Identificando Agentes Etiológicos que Causan Diarrea en Comunidades

Ecuatorianas de Bajos Ingresos

Abstracto

El éxito continuo en la disminución de la carga de la enfermedad diarreica requiere intervenciones específicas. Para desarrollar
tales intervenciones, es crucial entender qué patógenos causan diarrea. Usando un diseño de casos y controles, probamos muestras
de heces, recolectadas en el Ecuador rural y urbano, para 15 microorganismos patógenos. Los patógenos estuvieron presentes en
el 51% de los casos y el 27% de las muestras de control de la comunidad urbana, y el 62% de las muestras y el 18% de las muestras
de control recolectadas de la comunidad rural. El rotavirus y Shigellae se asociaron con diarrea en la comunidad urbana; las
coinfecciones fueron más patogénicas que una sola infección; Campylobacter y Entamoeba histolytica se encontraron en grandes
cantidades en casos y controles; y Salmonella no tifus y Escherichia coli enteropatógena no se encontraron en ninguna muestra.
En consonancia con el Global Enteric Multicéntrico Study, centrado en el sur de Asia y el África subsahariana, encontramos que
en Ecuador un pequeño grupo de patógenos representaba una cantidad significativa de la carga de la enfermedad diarreica.

Introducción

A pesar de la disminución de la mortalidad infantil asociada a la diarrea en las últimas cuatro décadas, las
enfermedades diarreicas siguen siendo la segunda causa de muerte entre los niños <5 años de edad en los
países en desarrollo. 1 , 2 Para seguir reduciendo la mortalidad asociada a la diarrea, se necesitan
intervenciones específicas. Informar el desarrollo de estas intervenciones requiere una comprensión de los
factores sociales, ambientales y biológicos de las enfermedades diarreicas. Con este fin, se realizó el
estudio multicéntrico Global Enteric (GEMS) para determinar los agentes etiológicos que causan la diarrea
en niños <5 años de edad. 3 Los sitios de estudio GEMS se ubicaron en el África subsahariana y el sur de
Asia, donde la carga de morbilidad por diarrea es más alta en el mundo. 1 , 2 El estudio GEMS,
desafortunadamente, no incluyó sitios de estudio dentro de América Latina, donde faltan instalaciones
mejoradas de agua y saneamiento y las enfermedades diarreicas son una gran preocupación. Para
complementar el estudio GEMS, llevamos a cabo un estudio de control de casos en una comunidad rural y
urbana dentro de Ecuador.

Las investigaciones clínicas de agentes microbianos diarreogénicos son lentas, costosas, difíciles de lograr en el
entorno clínico, y los resultados rara vez benefician al paciente 4 , 5 ; sin embargo, comprender qué agentes causan
enfermedades puede proporcionar información epidemiológica útil para diseñar estrategias de intervención. 6 , 7 Por
ejemplo, Vibrio spp. la infección se ha asociado con mariscos crudos o poco cocidos 6 y Salmonella spp. no tifus. a
menudo está relacionado con brotes transmitidos por los alimentos. 8 Además de los modos de transmisión específicos
del patógeno, la transmisión de la diarrea también varía según el contexto social y ambiental. Por ejemplo, se ha
observado que la tasa de salmonelosis disminuye cuando el nivel de desarrollo aumenta en un país. 9

A pesar de la importancia de comprender la epidemiología de las enfermedades diarreicas, se sabe poco sobre los
agentes etiológicos causantes de la diarrea en América Latina. Por ejemplo, en Ecuador la incidencia notificada de
enfermedades diarreicas aumentó de 17/1000 habitantes en 1994 a 46/1000 habitantes en 2012, 10 sin embargo, existe
una investigación limitada que describe la diversidad de patógenos de estos casos de diarrea. De los 12 estudios
publicados sobre enfermedad diarreica en Ecuador durante los últimos 30 años ( Tabla 1 ), siete estudios presentaron
datos de prevalencia que contenían escasa información etiológica, mientras que cinco estudios analizaron datos de
estudios de casos y controles que resaltaron la relación etiológica entre enfermedad y patógenos . 23 , 24 Cada estudio
se centró en al menos un patógeno, con algunos estudios que identifican las causas virales de la diarrea (p. Ej., Rotavirus
y norovirus) y otros que describen causas bacterianas y parasitarias. Además, cada estudio se limitó a un entorno rural
o urbano.
tabla 1

