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(CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO)
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Características dos analitos X Análise
cromatográfica
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Cromatógrafos Comerciais
Fabricante: Agilent 3
Cromatógrafos Comerciais
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Componentes de um cromatógrafo líquido
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Componentes de um cromatógrafo líquido
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FASE MÓVEL
• A fase móvel passa pela fase estacionária, que está
dentro de uma coluna (cromatografia em coluna), e os
componentes da amostra são separados pela
diferença de afinidade entre as duas fases.
• Solventes orgânicos
• Solvente aquoso: água e soluções tampão.
• Misturas de solventes: é necessário verificar a
compatibilidade entre os solventes.
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ESCOLHA DO SOLVENTE
Parâmetros devem ser considerados para a escolha do solvente:
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PROPRIEDADES DOS SOLVENTES
• Imiscibilidade com a FE
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FASE MÓVEL - FILTRAÇÃO
• A fase móvel não pode conter partículas para evitar
danos à bomba, injetor e coluna: necessário a filtração
antes de armazenar a fase móvel no reservatório.
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FASE MÓVEL:
REMOÇÃO DE GASES DISSOLVIDOS
• A fase móvel deve ser degaseificada para evitar a formação de
bolhas no processo de separação, o que pode interferir no
desempenho da análise.
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BOMBA CROMATOGRÁFICA
• Transporta a fase móvel desde o reservatório, coluna e até aos
detectores
Características:
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BOMBA CROMATOGRÁFICA
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BOMBA CROMATOGRÁFICA
Princípio de funcionamento
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BOMBA CROMATOGRÁFICA
• BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO
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BOMBA CROMATOGRÁFICA
• BOMBEAMENTO POR GRADIENTE
• Alteração da composição da fase móvel, sem alteração da
vazão total, com a finalidade de diminuir tempo de análise
e/ou melhorar a separação dos analitos da amostra.
i. Aço inoxidável
ii. PEEK (Poliéter-Éter-Cetona)
iii. Resina perfluorada
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LOOP PARA INJEÇÃO DA AMOSTRA
Loop da amostra
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FASE ESTACIONÁRIA
• As FE são constituídas de material sólido, granulado,
finamente dividido e densamente empacotado dentro de um
tubo feito de material inerte, normalmente aço.
• O material sólido pode estar revestido ou ligado
quimicamente a um líquido.
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FASE ESTACIONÁRIA
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FASE ESTACIONÁRIA
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FASE ESTACIONÁRIA
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Interações dos analitos com fase
estacionária polar
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Características da Fase Normal
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Micrografia de 5 µm de sílica
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Corte transversal do bastão cilíndrico
de sílica monolítica e sua ampliação
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Características da Fase Normal
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Força de eluição em Fase Normal
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FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Fase estacionária menos polar que a fase móvel
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Relação entre polaridade do solvente e tempo
de retenção em modo de fase reversa
60/40
70/30
80/20
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Fase estacionária reversa: orientações para a
otimização da separação dos picos cromatográficos
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FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Adequada para compostos não iônicos, compostos
polares a mediamente apolares.
• Ordem de eluição (ordem crescente): Analitos mais
polares → Analitos mais apolares
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FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Os grupos funcionais ligados à base de sílica são
apolares. Os analitos são atraídos para a superfície
pelos seus grupos funcionais não polares. O analito
mais polar elui primeiro, seguidos pelos outros em
ordem decrescente de polaridade.
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FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Composição da Fase Estacionária
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Distribuição espacial dos componentes
da fase estacionária (C18)
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Efeito da temperatura na fase estacionária
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NOVAS FASES ESTACIONÁRIAS (POLAR, APOLAR ??)
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NOVAS FASES ESTACIONÁRIAS (POLAR, APOLAR ??)
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NOVAS FASES ESTACIONÁRIAS (POLAR, APOLAR ??)
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Interações entre analitos quirais
(enantiômeros) e a fase estacionária
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Mecanismos de Separação
Em função da fase estacionária utilizada tem-se os
seguintes mecanismos de separação:
• Adsorção
• Partição
• Troca iônica
• Exclusão
• Bioafinidade
• Mistura de mecanismos
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Mecanismos de Separação
47
Mecanismos de Separação
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Fases Quimicamente Ligadas
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Relação entre tempo de retenção e
polaridade da fase estacionária e analitos
C18 (ODS) OH
Weak
Strong
CH3
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MECANISMO DE EXCLUSÃO POR TAMANHO
Fase
Estacionária
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MECANISMO POR EXCLUSÃO
• Principais
analitos:
✓ Polímeros
✓ Proteínas
✓ Peptídeos
✓ Carboidratos
✓ Ácidos
Nucleicos
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MECANISMO POR TROCA IÔNICA
• A separação baseia-se na interação eletrostática dos componentes da
amostras com grupos iônicos da FE.
• A FE é normalmente uma resina de poliestireno-divinilbenzeno a qual estão
ligados grupos iônicos, ou a FE é sílica recoberta com uma fina camada de
poliestirenodivinilbenzeno onde grupos iônicos estão ligados.
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MECANISMO DE ADSORÇÃO
• Utiliza partículas porosas em geral de 5 micra ou 10
micra
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Fases estacionárias para HILIC
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Relação entre HILIC e demais
modalidades de cromatografia
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Tipos de interações presentes na cromatografia
por interações hidrofílicas (HILIC)
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Pré-Coluna / Coluna de Guarda
É uma pequena coluna instalada antes da coluna analítica.
CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS:
• Protege a coluna analítica contra contaminações
químicas e reter materiais que por reações químicas
podem precipitar sobre a fase estacionária.
• Mesmo material de empacotamento da coluna
• Comprimento Típico: 25 mm
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Pré-coluna e Coluna de Guarda
Coluna de Guarda
Pré-coluna
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COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
• A separação é efetuada nas colunas cromatográficas, feitas em aço
e resistentes a altas pressões (até 500 atm)
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COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
• Como o tempo de retenção depende da temperatura, as
colunas devem ser mantidas termostatizadas em um
forno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada
para a separação
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Influência do diâmetro interno da
coluna na quantificação dos analitos
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DERIVATIZAÇÕES: REAÇÕES PÓS-COLUNA
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Derivatização pós-coluna
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DETECTORES
• O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que
registra a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser
registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a
quantidade do analito analisado.
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DETECTORES
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DETECTORES
➢ Índice de refração
➢ Espectrometria UV-Visível
➢ Fluorescência
➢ Eletroquímico
➢ Espectrometria de massa
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Detector de Índice de Refração
• Na passagem do analito pelo detector pode ocorrer a alteração do índice
de refração (IR) da fase móvel.
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Detector de UV-Visível (UV-VIS)
CONSIDERAÇÕES
➢ A fase móvel utilizada não pode absorver no comprimento de onda
selecionado
➢ A pureza da fase móvel é extremamente importante (traços de impurezas
podem absorver intensamente no comprimento de onda utilizado):
UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC
➢ Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de
interesse absorve e outros não.
➢ Permite a utilização de análise por gradiente: escolha do comprimento de
onda onde os constituintes da fase móvel não apresentam variação de
absorbância.
➢ Permite obter o espectro de absorbância de cada componente separado
interrompendo o fluxo da fase móvel e assim selecionar o melhor
comprimento de
onda.
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Detector DAD (REDE DE DIODOS)
• Nesse tipo de detector, toda a radiação passa pela cela.
APLICAÇÕES:
➢ Substâncias que absorvem na região do UV-Visível.
➢ Muito importante na determinação de impurezas nas sínteses e
controle de qualidade de princípios ativos de produtos farmacêuticos.
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Detector DAD (REDE DE DIODOS)
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Detector Eletroquímico
No processo eletroquímico, um par de eletrodos é colocado na cela e
um potencial suficientemente elevado é aplicado provocando uma
reação de oxidação ou redução. Isto gera uma corrente elétrica que é
medida em um detector eletroquímico. A corrente gerada é
proporcional a concentração da substância.
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Detector Eletroquímico
Aplicações:
Para possibilidade de muitas substâncias serem oxidados
ou reduzidos quando se aplica um potencial elétrico.
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Detector ELSD – Espalhamento
evaporativo de luz
• Detector universal para substâncias não voláteis.
Aplicações:
Lipídeos, ácidos graxos, carboidratos, polímeros,
esteroides, aminoácidos, aditivos de plásticos, produtos
farmacêuticos...
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Detector ELSD – Espalhamento
evaporativo de luz
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Detector CORONA
❖ Superior em desempenho em relação aos outros detectores, exceto
espectrômetro de massas.
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Detector CORONA
❖ O fator de resposta do analito é independente da
estrutura química.
APLICAÇÕES:
• Ideal para uma larga faixa de aplicações de substâncias
não voláteis e semi-voláteis: fármacos, drogas,
carboidratos, lipídios, esteróides, peptídeos, proteínas,
polímeros.
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Detector CORONA
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COMPARAÇÃO DE DETECTORES
Possibility of
Selectivity Sensitivity
Gradient System
Light-absorbing
Absorbance ng Possible
substances
Differential
None µg Impossible
refractive index
Evaporative light
Nonvolatile substances µg Possible
scattering
Electrical
Ionic substances ng Partially possible
conductivity
Oxidizing / reducing
Electrochemical pg Partially possible
substances
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Técnicas de preparo de amostras
acopladas com LC
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SPE online - LC
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SP online - LC
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MODULAÇÃO DA FASE ESTACIONÁRIA EM CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA ATRAVÉS DO ACOPLAMENTO DE COLUNAS
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MODULAÇÃO DA FASE ESTACIONÁRIA EM
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ATRAVÉS DO
ACOPLAMENTO DE COLUNAS
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PROBLEMAS EM
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
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Entupimento de coluna
Causas
Deposição de partículas sólidas ou cristalização de substâncias na
fase estacionária
Medidas preventivas
➢ Filtrar as amostras
➢ Verificar se as amostras dissolvem no eluente
➢ Verificar o histórico de pressão na coluna
Ações corretivas
✓ Checar para componentes que podem entupir, além da coluna
✓ Rinsar com solvente apropriado
✓ Abrir a entrada da coluna e trocar o filtro.
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Deformações dos Picos
Causa Ação corretiva
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Diminuição do Tempo de Retenção
Causas
➢ Composição da fase móvel (eluente)
➢ Vazão da fase móvel
➢ Temperatura da coluna
Ações corretivas
✓ Verificar a compatibilidade do analito com a fase móvel
(eluente)
✓ Se a coluna é identificada como a causa, rinsar ou troca
a coluna
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Ruídos na linha base
Causas
➢ Checar se a causa do problema não é a coluna
➢ Depois de remover a coluna, a causa pode ser a
fase móvel, sistema de liberação da fase móvel
(bomba ou degaseificador) ou o próprio detector.
Ações corretivas
• Se a coluna é identificada como a causa, rinsar ou
troca a coluna
• Revisar o controle da temperatura.
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