(32 alelos)
• Se identificaron alelos específicos en cada acervo genético.
El dendrograma mostró claramente dos conglomerados
principales:
• Entradas de los Andes con un modelo andino de proteína de
semilla
• Entradas mesoamericanas y andinas con un modelo
mesoamericano de proteína de semilla
• Tanto las razas locales andinas como mesoamericanas se
agruparon con sus familiares respectivos
• Por término medio, el fríjol lima mostró un 76% de
diversidad entre las entradas y un 24% dentro de ellas. Las
razones de este resultado son la autofecundación, la
presencia de poblaciones pequeñas y el escaso flujo de
genes
Ejemplo: Fríjol lima (continuación)
Conclusiones:
• Un programa de conservación de P. lunatus debe
incluir formas silvestres y formas cultivadas de ambos
acervos genéticos
• Como la diversidad genética se distribuye
principalmente entre las entradas, deberían
preservarse más poblaciones o entradas para
asegurarse de que se retiene la diversidad alélica y
genotípica tanto de los acervos genéticos como de las
formas botánicas

Ejemplo: Cebolla
Título:
Allozyme variation within and among populations of
onion (Allium cepa L.) from West Africa. Theor. Appl.
Genet. 2001. 103:855-861
Objetivo:
Evaluar la diversidad genética de las poblaciones
locales de cebolla, usando isoenzimas
• Se estudiaron 16 poblaciones locales cultivadas,
muestreadas en cinco países de África Occidental
• Se analizaron nueve sistemas enzimáticos
Ejemplo: Cebolla (continuación)
Resultados:
• Cuatro sistemas fueron polimórficos (ADH, MDH,
6-PGDH, PGI) y hubo, en total, nueve alelos
• La media de alelos encontrados por locus polimórfico
fue de 2.25. Además, 67% de los alelos estaban
presentes en todas las poblaciones
• El alelo adh-a2 estaba ausente en las cinco
poblaciones de Burkina Faso. El alelo 6-pgdh-a2
estaba presente sólo en dos poblaciones, una del sur
de Níger y la otra de Nigeria del norte
Ejemplo: Cebolla (continuación)
Discusión:
• La débil diferenciación geográfica entre
poblaciones puede haber resultado del intercambio
comercial entre países del mismo idioma
• En general los heterocigotos fueron pocos, quizás
por la autogamia de las poblaciones muestreadas o
por la deriva genética resultante de la producción
de semilla a partir de cantidades pequeñas de
bulbos usados como progenitores
Conclusiones:
Para comprender mejor la variabilidad de esta
especie, sería aconsejable que se hicieran estudios
similares a nivel del continente africano

En resumen
La tecnología de los isoenzimas se basa en la
extracción de las proteínas, en su separación
mediante electroforesis y en su tinción
histoquímica
El equipo requerido es sencillo
La interpretación de los patrones de bandas es
típicamente codominante y, debido a su
complejidad, puede necesitar un análisis
genético
Los isoenzimas usados como marcadores
genéticos son sumamente reproducibles

Los pasos principales que requiere la

tecnología de los isoenzimas
Los puntos principales que deben considerarse

al interpretar los patrones de bandas
Las ventajas y desventajas de los isoenzimas,

como marcadores genéticos, en los estudios de
diversidad

Hamrick, J.L. y M.J. Godt. 1989. Allozyme diversity in plant
species. p. 43-63 en Plant population genetics, breeding, and
genetic resources (A.H.D. Brown, M.T. Cleg, A.L. Kahler y
B.S. Weir, eds.). Sinauer Associates, Sunderland, MA, E.U.
Manchenko, G.P. 1994. Handbook of detection of enzymes on
electrophoretic gels. CRC Press, Boca Raton, FL, E.U.
Murphy, R.W., J.W. Sites, D.G. Buth y C.H. Haufler. 1996.
Proteins: isozyme electrophoresis. p. 51-20 en Molecular
Systematics (2a. ed.). (D.M. Hillis, C. Moritz y B.K. Mable, eds.).
Sinauer Associates, Sunderland, MA, E.U.
Soltis, D.E. y P. Soltis (eds.). 1989. Isozymes in plant biology.
Dioscorides Press, Portland, OR.
Tanksley, S.D. y T.J. Orton (eds.). 1983. Isozymes in plant
genetics and breeding. Parte A y Parte B. Elsevier Science,
Amsterdam, Holanda.
A continuación

Fundamentos del ADN

• Polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción (RFLP)
• Tecnologías basadas en la PCR
Glosario
5FDOPMPHÓBTEF.BSDBEPSFT.PMFDVMBSFTQBSB
&TUVEJPTEF%JWFSTJEBE(FOÏUJDBEF1MBOUBT
.ØEVMPEF"QSFOEJ[BKF
**5FDOPMPHÓBTCBTBEBTFOMBTQSPUFÓOBT
t /PDJPOFTCÈTJDBTTPCSFMBTQSPUFÓOBT
t *TPFO[JNBT
.enú principal

Fundamentos del ADN
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 1

Contenido
La molécula de ADN:
• Estructura y características
• Replicación
• Empaquetamiento en el cromosoma
• Organización de las secuencias
• ADN citoplasmático
Tecnología del ADN:
• Enzimas de restricción
• Electroforesis de ácidos nucleicos
• Polimorfismo de ADN
Procedimientos para el aislamiento del ADN, en
imágenes
La molécula del ADN: Estructura y
características
El ADN y el ARN son moléculas

constituidas por filamentos de
nucleótidos
Un nucleótido consta de:

• Un azúcar pentosa
• Un grupo fosfato
• Una base nitrogenada
Los elementos fundamentales del ácido desoxirribonucleico (ADN) y del ácido

ribonucleico (ARN) son los nucleótidos. Un nucleótido consta de:
• Un azúcar pentosa: en el ADN es la desoxirribosa, y en el ARN es la ribosa

• Un grupo fosfato
• Una base nitrogenada, que puede ser (en el ADN y en el ARN):
• Bases púricas: adenina (A) o guanina (G)
• Bases pirimidínicas: citosina (C) o timina (T); el uracilo (U) reemplaza la
timina en el ARN
La molécula de ADN consta de una cadena constituida por cuatro elementos

fundamentales sencillos (A, G, C y T) que se reúnen para formar una doble hélice. Una
hélice consta de dos hebras, cada una con su soporte de azúcar-fosfato, unidas por
enlaces débiles de hidrógeno entre las bases adenina-timina (dos enlaces de hidrógeno)
y citosina-guanina (tres enlaces de hidrógeno).
La conformación de las bases A y T y la de las bases C y G son ‘complementarias’ y

esta es la razón por la que el ADN puede copiarse a sí mismo. Dos cadenas de soportes
y de bases, que corren en direcciones opuestas (antiparalelas) forman la estructura de la
doble hélice. El orden o ´secuencia’ de estas bases a lo largo de la cadena forma el
código genético que lleva las instrucciones genéticas precisas para que el organismo
funcione.
La molécula del ADN: Replicación
3’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
En ciertas circunstancias (es decir, durante la replicación del ADN celular), las dos
cadenas de la molécula de ADN se separan. La ARN polimerasa sintetiza un tramo corto
de ARN complementario a una de las hebras de ADN en un sitio específico, conocido
como el sitio de inicio de la replicación.
Esta sección corta de ARN actúa como un patrón para que comience la réplica del ADN.
Nuevas bases de ADN se acercan al extremo 3’ y se adhieren a su pareja
complementaria en la hebra del ADN patrón. Las nuevas bases se unen luego para hacer
una cadena de ADN que es 'hija' del patrón anterior. Como los nucleótidos siempre se
agregan al extremo 3’, la síntesis de ADN ocurre en la dirección que va de 5’ a 3’. Este
proceso se presenta en cada una de las cadenas de la molécula de ADN original.
La molécula del ADN: Empaquetamiento en
el cromosoma
20 Å
110 Å
14000 Å
300 Å
{
3000 Å
Å = angstrom, una unidad de longitud que equivale a 1/109 m

Una molécula de ADN es mucho más larga que un cromosoma, de manera que se
necesita un mecanismo para plegar densamente y empaquetar la fibra de ADN.
La mezcla del material del cual se forman los cromosomas se llama cromatina, y es la
suma de la molécula de ADN más algunas proteínas. En los organismos eucariotas, el
ADN se condensa con proteínas histonas, con otras no histonas y con un poco de ARN.
Las histonas se organizan en nucleosomas y dan al ADN enroscado una apariencia de
cuenta de collar. El enroscado adicional de los nucleosomas produce una conformación
de solenoide, y todavía hace falta otro nivel de empaquetamiento para llegar a la
estructura cromosómica.
Los cromosomas están constituidos por regiones eucromáticas, levemente empacadas y

que contienen la mayoría de los genes activos, y por regiones heterocromáticas,
densamente empacadas y que aparentemente desactivan los genes a su alrededor.
Con frecuencia se encuentra heterocromatina alrededor de los centrómeros.
[La definición de Angstrom está modificada a partir del Merriam-Webster en línea

(http:/www.m-w.com)]
La molécula del ADN: Organización de las
secuencias
ADN de copia única Centrómero
ADN de copia múltiple Telómeros
Adaptado de Flavell y Moore (1996)

El ADN eucariótico puede agruparse en diferentes tipos o clases:
• De copia única, genes que codifican proteínas
• ADN presente en copias múltiples:

• Secuencias con función conocida
Codificantes
No codificantes
• Secuencias con función desconocida
Repeticiones (dispersas o en tándem)
Transposones
• ADN espaciador
Se pueden encontrar numerosas repeticiones en el ADN espaciador.
Constan de la misma secuencia presente en muchas localizaciones,
especialmente en los centrómeros y telómeros. Las repeticiones varían en
tamaño, en número y en distribución en todo el genoma, lo que las hace
sumamente apropiadas para su consideración como marcadores
moleculares.
Referencia
Flavell, R.B. y G. Moore. 1996. Plant genome constituents and their organization. En:
Plant Genome Isolation: Principles and Practice (Foster, G.D. y D. Twell, eds.). John
Wiley & Sons, Chichester, NY.
La molécula del ADN: ADN citoplasmático
ADN citoplasmático
• ADN de los cloroplastos (ADNcp)
• ADN de las mitocondrias (ADNmt)
Características:
• Herencia materna
• Tasas dispares de evolución (orden de los genes
vs. secuencia de los nucleótidos)
• Acumulación lenta de mutaciones
Se encuentran cantidades pequeñas de ADN en el citoplasma, fuera del núcleo: en los

cloroplastos (ADNcp) y en las mitocondrias (DNAmt). Tanto los cloroplastos como las
mitocondrias tienen su propio cromosoma, del cual hay varias copias. Sus genes
codifican para la traducción y la transcripción de los componentes de los organelos, y
tienen funciones altamente especializadas en la expresión del fenotipo del organismo a
que pertenecen.
El ADN citoplásmico se hereda comúnmente, aunque no siempre, a través del

progenitor materno, un modelo conocido como herencia materna.
Las secuencias del ADNcp y del ADNmt tienen sus peculiaridades. El ADNmt de las
plantas parece evolucionar rápidamente en lo que se refiere al orden de los genes, y
lentamente en la secuencia nucleotídica. La razón de que las mutaciones se acumulen
lentamente no se conoce con certeza, pero podría ser un efecto de la presencia ya sea
de un mecanismo sumamente eficaz de reparación de daños del ADN o de un sistema
de replicación del ADN relativamente libre de errores. En cambio, la tasa de evolución
del ADNcp parece, en general, lenta, tanto en función de la secuencia nucleotídica
primaria como del reordenamiento de genes.
Tecnología del ADN
La tecnología del ADN incluye los conceptos de:
Enzimas de restricción
Electroforesis de ácidos nucleicos
Polimorfismo del ADN

Enzimas de restricción
Cada enzima de restricción corta el ADN en
fragmentos definidos, gracias a la acción que ejerce
en secuencias específicas que son su objetivo
Dan lugar a extremos pegajosos o romos
Los enzimas de restricción son T
de varios tipos: A
G
C
• Tipo I y III, que cortan el ADN de
hebra o cadena doble por fuera de
la secuencia de reconocimiento
• Tipo II, que identifican secuencias
de 4, 5 ó 6 pb y cortan por dentro
de dicha secuencia
Las bacterias producen enzimas de restricción como un mecanismo de defensa contra

los bacteriófagos. Estos enzimas pertenecen a una clase que parte (o corta) el ADN en
posiciones internas específicas y únicas en toda su longitud. Por ello, también se los
llama endonucleasas. Estas enzimas actúan como tijeras y así cortan el ADN de los
fagos y los desactivan.
De los tres tipos de enzimas de restricción, los tipos I y III cortan el ADN de doble
cadena fuera de la secuencia de reconocimiento. En cambio, los enzimas de tipo II
identifican secuencias específicas de 4, 5 ó 6 pares de bases y cortan por dentro de
estas secuencias. Debido a sus características, estos tres tipos de enzimas se han
tornado esenciales para la tecnología del ADN recombinante.
Los enzimas pueden cortar una secuencia dada de ADN, dejando extremos escalonados
(o pegajosos) que permiten la creación de puentes de hidrógeno con una secuencia
complementaria (finales contusos). Cuando dos fragmentos de ADN se cortan con el
mismo enzima, se producirán fragmentos que tendrán extremos pegajosos
complementarios, y a ellos se podrán adherir, por tanto, fragmentos alternativos.
Los enzimas de restricción están disponibles comercialmente y suelen venir con la

solución tampón apropiada y con las instrucciones acerca de las condiciones y las
temperaturas de reacción.
Electroforesis de ácidos nucleicos
Un método para separar fragmentos de ADN y
permitir su visualización o su identificación (o
ambos)
Fuente de energía
eléctrica
-
Gel
+ - +
Unidad de electroforesis

Después de la digestión a que es sometida por un enzima de restricción, la molécula de

ADN se convierte en una colección de fragmentos de restricción. Estos fragmentos
pueden separarse según su tamaño al hacerlos migrar en un gel de agarosa o de
acrilamida.
Para lograr esa separación, la mezcla de fragmentos de ADN y del sobrante de enzima
se coloca en pocillos formados cerca de un borde del gel. El gel se somete luego a un
campo eléctrico que hace migrar los fragmentos de ADN según su tamaño, de modo que
los fragmentos grandes migran más lentamente que los fragmentos cortos. Las
moléculas de ADN, que están cargadas negativamente a pH neutro, migran hacia el
ánodo. Los geles de agarosa (de 0.8% a 2.0%) son muy útiles para separar fragmentos
de ADN cuyo tamaño esté comprendido en el intervalo de 300 a 10.000 pb. Los geles de
acrilamida (de 3.5% a 20%) son muy útiles para fragmentos cuyo tamaño oscile entre 20
y 1000 pb.
La visualización de los fragmentos de ADN, después de la electroforesis, se logra

mediante la tinción con bromuro de etidio; las moléculas de esta sustancia se colocan
entre las bases del ADN y producen una fluorescencia de color anaranjado bajo la luz
ultravioleta.
La distancia de migración es proporcional al logaritmo del número de bases. Por

consiguiente, el tamaño real de los fragmentos obtenidos puede calcularse partiendo de
la movilidad de los fragmentos de ADN de tamaño conocido.
Polimorfismo del ADN
Diversos sucesos pueden causar variantes, más o
menos complejas, en la secuencia de nucleótidos
del ADN. Tales variantes se describen,
generalmente, como polimorfismos
El polimorfismo se manifiesta en diferencias del
genotipo —lo que se demuestra en los diversos
perfiles de bandas que se detectan con un
procedimiento apropiado— y quizás del fenotipo
Varios sucesos pueden producir polimorfismos:
• Mutaciones puntuales
• Inserciones o deleciones
• Rearreglos
Mutaciones puntuales
Las mutaciones puntuales ocurren cuando una
base de la secuencia del ADN es reemplazada por
otra. La longitud de la secuencia del ADN no
cambia
Reemplazo
Las mutaciones puntuales pueden ocurrir en una base solamente, o en unas pocas
bases del mismo sitio. En el diagrama de la diapositiva, cuatro bases de la secuencia
cromosómica original (parte superior) son reemplazadas por cuatro bases alternativas.
Dado que el número original de bases no cambia, la longitud total de la secuencia no se
altera.
Inserciones o deleciones
Las inserciones o las eliminaciones son el
resultado de la adición o la desaparición de varias
bases en la secuencia del ADN. La longitud de la
molécula cambia
Deleción
Inserción
La parte superior del diagrama ilustra una deleción: se pierden algunas bases y el
fragmento de ADN resultante se vuelve más corto.
La mitad inferior del diagrama ilustra una inserción: se introducen algunas bases en una
sección de la secuencia del ADN. La secuencia original se torna, por tanto, más larga
según el número de bases que se hayan insertado.
Rearreglos
Los reordenamientos cromosómicos ocurren como
resultado de la recombinación genética o de la
inserción de elementos transponibles. La longitud
de la molécula puede cambiar o quedar igual
También pueden darse cambios en la secuencia del ADN debidos a los

reordenamientos; por ejemplo, cuando un segmento se da la vuelta. En estos casos,
aunque quizás no cambie la longitud de la secuencia del ADN, su composición puede
cambiar suficientemente para que se observe en este caso un polimorfismo.
Procedimiento de aislamiento del ADN en
imágenes
Las siguientes fotografías ilustran los diversos

pasos del procedimiento para aislar ADN

El técnico de laboratorio está recolectando unas pocas hojas, muy jóvenes, de tomate
para hacer una extracción pequeña de ADN. Para una extracción grande, se
recolectarían muchas más hojas y más grandes (cerca de 10 g) de plantas más viejas.
El tejido de la hoja (para las extracciones pequeñas de ADN) y la solución tampón se

convierten en una mezcla homogénea en un tubo de centrífuga de 1.5 ml, empleando un
taladro equipado con un vástago de plástico. Para aumentar la eficiencia, se pueden usar
dos taladros simultáneamente, que pueden ser controlados con pedales como los usados
en las máquinas de coser.
Para extracciones grandes de ADN, el tejido de la hoja se homogeneiza con una solución
tampón de extracción en batidoras estándar de cocina. Aunque no sean necesarios por
razones de seguridad, sí conviene usar guantes y un delantal de laboratorio para
proteger la ropa y la piel, ya que puede haber salpicaduras durante el procedimiento.
La mezcla del tejido foliar y solución tampón se vierte de la batidora, a través de una
gasa, en botellas de centrífuga colocadas sobre un lecho de hielo. Se exprime la gasa
para obtener tanto líquido como sea posible reteniendo en el filtro los pedazos grandes
de tejido foliar, que luego se descartan junto con el filtro.
Después de centrifugar y resuspender la bolita (pellet) de ADN (que es todavía verde y

contiene algo de material foliar), la mezcla se transfiere a un tubo nuevo al que se le
agrega cloroformo. Este paso debe realizarse en una campana extractora con
ventilación, y deben usarse guantes de seguridad y una bata de laboratorio.
Los tubos se invierten primero para mezclar suavemente el cloroformo y luego se

centrifugan para separar el ADN.
La capa más clara, que contiene el ADN, está ahora en la parte superior y puede ser
transferida a un tubo limpio. La capa inferior contiene tejido foliar no deseado, paredes
celulares y otros residuos, y se descarta.
Se agrega alcohol para precipitar el ADN, el cual, mediante una inversión suave, se
congrega generalmente como una sustancia filamentosa. Este ADN puede ser retirado
con un gancho o centrifugado. Luego se lava y se resuspende.
En resumen
Los elementos fundamentales del ADN son los
nucleótidos, que se unen haciendo una doble hélice
con la que se forma la cadena del ADN
La molécula del ADN se pliega cada vez más a
medida que la secuencia de los nucleótidos le da
forma al cromosoma
El ADN se organiza en diferentes clases: de copia
única, de copia múltiple y espaciador
Las mitocondrias y los cloroplastos tienen su propia
molécula de ADN
Varios sucesos causan polimorfismos en la
molécula de ADN: las mutaciones puntuales, las
inserciones, las deleciones y los rearreglos
Los componentes de un nucleótido
De qué modo los nucleótidos forman la doble
hélice del ADN
Las diferentes clases de ADN
Las características principales del ADN
citoplasmático
Lo que es un enzima de restricción
La forma en que se producen los polimorfismos
en la cadena de ADN

Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6a. ed.). W.H.
Freeman, Nueva York.
Lewin, B. 1994. Genes V. Oxford University Press.
Schleif, R. 1993. Genetics and molecular biology (2a. ed.). Johns

Hopkins University Press, Baltimore, MD, E.U.
Singer, M. y P. Berg. 1991. Genes and genomes. University

Science Books, Mill Valley, CA, E.U.
Watson, J.D., N.H. Hopkins, J.W. Roberts, J.A. Steitz y A.M.

Weiner. 1987. Molecular biology of the gene (4a. ed.). Vol. I:
General principles. Benjamin/Cummings Publishing, Menlo
Park, CA, E.U.
A continuación

Polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción (RFLP)

Glosario


Polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 RFLP 1

Contenido
Tecnología RFLP
• Aislamiento del ADN
• Digestión de restricción y electroforesis
• Transferencia del ADN por el método Southern
• Hibridación del ADN
• Equipo
Tecnología RFLP en imágenes
Interpretación de las bandas RFLP
Ventajas y desventajas de los RFLP
• Maíz
• Trigo
• Pino escocés
Tecnología RFLP
La detección del RFLP se basa en la posibilidad
de comparar patrones de bandas generados
mediante la digestión con enzimas de restricción
del ADN patrón. Las etapas de laboratorio son:
Aislamiento del ADN

Digestión y electroforesis
Transferencia del ADN por el método Southern
Hibridación del ADN
• Procedimiento
• Sonda de ADN
• Fuentes de sondas
Equipo
El análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) fue una de

las primeras técnicas que se usó ampliamente para detectar variaciones a nivel de la
secuencia del ADN. Esta tecnología se basa en el principio de que es posible comparar
patrones de bandas generados a partir de moléculas de ADN de diferentes individuos
que han sido sometidas a digestión con enzimas de restricción. Las diversas mutaciones
que afectan a las moléculas de ADN de muchas maneras producen fragmentos de
longitud variable. Estas diferencias de longitud de los fragmentos pueden observarse
una vez realizadas la electroforesis, la hibridación y la visualización.
Aislamiento del ADN
Se extrae ADN total de las células de la planta
Alternativamente, puede usarse el ADN
cloroplástico y el mitocondrial
El ADN debe estar limpio y debe tener elevado
peso molecular
Complicaciones:
• Rotura durante el aislamiento
• ADN degradado por las nucleasas
• Polisacáridos aislados junto con el ADN
• Aislamiento de metabolitos secundarios
El aislamiento del ADN es el primer paso en las tecnologías moleculares. El ADN se

encuentra tanto en los cromosomas nucleares como en los organelos (mitocondrias y
cloroplastos). Para extraer el ADN del sitio en que se halla, son necesarios varios pasos
de laboratorio para romper la pared celular y la membrana nuclear, y separar
apropiadamente el ADN de otros componentes celulares. Mientras se hace esto, hay
que asegurarse cuidadosamente de que el proceso no dañe la molécula de ADN y de
que ésta se recupere en forma de una hebra larga.
Digestión de restricción y electroforesis
+
Es necesaria la hibridación para
detectar fragmentos específicos
+ -
El ADN extraído es digerido con enzimas de restricción específicos, cuidadosamente

elegidos. Cada enzima de restricción, en condiciones apropiadas, reconocerá el ADN y
lo cortará de manera predecible, dando lugar a un conjunto reproducible de fragmentos
de ADN (‘fragmentos de restricción') de diferentes longitudes.
Los millones de fragmentos de restricción así obtenidos son separados comúnmente

mediante electroforesis en geles de agarosa. Dado que los fragmentos se verían como
un rastro continuo si el gel se tiñera con bromuro de etidio, la sola tinción no puede
detectar los polimorfismos. Por consiguiente, debe recurrirse a la hibridación para
detectar fragmentos específicos.
Transferencia del ADN por el método
Southern
Peso
Membrana
Gel
La transferencia del ADN se realiza por el método Southern, nombre tomado de E.M.
Southern (1975), quién inventó la técnica. En este método, primero se desnaturaliza el
gel en una solución básica y se pone en una bandeja. Se coloca sobre el gel una
membrana porosa de nylon o de nitrocelulosa y al conjunto se le superpone un peso.
Todos los fragmentos de restricción de ADN que estaban en el gel se transfieren, como
cadenas simples a la membrana por acción capilar. Todos los fragmentos conservan en
la membrana el mismo patrón que tenían en el gel.
Referencia
Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated
by electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.
Hibridación del ADN: El procedimiento
ADN adherido a la membrana
Hibridado
con la sonda
Sonda hibridada
Película expuesta
Se descarta el a rayos X
sobrante de sonda