Resumen de los datos publicados sobre la presencia de patógenos entéricos en Ecuador *

Algunos estudios más antiguos proporcionan datos etiológicos relevantes. A principios de la década de
1980, un estudio prospectivo en el noreste rural de Brasil encontró que el rotavirus, ETEC, STEC,
Shigellae y Giardia lamblia eran causas importantes de la enfermedad; el rotavirus fue más prevalente
durante las estaciones secas y ETEC durante las temporadas de lluvia. 25 A mediados de la década de 1980,
un estudio de casos y controles en el Brasil urbano reveló que EPEC, rotavirus, Salmonella , Shigellae y
ETEC y las coinfecciones con más de un agente patógeno se asociaban con la enfermedad. 26 Más
recientemente, una vigilancia pasiva en Lima, Perú, mostró que los agentes más comunes asociados con la
diarrea en niños <1 año de edad fueron CEEA, EPEC, Campylobacter y rotavirus; EAEC, EPEC y
Campylobacter se encontraron con frecuencia en individuos asintomáticos. 27 , 28

Aquí, presentamos datos de un estudio comparativo de casos y controles que describe la etiología de las
enfermedades diarreicas en un entorno urbano (vecindario de bajos ingresos en Quito) y rural (comunidad
de bajos ingresos en el noroeste de Ecuador). Dentro de cada comunidad, se recogieron muestras de heces
de los participantes del estudio y se analizaron para detectar 15 patógenos virales, bacterianos y
protozoarios importantes.

Materiales y métodos
Sujetos humanos.

Llevamos a cabo un estudio de casos y controles en el que se reclutaron participantes en dos lugares:
Guamaní, un barrio urbano de bajos ingresos en la capital ecuatoriana, Quito, y Borbón, una comunidad
rural de bajos ingresos en el noroeste de Ecuador. Guamaní se encuentra en la provincia de Pichincha a una
altitud de 2.700 metros sobre el nivel del mar (msnm). La población consiste en 65,065 individuos; casi
todos los hogares (98%) en esta área tienen acceso a una fuente de agua potable que se considera mejorada
según los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Borbón es un pequeño pueblo en la
provincia de Esmeraldas, en el noroeste de Ecuador, a una altitud aproximada de 15 msnm Borbón tiene
una población de 7.696 personas. A diferencia de Guamaní, <3 de cada 5 hogares en Borbón (58%) tienen
acceso a una fuente mejorada de agua potable. 29

Estudio Guamaní.

Se definió un caso como cualquier persona que acudió al centro de salud local que sufría de diarrea (tres
deposiciones blandas en 24 horas) y no había tomado antibióticos o medicamentos similares en las 2
semanas anteriores a la inscripción. Los controles se definieron como aquellos que vinieron al centro de
salud por otra razón, y no tuvieron síntomas diarreicos durante las últimas 2 semanas y no habían tomado
antibióticos en las 2 semanas previas a la inscripción. Cada caso inscrito se emparejó por edad (dentro de 1
mes para aquellos <1 año de edad, dentro de 6 meses para aquellos entre 1 y 10 años de edad, y dentro de 1
año para mayores de 10 años) y sexo hasta un control apropiado . El reclutamiento tuvo lugar entre marzo y
mayo de 2012 durante la temporada de lluvias (la precipitación media es de 145.8, 372 y 55 mm durante
marzo, abril y mayo, respectivamente, la temperatura media es de 13.9, 13.9 y 15.5 ° C durante marzo,
abril, y mayo, respectivamente). 30 - 32

Estudio Borbón.

Usando una cohorte de 400 hogares que estaban siendo seguidos en un estudio observacional de varios
años, cada hogar fue visitado diariamente por un período de 2 semanas. Durante cada visita, se preguntó a
un encuestado del hogar si algún miembro de la familia tenía diarrea (tres deposiciones sueltas en 24
horas). Si más de un miembro del hogar eran candidatos para el caso, solo se incluyó un caso seleccionado
al azar en el estudio. Para cada caso identificado tres controles seleccionados al azar (individuos sin
síntomas diarreicos durante la semana pasada) se seleccionaron entre los 400 hogares en la cohorte. Las
muestras de materia fecal se recolectaron entre julio y agosto de 2012, lo que corresponde a la estación
seca (la precipitación media es de 18.2 y 25.6 mm durante julio y agosto, respectivamente, la temperatura
media es de 25.7 y 25.6 ° C durante julio y agosto, respectivamente). 33 , 34 Todos los participantes
declararon que no tomaron antibióticos la semana pasada. Antes de inscribirse en los estudios Guamaní y
Borbón, todas las personas firmaron un documento de consentimiento que describe los procedimientos del
estudio, aprobado por los Comités de Ética de la Universidad de Michigan y la Universidad San Francisco
de Quito, con la aprobación del gobierno local y nacional del Ministerio de Salud Pública ecuatoriano.

Procedimientos de laboratorio.

Todos los participantes proporcionaron muestras de heces al equipo del estudio dentro de 1 hora de la
evacuación intestinal; las muestras se colocaron en un refrigerador si el transporte al laboratorio tomó más
de una hora. Todos los cultivos bacterianos y la conservación de las muestras comenzaron <8 horas
después de la recolección.

Identificación de bacterias.

Para identificar enterobacterias diarreicas, se cultivaron muestras de heces en cuatro medios de agar: agar
MacConkey Lactose (Difco, Sparks, MD); Agar MacConkey Sorbitol (Difco); Agar Salmonella-Shigella
(Difco); y agar Xylose lisina desoxicolato (Difco). Para investigar Campylobacter sp., Las muestras se
cultivaron en agar Campylobacter Oxoid (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, Inglaterra) utilizando
CampyGen CO 2 (Oxoid Ltd.). Las colonias sospechosas de Campylobacter jejuni-coli se tiñeron con
Gram, se probaron para oxidasa y se confirmaron mediante genes de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) (hippuricasa y aspartoquinasa). 35 , 36 Para clasificar Vibrio spp., Las muestras se cultivaron en
TCBS agar (Difco) sacarosa positiva y las colonias de sacarosa negativa se sometieron a pruebas API-20E
(bio Merieux, Marcy I'Etolie, Francia). La fermentación de lactosa y colonias positivas de β-D-
glucuronidasa (usando agar Chromocult de Difco) se sometieron a PCR para la presencia de los genes ipaH
, estA , eltA , bfpA , stx- 1, stx -2 para detectar patotipos de E. coli enteroinvasivos ( EIEC),
enterotoxigénico (ETEC), enteropatógeno (EPEC) y shiga-toxigénico (STEC), respectivamente. 37 - 39 La \
beta - D - glucuronidasa E. coli negativa también se analizaron para determinar la presencia de los genes
stx - 1 y stx - 2. Las colonias negativas a lactosa y xilosa se analizaron mediante pruebas API-20E para
determinar si las colonias eran Shigellae y Salmonella spp. Las Shigellae sospechosas se confirmaron por
la presencia del gen ipaH .

Identificación de virus.

Se usaron pruebas inmunocromatográficas para la detección de norovirus (Rida Quick Norovirus, r-

Biopharm, Darmstadt, Alemania) y rotavirus (RidaQuick Rotavirus, r-Biopharm).
Identificación de parásitos.