La membrana con el ADN patrón se incuba con la sonda de ADN. Las condiciones de
incubación son tales que si las cadenas de ADN de la membrana son complementarias a
las de la sonda, se dará la hibridación y se formarán duplos marcados. En condiciones
muy rigurosas, no ocurrirá la hibridación con un ADN que no sea homólogo o no
emparentado. De este modo, la sonda reconoce las secuencias complementarias e
“idealmente” homólogas entre los miles o millones de fragmentos no detectados que
migran a través del gel.
Los fragmentos deseados se pueden detectar después de que haya una exposición
simultánea de la membrana hibridada y una película fotográfica.
Hibridación del ADN: La sonda
ADN total o
ADNc Los clones recombinantes
se seleccionan y siguen
ADN digerido creciendo
-
Selección de
Los clones se dejan
fragmentos de ADN
crecer en una placa
según su tamaño
+
Fragmento del
ADN patrón
Vector extraído de El vector recombinante se

bacterias y abierto El fragmento de ADN introduce en las bacterias
se inserta en el vector y se clona
Para detectar el subconjunto de fragmentos de ADN que interesan, de entre todos los
fragmentos generados por la digestión con restricción, se necesita una sonda. La sonda
de ADN generalmente proviene de una genoteca de ADN (ADN genómico o
complementario), que es una colección de vectores (por ejemplo plásmidos) que
contiene una representación de una molécula de ADN original cortada en pedazos. Los
vectores se pueden transformar en bacterias y pueden multiplicar muchas veces el
pedazo de ADN que contienen.
La sonda de ADN también se convierte en una molécula de cadena simple, se marca

convenientemente usando cualquier método estándar (por ejemplo un radioisótopo o
digoxigenina), y se hibrida con el ADN patrón que está adherido a la membrana.
Hibridación del ADN: Fuentes de sondas (1)
ADN nuclear:
• Genotecas genómicas
• ADNc
ADN citoplasmático
La especificidad de muchas sondas de copia

única requiere que se construyan genotecas
cuando se estudian nuevas especies. Sin
embargo, a menudo pueden usarse sondas de
géneros emparentados
Entre las fuentes de sondas de ADN están las siguientes:
• Genotecas genómicas: en ellas el ADN total de la planta se digiere con enzimas

de restricción y los fragmentos individuales se clonan en un vector que puede ser
un plásmido de una bacteria o un virus. Se seleccionan sondas apropiadas de esta
genoteca ‘anónima’ para el análisis de RFLP.
• Genotecas de ADNc (ADN complementario): el RNAm se aísla y se transcribe en

ADN, usando el enzima transcriptasa reversa. El ADNc obtenido se clona en
vectores y se usa como genoteca para sondas en el análisis de RFLP.
• ADN citoplasmático: genotecas de ADN mitocondrial y cloroplástico.
Como resultado de la especificidad mostrada por muchas sondas de copia única, a

menudo deben construirse genotecas genómicas o de ADNc para estudios sobre
especies nuevas. Este trabajo puede requerir mucho tiempo. Sin embargo, el
conocimiento actual acerca de secuencias y genes comunes permite usar con frecuencia
sondas de géneros emparentados.
Hibridación del ADN: Fuentes de sondas (2)
Secuencias repetitivas o de tipo minisatélite:

• Repetición básica de 10 a 60 pb en tándem
• Altamente variables entre individuos del género
humano
• Polimorfismos en el número de unidades repetidas
(también llamados VNTR)
En las plantas, para detectar secuencias

minisatélite se han usado sondas provenientes de
una repetición interna del gen de la proteína III del
bacteriófago M13
Las secuencias repetitivas de tipo minisatélite tienen también su aplicación específica en el

análisis de RFLP. Son repeticiones de secuencias de un ‘motivo’ básico. Miden de 10 a 60 pb, se
encuentran en tándem (es decir, en unión de cabeza con cola) y se dan en muchos loci del
genoma.
El trabajo con marcadores minisatélite de plantas fue el resultado de estudios pioneros sobre el
genoma humano hechos por Jeffreys y col. (1985a, b), en los que se demostró que los
marcadores minisatélite eran sumamente variables en los seres humanos. Dado que los
polimorfismos están relacionados con el número de unidades repetidas, las secuencias también se
han llamado número variable de repeticiones en tándem (VNTR; Nakamura et al. 1987). Una
sonda seleccionada adecuadamente puede detectar fragmentos de restricción que representan un
gran número de loci. En la película, los patrones de fragmentos de restricción que contienen
minisatélites (la denominada ‘huella identificadora’ del ADN) permiten discriminar claramente
entre diferentes individuos.
Referencias
Jeffreys, A.J., V. Wilson y S.L. Thein.1985a. Hypervariable 'minisatellite' regions in

human DNA. Nature 314:67-73.
Jeffreys, A.J., V. Wilson y S.L.Thein.1985b. Individual-specific "fingerprints" of human
DNA. Nature 316:76-79.
Nakamura, Y., M. Leppert, P. O'Connell, R. Wolff, T. Holm, M. Culver, C. Martin, E.
Fujimoto, M. Hoff, E. Kumlin y R. White. 1987. Variable Number of Tandem Repeat
(VNTR) markers for human gene mapping. Science 235:1616-1622.
Rogstad, S.H., J.C. Patton, II y B.A. Schaal. 1988. M13 repeat probe detects DNA
minisatellite-like sequences in gymnosperms and angiosperms. Proc. Natl Acad. Sci.
U.S.A. 85:
9176-9178.
Ryskov, A.P., A.G. Jincharadze, M.I. Prosnyak, P.L. Ivanov y S.A. Limborska. 1988. M13
phage DNA as a universal marker for DNA fingerprinting of animals, plants and
microorganisms. FEBS Lett. 233:388-392.
Equipo
Recursos:
• Reactivos
Equipo:
• Refrigerador y congelador • Medidor de pH
• Campana extractora de • Balanza estándar
flujo laminar • Unidades de
• Centrífuga electroforesis
• Fuente de energía • Cuarto oscuro
eléctrica • Transiluminador
• Hornillo o microondas ultravioleta

Tecnología RFLP en imágenes
Las siguientes diapositivas ilustran los pasos del

procedimiento para detectar RFLP

Después de que la agarosa se haya vertido en el molde del gel, se insertan de inmediato
los peines para formar los pocillos y se dejan allí hasta que endurezca el gel. Luego se
retiran los peines y el gel se coloca en una cubeta de electroforesis.
Las muestras del ADN digerido, a las que se añadió colorante de azul de bromofenol, se
descargan en los pocillos con una pipeta.
Después de la electroforesis, el gel se trata con NaCl para romper los enlaces de la
doble hélice del ADN y convertirlo en cadenas simples. Esto permite lograr luego la
hibridación con una sonda de ADN de cadena simple.
Primero se prepara la bandeja para hacer la transferencia saturando las esponjas con
NaOH. Se requieren gafas de seguridad y guantes y se recomienda el uso de una bata
de laboratorio. Deben seguirse los reglamentos de seguridad de la institución donde se
trabaja.
Se coloca papel absorbente encima de las esponjas para impedir el contacto directo con
el gel.
Se quitan las burbujas entre el papel absorbente y las esponjas haciendo rodar una pipeta
o una varilla de vidrio por encima del papel. Esta operación asegura una transferencia
completa de la solución a través del gel.
Los espacios libres entre las esponjas y la bandeja se cubren con tiras plásticas para
prevenir la evaporación, porque ésta reduciría la eficiencia de la transferencia.
El gel de agarosa tratado se coloca encima del papel absorbente.

Se hacen salir las burbujas que haya entre el gel y el papel oprimiendo contra éste una
varilla de vidrio mientras se la hace rodar.
La membrana se corta según el tamaño apropiado.

Se coloca la membrana encima del gel, y luego se cubre con una hoja de papel
absorbente.
Se coloca un bloque de papel poroso (p.e., toallitas de papel o papel periódico) encima
del papel absorbente que protege la membrana.
Sobre todo este conjunto se coloca un peso (en la foto, una botella de agua que
descansa en una lámina de vidrio) para promover una buena transferencia. Después de
unas horas, la transferencia se ha completado; se quita entonces el papel secante y la
membrana se almacena hasta el momento de la hibridación con la sonda.
Empieza el proceso de la hibridación. Un ADN denominado bloqueador (porque minimiza

la hibridación de fondo que se realiza con la membrana) se hierve para desnaturalizarlo a
cadenas simples.
La membrana se coloca en un recipiente plástico junto con la solución de hibridación

apropiada y el ADN bloqueador y preincubado.
Se añade la sonda marcada al recipiente que contiene la solución de hibridación y la

membrana, y se incuba el conjunto toda la noche en un horno. Al día siguiente se saca la
membrana del recipiente de hibridación y se lava con la solución restringente apropiada.
(Nota: Las medidas de seguridad varían según las instituciones; por favor, revise las de
la institución en que usted trabaja)
Se seca la membrana con papel absorbente y se mete en una carpeta como las que
contienen películas de rayos X.
Pasando a un cuarto oscuro, se inserta también en la carpeta una película de rayos X.

La carpeta se envuelve, o se sella con cinta adhesiva, y se almacena en un congelador

hasta que la película haya estado expuesta suficiente tiempo, generalmente de 1 a
4 días.
La foto muestra un autorradiograma de RFLP.

RFLP en imágenes: Resumen
Sitio de
Sonda restricción
A
Digestión
A B Mutación = un nuevo sitio de restricción
Transferencia
Electroforesis Hibridación

Interpretación de las bandas RFLP (1)
Una mutación crea un nuevo sitio de restricción
dentro de la región de interés. Por consiguiente, se
detectan dos bandas más pequeñas en la película
Nuevo sitio de restricción
Sitio de restricción
A A B
B
Sonda
El resultado ideal de la tecnología de RFLP es una serie de bandas en un gel, que

pueden calificarse ahora ya sea por su presencia o por su ausencia, o como
marcadores codominantes. Las diferencias entre genotipos se visualizan generalmente
como un patrón variado de fragmentos de restricción de ADN.
En ésta y en las siguientes diapositivas se presentan los diferentes casos de mutación

que son responsables de los polimorfismos detectados mediante el análisis de RFLP.
En el diagrama anterior, una mutación crea un sitio de restricción nuevo en el segmento

A, precisamente en el sitio de reconocimiento de la sonda. En consecuencia, la sonda
hibridará simultáneamente con los dos segmentos creados por el enzima. En el
segmento B no ha habido mutación, y sólo un segmento hibridará con la sonda. Durante
la electroforesis, los dos segmentos de A migrarán más lejos en el gel que el segmento
hibridado en B y el polimorfismo como tal se observará en el gel del modo indicado en el
cuadrado a la derecha de la imagen.
Una mutación crea un nuevo sitio de restricción
entre sitios de restricción contiguos, creando un
fragmento de restricción más corto
Nuevo sitio de restricción
A A B
B
Sonda
En este caso una mutación crea un nuevo sitio de restricción en el segmento A. Sin
embargo, el nuevo sitio aparece a un lado del lugar de reconocimiento de la sonda. En
consecuencia, sólo un fragmento hibridará en el segmento A y sólo uno en el segmento
B. El polimorfismo se mostrará como un fragmento hibridado en A que es más corto que
el hibridado en B. El fragmento más corto, a su vez, migrará más lejos en el gel (ver el
cuadrado, a la derecha).
Una inserción de una secuencia de ADN entre
sitios de restricción contiguos crea un fragmento
de restricción más largo
Sitio de restricción Inserción ocurrida
A B
A
B
Sonda
Si tiene lugar un caso de inserción entre dos sitios de restricción (segmento A), el
fragmento hibridado será más largo. Como resultado, se observará un polimorfismo
entre los individuos A y B, en el sentido de que el fragmento hibridado en A será más
largo que el hibridado en B y su distancia de migración más corta (ver cuadrado, a la
derecha).
Una deleción de una secuencia de ADN entre sitios
de restricción contiguos crea un fragmento de
restricción más corto
Sitio de restricción Deleción ocurrida
A A B
B
Sonda
Si ocurre una deleción entre sitios de restricción adyacentes, la sonda hibridará con un
segmento más corto. Esta acción se observará en el gel como un polimorfismo con un
fragmento que migró más lejos para el individuo A (ver cuadrado, a la derecha).
Uno de los sitios de restricción adyacentes cambia
o se pierde a causa de una mutación o una
deleción. En consecuencia, el fragmento de
restricción se altera
Sitio perdido
A A B
Sonda
Si queda sólo un sitio de restricción, no se genera ningún fragmento de restricción, y no

habrá hibridación. Si el cambio generó un sitio nuevo, el nuevo fragmento hibridará y
mostrará un patrón de bandas diferente que el de un individuo en que no se produjo un
cambio.
Ventajas de los RFLP
Metodología sumamente sólida y muy transferible entre
laboratorios
Se heredan en forma codominante y, como tales, pueden
estimar heterocigosidad
No se requiere información acerca de la secuencia del ADN
Muy recomendables para el análisis filogenético de especies
emparentadas porque se basan en la homología de las
secuencias
Adecuado para construir mapas de ligamiento genético
Marcadores específicos del locus que permiten hacer estudios
de sintenia
Poder discriminatorio: tanto a nivel de especie o de población
(sondas de copia única) como a nivel de individuo (sondas de
copia múltiple)
Simplicidad: si se dispone de sondas adecuadas, la técnica
puede aplicarse fácilmente a cualquier planta

Desventajas de los RFLP
Requieren cantidades grandes de ADN
No permiten la automatización
Bajos niveles de polimorfismo en algunas especies
Pocos loci detectados por ensayo
Necesitan disponer de una genoteca de sondas
apropiadas
Lentos, especialmente con sondas de copia única
Costosos
Requieren la distribución de sondas a los laboratorios
colaboradores
Tienen exigencias técnicas moderadas
Pueden necesitar diferentes combinaciones de
sonda/enzima
Relaciones genéticas
Historia de la domesticación
Origen y evolución de las especies
Deriva genética y selección
Cartografía de genomas y de tipo comparativo
Localización de genes
Descubrimiento de genes valiosos de especies
silvestres
Construcción de genotecas exóticas
En las siguientes diapositivas se tratarán en detalle las referencias impresas en

color púrpura.
Ahn, S. y S.D. Tanksley. 1993. Comparative linkage maps of the rice and maize genomes. Proc.
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Zamir, D. 2001. Improving plant breeding with exotic genetic libraries. Genetics 2:983-989.
Ejemplo: Maíz
Título:
Relationships among maize inbred lines and populations
from European and North American origins as estimated
using RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 1999. 99:473-480
Objetivo:
Estudiar las relaciones genéticas entre líneas puras de
grupos heteróticos conocidos y razas locales de gran
importancia histórica en el desarrollo del material élite
Se analizaron 62 líneas puras de grupos heteróticos
conocidos y 10 poblaciones de maíz (cerca de 30
individuos por población) respecto a 28 loci de RFLP
(29 combinaciones diferentes de sonda/enzima)
Ejemplo: Maíz (continuación)
Resultados:
La comparación de alelos específicos de cada tipo de
germoplasma mostró un déficit de alelos dentro de las
líneas, que representaba cerca del 22% de la riqueza
alélica total de las poblaciones:
• Las asociaciones entre líneas puras y poblaciones
resultaron compatibles con los datos genealógicos
de las líneas puras y aportaron nueva información
sobre la base genética de los grupos heteróticos
• Las líneas puras europeas mostraron ser tan
cercanas a la población estudiada del nordeste de
Estados Unidos como a las típicas poblaciones
europeas
Ejemplo: Maíz (continuación)
Discusión:
Las poblaciones representan reservorios importantes de
diversidad, y no es probable que el germoplasma selecto
contenga todos los alelos útiles
Pregunta: ¿Cómo puede el grupo heterótico europeo
estar más cerca de las poblaciones del nordeste de
Estados Unidos de tipo 'Compton's Early' que de las
demás poblaciones de los Estados Unidos?
Conclusiones:
Los resultados indican que debería estudiarse un
conjunto más grande de poblaciones empleando
marcadores moleculares, con el fin de diseñar
estrategias apropiadas para que se usen con la máxima
efectividad estos recursos genéticos en los programas
de fitomejoramiento
Ejemplo: Trigo
Título:
Molecular markers to study genetic drift and selection
in wheat populations. J. Expl. Bot. 1999. 50(332):
283-290
Objetivo:
Comparar las frecuencias alélicas de poblaciones de
trigo que han estado sometidas a selección natural
Se estudiaron respecto a 30 loci dos poblaciones
originales y seis subpoblaciones derivadas, que se
cultivaron durante 10 años en lugares contrastantes
Ejemplo: Trigo (continuación)
La diferenciación entre subpoblaciones basada en la
diversidad de RFLP fue muy significativa:
• Se encontró que la variación de frecuencias alélicas era
mucho mayor que la esperada considerando la deriva
genética solamente. La selección influyó mucho en la
evolución de las poblaciones
• Algunos loci mostraron mayor diferenciación que otros.
Esto puede haber indicado que estaban genéticamente
ligados a otros loci polimórficos relacionados con la
adaptación
Conclusiones:
Las variaciones de frecuencias alélicas observadas
respecto a los marcadores RFLP no pueden explicarse
por la evolución bajo deriva genética solamente, sino
también por efectos directos o indirectos de la selección
Ejemplo: Pino escocés
Título:
The postglacial history of Scots pine (Pinus sylvestris
L.) in Western Europe: evidence from mitochondrial
DNA variation. Mol. Ecol. 1999. 8:83-88
Objetivo:
Investigar la estructura geográfica de las variantes del
ADN mitocondrial en poblaciones de pino escocés del
oeste de Europa
Se estudiaron 20 poblaciones de P. sylvestris de
Escocia y 18 de Europa continental (21 individuos por
población, en promedio), empleando el análisis RFLP
de ADN total
Ejemplo: Pino escocés (continuación)
Resultados:
Se detectaron tres patrones principales de RFLP para
el ADNmt (mitotipos a, b y d):
• En España se encontraron los tres mitotipos. La diversidad
génica fue alta y se distribuyó predominantemente entre las
poblaciones más que dentro de ellas. El mitotipo d sólo
estuvo presente en la población más sureña (Sierra
Nevada, España)
• Las poblaciones italianas estaban fijadas para el mitotipo b.
Las poblaciones del norte de Francia, de Alemania, de
Polonia, de Rusia y del sur de Suecia estaban fijadas para
el mitotipo a. Las poblaciones del norte de Fennoscandia
(Noruega, Suecia y Finlandia) estaban fijadas para el
mitotipo b
• En Escocia, el mitotipo a se hallaba, en su mayoría, fijado.
El mitotipo b estaba presente en algunas poblaciones
polimórficas
Ejemplo: Pino escocés (continuación)
Discusión:
• La detección de diferentes mitotipos fue una prueba
inequívoca de las diferencias genéticas existentes en el
genoma de las mitocondrias. La diversidad de mitotipos en
las poblaciones españolas indica que o bien descienden de
los que sobrevivieron en refugios durante la última
glaciación o representan reliquias del Terciario que han
sobrevivido como poblaciones aisladas
• En Europa, después de la era glacial, P. sylvestris inició,
aparentemente, su progresión en tres direcciones
evolutivas, por lo menos, cada una de origen diferente:
España, Norte de centro Europa y Norte de Fennoscandia
Conclusiones:
Estudios de marcadores de ADNmt heredados por vía materna
pueden arrojar luz sobre la historia de las especies y ayudar a
definir zonas geográficas en las que hay germoplasma que
debería conservarse
En resumen
La tecnología RFLP detecta cambios en
longitud en las moléculas de ADN después de
ser sometidas a digestión con enzimas de
restricción
Las bandas del RFLP se detectan cuando el
ADN de interés hibrida con una sonda de ADN
Los patrones de bandas RFLP reflejan
diferentes casos de mutación en el sitio de
hibridación de la sonda o en la región contigua
a ella
RFLP es una tecnología sumamente sólida,
pero es lenta y técnicamente exigente
Los pasos principales que comprende la

detección de los RFLP
Las distintas fuentes de sondas
El efecto de los diferentes casos de mutación

en la detección de los patrones de bandas
RFLP
Las ventajas y desventajas de la tecnología

RFLP para el análisis de la diversidad genética

Botstein, D., R.L. White, M. Skolnick y R.W. Davis. 1980. Construction of a genetic
linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J.
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Jeffreys, A.J., V. Wilson y S.L.Thein.1985b. Individual-specific "fingerprints" of
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Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-517.
A continuación

Tecnologías basadas en la PCR
Fundamentos de la PCR
• PCR con cebadores arbitrarios
• Polimorfismo de longitud de fragmentos
amplificados (AFLP)
• Sitios de secuencia etiquetada (STS)
• Últimas estrategias
Glosario

Fundamentos de la PCR
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 PCR 1

Contenido
La reacción en cadena de la polimerasa

Procedimientos de la PCR:
• Etapas
• Ciclo 1
• Ciclo 2
• Ciclo 3
• Condiciones de los ciclos
• Condiciones para la mezcla de la reacción
• Componentes
• Equipo
Tecnología de la PCR en imágenes

La reacción en cadena de la polimerasa
La PCR es un método rápido, de bajo costo y

sencillo para copiar fragmentos específicos de ADN
a partir de cantidades mínimas de ADN original
• Comprende la preparación de la muestra del ADN y de
una mezcla maestra de cebadores, y luego la
detección de los productos de reacción
• La detección no requiere necesariamente el uso de
radioisótopos o de productos químicos tóxicos
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Erlich, 1989) es una técnica potente que
se ha convertido rápidamente en una de las más ampliamente usadas en la biología
molecular porque es rápida, de bajo costo y sencilla. La técnica amplifica fragmentos
específicos de ADN a partir de cantidades mínimas del ADN patrón, aun cuando ese
ADN sea de calidad relativamente baja.
Referencia
Erlich, H.A. 1989. PCR technology: principles and applications for DNA amplifications.
Stockton Press, NY, E.U.
Procedimientos de la PCR: Etapas
Desnaturalización: La reacción se calienta a altas
temperaturas para reducir la doble hélice del ADN a
cadenas simples. Estas cadenas se tornan accesibles a
los cebadores
Hibridación: Se enfría la mezcla de reacción. Los
cebadores hibridan con las regiones complementarias de
las cadenas del ADN patrón, y se forman nuevamente
cadenas dobles entre los cebadores y las secuencias
complementarias
Extensión: La Taq polimerasa sintetiza una cadena
complementaria. El enzima lee la secuencia de la
cadena opuesta y extiende los cebadores agregando
nucleótidos en el orden en que pueden emparejarse. El
proceso entero se repite una y otra vez
El ADN polimerasa, conocido como ‘Taq polymerasa’, se denominó así por la bacteria
Thermus aquaticus que fue aislada originalmente de aguas termales. El enzima puede
resistir las altas temperaturas necesarias para la separación de las cadenas del ADN,
permaneciendo en el tubo de la reacción.
El ciclo de calentamiento y enfriamiento se repite una y otra vez, lo que estimula a los
cebadores a unirse a las secuencias originales y a las secuencias recién sintetizadas. El
enzima volverá a alargar las secuencias del cebador. Este ciclo de temperaturas produce
copias y luego copias de copias, y así sucesivamente, lo que lleva a un aumento
exponencial del número de copias de determinadas secuencias. Dado que la cantidad de
ADN colocado en el tubo al comienzo es muy pequeña, casi todo el ADN presente al final
de los ciclos de reacción pertenece a secuencias copiadas.
Los productos de la reacción se separan mediante electroforesis. Según la cantidad

producida y el tamaño del fragmento amplificado, los productos de reacción se pueden
visualizar directamente tiñendo con bromuro de etidio o con tinción de plata, o mediante
radioisótopos y autorradiografía.
Procedimientos de la PCR: Ciclo 1
ADN patrón de
doble cadena
Desnaturalización
5’ 3’
3’ 5’
Hibridación
5’ 3’
Cebador 2 Cebador 1
3’ 5’
Extensión
5’ 3’
3’ {
5’
Sitio de {
Sitio de
reconocimiento reconocimiento
del cebador del cebador
5’ 3’
3’ 5’
Las etapas de la PCR se llevan a cabo, una tras otra, en episodios cíclicos. El ciclo 1 es
como sigue:
• Durante la desnaturalización (cerca de 1 min a 95°C), las cadenas del ADN se

separan para formar cadenas sencillas.
• Durante la hibridación (cerca de 1 min a temperaturas que oscilan entre 45°C y

60°C), un cebador se une a una cadena de ADN y otro se une a la cadena
complementaria. Los sitios de hibridación de los cebadores se han elegido para
que fomenten la síntesis del ADN en la región de interés durante la extensión.
• Durante la extensión (cerca de 1 min a 72°C), la síntesis del ADN se lleva a cabo
en la región de interés y con distancias variables en la región flanqueante,
produciendo fragmentos de longitudes variables.
ADN recientemente sintetizado ADN original
5’ 3’
ADN patrón 3’ 5’
en el 2o ciclo 5’ 3’
3’ 5’
Desnaturalización
5’ 3’ 3’ 3’
5’ 5’
3’ 5’
5’ 3’ 3’ 5’
3’ 5’ 5’ 3’
Hibridación 5’ 3’
5’ 3’ 3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
Extensión Adaptado de Griffiths y col. 1996
Cuando comienza el segundo ciclo, hay en realidad dos tipos de patrón: (1) las cadenas
del ADN original; y (2) las cadenas del ADN recién sintetizadas, que constan de la región
de interés y de fragmentos de longitud variable de la región flanqueante, en el extremo
3’. Cuando se usa este último patrón en este ciclo, solamente se copia la región de
interés.
ADN patrón
en el 3er ciclo
Extensión
Desnaturalización
Hibridación
Y así sucesivamente