Se utilizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para detectar Giardia lamblia (Ridascreen
Giardia , r-Biopharm) y Cryptosporidium parvum (Ridascreen Cryptosporidium , r-Biopharm).
Identificación de ameba: PCR de muestras de heces se realizó para detectar Entamoeba histolytica . 40
También utilizamos microscopía para detectar protozoos (incluida la tinción ácido-rápida de Kinyoun).

Análisis estadístico.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft Corp., Redmond,
WA) y el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) Epi Info 7.1.0.6. Calculamos la
odds ratio (OR) para comparar los patógenos presentes en las muestras de casos y controles. Se calculó un
par coincidente OR y los intervalos de confianza exactos (IC) para los análisis de Guamaní. Para los
análisis de Borbón, se calculó un OR estratificado ponderado de Haenszel utilizando tres grupos de edad: 0
a 4,9 años, 5 a 13 años y> 13 años de edad.

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Resultados
Participantes.

En Guamaní, el tamaño de muestra fue de 200 (100 casos y 100 controles). La mediana de edad fue de 14
años tanto para los casos como para los controles (DE = 15.6 y 16.2 para los casos y los controles,
respectivamente). Los niños <5 años de edad representaron 49 casos y 49 controles y los hombres
representaron 54 casos y 54 controles. En Borbón, el tamaño de muestra fue de 151 (39 casos y 112
controles). La mediana de edad fue de 13 (DE = 19) y, 24 (DE = 19) años entre los casos y los controles,
respectivamente. Los hombres representaron 23 casos y 57 controles.

Patógenos.

Los patógenos se aislaron de muestras de casos con mayor frecuencia en Borbón (62%) que en Guamaní
(51%). Además, entre las muestras de casos, las coinfecciones fueron más prevalentes en Borbón (23%) en
comparación con Guamaní (16%) ( Tabla 2 ). Las probabilidades de diarrea asociada a patógenos, que
incluyen tanto infecciones únicas como coinfecciones, también fueron mayores en los entornos rurales que
en los urbanos (Borbón OR 7.36, IC 95% 3.2-16 y Guamaní OR 4.4, IC 95% 1.9-12 ) La presencia de cada
microorganismo específico, como agente de una sola infección y una coinfección, aislada de las
localizaciones urbanas y rurales se muestra en la Tabla 3 . Los patógenos asociados con la diarrea fueron
Shigellae y rotavirus en Guamaní, y rotavirus y Giardia lamblia en Borbón. Salmonella spp. y EPEC no se
encontraron en ninguna muestra de materia fecal recogida de ninguna ubicación, mientras que
Cryptosporidium se encontró en cuatro muestras de casos en Borbón y dos muestras de casos en Guamaní,
y no se encontró en ninguna muestra de control. Todos los casos positivos de Cryptosporidium se
encontraron en niños <5 años de edad (4 de 21 en Borbón y 2 de 49 en Guanamí). Se encontraron tasas más
altas de Campylobacter y Entamoeba histolytica en muestras del sitio urbano en ambos casos y controles,
en comparación con el sitio rural.
Tabla 2

Número de infecciones por estado de caso / control y odds ratios de diarrea en relación con el estado del caso en
Guamaní y Borbón, Ecuador *

Tabla 3

Distribución de patógenos y odds-ratio para la diarrea informada como estimación cruda y estratificada por
infección única y coinfección (dos o más infecciones) en Guamaní y en Borbón *

Coinfecciones

Las coinfecciones, definidas como la presencia de dos o más patógenos en una muestra de heces, se
encontraron tanto en las comunidades urbanas como rurales. La presencia de más de un patógeno aumentó
las probabilidades de tener diarrea en Borbón por cualquier infección OR 7.36, IC 95% 3.2-16, una
infección con un solo patógeno O 3.5, IC 95% 1.5-8, y una infección con 2 patógenos O 16,95% CI 3,2-86
( Tabla 2 ). Encontramos que el rotavirus tenía mayores probabilidades de causar diarrea en los sitios
urbanos (OR 12, IC 95% 1.23-358 y OR 14.8, IC 95% 1.7-132, respectivamente) si la muestra estaba
coinfectada. Esto también fue cierto para las muestras de Giardia lamblia del sitio rural (OR 8, IC 95% 2-
32). Dentro de Borbón, las coinfecciones de rotavirus / G. lamblia se asociaron con diarrea (OR 24, IC
95% 1.9-302). La Tabla 4 presenta una lista completa de coinfecciones identificadas en las muestras de
heces de las poblaciones estudiadas.
Tabla 4

Coinfecciones encontradas en Guamaní y en Borbón *

Discusión

Una gran cantidad de patógenos pueden causar enfermedades diarreicas; sin embargo, la mayoría de los
estudios sugieren que solo unos pocos patógenos representan la mayoría de la carga de la enfermedad. 3 , 6 ,
41
En general, estos mismos agentes etiológicos se han asociado sistemáticamente con la enfermedad a lo
largo del tiempo, aunque hay algunos patógenos emergentes importantes, como norovirus y
Cryptosporidium parvum . Nuestro estudio en el Ecuador rural y urbano complementa la información
proporcionada por GEMS llevada a cabo en África subsahariana y Asia.

De acuerdo con GEMS, el rotavirus se asoció con enfermedades diarreicas en nuestra comunidad urbana y
rural de bajos ingresos, mientras que Shigellae solo fue importante en nuestro entorno urbano. Giardia se
encontró en una gran cantidad de muestras tanto en entornos urbanos como rurales y en casos y controles.
La mayor prevalencia de Giardia en Borbón es probablemente el resultado de las diferencias en el diseño
del estudio entre los sitios. Las muestras de Guamaní provienen de individuos que asisten a un centro de
salud; mientras que las muestras de Borbón provenían de una vigilancia activa dentro de la comunidad.
Además, una sola infección con Giardia no se asoció con diarrea en ninguno de los entornos, lo que es
consistente con los hallazgos de una revisión sistemática publicada recientemente. 42 A diferencia de las
infecciones únicas, una coinfección con Giardia y rotavirus se asoció con diarrea en nuestro medio rural.
Esto está de acuerdo con dos estudios previos, uno realizado en nuestra región de estudio 16 y el otro en
Israel. 43 Las infecciones por Giardia también ocurren en una gran proporción de individuos con síntomas
subclínicos o leves.

Campylobacter coli y C. jejuni se aislaron en mayor número en la comunidad urbana tanto en los casos
como en los controles, y por lo tanto no se asociaron con diarrea. Ni ETEC ni Shigellae y EPEC se
asociaron significativamente con la diarrea en nuestro entorno rural. Los datos recopilados de los últimos
10 años en el mismo sitio rural mostraron una asociación constante de estos tres patógenos con la diarrea.
14
Los factores ambientales, como el clima 14 , 44 o la reducción de la virulencia de los patógenos que
circulan en el momento del estudio, también podrían proporcionar una explicación para la presentación de
los datos. El mayor papel de Shigellae en Guamaní puede ser causado por la alta densidad de población en
el entorno urbano.

Curiosamente, no encontramos ninguna Salmonella no tifus. Aunque esto es consistente con el estudio
GEMS, nuestro bajo tamaño muestral no excluye el hecho de que la Salmonella no tifus ocurre a niveles
más bajos. De hecho, estudios similares en Brasil encontraron Salmonella spp. No tifus. en muestras de
heces diarreogénicas. 45 - 48 Estas discrepancias pueden ser el resultado de las diferencias en la cría de
ganado o de otras características ambientales que puedan afectar la transmisión de este patógeno intestinal.