En el tercer ciclo, la región de interés recién sintetizada (es decir, sin regiones
flanqueantes) actúa como patrón. La molécula de ADN original está todavía presente y lo
estará hasta el final de la reacción. Sin embargo, después de unos pocos ciclos, el
fragmento de ADN recién sintetizado se establece rápidamente como el patrón
predominante.
Lo usual es que los ciclos se repitan de 25 a 45 veces. La normalización de las

condiciones de funcionamiento del termociclador es esencial para poder reproducir los
resultados.
Procedimientos de la PCR: Condiciones de
los ciclos
Desnaturalización completa del patrón de ADN
Temperatura óptima para la hibridación
Temperatura óptima para la extensión
Número de ciclos de la PCR
Etapa final de extensión
En la etapa inicial de desnaturalización, es esencial que se desnaturalice completamente

el patrón de ADN. La desnaturalización incompleta del ADN dará como resultado el uso
ineficiente del patrón en el primer ciclo de amplificación y, en consecuencia, en un
escaso rendimiento del producto de la PCR.
La temperatura de hibridación se calcula en 5°C por debajo de la temperatura de fusión

del duplo cebador-patrón de ADN. Si se obtienen productos de la PCR no específicos,
además del producto esperado, la temperatura de hibridación se puede optimizar
aumentándola por incrementos de 1 a 2°C.
La etapa de extensión se realiza, generalmente, a 72°C y una extensión de 1 min es

suficiente para sintetizar fragmentos de PCR de hasta 2 kb (kb = kilobase = 1000 pb).
Cuando se amplifican fragmentos de ADN más grandes, el tiempo generalmente se
extiende a razón de 1 min por cada 1000 pb.
El número de ciclos de la PCR dependerá, básicamente, del rendimiento esperado del

producto de la PCR.
Después del último ciclo, las muestras suelen incubarse a 72°C durante 5 min para
completar los extremos que sobresalen de los productos de la PCR recién sintetizados.
Procedimientos de la PCR: Condiciones de
la mezcla de reacción
Hay que evitar la contaminación del ADN con las

siguientes medidas:
Separando las zonas de extracción del ADN y
de la PCR
Empleando equipo de laboratorio dedicado a

un solo uso
Esterilizando en autoclave y haciendo alícuotas
Añadiendo una reacción testigo
Algunos consejos útiles:
• La extracción del ADN y la preparación y el procesamiento de la mezcla de

reacción de la PCR deben hacerse en zonas separadas.
• Se recomienda emplear recipientes dedicados a un solo uso, pipetas de

desplazamiento positivo y puntas de pipeta diferentes para cada muestra de ADN
y para cada preparación de mezcla.
• Todas las soluciones, excepto la de los dNTP, de los cebadores y de la Taq

polimerasa, deben esterilizarse en autoclave. Cuando sea posible, las soluciones
deben repartirse en cantidades pequeñas y almacenarse en zonas designadas
para la PCR.
• Una buena práctica, para confirmar la ausencia de contaminación, es añadir una

reacción testigo sin el ADN patrón.
Procedimientos de la PCR: Componentes
Componentes: Consideraciones:
• Agua desionizada estéril • ADN patrón
• Solución tampón de PCR • Cebadores
10X • Concentración de
• Mezcla de dNTP MgCl2
• Cebador • Taq polimerasa
• Taq polimerasa • dNTP
• MgCl2
• ADN patrón
Actualmente hay muchas máquinas de PCR disponibles en formatos de 48, 96 ó 384 pocillos. Esta opción,
combinada con el uso de pipetas multicanal, puede aumentar enormemente el número de reacciones que se
pueden hacer simultáneamente. Para preparar varias reacciones a la vez, se debe hacer una mezcla maestra
que contenga lo siguiente: agua, solución tampón, dNTP, cebadores, MgCl2 y Taq polimerasa, en un solo tubo.
Luego se repartirán alícuotas en los tubos individuales.
Consideraciones:
ADN patrón. Casi todos los métodos estándar de extracción de ADN son apropiados. La cantidad adecuada
está entre 0.1 y 1 µg de ADN genómico, para una mezcla total de reacción de 100 µl. Cantidades más grandes
de ADN patrón elevan, generalmente, el rendimiento de productos de la PCR no específicos.
Cebadores. (1) Los cebadores de la PCR deben tener entre 10 y 24 nucleótidos de longitud. (2) El contenido
de GC debe estar entre 40% y 60%. (3) El cebador no debe ser auto-complementario o complementario de
otro cebador en la mezcla de reacción, para evitar así la formación de dímeros de cebadores u horquillas.
(4) Las temperaturas de fusión de los pares de cebadores no deben diferir en más de 5°C, de modo que tanto
el contenido de GC como la longitud se deben elegir adecuadamente. (5) Las temperaturas de fusión y de
hibridación de un cebador se calculan así: si la longitud del cebador es menor que 25 nucleótidos, el valor de la
temperatura de fusión se calcula con la fórmula: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T). (6) La temperatura de
hibridación debe ser, aproximadamente, 5°C inferior que la temperatura de fusión.
Concentración de MgCl2. Puesto que los iones Mg++ forman complejos con los dNTP, con los cebadores y los
patrones de ADN, hay que establecer la concentración óptima de MgCl2 para cada experimento. Si los iones
Mg++ son demasiado escasos, se obtiene un bajo rendimiento del producto de la PCR y si son demasiado
abundantes, aumentará el rendimiento de productos no específicos. El intervalo recomendado de
concentración de MgCl2 es de 1 a 3 mM, en las condiciones de reacción estándar especificadas.
Taq polimerasa. Si las concentraciones de Taq polimerasa son mayores que las requeridas pueden
sintetizarse productos no específicos.
dNTP. La concentración de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en la mezcla de reacción es,
generalmente, de 200 µM. Se debe comprobar que estas concentraciones sean iguales, porque una
inexactitud aumentará el grado de incorporación errónea.
Procedimientos de la PCR: Equipo
Micropipetas
Termociclador
Unidades de electroforesis
Fuente de energía eléctrica
Equipo fotográfico

Tecnología de la PCR en imágenes
Las siguientes fotografías muestran la forma en que

se lleva a cabo la tecnología de la PCR

La mezcla para la PCR se prepara sobre hielo. No se requiere ropa de seguridad, pero
ésta puede beneficiar la reacción a menos que se practiquen buenas técnicas de manejo
estéril.
Los tubos de reacción se colocan en el termociclador.

Se cierra el termociclador, se bloquea y se programa.

Hay diferentes tipos de termocicladores: el de color negro es una tétrada, y en él se

pueden procesar simultáneamente 4 conjuntos de 96 muestras. Los cuatro más
pequeños, de color blanco tienen, cada uno, una capacidad de 96 pocillos.
Según el tamaño de las bandas que generó la PCR y de la discriminación que se

requiera, la visualización de las bandas puede lograrse mediante un gel de agarosa
corriente y horizontal, o con un gel de secuenciación vertical de acrilamida (ver la
próxima diapositiva). En esta diapositiva, los productos migran en un gel de agarosa.
El gel de acrilamida puede procesarse en una unidad independiente o en un

secuenciador automático.
La preparación del gel de secuenciación, aunque es un poco compleja, es similar para

ambos casos. En esta diapositiva se limpia el vidrio y se seca antes de preparar el gel
que se usará en un secuenciador automático.
Las placas de vidrio se insertan en el marco, que se colocará en el secuenciador.

Las placas de vidrio se sujetan firmemente en su sitio, y se alista toda la unidad para
verter en ella el gel.
El gel de acrilamida líquido se vierte en el molde. Puesto que la acrilamida es un

carcinógeno, debe usarse ropa de protección.
Las pinzas sujetan los bordes inferiores de las placas de vidrio para impedir que haya
fugas de gel.
Se inserta un peine en el extremo superior del gel para formar los pocillos en los que se
depositarán las muestras.
Una vez que el gel se solidifica, la unidad se coloca en el aparato secuenciador.

Las muestras son tomadas con una multi-pipeta…

...y se cargan en los pocillos del gel.

Esta diapositiva es una toma de cerca de la fotografía anterior. Observe que los pocillos
son de tamaño muy pequeño lo mismo que las puntas de pipeta, lo que permite cargar
muchas muestras en cada gel.
Se coloca una placa de calentamiento contra el gel para garantizar una temperatura de
funcionamiento constante.
Se vierte la solución tampón en el reservorio superior del gel…

…y en el reservorio inferior.
Se le da un vistazo final, luego se cierra la puerta y empieza el programa.

En resumen
La PCR es una técnica sencilla para obtener

múltiples copias de fragmentos específicos de
ADN
La PCR comprende tres etapas:

desnaturalización, hibridación y extensión
Para que el éxito sea seguro, hay que tener

cuidado tanto en preparar bien la mezcla de
reacción como en establecer las condiciones
óptimas de los ciclos

El fundamento en que se basa la PCR
Los elementos que pueden afectar, paso por

paso, el desempeño de la PCR, y los efectos
que tendrían en sus resultados

Erlich, H.A. 1989. PCR technology: principles and applications for
DNA amplifications. Stockton Press, NY, E.U.
Erlich, H.A. y N. Arnheim. 1992. Genetic analysis using the
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Freeman y Co., NY, E.U.
Newton, C.R. y A. Graham. 1994. PCR, Parte 1: Basic principles
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Saiki, R.K., D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T.
Horn, K.B. Mullis y H.A. Erlich. 1988. Primer-directed enzymatic
amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.
Science 239:487-491.
A continuación

PCR con cebadores arbitrarios
• Polimorfismo de longitud de fragmentos
amplificados (AFLP)
Glosario
5FDOPMPHÓBTEF.BSDBEPSFT.PMFDVMBSFTQBSB
&TUVEJPTEF%JWFSTJEBE(FOÏUJDBEF1MBOUBT
.ØEVMPEF"QSFOEJ[BKF
***5FDOPMPHÓBTCBTBEBTFOFM"%/
t 'VOEBNFOUPTEFM"%/
t 1PMJNPSmTNPEFMPOHJUVEEFGSBHNFOUPT
EFSFTUSJDDJØO 3'-1
.enú principal

(RAPD, DAF, AP-PCR)
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 1

Contenido
Tecnología RAPD, paso a paso:
• Reacción en cadena de la polimerasa
• Detección del producto de RAPD
• Diagrama de resumen
Equipo
Interpretación de los patrones de bandas RAPD
Ventajas y desventajas de los RAPD
• Festuca pratensis
• Pimiento
• Rosa
Diferencias: DAF y las tecnologías de la AP-PCR
MAAP (caracterización con ‘amplicones’ múltiples

arbitrarios) es la sigla propuesta para incluir las tres
tecnologías principales que corresponden a esta
categoría:
• Polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD)
• Amplificación de la huella de ADN (DAF)
• Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar
(AP-PCR)
Tres técnicas principales se inscriben dentro de la categoría de marcadores basados en

la PCR usando cebadores arbitrarios: RAPD, DAF y AP-PCR. MAAP es la sigla
propuesta por Caetano-Anollés et al. (1992), aunque no suele usarse, para incluir estas
técnicas estrechamente relacionadas. En este submódulo se prestará atención especial
a los RAPD y al final se hará una comparación entre los RAPD y las técnicas DAF y AP-
PCR.
Referencia
Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1992. DNA fingerprinting:

MAAPing out a RAPD redefinition? Bio/Technology 10 (9):937.
Tecnología RAPD, paso a paso
Características principales:
• Emplea un cebador aleatorio corto (generalmente,
de 10 bases)
• Amplifica trozos anónimos de ADN
Etapas de laboratorio:
• PCR con un cebador
• Separación de los fragmentos de ADN mediante
electroforesis
• Visualización de los fragmentos de ADN con
bromuro de etidio
La técnica para detectar polimorfismo en el ADN amplificado al azar (RAPD) es un

método basado en la PCR, en el que se emplea un cebador corto (generalmente, de 10
bases) para amplificar porciones anónimas de ADN. Con esta técnica no se busca
ningún fragmento de ADN específico, ya que el cebador se adherirá al ADN patrón en
secuencias complementarias de ubicación desconocida. En consecuencia, no se
conocerá la naturaleza de los productos obtenidos. Los fragmentos de ADN así
generados se separan y se detectan mediante electroforesis.
Aislamiento del ADN
Se puede usar ADN total, cloroplástico o

mitocondrial
• Cantidades diminutas de ADN son suficientes
• El ADN debe estar limpio y su peso molecular debe
ser elevado
Si no es posible obtener un ADN de calidad

mínima, será difícil garantizar la reproducibilidad de
los resultados

Reacción en cadena de la polimerasa
Componentes de la PCR
Los cebadores (10 bases de longitud) se

consiguen de diferentes proveedores
comerciales
Es habitual la adición de MgCl2
Los ciclos de hibridación (acoplamiento de los

cebadores al ADN patrón) se realizan a
temperaturas bajas (cerca de 40°C)
Los componentes que necesita la PCR se tratan en el submódulo “Nociones básicas de

la PCR”. Aquí sólo se usa un cebador corto (generalmente de 10 pb de longitud). Los
cebadores con estas características están comercialmente disponibles de marcas
diferentes. A menudo se agrega una concentración de MgCl2 para promover la
amplificación de más bandas durante la reacción. Sin embargo, se debe tener cuidado
de determinar la concentración apropiada para cada caso, lo que evitará la aparición de
productos no específicos.
Entre las condiciones de la PCR está, generalmente, un ciclo de hibridación a baja

temperatura (aproximadamente 40°C) que estimulará la hibridación entre el cebador y el
ADN y dará lugar a una cantidad suficiente de productos. Además, se debe impedir la
aparición de productos no específicos, y esto puede hacerse determinando la
temperatura apropiada en que no aparecerán bandas ‘fantasma’.
Detección de productos RAPD
Electroforesis de geles de agarosa o de acrilamida
y visualización con bromuro de etidio
Los RAPD pueden detectarse al migrar los productos de la PCR mediante electroforesis
en un gel de agarosa o de acrilamida. En ambos casos, el gel se tiñe con bromuro de
etidio.
La diferencia entre hacer migrar los productos del RAPD en acrilamida o en agarosa está
solamente en el grado de resolución de las bandas. En la mayoría de los casos, la
electroforesis en geles de agarosa proporciona suficiente resolución.
Diagrama de resumen
A
D Cebador
Banda
amplificada E
B
C Molécula
F
de ADN
Gel
E
C
A
D
B
F
Equipo
Recursos:
• Reactivos
Equipo:
• Refrigerador y • Hornillo o microondas
congelador • Medidor de pH
• Campana extractora • Balanza
de flujo laminar • Unidades de
• Centrífuga electroforesis
• Termociclador • Transiluminador de luz
• Fuente de energía ultravioleta
eléctrica
Interpretación de patrones de bandas
RAPD (1)
El polimorfismo del ADN en un grupo de individuos

puede deberse a:
Ensamblaje frustrado en el sitio del cebador
Aparición de un nuevo sitio de reconocimiento

del cebador
Longitud de la región amplificada entre los sitios

de reconocimiento del cebador

Interpretación de patrones de bandas
RAPD (2)
A causa de la naturaleza de los marcadores

RAPD, sólo puede evaluarse la presencia o la
ausencia de una banda. Los criterios para
seleccionar bandas que califican son:
Reproducibilidad: es necesario obtener los
mismos resultados en experimentos repetidos
Espesor (de la banda)
Tamaño
Observación de la segregación esperada en
una población segregante
Interpretación de patrones de bandas RAPD:
Ejemplo de un gel RAPD de mala calidad
Esta foto es una imagen de un gel de RAPD de mala calidad. Las bandas son borrosas.
Las de la parte superior tienen una sombra que comienza en el pocillo donde se cargó el
producto de la PCR y muchas se observan con dificultad. El fondo difuso complica la
observación: ¿en qué casos hay una banda o hay dos lado a lado? Algunas bandas son
claras, sin duda, y podrían tenerse en cuenta, pero otras muchas son dudosas y su
interpretación sería sumamente arriesgada. Esas dificultades hacen dudar de la
confianza que merecen los datos obtenidos.
Interpretación de patrones de bandas RAPD:
Ejemplo de un gel RAPD de buena calidad
Esta foto es una imagen de un gel de RAPD de buena calidad. Tanto la presencia como
la ausencia de la mayoría de las bandas son datos claros y el fondo es transparente. El
investigador no tendría dudas al seleccionar las bandas y tomar datos de este gel. En
consecuencia, la interpretación de los resultados sería muy fiable.
Ventajas de los RAPDs
Número alto de fragmentos
Técnica sencilla
Los cebadores arbitrarios se adquieren

fácilmente, y no requieren de información
inicial de tipo genético o genómico
Se requieren cantidades diminutas del ADN

patrón
Los costos unitarios por ensayo son bajos
Algunos comentarios:
• Normalmente se amplifican muchos fragmentos diferentes (que corresponden a

múltiples loci dispersos por todo el genoma) empleando un solo cebador. Por
consiguiente, la técnica es rápida para detectar polimorfismos. Aunque la mayoría
de los cebadores comerciales dan lugar a varios fragmentos, algunos cebadores
pueden fallar en la amplificación de fragmentos de algunos materiales.
• La técnica es sencilla. El análisis de RAPD no requiere la pericia especial con que

se maneja la hibridación del ADN a membranas u otras actividades más
especializadas.
Desventajas de los RAPDs
De herencia dominante
Falta de conocimiento previo de la identidad de

los productos de la amplificación
Problemas de reproducibilidad
Problemas por co-migración
Los marcadores de RAPD son dominantes. La amplificación ocurre en un locus o no ocurre, lo que exige
considerar las bandas partiendo de su presencia o de ausencia. Esto significa que los homocigotos y los
heterocigotos no pueden distinguirse. Además, la ausencia de una banda debida a la falta de una secuencia
determinada no puede distinguirse de la ausencia debida a la falta de amplificación por otras razones (por
ejemplo, porque el ADN era de calidad deficiente), lo que contribuye a la ambigüedad en la interpretación de
los resultados.
No se sabe nada acerca de la identidad de los productos de amplificación a menos que los estudios estén
apoyados en análisis de herencia.
Los problemas de reproducibilidad provienen de que la tecnología de RAPD es sensible a los cambios en la
calidad del ADN, en los componentes de la PCR y en las condiciones de la PCR, todo lo cual ocasiona
cambios en los fragmentos amplificados. Se pueden obtener resultados reproducibles si se tiene cuidado de
estandarizar las condiciones de los experimentos (Munthali y col., 1992; Lowe y col., 1996).
Los problemas de co-migración motivan preguntas como ésta: “¿Corresponden las bandas de igual tamaño al
mismo fragmento de ADN?”
• La presencia de una banda de idéntico peso molecular en diferentes individuos no es, por sí misma,
una prueba de que los individuos comparten el mismo fragmento de ADN (fragmento `homólogo`).
• Una banda detectada en un gel como banda sola puede en realidad comprender diferentes
productos de amplificación. Esto ocurre porque el tipo de electroforesis usado, aunque es capaz de
separar el ADN cuantitativamente (es decir, según el tamaño), no puede separar los fragmentos de
igual tamaño cualitativamente (es decir, según la secuencia de las bases).
Referencias
Lowe, A.J., O. Hanotte y L. Guarino. 1996. Standardization of molecular genetic techniques for
the characterization of germplasm collections: the case of random amplified polymorphic
DNA (RAPD). Plant Genet. Resour. Newsl. 107:50-54.
Munthali, M., B.V. Ford-Lloyd y H.J. Newbury. 1992. The random amplification of polymorphic
DNA for fingerprinting plants. PCR Methods Appl. 1(4):274-276.
Caracterización de germoplasma
Estructura genética de poblaciones
Domesticación
Detección de variación somaclonal
Identificación de cultivares
Pureza híbrida
Cartografía genética
Las referencias en color púrpura se explican detalladamente en las siguientes

diapositivas.
Cattan-Toupance, I., Y. Michalakis y C. Neema. 1998. Genetic structure of wild bean populations
in their South Andean centre of origin. Theor. Appl. Genet. 96:844-851.
Cristofani, M., M.A. Machado y D. Grattapaglia. 1999. Genetic linkage maps of Citrus sunki Hort.
ex. Tan. and Poncirus trifoliata (L.) Raf. and mapping of citrus resistance gene. Euphytica
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Hashmi, G., R. Huettel, R. Meyer, L. Krusberg y F. Hammerschlag. 1997. RAPD analysis of
somaclonal variants derived from embryo callus cultures of peach. Plant Cell Rep 16(9):
624-627.
Kölliker, R., F.J. Stadelmann, B. Breidy y J. Nösberger. 1998. Fertilization and defoliation
frequency affect genetic diversity of Festuca pratensis Huds. In permanent grasslands. Mol.
Ecol. 7:1557-1567.
Martelli, G., F. Sunseri, I. Greco, M.R. Sabina, P. Porreca y A. Levi. 1999. Strawberry cultivars
genetic relationship using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Adv. Hortic.
Sci. 13(3):99-104.
Martin, M., F. Piola, D. Chessel, M. Jay y P. Heizmann. 2001. The domestication process of the
Modern Rose: genetic structure and allelic composition of the rose complex. Theor. Appl.
Genet. 102:398-404.
Morden, C.W. y W. Loeffler. 1999. Fragmentation and genetic differentiation among
subpopulations of the endangered Hawaiian mint Haplostachys haplostachya (Lamiaceae).
Mol. Ecol. 8:617-625.
Nebauer, S.G., L. del Castillo-Agudo y J. Segura. 1999. RAPD variation within and among natural
populations of outcrossing willow-leaved foxglove (Digitalis obscura L.). Theor. Appl. Genet.
98:985-994.
Rodríguez, J.M., T. Berke, L. Engle y J. Nienhuis. 1999. Variation among and within Capsicum
species revealed by RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 99:147-156.
Rom, M., M. Bar, A. Rom, M. Pilowsky y D. Gidoni. 1995. Purity control of F1-hybrid tomato
cultivars by RAPD markers. Plant Breed. 114(2):188-190.
Ejemplo: Festuca pratensis
Título:
Fertilization and defoliation frequency affect genetic diversity of
Festuca pratensis Huds. in permanent grasslands. Mol. Ecol.
1998. 7:1557-1567
Objetivo:
Evaluar la variabilidad genética de Festuca pratensis y determinar
si la frecuencia de fertilización y de defoliación afectan la
variabilidad genética dentro de las poblaciones naturales
• Se estudiaron 6 poblaciones naturales y 3 cultivares de
Festuca pratensis mediante 69 marcadores RAPD (13
cebadores) y 7 caracteres agronómicos
• Se tomaron muestras de las poblaciones naturales de dos
experimentos de largo plazo no relacionados entre sí, en los
que se habían aplicado tratamientos durante períodos que
iban de 11 a 38 años
Ejemplo: Festuca pratensis (continuación)
Resultados:
• El análisis factorial de los caracteres agronómicos no
permitió separar los cultivares de las otras
poblaciones
• El análisis de agrupamiento con los datos de RAPD
señaló una clara distinción entre cultivares y
poblaciones naturales
• La variabilidad genética dentro de cultivares fue
inferior que dentro de poblaciones naturales
• El análisis de la varianza molecular (AMOVA) mostró
un efecto significativo del manejo sobre la variación
genética
Ejemplo: Festuca pratensis (continuación)
Discusión:
Existe variación genética significativa dentro de los
cultivares y de las poblaciones naturales de Festuca
pratensis. Sin embargo, la fertilización y alta frecuencia
de corte pueden reducirla
Conclusiones:
Las poblaciones de Festuca pratensis no fertilizadas y
raramente cortadas deben conservarse como un
acervo genético. Se necesitan estudios adicionales
sobre otras especies para aprender más acerca de la
forma en que los sistemas de manejo afectan la
diversidad de las comunidades vegetales y la
arquitectura genética de la especie
Ejemplo: Pimiento
Título:
Variation among and within Capsicum species
revealed by RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 1999.
99:147-156
Objetivo:
Caracterizar el germoplasma de especies de
Capsicum
Se caracterizaron 134 entradas de seis especies de
Capsicum, conservadas en el banco de germoplasma
del Asian Vegetable Research and Development
Center (AVRDC), empleando 110 marcadores RAPD
(25 cebadores)
Ejemplo: Pimiento (continuación)
• Se documentó la existencia de 10 pares de entradas que
podían estar duplicadas
• Se identificaron RAPD de diagnóstico que se emplearon
para mejorar la identificación taxonómica. También podrían
usarse para verificar la hibridación natural y artificial
• Tres entradas de Capsicum que estaban mal clasificadas
según sus caracteres morfológicos, fueron re-identificadas
con los RAPD de diagnóstico
• Se asignaron tres entradas, no clasificadas antes, a una
especie partiendo de los RAPD de diagnóstico
• Las entradas de Capsicum annuum del banco no fueron
diferentes de las líneas del programa de fitomejoramiento
respecto a la variación o diversidad indicada por los
marcadores RAPD
Ejemplo: Pimiento (continuación)
Conclusiones:
El programa de mejoramiento de pimiento del
AVRDC trabaja, al parecer, con una diversidad
que es representativa de su colección en el
banco de germoplasma. Los marcadores
moleculares pueden ser útiles para racionalizar
el manejo de una colección ex situ (por ejemplo,
identifican duplicados o errores taxonómicos)

Ejemplo: Rosa
Título:
The domestication process of the Modern Rose:
genetic structure and allelic composition of the rose
complex. Theor. Appl. Genet. 2001. 102:398-404
Objetivo:
Evaluar la variabilidad genética existente entre
variedades cultivadas de rosa e investigar la historia
de su fitomejoramiento
Se seleccionaron, de 13 grupos horticulturales,
100 variedades antiguas de rosa cultivada por el
modo en que definieron las etapas sucesivas de su
domesticación. Se estudiaron mediante AP-PCR con
cinco cebadores largos (de 20 bp)
Ejemplo: Rosa (continuación)
• Se produjeron 58 fragmentos polimórficos de ADN, de
los cuales 55 fueron informativos y discriminatorios, y
permitieron diferenciar casi todos los 100 cultivares
• Un dendrograma mostró las relaciones existentes
entre las rosas de fundación chinas y europeas, los
grupos híbridos de la primera y segunda generaciones,
y los híbridos más modernos producidos durante la
domesticación
• El análisis de componentes principales demostró la
existencia de un gradiente continuo en la proporción
entre alelos europeos y alelos chinos, y una
considerable reducción de la variabilidad genética en
el curso de la domesticación
Ejemplo: Rosa (continuación)
Conclusiones:
El efecto de la selección de un rango limitado
de caracteres morfológicos resultó en la
retención de un bajo número de alelos durante
la domesticación de la rosa. La rosa tiene
mucha más variación genética de la que se ha
usado hasta ahora. Debe estudiarse la
posibilidad de seleccionar diversas variantes
con nuevos y valiosos caracteres estéticos
para desarrollar más variedades

Diferencias entre las tecnologías DAF y RAPD
Respecto a la DAF:
Las concentraciones de cebador son más altas
Se usan cebadores más cortos (de 5 a 8

nucleótidos)
Un ciclo de dos temperaturas en lugar de un

ciclo de 3 temperaturas (usado en RAPD)
Obtención de combinaciones de bandas

sumamente complejas
Referencias
Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991a. DNA amplification

fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9(4):294-307.
Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991b. DNA amplification using
very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9:553-557.
Diferencias entre las tecnologías AP-PCR y
RAPD
Respecto a AP-PCR:
La amplificación se realiza en tres partes, cada
una con sus propios requisitos y concentración
de elementos constitutivos
Se emplean concentraciones altas del cebador
en los primeros ciclos de la PCR
Se eligen arbitrariamente cebadores de longitud
variable y diseñados, a veces, para otros fines
(por ejemplo, el cebador universal de análisis de
secuencias M13)
Referencia
Welsh, J. y M. McClelland. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary

primers. Nucleic Acids Res. 18(24):7213-7218.
En resumen
La tecnología RAPD se basa en una PCR

sencilla con un solo cebador arbitrario y corto
La técnica RAPD produce fácilmente un

número notable de bandas, pero sus
marcadores son dominantes y son frecuentes
los problemas de reproducibilidad
DAF y AP-PCR son tecnologías alternas

respecto a los RAPD, pero más complejas

Las características principales del procedimiento

de RAPD
Las causas de los polimorfismos de la molécula
de ADN que pueden detectarse con RAPD
Los criterios para la selección de bandas RAPD
para análisis de diversidad genética
Las ventajas y las desventajas de la tecnología
RAPD
Las diferencias principales de la DAF y de la
AP-PCR con respecto a la tecnología de RAPD

Referencias bá sicas
Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991a. DNA amplification
fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9(4):294-307.
Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991b. DNA amplification using
very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9:553-557.
Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1992. DNA fingerprinting: MAAPing
out a RAPD redefinition? Bio/Technology 10(9):937.
Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. An
introduction to genetic analysis (6th edn.). W.H. Freeman, NY, E.U.
Lowe, A.J., O. Hanotte y L. Guarino. 1996. Standardization of molecular genetic
techniques for the characterization of germplasm collections: the case of random
amplified polymorphic DNA (RAPD). Plant Genet. Resour. Newsl. 107:50-54.
Munthali, M., B.V. Ford-Lloyd y H.J. Newbury. 1992. The random amplification of
polymorphic DNA for fingerprinting plants. PCR Methods Appl. 1(4):274-276.
Welsh, J. y M. McClelland. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary
primers. Nucleic Acids Res. 18(24):7213-7218.
Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski y V. Tingey. 1990. DNA
polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic
Acids Res. 18(22):6531-6535.
A continuación

Polimorfismo de longitud de
fragmentos amplificados (AFLP)
Glosario
Tecnologías basadas en la reacción

en cadena de la polimerasa (PCR)
Polimorfismo de longitud de fragmentos
amplificados (AFLP)
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 AFLP 1
Contenido
La tecnología AFLP, paso a paso:

• Cuatro etapas
• Digestión del ADN y ligación
• Reacciones de la PCR y su detección
• Resumen de la tecnología
Equipo
Interpretación de las bandas AFLP
Ventajas y desventajas de los AFLP
• Limonium sp.
• Stylosanthes spp.
• Mostaza india

La tecnología AFLP*, paso a paso
Características principales:
Es una combinación de las tecnologías de
RFLP y de PCR
Está basada en la amplificación selectiva de
los fragmentos de restricción mediante la PCR
Es un método muy sensible para caracterizar
el ADN cualquiera que sea su origen y su
complejidad
Se puede aplicar con ADN genómico total o
con ADNc (‘perfiles de transcripción’)
* La técnica de AFLP fue propuesta por KeyGene (Holanda), una empresa privada de
biotecnología que adquirió los derechos de propiedad de esa tecnología. Para más
información, vea la página web de KeyGene: http:/www.keygene.com
Referencia
Zabeau, M. y P. Vos. 1993. Selective restriction amplification: a general method for
DNA fingerprinting. Publicación Europea de Patente 92402629 (Publicación No.
EP0534858A1).
Cuatro etapas
El ADN es digerido con dos enzimas de

restricción diferentes
Adaptadores oligonucleótidos se ligan a los
extremos de los fragmentos de ADN
Se amplifican subconjuntos específicos de los
productos de digestión del ADN empleando
combinaciones de cebadores selectivos
Se detecta el polimorfismo empleando
radioisótopos, colorantes fluorescentes o tinción
de plata
Digestión del ADN y ligación
Uno de los enzimas de restricción hace cortes

frecuentes (su sitio de reconocimiento es de
cuatro bases, por ejemplo MseI)
El segundo enzima de restricción hace cortes
infrecuentes (su sitio de reconocimiento es de
seis bases, por ejemplo EcoRI)
Se ligan a los fragmentos de ADN generados
adaptadores sintéticos de doble cadena, que
son específicos de cada sitio de restricción
El ADN objeto de estudio se digiere con dos enzimas de restricción diferentes, uno de
los cuales hace cortes frecuentes (el enzima de restricción de cuatro bases) y el otro
hace cortes poco frecuentes (el enzima de restricción de seis bases). Se pueden usar
diversas combinaciones de enzima/cebador. MseI y EcoRI son más apropiados en los
genomas ricos en pares adenina-timina (AT), dado que generan menos fragmentos en
los genomas ricos en pares guanina-citosina (GC).
Hecho esto, se ligan unos adaptadores sintéticos, específicos de cada sitio de

restricción, al ADN digerido. Tanto la etapa de restricción como la etapa de ligación se
pueden realizar en una sola reacción.
Reacciones de la PCR y su detección
Se realiza una primera PCR (preselectiva), usando
cebadores oligonucleótidos complementarios al
adaptador y a los sitios de restricción. Se añade un
nucleótido a los cebadores para seleccionar sólo un
subconjunto de fragmentos
Los productos de la amplificación preselectiva se
someten a otra PCR, y nuevamente se selecciona un
subconjunto de fragmentos. Generalmente, en la
segunda amplificación selectiva se agregan dos
nucleótidos más a los cebadores
La separación de los fragmentos de la reacción se
realiza mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida de tipo desnaturalizante (geles de
secuenciación) o electroforesis capilar
Digamos que un nucleótido A se añade a los cebadores preselectivos. En

consecuencia, sólo se amplificará el subconjunto de fragmentos de la mezcla en los que
la secuencia del sitio de restricción vaya seguida directamente por una A. Los
cebadores de amplificación tienen generalmente de 17 a 21 nucleótidos de longitud y se
acoplan perfectamente a sus secuencias complementarias.
Luego se lleva a cabo una segunda amplificación, empleando cebadores similares a los
de la primera reacción pero con dos bases adicionales (por ejemplo CA). Así, sólo un
subconjunto de la primera reacción de amplificación experimentará amplificación
durante la segunda ronda de PCR, es decir, aquellos fragmentos en los que la
secuencia CA vaya a continuación en la secuencia del sitio de restricción.
El subconjunto de fragmentos obtenidos se analiza mediante electroforesis en geles de

poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes para generar una huella identificadora.
Las bandas de ADN pueden detectarse empleando diversos procedimientos.
Si se usan cebadores fluorescentes, éstos tienen la ventaja de que se pueden cargar en

conjuntos de tres en el mismo carril del gel, cada uno marcado con diferente color, de
modo que se maximiza el número de datos recogidos por gel (Zhao et al,. 2000). Una
segunda ventaja de estos cebadores, al igual que la detección con nitrato de plata, es la
de evitar el uso de radioisótopos.
Referencia
Zhao, S., S.E. Mitchell, J. Meng, S. Kresovich, M.P. Doyle, R.E. Dean, A.M. Casa y J.W.
Weller. 2000. Genomic typing of Escherichia coli 0157:H7 by semiautomated
fluorescent AFLP analysis. Microbes Infect. 2:107-113.
Resumen de la tecnología*
ADN genómico
Digestión con 2 enzimas
de restricción
Empalme de los adaptadores
Preamplificación:
Cebadores = adaptadores + 1 base
Amplificación selectiva:
Cebadores = adaptadores + 1 base + 2 bases
Perfil de AFLP
* Adaptado del sitio web de KeyGene: http:/www.keygene.com

Equipo
Recursos:
• Reactivos
Equipo:
• Refrigerador y • Hornillo o microondas
congelador • Medidor de pH
• Campana extractora • Balanza estándar
de flujo laminar • Unidades de
• Centrífuga electroforesis vertical
• Termociclador • Transiluminador para luz
eléctrica • Secuenciador automático
Interpretación de las bandas de AFLP
La técnica AFLP detecta polimorfismos generados
por cambios (de presencia o tamaño) en los sitios
de restricción o en los adyacentes a éstos
Se pueden usar diferentes enzimas de restricción. Distintas
combinaciones de nucleótidos preselectivos y selectivos
aumentarán la probabilidad de encontrar polimorfismos
útiles
A mayor número de bases selectivas, menor detección de
polimorfismo
Las bandas se registran, generalmente, como presentes o
ausentes
En función del espesor de la banda, se pueden detectar
bandas heterocigóticas y homocigóticas, aunque no siempre
los resultados son confiables
La base molecular de los polimorfismos de AFLP generalmente se origina en los

nucleótidos. Se detectan cambios de un solo nucleótido cuando: (1) se afectan los
propios sitios de restricción; y (2) se afectan los nucleótidos adyacentes a los sitios de
restricción, lo que hará que los cebadores hibriden erróneamente en el extremo 3’
impidiendo la amplificación.
La mayoría de los marcadores de AFLP son de tipo mono-alélico, lo que significa que
sólo se podrá registrar un alelo porque su alelo complementario no se detecta. Aunque
es poco frecuente, se pueden identificar marcadores bi-alélicos como resultado de
pequeñas inserciones o deleciones en los fragmentos de restricción.
Un gel de AFLP procesado con cebadores
fluorescentes
Esta imagen muestra un gel de AFLP obtenido en un secuenciador automático. Antes

de cargar el gel, las muestras se marcaron con uno de tres colorantes fluorescentes
(amarillo, azul o verde). El rojo marca una muestra testigo que se incluyó con las demás
como comprobante del comportamiento de la electroforesis. La evaluación directa de la
presencia o ausencia de bandas específicas es casi imposible debido al elevado
número de bandas que normalmente se generan en el procedimiento de AFLP, y
porque los colorantes fluorescentes no pueden distinguirse a simple vista. Las bandas
pueden identificarse con un rayo láser, y los datos se recopilan con ayuda de
programas informáticos especializados.
AFLP detectados con tinción de plata
Esta imagen muestra un gel de AFLP proveniente de la electroforesis en una unidad

vertical y teñido con nitrato de plata. La imagen presenta ciertas regiones del gel con
alta concentración de bandas, mientras que otras están relativamente vacías. La
recopilación de los datos de geles teñidos con nitrato de plata puede hacerse mediante
apreciación visual, o con ayuda de programas informáticos después de haber adquirido
la figura del gel de forma electrónica mediante un escáner.
Ventajas de los AFLP
Los AFLP permiten una exploración rápida de los
polimorfismos del genoma entero
Puesto que se genera un gran número de bandas,
cada marcador da una huella identificadora de ADN
sumamente informativa
Son también altamente reproducibles
No se necesita información previa de las secuencias
ni hay que generar sondas de hibridación
Es una técnica muy útil para crear mapas genéticos
en forma rápida
Permiten la generación de “perfiles de trascripción”
La tecnología de AFLP puede aplicarse a cualquier muestra de ADN, incluyendo el

humano, el animal, el vegetal y el microbiano, lo que le da el potencial de convertirse en
un sistema universal para la caracterización de ADN.
Debido a la naturaleza de los cebadores de AFLP, los marcadores obtenidos son

sumamente confiables y sólidos, y no son afectados por las pequeñas variaciones del
proceso de amplificación.
Una “huella identificadora” característica de AFLP contiene entre 50 y 100 fragmentos

amplificados, muchos de los cuales pueden servir como marcadores genéticos.
La generación de perfiles de trascripción de AFLP con ADNc es una herramienta eficaz

para identificar los ARNm expresados diferencialmente. Esta herramienta tiene ventajas
que pueden ser útiles para descubrir genes en el germoplasma.
Desventajas de los AFLP
Los AFLP generan cantidades enormes de
información, por lo que pueden requerir un
análisis automatizado y, por consiguiente,
tecnología de computación adecuada
Son de tipo dominante
En los mapas genéticos, los AFLP se agrupan,
con frecuencia, en los centrómeros y telómeros
Requieren bastante técnica en el laboratorio y,
especialmente, en el análisis de los datos
Un inconveniente adicional de la tecnología de AFLP es, quizás, que no puede

garantizar la homología entre bandas de peso molecular (MW) similar, lo que dificulta
los estudios del tipo del análisis filogenético. Ahora bien, mientras bandas no
homólogas de peso similar también se encuentran utilizando otros marcadores como
los RAPD, pueden ser menos comunes en la tecnología de AFLP porque la resolución
de los geles es muy alta y, en consecuencia, la probabilidad de que las bandas no
homólogas sean, por coincidencia, del mismo peso molecular es más baja.
Evaluación de diversidad genética
Análisis de distancia genética
Huella identificadora de ADN
Análisis de colecciones de germoplasma
Construcción de mapas genéticos
Seguimiento de marcadores de diagnóstico
Las referencias en color púrpura se explican más detenidamente en las diapositivas

que vienen a continuación.
Badr, A., K. Müller, R. Schäfer-Pregl, H. El Rabey, S. Effgen, H.H. Ibrahim, C. Pozzi, W. Rohde y
F. Salamini. 2000. On the origin and domestication history of barley (Hordeum vulgare). Mol.
Biol. Evol. 17(4):499-510.
Barret, B.A. y K.K. Kidwell. 1998. AFLP-based genetic diversity assessment among wheat
cultivars from the Pacific Northwest. Crop Sci. 38:1261-1271.
Beebe, S., J. Rengifo, E. Gaitán, M.C. Duque y J. Tohme. 2001. Diversity and origin of Andean
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AFLP (R) data as a tool in genetic diversity assessment among maize (Zea mays L.) inbred
lines. Mol. Breed. 6(3):265-276.
Ejemplo: Limonium sp.
Título:
AFLP analysis of the critically endangered Limonium
cavanillesii (Plumbaginaceae). J. Hered. 1999.
90(4):485-489
Objetivo:
Comparar la efectividad de los AFLP para analizar la
diversidad genética de L. cavanillesii y su eficiencia
respecto a un estudio anterior de RAPD
Se extrajo el ADN de 29 individuos silvestres. Estos
individuos eran los mismos que se emplearon en un
estudio anterior* de RAPD. Se seleccionaron tres
combinaciones de cebadores
*Palacios, C y F. González-Candelas. 1997. Lack of genetic variability in the rare and

endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae) using RAPD markers. Mol.
Ecol. 6:671-675.
Ejemplo: Limonium sp. (continuación)
Resultados:
Se generaron, en total, 231 fragmentos: en promedio, 223
por individuo y 77 por combinación de cebadores. Sólo 6%
de los marcadores fueron polimórficos y distinguieron 11
perfiles AFLP diferentes, mientras que en un estudio anterior*
con RAPD no se obtuvo ningún marcador polimórfico
Discusión:
Los AFLP demostraron ser un tipo de marcador apropiado
para recopilar información crítica para la identificación de
poblaciones naturales en riesgo y para la planificación de
estrategias de recuperación de L. cavanillesii. Los bajos
niveles de variabilidad genética encontrada en L. cavanillesii
podrían explicarse como efecto de su sistema reproductivo
apomíctico o como un caso de cuello de botella reciente y
severo
*Palacios, C y F. González-Candelas. 1997. Lack of genetic variability in the rare and

endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae) using RAPD markers. Mol.
Ecol. 6:671-675.
Ejemplo: Stylosanthes spp.
Título:
Geographical patterns of genetic variation in two
species of Stylosanthes Sw. using amplified fragment
length polymorphism. Mol. Ecol. 2001. 10:1947-1958
Objetivo:
Evaluar la variación genética en dos especies del
género tropical Stylosanthes Sw.
Se escogieron 111 entradas: 59 de S. viscosa y 52 de
S. humilis, las cuales representan la distribución
geográfica de ambas especies. Se usaron cinco
combinaciones de cebadores para S. humilis y cuatro
para S. viscosa
Ejemplo: Stylosanthes spp. (continuación)
Resultados:
• S. humilis: de un total de 417 bandas, 316 eran
polimórficas (75%). La semejanza entre las entradas fue,
en promedio, de 0.71, y la distancia genética promedio
fue de 0.17 (coeficiente de Jaccard)
• S. viscosa: de un total de 373 bandas, 312 eran
polimórficas (83%). El valor de la semejanza entre
entradas fue, en promedio, de 0.67, y la distancia
genética promedio fue de 0.20
• El análisis de conglomerados y de PCA agruparon las
entradas de ambas especies según su origen geográfico,
con algunas excepciones. Una explicación de esto sería
la incidencia de sucesos de dispersión de largo alcance o
la introducción de genotipos de una zona a otra por el
hombre
Ejemplo: Stylosanthes spp. (continuación)
Discusión:
Estos resultados demuestran la utilidad de la
tecnología AFLP, no sólo para detectar la diversidad
genética dentro de las especies de Stylosanthes, sino
también para identificar individuos mal clasificados
Conclusiones:
Este estudio revela la capacidad de los AFLP para
detectar patrones geográficos en la variación genética,
información que es necesaria para desarrollar
estrategias óptimas de conservación

Ejemplo: Mostaza india
Título:
AFLP-based genetic diversity assessment amongst agronomically
important natural and some newly synthesized lines of Brassica
juncea. Theor. Appl. Genet. 2001. 102:193-199
Objetivo:
• Estudiar la variación genética existente entre entradas de
B. juncea
• Identificar las combinaciones de cebadores AFLP que son
informativas para la identificación varietal
• Buscar marcadores polimórficos para un posible etiquetado de
los caracteres agronómicos que se suponen presentes en el
germoplasma estudiado
El estudio empleó 30 entradas de B. juncea, que representaban
21 poblaciones naturales y 9 variedades sintéticas y líneas de
mejoramiento. La amplificación selectiva se llevó a cabo con
21 combinaciones de cebadores EcoRI/MseI
Ejemplo: Mostaza india (continuación)
Resultados:
• Se registraron 1251 fragmentos en los 30 genotipos.
Por término medio, 37 bandas por combinación de
cebadores fueron polimórficas
• Ni un solo par de cebadores pudo distinguir los
30 genotipos sobre la base de la presencia o la
ausencia de bandas específicas de la variedad
• Cuatro pares de cebadores fueron los más informativos
y tuvieron un poder discriminatorio del 100%
• El análisis de conglomerados basado en estos cuatro
cebadores concordó con resultados de estudios
anteriores basados en caracteres morfológicos* y en
datos de RAPD**
*Pradhan, A.K., Y.S. Sodhi, A. Mukhopadhyay y D. Pental. 1993. Heterosis breeding in

Indian mustard (Brassica juncea (L.) Czern. & Cross): analysis of component
characters contributing to heterosis for yield. Euphytica 69:219-229.
**Jain, A., S. Bhatia, S.S. Banga, S. Prakash y M. Lakshmikumaran. 1994. Potential

use of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique to study the
genetic diversity in Indian mustard (Brassica juncea) and its relationship to
heterosis. Theor. Appl. Genet. 88:116-122.
Ejemplo: Mostaza india (continuación)
Discusión y conclusiones:
En un estudio anterior* con 32 cebadores
RAPD se obtuvo un promedio de 12 loci
polimórficos por cebador. Por tanto, la técnica
AFLP proporcionó un mayor grado de
resolución para discriminar el germoplasma
estrechamente relacionado. El análisis con
AFLP tiene potencial para complementar tanto
los datos convencionales como otros de
distintos tipos de marcadores moleculares
*Jain, A., S. Bhatia, S.S. Banga, S. Prakash y M. Lakshmikumaran. 1994. Potential use
of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique to study the genetic
diversity in Indian mustard (Brassica juncea) and its relationship to heterosis. Theor.
Appl. Genet. 88:116-122.
En resumen
La tecnología AFLP se basa en la amplificación

selectiva de fragmentos de restricción después
de la digestión del ADN
Esta tecnología detecta polimorfismos causados
por cambios en los sitios de restricción o en sus
regiones adyacentes
Esta tecnología produce un gran número de
bandas por experimento; no obstante, las
bandas son dominantes y el procedimiento tiene
requisitos técnicos considerables

Las diferentes etapas que comprende la

generación de los AFLP
Las principales consideraciones que requiere la

interpretación de las bandas de AFLP
Las ventajas y las desventajas de los AFLP

respecto al análisis de la diversidad genética

Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant
genetic resources conservation. p. 85-93. En: Genome mapping in
plants (H. Paterson, ed.). RG Landes Company and Academic
Press, Austin, TX, E.U.
KeyGene, N.V. 2001. Empowering genomics. http://www.keygene.com
(30 junio 2002).
Vos, P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Hornes,
A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper y M. Zabeau. 1995. AFLP:
a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res.
23:4407-4414.
Zabeau, M. y P. Vos. 1993. Selective restriction amplification: a general
method for DNA fingerprinting. Publicación de Patente Europea
92402629 (Publicación No. EP0534858A1).
Zhao, S., S.E. Mitchell, J. Meng, S. Kresovich, M.P. Doyle, R.E. Dean,
A.M. Casa y J.W. Weller. 2000. Genomic typing of Escherichia coli
0157:H7 by semiautomated fluorescent AFLP analysis. Microbes
Infect. 2:107-113.
A continuación

Sitios de secuencia etiquetada
Glosario


Sitios de secuencia etiquetada
(Microsatélites, SCAR, CAPS, ISSR)
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 STS 1

Contenido
Sitios de secuencia etiquetada (STS) como
marcadores
Microsatélites (SSR, STMS o SSRP)
• Identificación de las regiones de microsatélite
• Estructura
• Selección de los cebadores
• Metodología y visualización
• Equipo
• Ventajas y desventajas
• Aplicaciones de los SSR y ejemplos
SCAR
CAPS
ISSR
Sitios de secuencia etiquetada (STS) como
marcadores
A diferencia de las técnicas basadas en

cebadores arbitrarios, los STS dependen de un
cierto conocimiento de las secuencias
Los marcadores basados en STS son
codominantes
Tienden a ser más reproducibles porque se
usan secuencias cebadoras más largas
Requieren, básicamente, los mismos protocolos
de laboratorio y el mismo equipo que la PCR
estándar
A diferencia de la PCR con cebadores arbitrarios, el diseño de los cebadores para

detectar sitios de secuencia etiquetada (STS) está basado en cierto conocimiento de
las secuencias. Estos cebadores son únicos y específicos de las secuencias, y
detectan variación en el ADN genómico alélico. Los STS tienen una ventaja especial
sobre los RAPD por ser codominantes, o sea, pueden distinguir entre los homocigotos
y los heterocigotos. Tienden también a ser más reproducibles, porque las secuencias
de los cebadores son más largas.
Tienen, sin embargo, una desventaja: requieren de algún conocimiento preexistente de

la secuencia del ADN de la región, aunque sólo sea parcial. Su inconveniente principal
es la inversión en esfuerzo y costo que se necesita para diseñar los cebadores
específicos de cada locus.
Del mismo modo que con los RAPD, el uso de la PCR genera datos rápidamente y
requiere poco ADN. Todos los métodos de STS usan los mismos protocolos básicos
que usan los RAPD (extracción de ADN y PCR) y requieren el mismo equipo.
Microsatélites (SSR, STMS o SSRP)
Los microsatélites son secuencias cortas

(1-10 pb) que se repiten en serie
Para poder usarlos como marcadores, debe
identificarse, en primer lugar, su ubicación en el
genoma de interés
Los polimorfismos en la región repetida se
pueden detectar mediante una PCR con
cebadores diseñados a partir de la región del
ADN adyacente a la repetición
Los microsatélites también se llaman repeticiones de secuencia simple (SSR) y,

ocasionalmente, sitios de microsatélite de secuencia etiquetada (STMS) o polimorfismo
de repeticiones de secuencia simple (SSRP). Son con mucho el tipo de STS que más
se usa.
Los SSR son repeticiones cortas en serie cuya longitud está entre 1 y 10 pb; los más
típicos miden de 2 a 3 pb. Son altamente variables y están distribuidos por igual en todo
el genoma. Este tipo de ADN repetitivo es común en organismos eucariotas, y el
número de unidades repetidas varía ampliamente entre los organismos, hallándose en
algunos hasta 50 copias de la unidad repetida. Para identificar estos polimorfismos, se
construyen cebadores de PCR para la región del ADN que flanquea el microsatélite. Las
regiones adyacentes a los microsatélites tienden a conservarse dentro de las especies,
aunque a veces se conservan también en niveles taxonómicos mayores.
Referencia
Hajeer, A., J. Worthington y S. John (eds.). 2000. SNP and microsatellite genotyping:
Markers for genetic analysis. En: Biotechniques: Molecular laboratory methods
series. Eaton Publishing, Manchester, U.K.
Identificación de regiones microsatélite
Secuencias disponibles No hay secuencias disponibles

en las bases de datos en las bases de datos
Usar microsatélites conocidos Usar secuencias de

Identificar las secuencias
para aislar clones candidatos microsatélite como sonda
que contienen microsatélites
de una genoteca frente al ADN digerido
Diseñar cebadores Secuenciar los Detectar el

específicos clones positivos polimorfismo
Detectar el Diseñar cebadores

polimorfismo específicos
Detectar el
polimorfismo
Tal como ocurre en las zonas del genoma con alta concentración de repeticiones, los
SSR tienden a agruparse en los centrómeros y en los telómeros. Sin embargo, este
problema se puede resolver identificando SSR a partir de genotecas de EST, que son
ricas en genes y cuya distribución es más uniforme.
Estructura
= región repetida (p.e., GA)
Regiones adyacentes únicas
El número de repeticiones es altamente variable

entre individuos

Selección de los cebadores
Diseñar cebadores ( ) complementarios de las

regiones adyacentes

Metodología y visualización
Metodología:
• Extracción del ADN
• PCR con cebadores específicos de las regiones
adyacentes al microsatélite
• Separación de fragmentos
Visualización:
• Mediante electroforesis en geles de agarosa, usando
tinción con bromuro de etidio y luz ultravioleta, o
• En geles de acrilamida, tiñendo con nitrato de plata,
o empleando radioisótopos, o
• Con secuenciadores automáticos, empleando
cebadores pre-marcados con fluorescencia
Análisis de datos
La variación en tamaño de los productos de la PCR se debe a la diferencias en el

número de las unidades repetidas en el microsatélite. Los polimorfismos de SSR se
pueden visualizar mediante electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. Los
alelos del microsatélite se detectan usando diversos métodos: tinción con bromuro de
etidio, nitrato de plata, radioisótopos o fluorescencia.
Si se usan cebadores marcados con fluorescencia, y los productos son suficientemente

diferentes en tamaño y no se sobreponen, se puede cargar un carril con varios
productos de reacción de forma simultánea, lo que aumenta enormemente la eficiencia
de estos marcadores, (Dean et al., 1999, trae un buen ejemplo).
Referencia
Dean, R.E., J.A. Dahlberg, M.S. Hopkins, S.E. Mitchell y S. Kresovich. 1999. Genetic
redundancy and diversity among 'Orange' accessions in the U.S. national sorghum
collection as assessed with Simple Sequence Repeat (SSR) markers. Crop Sci.
39:1215-1221.
Tinción con bromuro de etidio
Como se mencionó anteriormente, una manera de visualizar los microsatélites es

empleando electroforesis en geles de agarosa. Este método es apropiado cuando los
alelos son suficientemente largos, o sea, de más de 200-300 pares de bases, y las
diferencias entre alelos también son significativas (es decir, más de 10-20 pb).
Esta foto muestra un microsatélite que se hizo migrar en un gel de agarosa teñido con
bromuro de etidio. Los carriles segundo y tercero (el primero, muy débil, lleva un
marcador de tamaño) corresponden a los progenitores, uno de los cuales tiene solo una
banda y el otro dos. El heterocigoto, por lo tanto, tiene tres. En el segundo progenitor,
una de las bandas es mucho más tenue. Como las dos bandas co-segregan, no son el
resultado de dos loci que estén en diferentes lugares, pero puede deberse a que las
dos copias del microsatélite están separadas por una inserción o una deleción, o bien
están ubicadas una cerca de la otra.
Tinción con nitrato de plata
Los microsatélites pueden analizarse también después de hacer migrar los productos
de la PCR en un gel de acrilamida teñido con nitrato de plata. En esta imagen, las
muestras pertenecen a una especie diploide y, por consiguiente, tienen un máximo de
dos alelos. Cada banda (cada alelo) parece ser más de una banda. Este fenómeno
ocurre con frecuencia en la amplificación de los microsatélites. Puesto que puede
causar confusión, se debe poner especial cuidado en la interpretación de los
resultados.
Equipo
Recursos:
• Reactivos
Equipo:
• Refrigerador y • Medidor de pH
congelador • Balanza estándar
• Campana extractora • Unidades de
de flujo laminar electroforesis para geles
• Centrífuga horizontales y verticales
• Termociclador • Transiluminador para luz
eléctrica • Secuenciador automático
• Hornillo o microondas
Ventajas:
• Requieren muy poco ADN y éste no
necesariamente de alta calidad
• Sumamente polimórficos
• Uniformemente distribuidos en todo el genoma
• Interpretación sencilla de los resultados
• Automatizados fácilmente, y permiten la carga
simultánea de productos en el mismo carril
• Buena resolución analítica y alta reproducibilidad
Desventajas:
• Procedimiento de descubrimiento complejo
• Costo elevado
Los loci identificados son generalmente multi-alélicos y co-dominantes. Las bandas

pueden registrarse o de manera codominante, o como bandas presentes o ausentes.
Dado que el ADN adyacente al microsatélite tiene mayor probabilidad de ser

conservado, los cebadores derivados de microsatélites se pueden usar a menudo con
muchas variedades e incluso con otras especies. La detección de estos marcadores se
automatiza fácilmente, son muy polimórficos y tienen buena resolución analítica. Todo
esto los convierte en una alternativa preferida como marcadores (Matsuoka y col.,
2002).
Referencia
Matsuoka, Y., S.E. Mitchell, S. Kresovich, M. Goodman y J. Doebley. 2002.
Microsatellites in Zea - variability, patterns of mutations, and use for evolutionary
studies. Theor. Appl. Genet. 104:436-450.
Ejemplos de aplicaciones de los SSR
Genotipificación de individuos
Evaluación de germoplasma
Cartografía de genomas
Estudios filogenéticos
Estudios evolutivos
Las referencias en color púrpura se explican en detalle en las diapositivas que siguen.
Cipriani, G., M.T. Marrazzo, R. Marconi, A. Cimato y R. Testolin. 2002. Microsatellite

markers isolated in olive (Olea europaea L.) are suitable for individual fingerprinting
and reveal polymorphism within ancient cultivars. Theor. Appl. Genet. 104:223-228.
Dean, R.E., J.A. Dahlberg, M.S. Hopkins, S.E. Mitchell y S. Kresovich. 1999. Genetic
redundancy and diversity among 'Orange' accessions in the U.S. national sorghum
collection as assessed with Simple Sequence Repeat (SSR) markers. Crop Sci.
39:1215-1221.
Matsuoka, Y., S.E. Mitchell, S. Kresovich, M. Goodman y J. Doebley. 2002.

Microsatellites in Zea - variability, patterns of mutations, and use for evolutionary
studies. Theor. Appl. Genet. 104:436-450.
Smith, J.S.C., S. Kresovich, M.S. Hopkins, S.E. Mitchell, R.E. Dean, W.L. Woodman, M.
Lee y K. Porter. 2000. Genetic diversity among elite sorghum inbred lines assessed
with simple sequence repeats. Crop Sci. 40:226-232.
Westman, A.L. y S. Kresovich. 1999. Simple sequence repeats (SSR)-based marker

variation in Brassica nigra genebank accessions and weed populations. Euphytica
109:85-92.
Aplicaciones: Ejemplo en sorgo
Título:
Genetic diversity among elite sorghum inbred lines
assessed with simple sequence repeats. Crop Sci.
2000. 40:226-232
Objetivo:
Evaluar los niveles de redundancia genética en las
entradas de sorgo mantenidas por el Sistema
Nacional de Germoplasma Vegetal (NPGS) de los
Estados Unidos
Se analizaron 96 individuos (5 plantas de cada una de
las 19 introducciones de la línea "Orange" y una
variedad pura selecta) empleando 15 marcadores
SSR
Aplicaciones: Ejemplo en sorgo (continuación)
La mayoría de las accesiones fueron genéticamente
distintas, pero se encontraron dos grupos redundantes
(que incluían, en total, 5 entradas)
Los valores promedio de heterocigosidad fueron muy
bajos (lo que se espera de un cultivo autógamo). Una
entrada contenía una mezcla de genotipos, lo que
indicaba algún tipo de contaminación
El análisis de varianza molecular (AMOVA) indicó que un
90% de la variación genética total se debía a las
diferencias entre entradas, mientras que un 10% era el
resultado de las diferencias genéticas entre plantas
individuales dentro de las entradas
Aplicaciones: Ejemplo en sorgo (continuación)
Conclusiones:
Los 15 marcadores SSR dieron una notable
resolución genética
El número de entradas de ‘Orange’ conservadas
podría reducirse a casi la mitad sin causar una
pérdida sustancial en la variación genética
general y reduciendo mucho, por tanto, los
costos de mantenimiento
La combinación de reacciones resultó en un
ahorro de 1152 carriles, o sea, en un 80% de
reactivos y de tiempo

Aplicaciones: Ejemplo en olivo
Título:
Microsatellite markers isolated in olive (Olea europaea
L.) are suitable for individual fingerprinting and reveal
polymorphism within ancient cultivars. Theor. Appl.
Genet. 104:223-228
Objetivo:
Evaluar la eficiencia de los marcadores SSR para
identificar polimorfismos entre cultivares de olivo
Se usaron 36 SSR para analizar 12 cultivares de olivo
(4 bien conocidos y 8 antiguos)
Aplicaciones: Ejemplo en olivo (continuación)
Todos los marcadores SSR, excepto dos,
mostraron polimorfismo (entre 2 y 5 alelos).
Todos los cultivares se separaron fácilmente
entre sí
• Cinco pares de cebadores amplificaron dos loci
diferentes
• Se descartaron seis pares de cebadores porque
produjeron patrones ilegibles
• Se confirmó que dos variedades, que parecían
idénticas, lo eran en realidad porque mostraron
patrones de bandas iguales en todo los loci. Otro par
de variedades, que también se creían idénticas,
mostraron que no lo eran
Aplicaciones: Ejemplo en olivo (continuación)
Conclusiones:
Los SSR podrían fácilmente diferenciar todas
las variedades y, por tanto, son una buena
herramienta para encontrar patrones exclusivos
de ADN. Se identificó también la variabilidad
genética dentro de los cultivares de olivo,
empleando un número muy bajo de
marcadores. En estudios anteriores con AFLP
se requirieron muchos más marcadores

Aplicaciones: Ejemplo en mostaza negra
Título:
Simple sequence repeats (SSR)-based marker
variation in Brassica nigra genebank accessions and
weed populations. Euphytica. 1999. 109:85-92
Objetivo:
Determinar el grado y la distribución de la variación
genética en B. nigra (la mostaza negra)
Se usaron cinco marcadores SSR para analizar
32 entradas de B. nigra (accesiones del banco de
germoplasma y poblaciones arvenses) provenientes
de cuatro regiones: África del Norte/Europa, India,
Etiopía y América del Norte
(continuación)
Las entradas etíopes formaron el grupo más
sobresaliente
Más de la mitad de la variación se detectó entre plantas,
dentro de entradas
Las entradas europeas y norteamericanas contenían la
mayor cantidad de variación y, generalmente, se
agrupaban juntas
En las poblaciones arvenses de América del Norte se
detectaron variantes únicas, pero la variación entre
poblaciones no se correlacionó con la distancia
geográfica
(continuación)
Conclusiones:
Aunque se creía que había poca variación
genética dentro de B. nigra, los marcadores
SSR demostraron que los patrones de variación
de la especie eran compatibles con su historia
agrícola

Región amplificada caracterizada por una
secuencia (SCAR)
Los SCAR aprovechan una banda que ha sido

generada en un experimento de RAPD
Usan cebadores de16 a 24 pb, diseñados a
partir de los extremos de marcadores RAPD
clonados
Esta técnica transforma una banda —propensa
a dificultades de interpretación o de
reproducibilidad— en un marcador muy
confiable
Referencia
Paran, I. y R.W. Michelmore. 1993. Development of reliable PCR based markers linked
to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85:985-993.
Pasos para la obtención de polimorfismos
de SCAR
Se identifica, en un gel de RAPD, una banda

que despierta un interés potencial
La banda se corta y se retira del gel
El fragmento de ADN se clona en un vector y se
obtiene su secuencia
Se diseñan cebadores específicos (16 a
24 pb de longitud) para ese fragmento de ADN
La reamplificación del ADN patrón con los
nuevos cebadores presentará un patrón de
PCR nuevo y más sencillo

Diagrama del procedimiento para obtener
los SCAR
1 2 3
Gel de
RAPD
Banda polimórfica Clonar la banda polimórfica

en un vector
Secuenciar el fragmento y
diseñar nuevos cebadores
para amplificar únicamente
la banda de interés
Después de la amplificación con
los nuevos cebadores, el resultado 1 2 3
es un patrón de bandas más fácil de
interpretar
Banda polimórfica
Ventajas:
• Patrones más sencillos que los RAPD
• Ensayo sólido gracias al uso de cebadores largos
específicos
• Herencia mendeliana. A veces convertibles a
marcadores codominantes
Desventajas:
• Requieren un conocimiento mínimo de las
secuencias
• Requieren esfuerzo y gastos para diseñar
cebadores específicos de cada locus
Dado que los cebadores empleados son más largos que los que se usan en los RAPD,
los SCAR se caracterizan por ser más reproducible que los RAPD, de los cuales se
derivan. Los SCAR son generalmente co-dominantes, excepto si uno o ambos
cebadores se superponen en el sitio de variación de la secuencia.
Secuencia de restricción amplificada y
polimórfica (CAPS)
Este método se basa en el diseño de cebadores

específicos, en la amplificación de fragmentos
de ADN, y en la generación de fragmentos más
pequeños, posiblemente variables, mediante un
enzima de restricción
El objetivo de esta técnica es convertir una

banda amplificada, que no muestra variación,
en una banda polimórfica
Los marcadores de secuencia de restricción amplificada y polimórfica (CAPS) son como

los SCAR, pero con una paso adicional (una digestión de restricción) para favorecer la
identificación de polimorfismos que quizás no hubieran podido identificarse entre el total
de productos de la PCR. Tanto los SCAR como los CAPS se basan en la presencia de
cambios en los nucleótidos o de inserciones o deleciones, los cuales causan diferencias
entre las secuencias experimentales. Un inconveniente de ambas tecnologías es que
detectan polimorfismo sólo en un intervalo pequeño del genoma, o sea, en la zona entre
los cebadores que se caracteriza por ser menor que 5 kb.
Referencia
Konieczny, A. y F.M. Ausubel. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations
using codominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J. 4(2):403-410.
Pasos que requiere la generación de CAPS
Se reconoce la importancia de una banda, de un
fragmento de ADN, de una secuencia génica o de otro
tipo de marcador
O bien la banda se detecta a través de la PCR (y se corta
del gel y el fragmento se clona y es secuenciado) o la
secuencia del fragmento está ya disponible
Se diseñan cebadores específicos partiendo de la
secuencia del fragmento
Los cebadores recién diseñados se usan para amplificar
el ADN patrón
El producto de la PCR se somete a digestión con varios
enzimas de restricción
Se identifica el polimorfismo empleando alguno de los
enzimas
Una vez identificado un polimorfismo con un enzima de restricción específico, los

cebadores pueden rediseñarse sobre la base de los fragmentos recién generados, para
optimizar la detección y la visualización del polimorfismo.
En cuanto sea posible, los cebadores deben elegirse de modo que exista la
probabilidad de que los productos de la PCR incluyan intrones. Así aumentarán las
oportunidades de obtener polimorfismos.
Generación de CAPS
A/A B/B A/B
R R R R R R R R
PCR + digestión con el enzima R + electroforesis
De: Konieczny, A. y F.M. Ausubel. 1993. Plant J. 4(2):403-410.

En este ejemplo, se generaron CAPS para dos ecotipos de Arabidopsis.
En la parte superior del diagrama se muestran los tres genotipos posibles para el
experimento: los dos ecotipos homocigóticos (A/A y B/B) y el ecotipo heterocigótico
(A/B).
Si se llevara a cabo una PCR estándar de los ADN originales con los cebadores
dibujados (flechas azules), no se obtendría ningún polimorfismo entre los tres
genotipos.
Se encontró un enzima de restricción que digería los fragmentos A dos veces y el

fragmento B tres veces. En consecuencia, el heterocigoto A/B debe producir una copia
del fragmento digerido dos veces y otra del fragmento digerido tres veces.
Se realizó entonces una PCR y los productos se digirieron con el enzima de restricción
específico ya mencionado. La visualización en gel de agarosa mostró tres fragmentos
para el genotipo A/A, cuatro fragmentos para el genotipo B/B y siete fragmentos para el
heterocigoto A/B. El diagrama muestra sólo 5 fragmentos para A/B, porque dos de los
siete fragmentos (señalados por asteriscos) migran a distancias similares a las de otros
fragmentos.
Ventajas:
• Ensayo sólido, porque se usan cebadores
específicos largos
• Marcadores co-dominantes
• Favorecido por marcadores que pueden estar ya
localizados en un mapa genético
• Identifican polimorfismos en marcadores que
anteriormente no eran informativos
Desventajas:
• Requieren, al menos, un mínimo nivel de
conocimiento de las secuencias
• El diseño de cebadores específicos para cada
locus requiere trabajo adicional y más gastos
Secuencia entre repeticiones simples (ISSR)
Son las regiones situadas entre microsatélites
La técnica se basa en la amplificación,

mediante la PCR, de las secuencias ubicadas
entre microsatélites
Gracias a la conocida abundancia de

secuencias repetitivas esparcidas por todo el
genoma, identifica múltiples loci
Referencia
Zietkiewicz, E., A. Rafalski y D. Labuda. 1994. Genome fingerprinting by simple
sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification.
Genomics 20:176-183.
Identificación de polimorfismos ISSR
Se ejecuta una PCR típica en la cual los cebadores

han sido diseñados partiendo de una secuencia
repetitiva de microsatélite y se han extendido, en
una o varias bases, en la secuencia adyacente a
modo de puntos de anclaje. Puede haber varias
opciones:
Se emplea sólo un cebador
Se emplean dos cebadores de características
similares
Se combinan un cebador de secuencia de
microsatélite anclado y un cebador aleatorio
(como los usados para RAPD)
Diseño de cebadores para polimorfismos
ISSR
NNNN(CA)n
(CA)nNN
ADN genómico Repetición CA
NNNNNNNNNNNN CACACACACACACACA NNNNNNNNNNNNNN TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNN
A
TGTGTGTGTGTGTGTG CACACACACACACACACACACACACAC
NNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNN NNNNNN
Repetición CA
(CA)nNN
NN(CA)n
Producto de la PCR
cebador anclado en 3’
Producto de la PCR
cebador anclado en 5’
De: Zietkiewicz, E., A. Rafalski y D. Labuda. 1994. Genomics 20:176–183

El diagrama anterior presenta tres puntos diferentes:
• La secuencia del ADN original, en la cual se identifican dos secuencias repetidas

diferentes (CA), orientadas en sentido inverso. Entre las dos secciones repetidas
hay, además, un espacio bastante corto.
• Si los cebadores se diseñaran solamente del interior de la región repetida, se

amplificaría la sección entre las repeticiones pero podría no estar garantizada la
especificidad del locus. En la segunda hilera (ver diagrama), aparece un producto
de la PCR como resultado de la amplificación de un cebador anclado en
3’ (CA)nNN en cada extremo de la región entre las repeticiones. CA es la
secuencia que se alargó en NN, dos nucleótidos que entran dentro de la región
situada entre las repeticiones.
• Alternativamente, las anclas pueden elegirse de la región 5’. El producto de la

PCR de la tercera hilera resulta de emplear cebadores basados en la repetición
CA pero prolongados en el extremo 5’ por NNN y NN, respectivamente.
Ventajas:
• No requieren información previa sobre secuencias
• Se puede encontrar variación dentro de regiones
únicas del genoma en varios loci simultáneamente
• Tienden a identificar niveles significativos de variación
• Específicos de secuencias de microsatélites
• Muy útiles para realizar perfiles de ADN,
especialmente de especies estrechamente
relacionadas
Desventajas:
• Marcadores dominantes
• Puede ser necesaria la electroforesis en gel de
poliacrilamida y la detección con tinción de plata o con
radioisótopos
En resumen
El uso de los STS como marcadores se apoya en
algún conocimiento sobre secuencias. Son co-
dominantes y altamente reproducibles
Los SSR son el tipo de STS más ampliamente
usado. Otros son SCAR, CAPS e ISSR
Los SSR son repeticiones cortas en serie,
sumamente variables y distribuidas uniformemente
en el genoma. Estas características hacen de los
SSR los marcadores preferidos para el análisis de
diversidad genética
Los polimorfismos de los SSR son causados por las
diferencias en el número de unidades repetidas

Las características de los STS como

marcadores
Los diferentes tipos de marcadores STS y sus

rasgos contrastantes
Los pasos necesarios para identificar

microsatélites, diseñar los cebadores y detectar
los polimorfismos
Las propiedades de los microsatélites respecto

a los análisis de diversidad genética
Ajay, J., C. Apparanda y P.L. Bhalla. 1999. Evaluation of genetic diversity and genome fingerprinting of Pandorea
(Bignoniaceae) by RAPD and inter-SSR PCR. Genome 42:714-719.
Blair, M.W., O. Panaud y S.R. McCouch. 1999. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of
microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 98:780-792.
Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. p. 85-93
en: Genome mapping in plants (H. Paterson, ed.). R.G. Landes Company, Georgetown, TX, E.U.
Buso, G.S.C., P.H.N. Rangel y M.E. Ferreira. 2001. Analysis of random and specific sequences of nuclear and
cytoplasmatic DNA in diploid and tetraploid American wild rice species (Oryza sp.). Genome 44:476-494.
Hajeer, A., J. Worthington y S. John (eds.). 2000. SNP and microsatellite genotyping: markers for genetic
analysis. Biotechniques: Molecular Laboratory Methods Series. Eaton Publishing, Manchester, U.K.
Joshi, S.P., V.S. Gupta, R.K. Aggarwal, P.K. Ranjekar y D.S. Brar. 2000. Genetic diversity and phylogenetic
relationship as revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza. Theor.
Appl. Genet. 100:1311- 1320.
Kantety, R.V., X.P. Zeng, J.L. Bennetzen y B.E. Zehr. 1995. Assessment of genetic diversity in dent and popcorn
(Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. Mol. Breed. 1:365-373.
Konieczny, A. y F.M. Ausubel. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-
specific PCR-based markers. Plant J. 4(2):403-410.
Lowe, A.J., J.R. Russell, W. Powell y I.K. Dawson. 1998. Identification and characterization of nuclear, cleaved
amplified polymorphic sequence (CAPS) loci in Irvingia gabonensis and I. wombolu, indigenous fruit trees of
west and central Africa. Mol. Ecol. 7(12):1786-1788.
Morgante, M. y A.M. Olivieri. 1993. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. Plant J. 3(1):
175-182.
Paran, I. y R.W. Michelmore. 1993. Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew
resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85:985- 993.
Zietkiewicz, E., A. Rafalski y D. Labuda. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored
polymerase chain reaction amplification. Genomics 20:176-183.
A continuación

Últimas estrategias
Glosario


(Secuenciación de ADN, EST, matrices,
DArT, SNP)
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Últimas estrategias 1

Contenido
Secuenciación de ADN
Marcador de secuencia expresada (EST)
Tecnología de matrices
Tecnología de matrices de diversidad (DArT)
Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)

Secuenciación del ADN
La secuenciación del ADN es la medida

fundamental de la diversidad porque detecta
polimorfismos dentro de los elementos básicos
del ADN
La información puede obtenerse

automáticamente
La secuenciación del ADN es la medida de la diversidad verdaderamente fundamental,

porque todos los marcadores se derivan de polimorfismos en los elementos básicos del
ADN, o sea, en la secuencia nucleotídica de un segmento específico de ADN. La tecnología
de la secuenciación ha mejorado enormemente en los últimos años, y ahora los productos
de la PCR (una región de ADN amplificada en cantidad suficiente) pueden provenir de
cualquier posición genómica de interés y secuenciarse directamente. La recopilación de los
datos puede automatizarse.
Maxam, A.M. y W. Gilbert. 1977. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl Acad. Sci.
U.S.A. 74:560-564.
Sanger, F. 1988. Sequences, sequences and sequences. Annu. Rev. Biochem. 57:1-28.
Sanger, F., S. Nicklen y A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5468.
Secuenciación del ADN: Métodos
Hay dos métodos principales:
Maxam-Gilbert
Sanger (secuenciación dideoxy o terminación

de cadena)
Los dos métodos difieren ligeramente; el método de Sanger (descrito en la diapositiva 6) es

más fácil de automatizar y, por tanto, es mucho más empleado.
Secuenciación del ADN: Procedimientos
El ADN se divide en fragmentos, que luego se sub-
clonan
Cada pedazo corto se usa como una plantilla para
generar un conjunto de fragmentos que difieren entre
sí, en longitud, en una sola base
Los fragmentos se separan mediante electroforesis
Se identifica la base que queda al final de cada
fragmento. Se recrea la secuencia original de las
bases (A, T, C y G) de cada pedazo corto generado
en el primer paso
Las secuencias cortas se ensamblan en una
secuencia larga
Un diagrama del método Sanger
5’ 3’
C A T A G C T G T T T C C T G T G A A A
C T T T Marcaje
Polimerasa + dNTP
C A T A G C T G T T T C C T G T G A A A
+
A G G A C A C T T
T
+
G C A A A G G A C A C T T T
+ ddATP ddTTP ddCTP ddGTP
C A C T T T C
A
T
+ A
G
G T A T C G A C A A A G G A C A T T T C
T
G
T
T
T
C
C
T
G
T
G
A
A
A

Pueden usarse colorantes fluorescentes de diversos colores, lo que permite la separación

de los cuatro fragmentos en un solo carril del gel y aumenta mucho la eficiencia. Los
secuenciadores automáticos pueden analizar los electroferogramas resultantes y producir
un cromatograma de cuatro colores en que aparecen los picos que representan cada una
de las cuatro bases de ADN.
Secuenciación del ADN: Ventajas y
desventajas
Ventajas:
• Resultados altamente reproducibles
• El contenido de información es máximo
Desventajas:
• Costos todavía elevados
• Presenta exigencias técnicas
Los resultados son, desde luego, sumamente reproducibles e informativos. Los costos son
elevados, sin embargo, y se necesita un nivel alto de pericia técnica, dos factores que
alejan esta tecnología de las posibilidades de muchos investigadores. El uso de la PCR
para abordar regiones específicas del ADN y la disponibilidad de máquinas de
secuenciación automatizadas han reducido las dificultades técnicas, aunque el proceso es
todavía costoso, en particular en su etapa de establecimiento.
Estudios evolutivos
Cálculos de la variación genética
Genómica comparativa
Elaboración de ensayos de tipo PCR (diseño de

cebadores para convertir cualquier marcador en
otro marcador basado en la PCR)
Aunque la tecnología de los marcadores está basada, en general, en la variación de la

secuencia del ADN, el investigador no necesita, por fortuna, conocer toda la secuencia del
ADN para poder usar los marcadores moleculares. Desde luego, el análisis de la secuencia
del ADN tiene muchas aplicaciones útiles, pero tiene un gran inconveniente, en particular
para la medición de la diversidad: el hecho de que genes diferentes evolucionan en grado
diferente. Por consiguiente, la extrapolación de información obtenida de genes específicos
al nivel de la especie debe hacerse con cuidado (Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996.
Molecular characterization for plant genetic resources conservation. p. 85-93, en: Genome
mapping in plants (H. Paterson, ed.). R.G. Landes Company, Georgetown, TX, E.U.)
Marcador de secuencia expresada (EST)
Las etiquetas de secuencia expresada son

pedazos pequeños de secuencia del ADN que
tienen, generalmente, de 200 a 500 nucleótidos
de largo
Se generan al secuenciar bien sea uno o ambos

extremos de un gen expresado proveniente de
una genoteca de ADNc
Esta estrategia es una forma sumamente eficaz

de encontrar genes nuevos
El número de secuencias de EST de plantas disponibles para el público ha aumentado

extraordinariamente en los últimos años llegando a más de 1,000,000 en el momento de
escribir este documento (Informe de Progreso de la Iniciativa Nacional del Genoma Vegetal,
diciembre 2001). Una lista de bases de datos de los EST de muchas plantas se puede
encontrar en la dirección electrónica http:/www.ostp.gov/NSTC/html/mpgi2001/building.htm
Referencia básica
National Center for Biotechnology Information (NCBI). 2001. ESTs: gene discovery made
easier. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/est.html
Diseño de cebadores de EST
ARNm
A C U G Transcriptasa inversa
ARN
A C U G
T G A C
ADNc
Degradación del ARN por ribonucleasas
Síntesis de la segunda cadena del ADN
A C T G
ADN de doble cadena
T G A C
Cebador Cebador
5’ EST 3’ EST
http:/www.ostp.gov/NSTC/html/mpgi2001/building.htm
Los EST: Ventajas y desventajas
Ventajas:
• Muy buenos como marcadores genéticos
• Codominantes
• Las secuencias se pueden generar rápidamente
• Fuente eficiente de secuencias para obtener
cebadores para SSR
Desventajas:
• El aislamiento del ARNm puede ser complicado
• Los intrones, que pueden contener información
importante, no son parte del ADNc

Los EST: Ejemplos de aplicaciones
Las aplicaciones de los EST se basan en el hecho
de que se originan a partir de segmentos de
secuencias génicas:
Comparación de la diversidad génica en
diferentes organismos
Estudios de evolución génica
Búsqueda de supuestos ortólogos en bases de
datos
Sondas para estudios de expresión génica
Detección de SNP*
* Ver la sección que empieza en la diapositiva 25.

Tecnología de matrices o “arreglos”
Las matrices son ordenamientos de pequeños
fragmentos de ADN fijados a portaobjetos de vidrio
o membranas de nylon
Esta tecnología permite hacer el seguimiento
simultáneo del genoma entero
El principio fundamental de las matrices
es el apareamiento de las bases o la
hibridación de sondas cortas con secuencias
complementarias de ADN
Las matrices se construyen con ADNc (matrices de
ADNc), con secuencias genómicas o con
oligonucleótidos sintetizados in silico (“arreglos de
ADN”)
Mediante la tecnología de matrices (también llamada 'tecnología de chip'), los genomas

pueden analizarse a escala del genoma entero. Esta tecnología se basa en la hibridación
entre sondas cortas de oligonucleótidos y secuencias complementarias de ADN. Decenas
de miles de muestras se pueden inmovilizar en una lámina pequeña de vidrio (que es lo
más corriente) o en una membrana de nylon donde pueden hibridarse con diferentes
sondas o trozos de ADN de interés (la terminología es equívoca y permite que al ADN
inmovilizado en el “arreglo” se le llame también sonda o ADN de interés). Se puede hibridar
más de una sonda a la vez, por ejemplo, para comparar diferencias en la expresión,
marcando las sondas con tintes fluorescentes de diverso color.
Hay programas informáticos especiales que captan datos automáticamente. Las matrices
pueden aplicarse al diagnóstico, al estudio de la expresión de genes y al desarrollo o
análisis de mapas genéticos, entre otros objetivos. Sin embargo, la tecnología es todavía
relativamente costosa, en particular en su etapa inicial, y la cantidad de datos generados
puede ser imponente.
Alscher, R. 2001. Grid it: resources for microarray research.
http://www.bsi.vt.edu/ralscher/gridit/
Brown, V.O. y D. Botstein. 1999. Exploring the new world of the genome with DNA
microarrays. Nature Genet. 21(supp): 33-37.
Richmond, T. y S. Somerville. 2000. Chasing the dream: plant EST microarrays. Current
Opinion Plant Biol. 3(2):108-116.
Una matriz hibridada
http://bti.cornell.edu/CGEP/CGEP.html
La imagen es cortesía de Mark D’Ascenzo, Boyce Thompson Institute for Plant Research,
Center for Gene Expression Profiling, Cornell University.
Matrices: Ventajas y desventajas
Ventajas:
• Tecnología de alto rendimiento
• Exploración del genoma entero
• Permite el descubrimiento de la relación genotipo-
fenotipo
Desventajas:
• Debe estar disponible la información sobre la
secuencia de los genes
• Costosa
• Tiene requisitos técnicos considerables
• La cantidad y el tipo de los datos producidos
requiere de un alto nivel de pericia en computación
y de un equipo avanzado
Matrices: Ejemplos de aplicaciones
Identificación de secuencias (génicas o de
mutación génica)
Determinación del nivel de expresión de los
genes
• Ensayo de la abundancia de secuencias específicas
en el ADN genómico
• Análisis de la expresión de gran número de genes
(matrices de ADNc)
• Identificación de gran número de marcadores
específicos de ADN (por ejemplo, polimorfismo de
un solo nucleótido o SNP) mediante hibridación
molecular (matrices de oligonucleótidos sintéticos)

Tecnología de matrices de diversidad (DArT)
Comprende dos pasos:
Generación de la matriz
Genotipificación de la muestra
Las matrices de diversidad, también llamadas DArT, fueron concebidas por CAMBIA (ver
Glosario). Esta tecnología implica un nuevo uso de las matrices que no requiere un
conocimiento previo de las secuencias; por tanto, puede convertirse en una herramienta
muy útil para los investigadores.
Las siguientes diapositivas de DArT se han tomado, con autorización previa de CAMBIA, del
sitio web de dicho Centro: http://www.cambia.org.au/
CAMBIA. 2000. Enabling innovation. http://www.cambia.org/
Jaccoud, D., K. Peng, D. Feinstein y A. Kilian. 2001. Diversity arrays: a solid-state

technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research 29
(4):E25.
DArT: Preparación de la matriz (1)
Se clonan los fragmentos generados por
restricción, que representan la diversidad de un
acervo genético. Al resultado se le llama una
'representación' (de 0.1% a 10% del genoma,
comúnmente)
Se identifican los clones polimórficos de la
genoteca obteniendo primero la matriz de
fragmentos tomados de un conjunto aleatorio de
clones e hibridando luego la matriz con
diferentes muestras
Los fragmentos de los clones polimórficos se
inmovilizan en una matriz
DArT: Preparación de la matriz (2)
Gx Gy Gn ADN de interés
Utilizar método de reducción de

complejidad, por ejemplo, digestión
Mezcla de genomas con enzimas de restricción, ligamiento
de adaptadores, amplificación por PCR
Seleccionar clones
Clonar fragmentos individuales y
de la representación Genoteca amplificar por PCR
Productos de la PCR
purificados y ordenados

DArT: Obtención del genotipo de una
muestra (1)
Marcar la representación (ADN) de la muestra

con fluorescencia e hibridarla con la matriz
Examinar la matriz y medir, para cada fragmento

de la matriz, la cantidad de señal de hibridación
Empleando marcas múltiples, contrastar la

representación de una muestra con la
representación obtenida de otra o con una
sonda testigo

DArT: Obtención del genotipo de una
muestra (2)
Gx Gy
Seleccionar 2 genomas para el análisis
Utilizar el mismo método de

reducción de la complejidad que usó
para hacer el panel de diversidad
Cortar, ligar
adaptadores
y amplificar
vía PCR Marcar cada subgrupo
genómico: color rojo…
Marcar cada subgrupo

genómico: color verde…
Hibridar con la matriz

Una matriz DArT hibridada

DArT: Ventajas y desventajas
Ventajas:
• No requiere información sobre las secuencias
• Alto rendimiento
• Adquisición rápida de datos y análisis rápido
• Detecta cambios de una sola base así como inserciones o
deleciones
• Detecta diferencias en la metilación del ADN, según el enzima
usado para generar los fragmentos
• Genera clones listos para secuenciar
• Requiere muestras pequeñas de ADN
• Buena transferencia de marcadores entre poblaciones de
mejoramiento
• Puede automatizarse totalmente
Desventajas:
• Los marcadores son dominantes
• Tiene requisitos técnicos considerables
DArT: Ejemplos de aplicaciones
Caracterización rápida del germoplasma
Construcción de mapas genéticos
Mejoramiento asistido por marcadores

Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)
Sustituciones de una sola base entre

secuencias homólogas
Los SNP se dan con mayor frecuencia que

cualquier otro tipo de polimorfismo
Pueden identificarse mediante matrices y el

equipo DHPLC
Un tipo muy reciente de marcador, que está disponible gracias a las nuevas tecnologías de
secuenciación, son los polimorfismos de un solo nucleótido (los SNP). Estos polimorfismos
son sustituciones de una sola base entre secuencias. Los SNP ocurren con mayor
frecuencia que cualquier otro tipo de marcador y están o muy cerca del gen que interesa o
incluso dentro de él.
Los SNP pueden ser identificados o empleando una matriz o con una máquina de DHPLC.
Referencia
Patil, N., A.J. Berno, D.A. Hinds, W.A. Barret, J.M. Doshi, C.R. Hacker, y otros. 2001.
Blocks of limited haplotype diversity revealed by high-resolution scanning of human
chromosome 21. Science 294:1719-1723.
Equipo DHPLC
DHPLC se refiere a la cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento, y se usa

para visualizar los SNP.
Interpretación de los SNP (1)
http://bldg6.arsusda.gov/pberkum/Public/sarl/cregan/snps.htm
Este dibujo esquemático del polimorfismo de un solo nucleótido muestra dos fragmentos de
ADN (uno en la parte superior y otro en la inferior) que comparten la misma secuencia en
30 pares de bases y difieren sólo en un par: la posición 28 de los fragmentos. En esa
posición, un A-T (parte superior) ha cambiado a un C-G (parte inferior).
Interpretación de los SNP (2)
SNP #1
SNP #2
De: Patil y col., 2001. Science 294:1719-1723
La altura del bloque representa un tramo de ADN en un cromosoma. Cada columna de

cuadritos representa la misma sección de ADN en un individuo diferente por genotipo.
Cada hilera de cuadritos amarillos o azules representa un solo SNP. Los cuadritos azules
de cada hilera representan el alelo principal de ese SNP, y los cuadritos amarillos
representan el alelo secundario. La ausencia de un cuadrito en cualquier posición de una
hilera indica que faltan datos.
En este bloque, se pueden identificar 26 SNP comunes. Pueden organizarse en siete

patrones diferentes de haplotipos (número de genotipos: 5, 4, 4, 3, 2, 1 y 1). Entre los
cuatro patrones más comunes están 16 de los 20 cromosomas muestreados. Los círculos
azules y amarillos indican los patrones alélicos de dos SNP (encerrados por líneas rectas),
que distinguen sin ambigüedad los cuatro haplotipos comunes del bloque.
En resumen
Continuamente se desarrollan estrategias para
mejorar la detección de polimorfismos
La obtención de secuencias de ADN permite detectar
la variación incluso a nivel de los nucleótidos
Los EST son herramientas poderosas para detectar
la diversidad dentro de regiones codificantes
Las matrices y las DArT hacen posible el análisis
simultáneo de muchos loci
Los SNP son sustituciones de una sola base entre
secuencias, y representan la variante más frecuente
del ADN

Los diferentes tipos de variación del ADN que

pueden detectarse por secuenciación, los EST
y los SNP
El principio fundamental de las matrices y de

las DArT
Las ventajas y las desventajas de las más

modernas tecnologías con que se analiza la

Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6a edn.). W.H.
Freeman y Co., NY.
Hajeer, A., J. Worthington y S. John (eds.). 2000. SNP and

microsatellite genotyping: markers for genetic analysis.
Biotechniques: Molecular Laboratory Methods Series. Eaton
Publishing, Manchester, U.K.
USDA-ARS. 1999. The Cregan lab.

http://bldg6.arsusda.gov/pberkum/Public/sarl/cregan/snps.htm
Wang, D.G., J.B. Fan, C.J. Siao, A. Berno, P. Young, R. Sapolsky,

y otros. 1998. Large-scale identification, mapping, and
genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human
genome. Science 280(5366):1077-1082.
A continuación
Glosario

Agradecimientos
La producción del módulo títulado Tecnologías de Marcadores Moleculares para
Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de Aprendizaje es el resultado de
un esfuerzo de colaboración entre el Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos
(IPGRI) y el Instituto para la Diversidad Genómica (IGD) de la Universidad de Cornell.
Las autoras agradecen especialmente la contribución recibida de las siguientes
personas o instituciones:
La Oficina Regional del IPGRI para Asia, el Pacífico y Oceanía, que desde su
Proyecto de Árboles Frutales Tropicales apoyado, a su vez, por el Banco Asiático de
Desarrollo (ADB), financió en parte la preparación del material de este módulo.
Félix Alberto Guzmán (Oficina Regional de IPGRI-Américas), por su ayuda en la

recopilación de la información para los submódulos, especialmente por elegir buenos
ejemplos de la aplicación de las tecnologías a estudios reales de diversidad genética, y
también por sus sugerencias para hacer que los módulos fueran claros y
comprensibles.
Brian V. Ford-Lloyd (Universidad de Birmingham, Reino Unido), quien escribió el

módulo de capacitación producido inicialmente por el IPGRI en 1996 (Measuring
genetic variation using molecular markers), que sirvió de base en la preparación del
módulo actual, extendido y actualizado. En realidad, conservamos el texto anterior en
aquellos sitios en que resultó ser el más apropiado.
Pere Arús (Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries, IRTA, España), por

ayudar a hacer las diapositivas en que se interpretan los isoenzimas, y por prestarnos
la serie de imágenes sobre los procedimientos de laboratorio empleados para detectar
isoenzimas. Estas imágenes fueron incluidas en el submódulo correspondiente.
Andrzej Kilian (Centre for the Application of Molecular Biology to International

Agriculture, CAMBIA, Australia), por permitirnos usar las ilustraciones esquemáticas de
la tecnología DArT que aparecen en la página web de CAMBIA.
Steve Tanksley (Cornell University, NY), quien nos prestó diapositivas de su colección
didáctica sobre microsatélites para incluirlas en este módulo; también Rebecca Nelson,
de Cornell University, por compartir información acerca de la simplificación de los
protocolos de AFLP.
Humberto Gómez Paniagua (Centro Internacional de Agricultura Tropical, CIAT,

Colombia, y International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics, ICRISAT-
Colombia), quien facilitó imágenes de perfiles de RAPD para usarlas como ejemplos
de resultados buenos o malos obtenidos con esta tecnología, y nos dio muchas ideas
sobre la forma de mejorar la presentación didáctica de este módulo.
Helmer Ayala (Universidad de San Carlos, Guatemala), por la imagen que sirvió de
ejemplo de detección de AFLP con tinción de plata; Xiaoming Pang (Universidad de
Guizhou, China), por facilitar una imagen de un microsatélite detectado con tinción de
plata; y Kamel Chabane (International Center for Agricultural Research in Dry Areas,
ICARDA, Siria) y Martin Fregene (CIAT, Colombia), quienes proporcionaron imágenes
de diferentes marcadores moleculares, para fondo de las diapositivas de varios
submódulos.
El personal de la Unidad de Recursos Genéticos del CIAT (Colombia), por permitirnos
tomar fotos de los procedimientos de detección de isoenzimas en su laboratorio.
Heiber Cárdenas (Profesor del Departamento de Biología, Universidad del Valle,

Cali, Colombia), quien ensayó el módulo de capacitación con cinco de sus estudiantes
(Iván Andrés González, Olga Lucía Agudelo H., Martha Nora Moyano, Fernando
Rondón G. y Diego Mauricio Villamarín M.) e hizo comentarios valiosos para el
mejoramiento del módulo.
Luigi Guarino, Ramanatha Rao, Issiaka Zoungrana, Margarita Baena, Toby Hodgkin,
Jan Engels, Paul Neate y Elisabeth Goldberg (de diferentes oficinas del IPGRI), por
sus comentarios y sugerencias sobre la forma de mejorar este producto y hacerlo más
útil a nuestros socios.
José Ignacio Cubero Salmerón (Universidad de Córdoba, España), por su ayuda para
lograr una traducción adecuada de los nombres de las tecnologías de marcadores del
inglés al español.
W. H. Freeman y los Editores de Company/Worth (Nueva York), quienes dieron

autorización para reproducir las versiones modificadas de las figuras 4-3, 11-12,
12-3(a), 12-6, 12-7(c), 12-7(d), 14-20, 14-24, 14-29 y 17-10(a) del libro que publicaron
en 1996 bajo el título Introducción al Análisis Genético (escrito por Griffiths et al.).
Francisco Motta, por su ayuda en la edición de estilo del manuscrito en español.
Elizabeth L. McAdam, por su ayuda en la revisión del manuscrito en inglés y por sus
útiles sugerencias para mejorar el formato de este producto.
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Tecnologías complementarias 1

Contenido
Introducción
Electroforesis en geles de gradiente
desnaturalizante (DGGE)
Electroforesis en geles de gradiente de
temperatura (TGGE)
Polimorfismo de conformación de cadena única
(SSCP)
Análisis de heteroduplex
Cromatografía líquida desnaturalizante de alto
rendimiento (DHPLC)

Introducción
Hay varias tecnologías que sirven para señalar

la presencia de diferencias en las secuencias
Ayudan a reducir la posibilidad de que sea
necesario secuenciar algo (¿hay algún
polimorfismo que merezca secuenciarse?)
No indican, sin embargo, en qué consisten las
diferencias que hay en las secuencias
Cuando se buscan diferencias en la secuencia del ADN, es necesario que podamos separar
segmentos específicos de ADN de una mezcla (p.e. del genoma entero).
La electroforesis separa las moléculas sometidas a un campo eléctrico basándose en su

carga, su tamaño y su forma. Si una molécula de ADN se corta en secciones pequeñas y se
coloca en un pocillo en el extremo (cátodo) de un gel de agarosa, los fragmentos de ADN se
moverán a través del gel hacia el ánodo. La velocidad del movimiento dependerá de los
tamaños individuales, de manera que aparecerán bandas en el gel en diferentes posiciones.
Las bandas pueden visualizarse luego con tinción de bromuro de etidio, un compuesto que le
da fluorescencia al ADN bajo la luz ultravioleta.
El mismo resultado se logra con la electroforesis en gel de acrilamida, siendo la única

diferencia el grado de resolución. La acrilamida permite discriminar diferencias más
pequeñas en el tamaño de los fragmentos que la agarosa.
La electroforesis es un procedimiento de diagnóstico que permite identificar moléculas de

diferentes tamaños. Cuando se emplea como tal, la electroforesis es un medio para mostrar
polimorfismos y, en consecuencia, la variación genética que hay entre genotipos.
La electroforesis, no obstante, puede ser también útil como un primer paso hacia la
identificación y el aislamiento de moléculas específicas de ADN que, aunque del mismo
tamaño, difieren en la composición de sus secuencias.
desnaturalizante (DGGE) (1)
Hace posible la detección de polimorfismos o de

mutaciones muy pequeñas del ADN
También se puede aplicar a fragmentos de ADN
grandes, que midan cientos de pares de bases
No requiere un conocimiento previo de la
existencia de algún polimorfismo
Se basa en las propiedades de renaturalización
de las cadenas de ADN
La desnaturalización del ADN tiene lugar
durante la electroforesis
Referencia básica
Myers, R.M., N. Lumelsky, L.S. Lerman y T. Maniatis. 1985. Detection of single base
substitutions in total genomic DNA. Nature 313:495-498.
Fragmentos pequeños de ADN se someten a

electroforesis en un gel de poliacrilamida bajo
condiciones de desnaturalización progresiva
(con concentraciones de formamida/urea)
El ADN se ‘deshace’ y se convierte en ADN de
cadena simple
Las moléculas del ADN cambian de forma y se
detienen
Se identifican entonces las diferencias en la
secuencia del ADN
Primero, los fragmentos de ADN migran como moléculas de cadena doble. Más adelante, y a
causa de la composición cambiante del gel, las moléculas se desnaturalizan, y se convierten
en cadenas simples formando una estructura ramificada. Esta estructura, así modificada,
reduce la capacidad de las moléculas para moverse a través del gel.
El punto en que el ADN se ‘deshace’ depende de la secuencia de los nucleótidos en la región

afectada. Por consiguiente, la ubicación final de las moléculas en el gel depende de la
secuencia nucleotídica de los fragmentos.
La DGGE puede ser un proceso de dos etapas:

Las muestras se hacen migrar para separar los
fragmentos según su tamaño
Los fragmentos se separan en las condiciones
de la DGGE según el proceso de ‘punto de
fusión’
Cuando las muestras se mezclan, las bandas
dobles indican diferencias de secuencia entre las
bandas del mismo tamaño
Se calcula que, con este procedimiento, se pueden detectar al menos 95% de las diferencias
en la composición de las secuencias.
La DGGE sirve también para distinguir los genotipos homocigotos de los heterocigotos
respecto a un fragmento determinado de ADN. Para aprovechar esta capacidad, después del
último ciclo de la PCR debe hacerse un ciclo de desnaturalización y otro de 'renaturalización'.
A medida que los alelos se reasocian, se forman homoduplex y heteroduplex. En un gel de
DGGE, las combinaciones homoduplex que migran rápidamente indicarán genotipos
homocigóticos. Los genotipos heterocigóticos presentarán combinaciones tanto de
homoduplex como de heteroduplex. Los heteroduplex se forman a causa del emparejamiento
erróneo y de la desnaturalización rápida en el gel, los cuales detienen el curso migratorio de
estas moléculas.
Electroforesis en geles de gradiente de
temperatura (TGGE)
Es similar a la DGGE
Las condiciones de desnaturalización progresiva

se logran con un gradiente de temperatura, no
por cambios en la concentración de los reactivos
Puede emplearse también para analizar ARN de

cadena simple y proteínas
Referencia básica
Myers, R.M., N. Lumelsky, L.S. Lerman y T. Maniatis. 1985. Detection of single base
substitutions in total genomic DNA. Nature 313:495-498.
Polimorfismo de conformación de cadena
única (SSCP) (1)
La técnica de SSCP se basa en el
comportamiento electroforético de una molécula
de ADN de cadena simple a través de un gel de
acrilamida no desnaturalizante
• Una molécula de cadena simple tiene la propiedad
de formar estructuras secundarias gracias a
apareamientos internos de sus bases
• Estas estructuras secundarias dependen de la
secuencia y dan lugar a formas particulares en cada
molécula de cadena simple
Las diferencias de estructura secundaria hacen
que las cadenas de ADN migren de modo
diferente en el gel
La técnica de SSCP puede distinguir entre dos secuencias de ADN muy similares, sólo
basada en la forma específica de sus estructuras de cadena simple. Por consiguiente, pueden
discriminarse, en principio, hasta dos alelos del mismo gen.
Referencia básica
Hayashi, K. 1992. A method for the detection of mutations. Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79.
SSCP (2)
La secuencia objeto de estudio se somete a la PCR
Enseguida, el producto de la PCR se desnaturaliza
a 94°C y se enfría rápidamente en hielo. Las
moléculas de cadena simple no se emparejan pero
forman estructuras secundarias estables
Los fragmentos reasociados se someten luego a
electroforesis:
• En el caso de un homocigoto, se observarán dos
bandas, cada una de las cuales corresponde a una
estructura secundaria ligeramente diferente
• En el caso de un heterocigoto, podrán observarse
cuatro bandas, por lo menos
SSCP es una técnica sencilla, sin embargo tiene dos desventajas principales, por lo menos:
• El comportamiento electroforético de las moléculas de cadena simple es impredecible,

porque depende mucho de la temperatura y de las condiciones en que ocurre la
migración.
• Si se trata de fragmentos largos de ADN (> 200 pb), el método se vuelve insensible a
algunas mutaciones. En principio, el SSCP funciona mejor, al parecer, para analizar
inserciones o deleciones pequeñas.
Análisis de heteroduplex
Dos productos amplificados mediante la PCR se

mezclan en cantidades iguales, se
desnaturalizan a 95°C y se dejan enfriar
Durante el enfriamiento, las cadenas de ADN se
reasocian para formar ADN heteroduplex
Cualquier acoplamiento erróneo en el
heteroduplex dará lugar a una estructura
tridimensional diferente, cuya movilidad se
reducirá proporcionalmente al grado de
divergencia de las secuencias
Referencia básica
Delwart, E.L., E.G. Shpaer, J. Louwagie, F. McCutchan, M. Grez, H. Rübsamen Waigmann
y J.I. Mullins. 1993. Genetic relationships determined by a heteroduplex mobility assay:
analysis of HIV env genes. Science 262:1257-1261.
Cromatografía líquida desnaturalizante de
alto rendimiento (DHPLC): Metodología
Este método puede detectar diferencias de

secuencia en un solo par de bases, así como
inserciones y deleciones
Funciona con los productos directos de la PCR
y no requiere la secuenciación previa del ADN
Está basado en la elución diferencial del ADN
homoduplex y el heteroduplex cuando migran a
través de una columna cromatográfica
La DHPLC es un método de cromatografía líquida de alto rendimiento, en el cual se separan

fragmentos de ADN según su tamaño o según la presencia de heteroduplex (cadenas de
ADN reasociadas) durante su tránsito por un gradiente de una columna.
En el ADN amplificado de cadena doble, los nucleótidos que se asocian erróneamente a

causa de mutaciones y polimorfismos se hacen evidentes después de la formación de
heteroduplex. La presencia de estos polimorfismos crea una mezcla de heteroduplex y
homoduplex durante la reasociación del ADN salvaje y del mutante. Si esta mezcla de
fragmentos se hace migrar, mediante HPLC en condiciones parcialmente desnaturalizantes,
los heteroduplex fluyen de la columna antes que los homoduplex debido a su temperatura de
fusión más baja.
Este análisis puede hacerse para detectar variaciones de secuencia entre individuos o para
determinar heterocigosidad.
Referencia básica
Oefner, P.J. y P.A. Underhill. 1998. DNA mutation detection using denaturing high-
performance liquid chromatography (DHPLC). En: Current Protocols in Human Genetics,
Suplemento 19, [7.10.1]-[7.10.12]. Wiley & Sons, NY, E.U.
DHPLC: Aplicaciones
Descubrimiento de nuevas mutaciones y

polimorfismos en cualquier fragmento de ADN o
en cualquier secuencia específica de un gen
Evaluación de clones para identificar
fragmentos candidatos para secuenciación
Evaluación de la fidelidad de fragmentos
amplificados
Diagnóstico de la presencia de mutaciones
conocidas

En resumen
Varias tecnologías sirven para identificar la

presencia de diferencias en las secuencias
Aunque no pueden identificar la variante,

pueden ciertamente ayudar a reducir el intervalo
de posibles estrategias que se emplearían para
detectarla

Los principios básicos de:

La electroforesis en geles de gradiente
desnaturalizante (DGGE)
La electroforesis en geles de gradiente de
temperatura (TGGE)
El polimorfismo de conformación de cadena
única (SSCP)
El análisis de heteroduplex
La cromatografía líquida desnaturalizante de alto
rendimiento (DHPLC)

A continuación
Glosario

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Consideraciones finales 1

Contenido
Al elegir una técnica...
Aplicaciones prácticas

Al elegir una técnica...
Haga primero la pregunta biológica:
¿Cuál es el problema?
¿Cuántos loci o alelos (o ambos) se requieren?
¿A qué nivel se busca discriminar?
¿Es importante la modalidad de herencia del

marcador?
¿Cuál es el problema que se presenta?

Esta es la pregunta más importante. El primer paso es conocer exactamente la pregunta
biológica a la que se quiere responder con la investigación. Este conocimiento es esencial
para elegir la técnica correcta. Por ejemplo, para obtener información sobre historia de
poblaciones o sobre relaciones filogenéticas, deben usarse datos de secuencias o de sitios
de restricción.
Número de loci o de alelos (o de ambos) que se requiera

¿Será suficiente la información derivada de unos pocos loci o se requerirá un examen más
amplio del genoma? Los isoenzimas son limitados. Los AFLP detectan un alto número de
loci. Cuando se requiere alta variabilidad, las mejores técnicas son las que se basan en
loci específicos (por ejemplo, SSR).
Nivel de discriminación
Hay que definir el nivel taxonómico al cual queremos medir la variación genética: ¿Dentro
de poblaciones, entre especies o entre géneros? ¿Es el método escogido el apropiado
para detectar el nivel deseado de variación?
Modalidad de herencia
¿Deberían identificarse tanto los homocigotos como los heterocigotos? ¿Se necesitan
marcadores codominantes (RFLP de copia única, aloenzimas, microsatélites amplificados
por PCR) o bastarán marcadores dominantes (RAPD, AFLP)? Si es suficiente la
información que indique presencia o ausencia, se puede emplear cualquier tecnología de
marcador molecular; pero si se necesita información acerca de los heterocigotos (por
ejemplo, estructura poblacional y estructura de la diversidad, noción del tipo de herencia)
deberían usarse solamente marcadores codominantes como los isoenzimas o los
microsatélites.
Al elegir una técnica... (continuación)
Recursos:
¿Es importante disponer de ADN de buena
calidad?
¿Se dispone de la experiencia adecuada?
¿Se cuenta con un laboratorio bien equipado?
Costos:
• Equipo
• Reactivos
Rapidez
Disponibilidad del ADN
El análisis de RFLP requiere cantidades grandes de ADN. La mayoría de los métodos basados en la
PCR requieren sólo cantidades mínimas de ADN obtenido por métodos sencillos. En muchos casos,
la PCR se lleva a cabo sólo para amplificar la cantidad original del ADN objeto de estudio.
Experiencia requerida
Las tecnologías que contemplan la hibridación o la secuenciación manual tienen más requisitos
técnicos que las otras. Los RAPD o los SSR (estando ya disponibles los cebadores) son los que
presentan menos exigencias.
Disponibilidad de instalaciones y de equipo de laboratorio
Una vez aclaradas las preguntas biológicas, los criterios técnicos y de organización adquieren
importancia a la hora de seleccionar una tecnología. Consideremos, por ejemplo, los siguientes: (1)
tener acceso a un laboratorio que tenga el equipo adecuado; (2) tener presupuesto para adquirir
equipo adicional y reactivos cuando sean necesarios; (3) poseer buenos conocimientos de
habilidades básicas de laboratorio; y (4) tener nociones básicas sobre diseño experimental y su
ejecución.
Costos
Hablando de costos, los isoenzimas son los más baratos; RAPD, RFLP e incluso AFLP son de costo
intermedio; la secuenciación es aún más costosa que los anteriores. Deben considerarse los costos
de todos los tipos de experimentos, porque la falta de reproducibilidad de algunos marcadores
puede ocasionar, al final, costos mayores.
Respecto a las habilidades necesarias, una visita prolongada a otro laboratorio en que se empleen
las técnicas requeridas aporta, a menudo, información excelente para establecer una investigación.
Los contactos personales que puedan ayudar en los primeros pasos de la investigación, son de un
valor inestimable.
Rapidez
¿Con qué rapidez se necesitan los datos y qué tiempo nos rendirá el equipo disponible? Los
métodos basados en la PCR dan, sin duda, resultados rápidos cuando se dispone ya de los
cebadores. Los métodos basados en la hibridación son más lentos. La secuenciación convencional
del ADN es lenta, mientras que la secuenciación automatizada es más rápida.
Al elegir una técnica... (continuación)
Otros asuntos relacionados:
Reproducibilidad
Técnicas con PCR frente a técnicas no basadas

en la PCR
Reproducibilidad
¿Es necesario emplear métodos sólidos? Preguntemos, por ejemplo: ¿se intercambiarán los marcadores?
¿Participa más de un laboratorio en la investigación? En tales casos, los isoenzimas, los RFLP, los SSR y la
secuenciación son sólidos, pero los RAPD no lo son.
Técnicas con PCR frente a técnicas no basadas en la PCR
Las técnicas de marcadores moleculares basadas en la PCR abren numerosas posibilidades y podrían
considerarse entre las primeras a la hora de decidir, en razón de su sencillez. Las técnicas basadas en
hibridación suponen un trabajo más intenso, tienen mayores exigencias técnicas y requieren un equipo
diferente.
• RAPD es una técnica excelente que ayuda a familiarizarse con la PCR. Permite el examen rápido de
los polimorfismos en la mayoría de las especies de interés y se dispone fácilmente de cebadores.
• Otros marcadores basados en la PCR, como los SSR, se pueden aplicar con relativa facilidad, cuando
los cebadores están disponibles. Cada vez más, éste es el caso en muchas especies. Están
mejorando también las estrategias para buscar cebadores apropiados, y hay enfoques de búsqueda
de microsatélites que se apoyan en bases de datos de secuencias, de manera que se puede eludir la
dificultad de tener que elaborar y examinar genotecas en el laboratorio.
• Los AFLP se han convertido en una opción muy popular; sin embargo, los requisitos de una PCR
doble y la electroforesis en geles verticales los hacen más costosos y elevan sus requisitos técnicos.
Los costos de los experimentos de secuenciación han disminuido significativamente. Muchos EST
están ya disponibles para varias especies. Las matrices, basadas ya sea en la caracterización
anónima del genoma o en la expresión génica, se están convirtiendo en técnicas comunes. La
tecnología de matrices plantea todavía muchas exigencias, tanto técnicas como relativas al equipo.
Antes de decidirse por ella, es importante familiarizarse con las técnicas, sus requisitos y los
resultados que entrega. Una mejor opción sería considerar la contratación del servicio de análisis
de muestras y concentrarse en la interpretación de los resultados y en la toma de decisiones. Los
SNP se usan habitualmente en los estudios realizados con seres humanos. Son todavía
demasiado costosos para aplicarlos a los estudios corrientes de diversidad genética de plantas. Se
orientan, no obstante, al último nivel de variación de la secuencia del ADN, es decir, a los
nucleótidos, y tienen muchas probabilidades de ser la mejor opción como marcador molecular en el
futuro, cuando hayan disminuido los costos de su descubrimiento y de su aplicación.
Aplicaciones prácticas: Estudios de
Parentesco genético y diversidad: genética de
poblaciones
Estudio del polimorfismo en razas locales y en
cultivares
Identificación de cultivares y taxonomía
Estudios filogenéticos
Estudios de domesticación y evolución
Flujo de genes e introgresión
Cartografía comparativa de genomas
Algunos de los submódulos anteriores describen experimentos reales, en los cuales se

aplicaron las técnicas moleculares para responder a preguntas sobre diversidad genética.
En ellos se dieron también listas de referencias sobre la tecnología correspondiente.
Aplicaciones prácticas: Manejo de
germoplasma
Caracterización taxonómica de germoplasma

Mantenimiento de las colecciones:
• Identificación de ausencias
• Identificación de duplicados
• Constitución de colecciones nucleares
• Evaluación de la estabilidad del material conservado
• Medición de la erosión genética
Desarrollo de estrategias de conservación
Los marcadores moleculares pueden usarse en el manejo de los bancos de germoplasma

para:
• Identificar con exactitud el germoplasma
• Seleccionar el germoplasma que necesitan usar los mejoradores y otros

investigadores. Ejecutar el mantenimiento rutinario del banco, que se simplificará
gracias a la identificación de duplicados, a la evaluación de la estabilidad por medio
de diferentes rondas de regeneración o multiplicación, y a la medición de la erosión
genética
• Identificar las ausencias que tiene la colección para planear futuras actividades de
conservación y de recolección. Definir colecciones nucleares, con el complemento
de otros datos, asegurando al máximo la riqueza alélica de la colección
Asimismo, la información molecular puede usarse para definir estrategias de

conservación, tanto ex situ (por ejemplo estrategias de recolección) como in situ.
Aplicaciones prácticas: Uso del
germoplasma
Localización de genes en mapas genéticos y su
identificación
Selección asistida por marcadores para el
fitomejoramiento
Detección de variación somaclonal
Evaluación de germoplasma para descubrir
genes útiles
Análisis de parentesco
Identificación de híbridos
Las tecnologías moleculares ayudan a promover el uso del germoplasma al suministrar

datos exactos acerca de los atributos genotípicos de las plantas, incluyendo las
cultivadas. La caracterización del germoplasma ofrece información sobre la composición
genómica del individuo y, como tal, permite que los mejoradores seleccionen material
promisorio basados en el genotipo tanto como en el fenotipo. La construcción de mapas
de ligamiento moleculares ha abierto la posibilidad de ubicar caracteres agronómicos
importantes en los genomas de los cultivos y, en consecuencia, de seleccionar
germoplasma partiendo de la presencia de un gen específico de interés. La introgresión
de genes a partir del germoplasma ‘donante’ puede seguirse en las generaciones
posteriores, mediante la denominada selección asistida por marcadores, facilitando y
acelerando los ensayos tradicionales de selección.
Las tecnologías de marcadores moleculares se emplean también para detectar la

variación somaclonal —potencialmente útil para el fitomejoramiento— la cual se presenta
a veces después de la regeneración que sigue al cultivo de tejidos. Estas tecnologías
pueden ayudar también en las actividades corrientes de mantenimiento de un programa
de fitomejoramiento, tales como seguirle el rastro a la descendencia a través del análisis
de parentesco, identificar los individuos fuera de tipo en los lotes de semilla, y confirmar o
rechazar la pureza híbrida.
Se espera que las herramientas más modernas de la genética molecular aceleren los
procedimientos de fitomejoramiento mediante actividades como facilitar el descubrimiento
rápido de genes útiles en las colecciones de germoplasma o correlacionar el genotipo con
el fenotipo de los individuos.
En resumen
Los criterios más importantes que se aplican en

la elección de una técnica molecular para un
estudio de diversidad genética son:
• La pregunta biológica que motiva el estudio
• Los recursos de que se dispone frente a los que se
requieren
Las aplicaciones de las tecnologías moleculares
abarcan todos los aspectos del análisis de la
diversidad genética, del manejo del
germoplasma y del uso del germoplasma

Los criterios que le ayudarán a acertar en el

proceso de selección de las tecnologías
moleculares y en su aplicación a los recursos
fitogenéticos de interés

A continuación
Glosario

Glosario
Accesión: Muestra de un cultivo recolectada en una localidad y en un tiempo
específicos; puede ser de cualquier tamaño. Se llama también entrada (por la acción
de 'entrar' en una colección o tener 'acceso' a ella)
Acervo genético: La suma total de los genes, con todas sus variantes, propios de
una especie determinada en un momento dado.
ADN: Acido desoxirribonucleico, una cadena doble de nucleótidos unidos entre sí (en
los que el componente azúcar es la desoxirribosa), que es la molécula fundamental en
la trasmisión de los genes.
ADNc o ADN complementario: ADN trascrito de una molécula de ARN por un

enzima llamada transcriptasa inversa.
ADNcp: ADN de los cloroplastos.
ADN homoduplex: Molécula de ADN de doble cadena en la que ambas cadenas

tienen el mismo origen.
ADN microsatélite: Tipo de ADN repetitivo que consiste en repeticiones muy cortas,
tales como dinucleótidos, trinucleótidos o tetranucleótidos. Ver también ADN repetitivo.
ADN minisatélite: Tipo de secuencia de ADN repetitivo que consiste en repeticiones

cortas que tienen un núcleo común único. Ver también ADN repetitivo.
ADNmt: ADN de las mitocondrias.
ADN polimerasa: Cualquier enzima que sea capaz de sintetizar nuevas cadenas de
ADN a partir de un ADN patrón.
ADN repetitivo: Tramo de ADN que consta de repeticiones múltiples de un motivo.

Ver también ADN microsatélite, ADN minisatélite y ADN satélite.
ADN satélite: Repetición de alta frecuencia (desde 1000 hasta más de 100,000
copias) de un motivo básico o unidad de repetición (comúnmente de 100 a 300 pares
de bases) que se presenta en unos cuantos loci del genoma. Ver también ADN
repetitivo.
AFLP: Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados. Es un método muy
sensible para detectar polimorfismos del ADN. Primero se somete el ADN a
digestión con dos enzimas de restricción; luego se selecciona un subconjunto de los
fragmentos de ADN que resultan de la digestión para que sean amplificados en la
PCR y, finalmente, visualizados.
Alelo: Una de las formas alternas de un gen que puede existir en un locus.
Alelo dominante: Alelo que expresa su efecto fenotípico aun cuando esté en
heterocigosis con un alelo recesivo (ver este término). Es decir, si A es dominante
sobre a, entonces AA y Aa tienen el mismo fenotipo.
Alelo recesivo: Alelo cuyo efecto fenotípico no se expresa en condición

heterocigótica porque es ocultado por el alelo dominante.
Aloenzima: Isoenzima cuya síntesis es controlada por los alelos codominantes de

un gen.
Aminoácidos: Compuestos orgánicos bi-funcionales que contienen un grupo básico

amino (–NH2) y un grupo ácido carboxilo (–COOH). También se llaman ácidos
aminos.
Análisis de heteroduplex: Es el estudio de la movilidad del ADN heteroduplex

sometido a electroforesis en geles de poliacrilamida. La reducción en la movilidad
del ADN heteroduplex, comparada con la del ADN homoduplex, es proporcional al
grado de divergencia de las secuencias. Ver también DGGE, SSCP y TGGE.
Apomixis: Es la producción de un embrión sin meiosis. Las plantas superiores

apomícticas producen semillas asexuadas, que provienen de tejido materno
solamente.
AP-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar. Una técnica para

amplificar tramos anónimos de ADN mediante la PCR. Está relacionada con el
RAPD.
Árbol genealógico: Diagrama simplificado del linaje de una familia que muestra las
relaciones entre los miembros de la familia y cómo se han heredado un carácter
dado o enfermedades.
ARN: Ácido orgánico constituido por unidades de nucleótidos de adenina (A),

guanina (G), citosina (C) y uracilo (U) que se repiten, cuyos componentes de ribosa
están unidos con enlaces de tipo fosfo-diester.
Autogamia: Es la transferencia del polen desde la antera de una flor al estigma de

la misma flor o, a veces, al de una flor genéticamente idéntica (o sea, de la misma
planta o del mismo clon). Es también la habilidad que tienen muchas especies
vegetales de lograr con éxito la fertilización natural de ellas mismas. Se llama
también autopolinización.
Autorradiografía: Es una técnica en que las moléculas marcadas radiactivamente

se visualizan en una película de rayos X.
Bacteriófago: Virus que infecta bacterias. Sus formas genéticamente alteradas se

usan como vectores para clonar el ADN.
Banco de germoplasma: Instalación que se construye para la conservación ex situ
de individuos (semillas), tejidos o células reproductivas de plantas o animales.
Base: Unidad química que caracteriza a un nucleótido. En el ADN, las bases son:
adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C). Las bases del ARN son adenina,
guanina, uracilo (U) y citosina.
Bases nitrogenadas: Moléculas que son componentes importantes de los ácidos

nucleicos; están constituidas por una estructura de anillo que contiene nitrógeno. Los
puentes de hidrógeno que unen las bases sirven de enlace a las dos cadenas de
ADN para formar la doble hélice.
CAPS: Secuencia de restricción amplificada y polimórfica, conocida también como

PCR-RFLP; es una técnica que detecta polimorfismos en un locus específico. Un
locus se somete a la amplificación por PCR y los polimorfismos resultantes se
detectan por las diferencias en tamaño de los fragmentos de restricción entre
individuos.
Carácter: O rasgo, atributo de los individuos de una especie para el cual pueden
definirse varias diferencias hereditarias.
Cebador: Fragmento corto de ADN o de ARN hibridado con un ADN de cadena

simple, y al cual pueden agregarse más nucleótidos mediante la polimerasa de ADN.
Cebador arbitrario: Cebador constituido por un oligonucleótido corto, que se usa en

ciertos métodos de PCR para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del
ADN patrón.
Centrómero: La región constreñida de un cromosoma, a la cual se adhieren las

fibras del huso durante la división celular.
Clonación: En biología molecular: es el proceso en que, mediante procedimientos

de manipulación del ADN, se producen copias múltiples de un único gen o de un
segmento de ADN.
Codominancia: Es la situación en que un individuo heterocigótico exhibe el fenotipo

de ambos alelos de un gen específico.
Conservación ex situ: (1) Método de conservación que implica la remoción de los

recursos de germoplasma (semilla, polen, esperma, organismos individuales) de su
hábitat original o de su ambiente natural. (2) Es la acción de mantener vivos los
componentes de la diversidad biológica fuera de su hábitat original o de su ambiente
natural. Ver Conservación in situ
Conservación in situ: Es un método de conservación que pretende preservar la

integridad genética de los recursos genéticos manteniéndolos dentro de los
ecosistemas de evolución dinámica del hábitat original o del ambiente natural. Ver
Conservación ex situ.
Cromatina: Complejo de ADN y proteínas de la célula en la interfase.
Cromosoma: Organización lineal continua de genes y de otro ADN, además de

proteínas y del ARN asociado.
Cuello de botella: Breve reducción del tamaño de una población que ocasiona,
generalmente, deriva genética aleatoria.
DAF: Amplificación de la huella de ADN. Técnica que amplifica tramos anónimos de

ADN, aplicando la PCR. Está relacionada con el RAPD.
DArT: Tecnología de matrices de diversidad.
Deleción: Es una clase especial de mutación en que se pierde parte del ADN de un
cromosoma.
Dendrograma: Todo diagrama ramificado que muestre, mediante líneas en forma de

U, una jerarquía de categorías u objetos basada en el grado de semejanza o en el
número de caracteres compartidos. La longitud de cada rama en U representa, a
veces, la distancia que separa los dos objetos conectados.
Deriva genética: Es un cambio de frecuencia alélica entre una generación y la

siguiente de una población, debida al muestreo de un número finito de genes,
inevitable en todas las poblaciones de tamaño finito. Cuanto más pequeña es la
población, mayor es la deriva genética, y el resultado será que algunos alelos se
pierdan y que la diversidad genética se reduzca.
Desnaturalización: Es la separación de las dos cadenas de la doble hélice del ADN,

o la ruptura severa de una molécula compleja sin que se destruyan los enlaces
principales de sus cadenas.
DGGE: Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante. Método para separar

fragmentos de ADN según su movilidad en condiciones cada vez más
desnaturalizantes (generalmente, por concentración creciente de formamida o de
urea). Ver también Análisis de heteroduplex, SSCP y TGGE.
DHPLC: Cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento. Este método

permite detectar la variación en la secuencia de un sólo par de bases.
Doble hélice: Estructura propuesta por Watson y Crick (los primeros en hacerlo) para
el ADN, que consta de dos hélices afines unidas por enlaces de hidrógeno que se
establecen entre las bases apareadas.
Ecotipo: Población o raza de un organismo adaptada a un hábitat específico.
Electroforesis: Técnica que separa, los componentes de una mezcla de moléculas

(proteínas, ADN, ARN) según su tamaño, como resultado de un campo eléctrico en un
gel que sirve de soporte.
Elemento transponible: Elemento genético que tiene capacidad para moverse de un

sitio a otro en un cromosoma. Algunos se asemejan a los retrovirus y es posible que
se hayan originado en ellos.
Enzima: Proteína que funciona como catalizador de reacciones bioquímicas.
Enzima de restricción: Endonucleasa que reconoce como objetivo una secuencia

específica y corta la cadena de ADN en ese punto.
EST: Marcador de secuencia expresada. Es una sección pequeña de la parte activa
de un gen, y está hecha de ADNc. Puede usarse como un marcador, para buscar el
resto del gen o para ubicarlo en un segmento más grande de ADN.
Eucariota: Célula u organismo que posee un núcleo rodeado por una membrana, y
otros componentes subcelulares diferenciados.
Fenotipo: (1) Forma en que se manifiesta un carácter (o grupo de caracteres) en un

individuo determinado; (2) la apariencia externa perceptible de un genotipo específico.
F 1, F 2, F 3, …: Notación abreviada que se usa para indicar las diferentes

generaciones que ocurren en un experimento de mejoramiento. F1 es la primera
generación filial, o sea, la descendencia del cruzamiento paterno; F2 es la segunda
generación filial, o sea, la descendencia de la autofecundación o del cruzamiento de los
individuos de la F1; y así sucesivamente.
Flujo génico: Intercambio de genes entre poblaciones diferentes aunque, por lo

regular, con alguna relación.
Fragmento de restricción: Fragmento de ADN que ha sido cortado por un enzima de

restricción.
Frecuencia alélica: Es una medida de la presencia continua o asidua de un alelo en

una población, o de la proporción que representa de todos los alelos de un gen.
Gen: Unidad básica, tanto física como funcional, de la herencia, que transmite
información de una generación a la siguiente. Es un segmento de ADN que incluye una
sección transcrita y un elemento regulador que permite su transcripción.
Gen estructural: Cualquier gen que codifique para una proteína.
Genoma: Todo el complemento de material genético en un organismo.
Genoteca: Colección de clones de ADN obtenidos de un donante de ADN.
Genotipo: Composición específica de alelos de toda la célula o, más comúnmente, de

determinado gen o de un conjunto de genes.
Germoplasma: La variabilidad genética total disponible de una población de

organismos representados por células germinales, semillas, etc.
Haplotipo: Constitución alélica específica de cierto número de loci en un bloque de

ligamiento definido.
Herencia: Proceso en que se transmiten los rasgos genéticos de los progenitores a

sus progenies.
Herencia citoplasmática: Herencia de los genes encontrados en los organelos del

citoplasma (los cloroplastos o las mitocondrias).
Heteroduplex: Molécula de ADN de doble cadena o híbrido de ADN y ARN, en que

cada cadena tiene un origen diferente.
Híbrido: Puede ser: (1) un individuo heterocigótico, o (2) un individuo descendiente
de un cruzamiento entre progenitores de diferente genotipo.
Hibridación: En biología molecular, es la unión de secuencias complementarias de

ADN y/o de ARN para formar una estructura de doble cadena.
Homólogo: Correspondiente o similar en estructura, posición u origen.
Huella identificadora de ADN: Patrón único de fragmentos de ADN que puede

revelarse mediante la hibridación Southern o la PCR.
Inserción: Anormalidad cromosómica en la que se inserta una secuencia de ADN en

un gen, lo que distorsiona la estructura y la función normales de ese gen.
Isoenzima: Formas múltiples de un enzima cuya síntesis es controlada por más de

un gen.
ISSR: Secuencia entre repeticiones simples. Los cebadores de la ISSR quedan

anclados en sus extremos 3’ para dirigir la amplificación de los segmentos genómicos
entre los ISSR.
Ligación: Proceso en que se unen de nuevo dos o más fragmentos de ADN.
Ligamiento genético: Proximidad de dos o más genes en un cromosoma, de modo

que los genes tienden a heredarse juntos.
Ligasa: Tipo de enzima que puede unir de nuevo un enlace fosfo-diester roto de un
ácido nucleico.
Locus (pl. loci): Sitio específico de un cromosoma donde está localizado un gen o un
trozo definido de ADN.
MAAP: Caracterización con amplicones múltiples arbitrarios. Término colectivo para

las técnicas de tipo PCR en las que se emplean cebadores arbitrarios.
Mapa de genes: Es la determinación de la posición relativa de los genes en un

cromosoma o en un plásmido, y de la distancia que los separa.
Marcador: Ubicación física identificable en un cromosoma cuya herencia puede

rastrearse (por ejemplo, un gen, un sitio de corte de un enzima de restricción o
marcador de RFLP).
Marcador genético: Un alelo, una banda en un gel o un carácter que sirve

experimentalmente como sonda para identificar a un individuo o a alguna de sus
características.
Matriz: Manchas pequeñas de ADN que se fijan en portaobjetos de vidrio o en

membranas de nilón. Esta tecnología se basa en la hibridación de sondas cortas de
oligonucleótidos con secuencias complementarias de ADN.
Mutación: Alteración estructural permanente del ADN. En la mayoría de los casos,

los cambios ocurridos en el ADN o no tienen ningún efecto o causan algún daño;
ocasionalmente, una mutación puede mejorar la probabilidad de supervivencia de un
organismo y pasar el cambio favorable a sus descendientes.
Mutación puntual: Cambio en un solo par de bases de ADN.
Nucleasa: Enzima que corta los enlaces de tipo fosfodiéster que enlazan los
nucleótidos adyacentes del ADN y del ARN. Una exonucleasa avanza cortando
enlaces desde el extremo de la molécula de sustrato; una endonucleasa corta en
sitios internos de la molécula del sustrato.
Nucleótido: Molécula compuesta por una base nitrogenada, un azúcar y un grupo

de tipo fosfato. Los nucleótidos son los componentes elementales de los ácidos
nucleicos.
Oligonucleótido: Segmento corto de ADN sintetizado artificialmente.
Par de bases: Las dos bases de nucleótidos que están situadas en diferente
cadena de una molécula de ácido nucleico y que se mantienen unidas por enlaces
de hidrógeno. Las bases pueden emparejarse de dos maneras: adenina con timina
(en el ADN) o con uracilo (en el ARN), y guanina con citosina (en ADN y ARN). Ver
también Secuencia complementaria.
Par de genes heterocigótico: Par de genes que tiene dos alelos diferentes en los
dos cromosomas de un individuo diploide; por ejemplo, Aa o A1A2.
Par de genes homocigótico: Par de genes en que hay alelos idénticos en ambas
copias del cromosoma; por ejemplo, AA o aa.
Patrón: Molécula que sirve como modelo para sintetizar otra molécula; por ejemplo,
una molécula de ADN de cadena simple puede usarse como plantilla para sintetizar
la cadena de nucleótidos complementaria.
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. Método para amplificar una secuencia

de ADN en grandes cantidades mediante una polimerasa estable al calor y con
cebadores apropiados, los cuales dirigen la amplificación de la región del ADN que
interesa.
PCR-RFLP: Nombre alternativo para la técnica conocida como ‘Secuencia de

restricción amplificada y polimórfica’ o CAPS (Ver este término).
Péptido: Conjunto de dos o más aminoácidos unidos por un enlace péptidico.
Plásmido: Molécula cromosómica de ADN extra que es capaz de replicarse en

forma autónoma.
Polimerasa: Término genérico para los enzimas que llevan a cabo la síntesis de un
ácido nucleico, usando un patrón de ácido nucleico pre-existente y los nucleótidos
apropiados (es decir, ribonucleótidos para el ARN y desoxiribonucleótidos para el
ADN).
Polímero: Molécula compuesta por subunidades repetidas.
Polimorfismo: Aparición de diferentes formas asociadas con diversos alelos de un

gen o con homólogos de un cromosoma.
Polipéptido: Una proteína, que es una cadena de aminoácidos unidos.

Proteína: Polímero de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, que puede
incluir dos o más cadenas polipeptídicas.
RAPD: Polimorfismo de ADN amplificado al azar. Técnica que amplifica tramos

anónimos de ADN empleando la PCR con cebadores arbitrarios.
Raza local: Cultivar vegetal o línea animal que ha evolucionado junto con los
agricultores tradicionales y ha sido mejorado(a) genéticamente por ellos, sin la
intervención de las prácticas modernas de mejoramiento.
Reacción múltiple (en inglés: multiplexing): Es la realización simultánea de

varias reacciones diferentes en un mismo tubo de reacción, o la electroforesis
simultánea de varios productos de reacción obtenidos separadamente, con el fin de
aumentar la eficiencia del proceso.
Recombinación: También llamada sobrecruzamiento. Es la producción de una

molécula de ADN con segmentos derivados de más de una molécula del ADN de
los progenitores. En los organismos eucariotas, este proceso se realiza mediante el
intercambio recíproco de ADN entre cromátidas no hermanas de un par homólogo
de cromosomas durante la profase de la primera división meiótica. La
recombinación permite a los cromosomas la reorganización de su material genético,
y de este modo incrementa el potencial de la diversidad genética.
Recursos genéticos: Genes que se encuentran en plantas y animales y que

tienen un valor real o potencial para los seres humanos.
Regiones flanqueantes: Secuencias de ADN que se extienden a uno y otro lado

de un gen o de un locus.
Repetición en tándem: Copias múltiples de una misma secuencia de bases en un

cromosoma.
RFLP: Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción. La variación entre

los individuos se detecta por las diferencias en los tamaños de los fragmentos de
ADN después de la digestión con un enzima de restricción.
SCAR: Región amplificada caracterizada por una secuencia Es un locus

identificado a partir de un solo fragmento de RAPD que ha sido secuenciado. Se
pueden diseñar cebadores específicos para el locus y usarse para la amplificación
específica del fragmento mediante PCR.
Secuenciar: Determinar el orden de los nucleótidos en una molécula de ADN o de

ARN, o el orden de los aminoácidos en una proteína.
Secuencia complementaria: Secuencia de una cadena simple de ADN o de ARN,

a la cual se puede unir una determinada secuencia de nucleótidos para formar una
estructura de doble cadena de uno u otro ácido. Por ejemplo, TAGGAT es la
secuencia complementaria de ATCCTA, donde A = adenina, C = citosina, G =
guanina y T = timina. Ver también Par de bases.
Secuencia de ADN: Orden de las bases de los nucleótidos en la molécula de

ADN.
Secuencia de bases: El orden de las bases de nucleótidos en el ADN o el ARN.

Segregación: Genéticamente, se refiere a la producción de los dos fenotipos
separados correspondientes a los dos alelos de un gen.
Sintenia: Se dice que ocurre donde todos los loci se localizan en el mismo
cromosoma. Los loci quizás no parezcan ligados por las pruebas genéticas
convencionales de ligamiento pero todavía pueden ser sinténicos.
Sitio de restricción: Secuencia determinada de ADN, la cual es reconocida por un

enzima de restricción específica de ADN.
SNP: Polimorfismo de un solo nucleótido. Polimorfismos que resultan de la

sustitución de una sola base entre secuencias homólogas.
Sonda: Trozo finito de ácido nucleico empleado para identificar segmentos

específicos de ADN que lleven su secuencia complementaria.
SSCP: Polimorfismo de conformación de cadena única. Método para distinguir

mutaciones en fragmentos de ADN de tamaño similar según la movilidad del ADN de
cadena simple bajo electroforesis de geles de poliacrilamida. Ver también DGGE,
análisis heteroduplex y TGGE.
SSR: Repeticiones de secuencia simple. Ver ADN microsatélite.
SSRP: Polimorfismo de repeticiones de secuencia simple. Ver ADN microsatélite.
STMS: Sitios de microsatélite de secuencia etiquetada. Los cebadores son

construidos de las regiones que flanquean el ADN microsatélite y pueden usarse en
reacciones de PCR para amplificar la región repetida.
STS: Sitios de secuencia etiquetada. Término general dado a un marcador que se

define por la ubicación exacta de su cebador y por el orden de las bases.
Telómeros: Extremos distales de cada brazo cromosómico, involucrados en la

replicación y en la estabilidad de las moléculas lineales de ADN.
Temperatura de fusión (Tm): Punto medio del intervalo de temperaturas al cual el

ADN se desnaturaliza.
TGGE: Electroforesis en geles de gradiente de temperatura. Método para separar

fragmentos de ADN según su movilidad en condiciones desnaturalizantes
gradualmente más calientes. Ver también DGGE, Análisis de heteroduplex y SSCP.
Tipo silvestre: Tipo o forma de un organismo o gen que se da con más frecuencia
en la naturaleza. Se refiere muchas veces a la forma en que los organismos o los
genes se encuentran en la naturaleza, antes de que los investigadores indujeran
mutaciones.
Transcripción: Es la síntesis del ARN complementario, usando un patrón de ADN.
Transcriptasa inversa: Enzima que, cuando dispone de un cebador de ADN,

cataliza la síntesis de una cadena de ADN complementaria a partir de un patrón de
ARN.
Transferencia Southern: Procedimiento en que los fragmentos de ADN, separados
mediante electroforesis, son transferidos a una membrana para detectar secuencias
de bases específicas mediante sondas complementarias marcadas radiactivamente.
Se conoce también como hibridación Southern.
Variación somaclonal: La variación hallada en células vegetativas que se dividen

mitóticamente en un cultivo de tejidos.
Vector: Agente (por ejemplo, un plásmido o un virus) que se emplea para transportar
un segmento de ADN clonado.
VNTR: Número variable de repeticiones en tándem. Tipo de polimorfismo

caracterizado por un número muy variable de copias de secuencias idénticas o
estrechamente relacionadas.
Formulario para sugerencias
El tema de este módulo experimenta cambios continuos, lo que hace aconsejable su

actualización periódica. Por esta razón, presentamos el módulo en formato
electrónico. Para ayudarnos con nuestra tarea de actualización, agradeceríamos
recibir comentarios y solicitudes de los usuarios para mejorar aún más el módulo.
También nos ayudarán mucho sus opiniones sobre la utilidad de esta herramienta.
Hacemos enseguida unas cuantas preguntas orientadoras para que usted las
responda. Puede enviar sus respuestas directamente pulsando el botón ‘Enviar’ al
final de esta página, o puede enviarlas por telefax [No: (57-2) 445 0096], por correo
postal a su contacto en el IPGRI, o por correo electrónico a alguna de estas
direcciones: cdevicente@cgiar.org o tf12@cornell.edu
Preguntas:
1. Descríbanos la forma en que usa esta herramienta…
2. ¿Usted piensa que el módulo…:
a. …proporciona una síntesis global de los conceptos científicos básicos

relativos a las tecnologías de los marcadores moleculares y
secuenciación del ADN, y de su uso en el campo de los recursos
fitogenéticos?
Sí
No
¿Por qué?
b. …suministra información sobre la forma de comparar las ventajas y las

desventajas de cada tecnología y de contrastarlas entre sí, y permite
así tomar decisiones adecuadas respecto a una situación específica de
investigación?
Sí
No
¿Por qué?
c. …proporciona una lista de los recursos bibliográficos actuales para cada

una de las tecnologías tratadas?
Sí
No
¿Por qué?
3. Díganos lo que le gustó y lo que usted cambiaría sobre los siguientes
aspectos del módulo:
a. El contenido
b. La diversidad de tecnologías ofrecidas
c. Los criterios empleados para seleccionar las técnicas
d. La estructura que tienen los submódulos
e. Los dibujos, los diagramas, las imágenes
f. Otros aspectos
4. De los siguientes temas, ¿cuál agregaría usted al módulo para hacerlo más
útil en relación con su situación particular?
a. Referencias básicas
b. Ejemplos de aplicaciones
c. Información adicional sobre conceptos básicos
d. Más tecnologías:
i. Antiguas
ii. Recientes
5. ¿Qué otros temas querría usted ver en este módulo?
5. ¿Fue difícil descargar de Internet el módulo o alguna de sus partes? ¿Por qué?
Enviar
M. Carmen de Vicente, IPGRI César López, Univ. La Molina
Correo electrónico: cdevicente@cgiar.org Correo electrónico: cflb@lamolina.edu.pe
Theresa Fulton, IGD, Cornell University

Correo electrónico: tf12@cornell.edu
IPGRI - El Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI) es un organismo
internacional autónomo de carácter científico cuya misión es promover la conservación
y el uso de los recursos fitogenéticos para beneficio actual y futuro de la humanidad.
Es uno de los 16 Centros de Future Harvest que opera bajo los auspicios del Grupo
Consultivo sobre Investigación Agrícola Internacional (GCIAI), una asociación de
miembros públicos y privados que apoyan las actividades para promover los últimos
descubrimientos de la ciencia para reducir el hambre y la pobreza, mejorar la salud y la
nutrición y proteger el medio ambiente. El Instituto tiene su sede en Maccarese, cerca
de Roma, Italia, y oficinas en más de 20 países del mundo. El IPGRI opera mediante
tres programas: (1) el Programa de Recursos Fitogenéticos, (2) el Programa de Apoyo
a las actividades en Recursos Fitogenéticos de los Centros del GCIAI y (3) la Red
Internacional para el Mejoramiento del Banano y el Plátano (INIBAP).
IGD - El Instituto para la Diversidad Genómica (Institute for Genomic Diversity, IGD) se
encuentra en la ciudad de Ithaca, Nueva York, Estados Unidos. La misión del IGD es
desarrollar, transferir y proveer tecnologías y recursos educacionales, para resolver los
problemas que afectan la conservación de la biodiversidad y la seguridad alimentaria
global. Específicamente, nuestros objetivos son: utilizar estrategias de genómica
comparativa y evolutiva para resolver problemas aplicados; desarrollar y transferir
tecnologías capacitadoras en genómica y bioinformática; proveer apoyo a los
esfuerzos nacionales e internacionales en conservación, agricultura y mejoramiento de
cultivos; y educar y entrenar en todos los niveles (incluyendo pero no limitados a los
estudiantes de pregrado y posgrado, científicos visitantes, profesores y personal en
general).
Derechos de Autor © 2003 por el Instituto Internacional de Recursos

Fitogenéticos (IPGRI) y el Instituto para la Diversidad Genómica (IGD), Cornell
University.
Salvo lo declarado expresamente de otro modo, el IPGRI y Cornell University

poseen los derechos de autor y todos los demás derechos relacionados con este
trabajo. Los individuos pueden copiar e imprimir libremente los materiales para
fines educativos o no comerciales, sin necesidad de obtener permiso previo de
los propietarios de los derechos de autor. Sin embargo, es un requisito citar la
fuente de los materiales.
Cita
de Vicente, M.C. y Fulton, T. (eds.). 2003. Tecnologías de Marcadores
Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de
Aprendizaje. Illus. Nelly Giraldo. Instituto Internacional de Recursos
Fitogenéticos (IPGRI), Roma, Italia.
M. Carmen de Vicente, Ph.D., es Genetista Molecular de Plantas, en la Oficina

Regional del IPGRI-Américas, en Cali, Colombia. Theresa Fulton, Ph.D., es Directora
de Extensión en el Instituto para la Diversidad Genómica de la Universidad de Cornell,
Ithaca, NY.

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Nuestra ilusión es que este módulo en línea le dé a usted, su usuario, el contexto,

Las tecnologías de marcadores moleculares son el medio más avanzado y,

Este conjunto de módulos de entrenamiento pretende contribuir al desarrollo de

• Los principios fundamentales de la diversidad genética.

Los procedimientos experimentales más importantes se explican con gráficos

La actualización y la información de retorno tienen una importancia crítica en campos

International Plant Genetic Institute for Genomic Diversity

M. Carmen de Vicente Theresa Fulton

• Que desarrollen la habilidad de comparar y contrastar las ventajas y

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 1

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 2

La diversidad genética se refiere a la variación

La diversidad genética es el resultado de la

La diversidad genética se refiere a la variación de los genes de las especies, o sea, a la

La generación de nueva variación genética se produce continuamente en los individuos a

Entre los recursos fitogenéticos se incluye la

Debemos conservar los recursos fitogenéticos

Los recursos fitogenéticos comprenden la variación genética presente y potencialmente útil

La conservación y el uso eficaz de los recursos

La variación genética puede medirse en dos

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 5

La evaluación de la variación genotípica se hace al nivel de la molécula de ADN, que es la

Los marcadores genéticos identifican en un

El seguimiento de la herencia de los marcadores

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 6

Un marcador genético es un carácter cuantificable que puede detectar variación ya sea en

Es posible que un carácter genético no tenga efectos observables en el comportamiento de

Marcadores proteicos (o bioquímicos)

Marcadores de ADN (o moleculares)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 7

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 8

Tradicionalmente, la diversidad que existe dentro y entre las poblaciones se ha determinado

Los marcadores proteicos (proteínas de almacenamiento de la semilla e isoenzimas) se

La detección de polimorfismos —o sea, las diferencias detectables para un marcador

Son polimorfismos detectados en la secuencia

Su desventaja principal es que necesitan de un

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 10

Un buen marcador es:

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 12

RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (Restriction fragment

Extracción de ADN 5.40-101.40 5.40 5.40 5.40 96 micropreparaciones vs. 96

Tubos de centrífuga o de microcentrífuga 2.40

O, placa de 96-pocillos 3.50

O, tubos de 50 ml (preparaciones grandes) 24.00

Tampón de extracción 2.00-50.00 96 micropreparaciones vs. 96

Insumos diversos (alcohol, tampón de lisis, 1.00-25.00

Agarosa 10.00 (2 geles)

Tampón 13.00 (2 geles)

Electroforesis en geles de 1.50 1.50

Acrilamida 0.75 (1 gel)

Urea 0.75 (1 gel)

Electroforesis en geles de 4.06 4.06

Cebadores marcados con fluorescencia 2.56

Gel (ver electroforesis en geles de 1.50

Método de visualización con 0.20-2.00 0.20-2.00 0.20-2.00

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 13

PCR 74.30 74.30 74.30

Taq polimerasa 50 1.5 U/reacción. El costo se reducirá

Tampón con MgCl2 para PCR

Digestión con enzimas de 0.30-30.00

Enzimas 0.30-30.00 ~10 unidades/muestra, precios muy

Transferencia por “Southern” 30.50

Tampones (HCl, NaOH) 4 (2 geles)