Aunque solo aislábamos C. parvum en dos muestras en Guamaní y cuatro muestras en Borbón, es
interesante que las seis muestras provinieran de casos de niños <5 años de edad. Por lo tanto, en Borbón, 4
de los 21 casos fueron positivos para C. parvum . En comparación, 3 de los 21 casos fueron positivos para
el rotavirus, lo que sugiere que C. parvum es un importante patógeno en esta zona rural de Ecuador. Esto es
en general coherente con el estudio GEMS, que se centró en niños <5 años de edad. La importancia de C.
parvum como causa de diarrea disminuyó significativamente después de los 2 años en los datos de GEMS,
lo que demuestra que es menos probable que este patógeno cause enfermedad en niños mayores. Una
distinción importante entre el estudio GEMS y el nuestro es que no utilizamos una escala de gravedad para
aislar los casos; sin embargo, asumimos que los casos clínicos de Guamaní (urbanos) fueron generalmente
más severos que los casos de la comunidad Borbón (rural).

Se observaron altas tasas de portadores asintomáticos de patógenos intestinales en los dos lugares (27% en
Guamaní y 18% en Borbón). El transporte asintomático puede ser causado por varios factores, incluyendo
la patogenicidad de la cepa, la inmunidad del huésped contra los factores patógenos, la microbiota
intestinal y la inmunidad de la manada. 5 , 49 , 50 Campylobacter spp. Asintomático. el transporte entre
personas que viven en países de América Latina se ha documentado desde fines de la década de 1980 51 ;
específicamente, el transporte de C. coli se ha documentado entre las personas que viven o se ocupan de
cerdos, ovejas o pollos. 52 , 53 Estos hallazgos respaldan la hipótesis de que Campylobacter spp. está
presente en entornos donde las personas viven muy cerca de los animales y en malas condiciones de
saneamiento. 51

Algunas de las discrepancias entre los entornos rurales y urbanos podrían explicarse por las diferencias
ecológicas. Guamaní se encuentra en los Andes a una altura de 2.700 m, tiene poca humedad y se
recolectaron muestras durante la temporada de lluvias. Borbón se encuentra cerca de la costa (baja
elevación y alta humedad) y se obtuvieron muestras durante la estación seca.

Nuestra tasa de detección de patógenos entre los casos en este estudio, 51% en el área urbana y 62% en el
área rural, es consistente con estudios similares en América del Sur (13.1% a 62.2%) 46 , 54 y Ecuador (27%
a 65%, Tabla 1 ). Hay una variedad de razones para no poder explicar el 100% de los casos de diarrea.
Primero, no todos los casos fueron de origen infeccioso. Segundo, utilizamos procedimientos de
diagnóstico que tenían limitaciones de sensibilidad. Nuestros resultados difieren de GEMS, posiblemente
porque nuestros procedimientos y reactivos (como los kits de EIA) fueron diferentes y nuestros tamaños de
muestra fueron significativamente más pequeños. Además, no investigamos todos los patógenos
potenciales incluidos en el estudio GEMS como adenovirus, Yersinia enterocolitica , infecciones por
Clostridium perfringens o enterotoxinas ( Staphylococcus aureus o Bacillus cereus ).

Este estudio confirma que en Ecuador, un subconjunto pequeño y consistente de patógenos, incluyendo
rotavirus y E. coli patógena, son las principales causas de diarrea. Sin embargo, el conjunto específico de
agentes etiológicos importantes varía según el entorno urbano / rural, el nivel socioeconómico y otros
factores ambientales importantes. Por lo tanto, los estudios etiológicos específicos del sitio pueden ayudar a
informar intervenciones específicas y estrategias de control.
EXPRESIONES DE GRATITUD

Agradecemos a los participantes que fueron incluidos en esta investigación, y a los médicos y enfermeras
del Centro de Salud de Guamaní, Quito, Ecuador por su contribución al reclutamiento de los participantes.
También agradecemos a Aimee Miller por su ayuda en la coordinación del estudio, y a Darlene Bhavnani y
Velma Lopez por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito.