Partea 1-a

SISTEMUL IMUN
Curs 1. Sistemul Imun

Organismul animalelor şi omului, în decursul evoluţiei şi-a „construit" un sistem de apărare foarte
eficient pentru a putea rezista atacului numeroaselor micro-organisme care tind să-l dezorganizeze sau a
pătrunderii în interiorul său a structurilor străine, care-i pot modifica integritatea funcţională. El se
numeşte sistemul imun. Sarcina acestuia este să protejeze intacte structurile proprii (self) şi să le
elimine pe cele străine.
In ansamblul său sistemul imun este compus din organe specifice şi organe nespecifice. Organele
nespecifice sunt: pielea şi mucoasele, iar cele specifice sunt celulele şi moleculele specializate
pentru apărare.
Sistemul imun este structurat pe nivele de eficienţă
■ Primul nivel de apărare
Prima barieră care se opune pătrunderii structurilor străine în organismul propriu este pielea, care
apară organismul de „intruşi" pe dinafară, precum şi mucoasele care apără organismul pe dinăuntrul
tuburilor care străbat organismul (tubul digestiv, respirator, urinar, genital, urechi, ochi), împotriva
moleculelor străine şi a micro-organismelor (bacterii, fungi, virusuri, paraziţi).
Pentru aceasta organismul şi-a „construit", prin evoluţie, mai multe linii sau bariere de apărare.
Pielea separă organismul de mediul înconjurător opunându-se în acest fel la invazia
microorganismelor şi a moleculelor străine. Ea poate realiza acest lucru deoarece este formată din
celule epiteliaie care se ataşează solidar, una de alta, formând o "cuirasă" impenetrabilă pentru
intruşi. Numai leziunile care pot să apară velul ei pot să devină „poarta" de intrare pentru structurile
străine (nonself). Pielea se opune invaziei microorganismelor şi cu ajutorul produsului de secreţie a
glandelor sebacee numit sebum. El, de regulă, are un pH = 3-5 creat de către acizii graşi şi acidul
lactic care se găseşte din abundenţă în sebum.
Mucoasele care căptuşesc structurile tubulare (aparatul respirator, digestiv, genito-urinar, ureche)
apără organismul de invazia structurilor străine pe aceiaşi cale ca şi pielea: a) prin alcătuirea ţesutului
epitelial care formează o structură de suprafaţă impermeabilă precum şi b) prin secreţiile care le elaborează
aşa cum sunt: saliva, mile, mucusul. Ele, au nu numai, proprietatea de-a spăla lumenul tuburilor de
eventualii invadatori, dar au şi capacitatea de-a fi bactericide (conţin substanţe antibacteriene şi
antivirale). Mucusul vâscos secretat de către celulele epiteliaie specializate numite celule calciforme are
proprietatea de-a îngloba intruşii (micro-organisme, praf etc.) şi ai elimina în afara organismului cu
ajutorul cililor vibratili care se găsesc în unele regiuni ale tractului respirator, oviduct etc.
 Al doilea nivel de apărare
Este compus din: 1) leucocite şi 2) molecule diverse. Atât celulele cât şi moleculele sunt
răspândite în organism în toate ţesuturile, cu sarcina de-al apăra împotriva infecţiilor şi de a-1
proteja împotriva multiplicării nefireşti ale celulelor proprii care au suferit mutaţii devenind
canceroase.
Caracteristica fundamentală a celulelor şi moleculelor sistemului imun este capacitatea de-a
recunoaşte şi a face distincţie între celulele şi moleculele proprii numite self şi cele străine numite
nonself. Celulele şi moleculele sistemului imun recunosc intrusul după structura moleculelor care
compun membrana acestuia, dacă este un microorganism sau sunt celule izolate, precum şi după
structura moleculei însăşi, dacă ea este suficient de mare. Orice structură care este în stare să
provoace un răspuns imun se numeşte antigen. Recunoaşterea structurilor străine are loc indiferent
că acestea sunt izolate sau dacă sunt legate de altele într-un complex.
Dacă structurile străine trec bariera constituită din piele şi mucoasă, atunci apărarea organismului
este preluată de către sistemul imun celular şi molecular, din cea de-a doua linie de apărare. Acesta, în
contact cu invadatorul, se activează şi intră în funcţiune realizând un răspuns imun menit să blocheze
şi apoi să distrugă şi să elimine din organism structurile străine nonself.
Răspunsul imun are rolul, nu numai să distrugă şi să elimine intrusul intrat în momentul respectiv în
organism, ci şi să sensibilizeze. întregul organism, asupra structurii moleculare a invadatorului,
pentru al putea recunoaşte prompt şi mai ales pentru a putea să lupte cu el, cu mai multă eficientă
atunci când agresorul revine din nou. Se poate spune, cu alte cuvinte, că răspunsul imun are menirea să
creeze organismului o anumită rezistenţă împotriva structurilor străine cu care a venit în contact. In
termeni imunologiei această proprietate se numeşte imunitate.

1.1. Caracteristicile sistemului imun

Prima caracteristică a sistemului imun este specificitatea
Imunitatea pe care o capătă organismul împotriva moleculelor străine este strict specifică. Ea poate
recunoaşte doar structurile microorganismului respectiv nu şi ale rudelor sale. O astfel de proprietate se
numeşte specificitate. Specificitatea este una din proprietăţile fundamentale ale sistemului imun. De
exemplu, dacă un copil s-a îmbolnăvit de pojar el nu va mai face boala toată viaţa, deoarece organismul a
memorat caracteristicile moleculare ale microorganismului care produce boala. Pe această bază celulele
sistemului imun îl vor recunoaşte, cu ajutorul receptorilor de antigen de pe suprafaţa lor. Fiecare tip
de limfocit are proprii săi receptori de antigeni cu ajutorul cărora pot discerne structurile self de cele
nonself pe deoparte şi specificul molecular al fiecărui antigen pe de altă parte. Ei se numesc receptori de
antigeni, pentru limfociţii T şi imunoglobuline (anticorpi) pentru limfocitele B.
 O altă caracteristică a sistemul imun este marea sa diversitate
Aceasta înseamnă că el poate recunoaşte orice structură organică cu moleculă mare din natură şi este
capabil să elaboreze anticorpi complementari ca structură împotriva lui. Reacţia imună se înfăptuieşte mai
ales împotriva microorganismelor agresive şi virulente şi numai în mică măsură împotriva unui
microorganism cu activitate virulentă atenuată. De exemplu: bacteriile omorâte sau virusurile cu activitate
diminuată, deşi provoacă reacţie imună, ea nu este aşa de dramatică ca şi atunci când în organism pătrunde
bacteria vie şi virulentă sau virusul viu. Subliniem că procesul de vaccinare a animalelor şi oamenilor
împotriva microorganismelor infecţioase se bazează pe această proprietate de reacţie a sistemului imun.

1.2. Sistemul imun este compus din celule şi molecule

Din motive de eficienţă, precum şi din motive de economie în consumul de energie, sistemul imun are
două componente şi anume:
1) Sistemul imun celular, care este mai prompt şi mai eficient, dar care este şi un mare consumator de
energie.
2) Sistemul imun molecular, care este mai lent, dar mai precis şi mai economic energetic în realizarea
obiectivelor sale.
Imunitatea mediată celular realizată de către leucocitele organismului este prezentă în toate locurile şi în
toate ţesuturile organismului. Ea are sarcina de-a sesiza, recepţiona şi distruge, încă de la locul de intrare
structurile străine sau nonself. Numărul mare de celule care provin din diviziuni repetate, ca urmare a
instalării inflamaţiei, sunt mari consumatoare de energie.
Imunitatea mediată de către molecule este denumită şi imunitate umorală, deorece ea supraveghează
umorile (lichidele) organismului împotriva intruşilor. Eficienţa ei provine din faptul că moleculele din sânge
sau limfă pot să scalde toate celulele şi structurile din componenţa ţesuturilor, supraveghându-le puritatea
mediului care le înconjoară. Imunitatea datorată moleculelor este avantajoasă pentru organism, din punct de
vedere termodinamic, deoarece durata lor de viaţă este mai lungă şi în consecinţă consumul de energie este
mai mic.

1.2.1. Imunitatea mediată celular

Este asigurată de către leucocite. Termenul de leucocite cuprinde: 1) elemente mieloide sau granulocite
sau polimorfonucleare (neutrofile, bazofile şi acidofile), 2) elemente limfatice reprezentate de către limfocitul
T şi B, 3) elemente mononucleare reprezentate de către monocite care constituie sistemul reticulo-histiocitar.
Tipurile de celule implicate în apărarea organismului
Macrofagele sau monocitul. Se găseşte în piele şi alte ţesuturi. El se formează în măduva hematogenă din
celula stern mieloidă. În acest loc el trece prin stadiul de monoblast. şi promonocit după care se transformă în
monocit. Atunci când părăseşte măduva hematogenă şi ajunge în sânge el se găseşte în stadiu de monocit.
Sediul său final nu este însă sângele, ci ţesuturile. În aceste locuri monocitul îşi îndeplineşte
adevărata menire de „paznic" al integrităţii sectorului de care "răspunde". În acest stadiu monocitul
este matur şi poartă denumirea de macrofag, capabil să recunoască structurile nonself, precum şi să le
fagociteze. In funcţie de ţesutului unde macrofagul ajunge şi-şi îndeplineşte datoria de apărător al
locului respectiv, el ia denumiri diferite. Dacă ajunge în pulmon el devine macrofag alveolar, dacă el
se implantează în ficat devine celulă Kupffer, iar dacă ajunge în creier el devine celulă glială. (Fig.3
şi 4)
Funcţiile macrofagelor
Macrofagele (monociţi maturizaţi în ţesuturi) au proprietatea de a recunoaşte prin intermediul
receptorilor de membrană antigene nonself. Ele formează prime barieră de apărare împotriva
intruşilor, în structura pielii şi a mucoaselor. Ele recunos structurile străine şi le fagocitează cu ajutorul
lizosomilor (enzime proteolitice) Structurile nonself (de regulă proteine complexe) fagocitate sunt
uneori fragmentaţi până la stadiul de aminoacizi şi glucide simple (oze). Dacă atacul intruşilor eşti
masiv, macrofagele şi celulele dendritice fragmentează antigenul în porţiuni mai mici numite peptide
şi le leagă apoi separat de moleculele MHC clasa II, formând în acest fel complexe peptide - MHC pe
care apoi le afişează pe suprafaţa membrane Numai în această stare structurile nonself pot să fie
recunoscute de către limfocitele T care se activează şi se transformă în limfocite T-helper, limfocite
citotoxice și limfocită de memorie.
Celulele dendridice sunt prezente în ţesuturile limfoide precum şi în ţesuturile nelimfoide. Când
se găsesc în epiteliul pielii ele poartă denumirea de celu Langerhans. Ele au o formă specială şi
posedă prelungiri dendridice de unde le vine şi numele (Fig. 1).

Mitocond
 După contactul cu antigenul nonself, celulele dendritice au proprietatea de a trimite semnale de activare
pentru celulele T inactive, determinându-le să se transforme în limfoblaste şi de acolo în celule specializate, aşa
cum sunt: limfocitele T-helper, limfocite T-citotoxice şi limfocitele T de memorie.
Celulele Natural killer fac parte din grupul limfocitelor şi sunt specializate în depistarea celulelor proprii care
au suferit modificări consecutive infecţiilor virale sau a celor care şi-au pierdut capacitatea de-a urma tiparul
(patternul) unei diviziuni normale aşa cum sunt celulele neoplazice (canceroase). Celulele Natural killer au
misiunea de-a le recunoaşte pe acestea şi de-a le distruge, prin fagocitare, limitând în acest fel dezvoltarea
procesului infecţios (cu virusuri) sau a celui neoplazic (canceros).
Limfocitul B. Se numeşte limfocit B deoarece a fost identificat prima dată în Bursa lui Fabricius de la
păsări.
La mamiferele adulte limfocitul B provine din celula stem limfoidă şi îşi începe dezvoltarea în măduva
hematogenă. El trece prin mai multe stadii de dezvoltare după care este vărsat în sânge. Stadiile pe care le
parcurge sunt următoarele: celule stem pluripotente —>proBl—>proBll —>B-imatur —> B-matur (Fig. 3 şi 4).
■ Funcţiile limfocitului B
Limfocitele B mature au rol de a supraveghea puritatea umorilor organismului, cu ajutorul anticorpilor pe
care-i sintetizează.
Când limfocitul B este vărsat în sânge el se găseşte în stadiul de limfocit de repaus după care trece în
limfoblast. Când limfoblastul recunoaşte o structură străină el capătă o informaţie pe care o transformă în
semnal. Acesta este apoi condus la nucleu unde se elaborează răspunsul. Rezultatul va fi transformarea
limfoblastului în plasmocit şi în celule de memorie
Plasmocitul este capabil să sintetizeze anticorpi, iar limfocitul B de memorie este capabil să recunoască mai
târziu, cu uşurinţă, antigenul cu care a venit în contact şi s-a declanşat conflictul.
Să se reţină că în fiecare etapă ontogenetică a limfocitului B, pe parcursul . clului celular al diviziunii, au
loc rearanjamente multiple ale segmentelor cromo-somale. Acesta are ca urmare producerea unei variaţii
aproape infinită de tipuri de limfocite B, capabile să sintetizeze anticorpi împotriva oricărui antigen.
Receptorii de membrană ai limfocitelor B sunt imunoglobuline sau anticorp.
Receptorii de antigeni ai limfocitelor B au structură şi aşezare în membrană, foarte asemănătoare cu a
receptorilor de antigeni ai limfocitelor T. De aceia ei pot sesiza antigenele nonself din umori, şi să se cupleze
cu ele. Dimpotrivă receptorii limfocitelor T sunt imunoglobuline, molecule proteice proprii cu ajutorul cărora
pot recunoaşte numai complexe peptidice cuplate cu molecule MHC.
Limfocitul T are rol de apărare pentru toate ţesuturile organismului. El are o ontogenie diferită de a
limfocitelor B. Precursorii acestora părăsesc măduva hematogenă, ajung în sânge şi intră în timus unde se
desfăşoară diferenţierea lor până la celulele T mature. Din această cauză el se mai numeşte şi limfocit T. (a
fost identificat prima dată în timus).
 Limfocitul T matur - participă la procesul imun numai după ce receptorii Iui au venit în contact cu complexul
u
peptide-molecule MHC clasa II", afişate pe suprafaţa ..celulelor prezentatoare de antigeni" (macrofage,
celule dendritice).
Semnalul care se naşte dintr-un astfel de contact are darul să iniţieze transfor-marea limfocitului T "naiv" în
limfocit T helper, limfocit T citotoxic, limfocit T de memorie şi limfocit T supresor. Împreună participă la
exacerbarea funcţiilor de apărare a tuturor celulelor şi moleculelor implicate în sistemul de apărare a
organismului.
Subliniem că în fiecare stadiu ontogenetic limfocitele T, prin recombinare genetică, achiziţionează noi
receptori de membrană necesari recunoaşterii antigenelor seif şi nonself. Limfocitele T în, decursul ontogenezei
lor, sintetizează receptori de antigeni (denumiţi CD3, CD4; CD8 şi aşa mai departe) care se aşează transversal în
cuprinsul membranar. Aici receptorii de membrană formează trei domenii şi anume: a) extracelular, b)
intramembranar şi c) intracitoplasmatic. Prin intermediul receptorilor limfocitele T recunosc moleculele seif şi
nonself. Acestea acţionează în calitate de liganzi pentru receptorii de antigen pe care îi transformă în semnale şi
care apoi sunt duse la nucleul celulei. Aici operoanele genelor implicate în răspunsul imun sunt puse în
funcţiune. Se sintetizează, prin transcripţia genei, fie ARN-m, pe baza căruia după ce au ajuns în citoplasmă se
sintetizează proteine, fie că se declanşează o nouă diviziune celulară de diferenţiere. Printr-un astfel de
mecanism i-au naştere limfocitele T-helper (CD4+) limfocitele T citotoxice (CD8) sau celulele T de memorie.
Leucocitele polimorfo-nucleare - sunt celule mari cu nucleul segmentat din care cauză mai este denumit
şi nucleu polimorfe. Citoplasmă este în cantitate mare şi plină cu granulaţii care se colorează diferit în funcţie
de tipul acestora. Din această cauză se mai numesc şi granulocite polimorfonucleare. Celulele polimorfo-
nucleare a căror granulaţii citoplasmatice se colorează în roşu poartă numele de leucocite acidofile. Celulele a
căror granulaţii citoplasmatice se colorează în albastru poartă numele de leucocite bazofile, iar cele care au
granulaţii multe şi mărunte cu coloraţie slab violet se numesc leucocite neutrofile. (Fig. 3 şi 4).
■ Funcţiile leucocitelor polimorfonucleare
Granulocitele polimorfonucleare neutrofile au capacitate de fagocitare şi participă intens la declanşarea
şi menţinerea procesului imun. In acest fel neutrofilele, care sunt predominante în circulaţie, sunt implicate în
apărarea nespecifică şi în etapa iniţială a răspunsului inflamator, imediat după ce intrusul nonself a pătruns în
organism. Ele sunt capabile să înglobeze, prin fagocitoză şi endocitoză bacteriile şi alte substanţe extracelulare
grosiere şi prin pinocitoză moleculele nonself. Polimorfo-nuclearele participă activ la purificarea locului unde a
avut loc un conflict între antigen şi anticorp. Din această cauză granulocitele neutrofile se mai numesc şi "gunoier
ai organismului.
Granulocitele polimorfo-nucleare acidofile (eozinofile), deşi au o capacitate redusă de fagocitoză, ele pot
totuşi îngloba, selectiv, substanţe de origine bacteriană, precum şi complexe antigen-anticorp în stare de
precipitat sau de aglutinate. Prin această activitate şi acest tip de granulocite participă la curăţirea locului de
conflict. După endocitare substanţele internalizate în celule sunt distruse de către enzimele hidrolitice conţinute în
granulele citoplasmatice. Polimorfo-nuclearele acidofile sunt implicate puternic în apărarea organismului
contra paraziţilor precum şi în procesele alergice.
 Granulocitele (polifmorfonucleare) bazofile, după trecerea lor din măduva în sânge se localizează
predominant la nivelul mucoaselor şi a pielii. Ele sunt implicate puternic în declanşarea şi menţinerea
alergiei. Forma matură a bazofilului se numeşte mastocit şi participă la menţinerea procesului inflamator,
consecutiv pătrunderii non-selfului în organism, precum şi la declanşarea reacţiei de hiper-sensibilitate
mediată de .munoglobulina E. Antigenii nonself iniţiază degranularea mastocitului şi a mediatorilor
preformaţi (histamina, activatori ai cascadei complemen-tului, enzime proteolitice, ractor chemotactici pentru
celelalte tipuri de granulocite), care după ce se cuplează cu imunoglobulinele E, produc efecte vasomotorii şi
constricţii ale musculaturii netede care participă la declanşarea şi menţinerea alergiei şi şocului anafilactic.
Toate celulele sistemului imun au origine comună
Toate celulele sangvine, provin printr-un proces de diferenţiere care are loc în măduva osoasă
hematogenă, denumit şi procesul de hematogeneză (procesul de formare a sângelui).
Celulele hematopoetice din măduva hematogenă sunt celule totipotente care pot da naştere, prin
diferenţiere, tuturor tipurilor de celule albe (leucocite) şi roşii (hematii şi trombocite). Din această cauză
celulele totipotente se mai numesc şi celule hematopoetice. Ele sunt celulele originare care dau naştere prin
diviziuni succesive, de un anumit fel, tuturor tipurilor de celule care participă la procesul imun al
organismului. O celulă stem se poate divide în două feluri şi anume:
a) una care dă naştere la celule asemănătoare cu ea şi care serveşte la replicarea (înmulţirea) acestora
b) şi alta care duce la producerea de celule modificate genetic (recombinate genetic sau diferenţiate).
Acestea din urmă devin originea linilor celulare noi care dau naştere, prin hematopoieză, la limfocite,
monocite, polimorfo-nucleare, hematii, trombocite. Reiese de aici că celulele sistemului imun parcurg ciclul
celular pe două căi: una care serveşte la reînnoirea acestora şi alta care are capacitatea să de-a naştere, prin
hematopoeză, la toate tipurile sau liniile leucocitare (Fig. 2).
 Ontogenia celulelor sistemului imun
Toate celulele sangvine, atât leucocitele, cât şi hematiile sau trombocitele (plachetele sangvine) provin din
două tipuri de celule precursoare denumite celule stem hematoformatoare. Acestea sunt: 1) celula stem
mieloidă şi 2) celula stem limfoidă
Din celula stem mieloidă, componentă a măduvei hematogene din oase, pe parcursul ontogeniei
organismului, iau naştere leucocitele mononucleare, leucocitele polimorfonucleare, hematiile (eritrocitele) şi
trombocitele.
Din celula stem limfoidă iau naştere 1) limfocitele B şi 2) limfocitele T şi 3) celulele Natural Killer (ele
ucid celulele organismului propriu care au suferit modificări esenţiale aşa cum sunt cele infectate cu virusuri
sau celulele canceroase).
 Liniile celulare din organele hematoformatoare (măduva) până ajung la starea adultă, aşa cum pot fi
observate în sânge sau în ţesuturi, parcurg un proces de maturizare lung câştigat pe parcursul unor diviziuni
speciale succesive.
În prima linie de apărare imunologică în piele, mucoase şi ganglioni limfatici, se mai găsesc în afară de
macrofage încă două tipuri de celule. Acestea sunt celulele dendritice şi celulele Natural Killer cu rol esenţial
în menţinerea integrităţii funcţionale de apărare a organismului.
În figura 3 redăm, sumar, o schemă a ontogeniei fiecărei linii celulare implicată în procesul imun al
organismului.
In figura 4 redăm, o schemă, sumară a organelor (ţesuturi) unde se petrece ontogonia tuturor celulelor care
participă la alcătuirea sistemului imun.
 □ La producerea şi maturizarea celulelor sistemului imun participă, în mod esenţial şi ţesuturile
limfoide
Se cunosc două feluri de ţesuturi limfoide:
1) Ţesutul limfoid primar format din măduva oaselor, timusul, bursa lui Fabricus (doar la păsări) şi plăcile
Peyer din mucoasa intestinului la oaie.
2) Ţesutul limfoid secundar format din nodulii limfatici, ţesuturile limfoide din mucoasa intestinală,
amigdale şi adenoizi. Aici celulele sistemului imun primesc diferite semnale de la structurile specifice acestor
organe care declanşează procesul de diferenţiere şi de activare (maturizare) sau care declanşează contacte
între tipurile de celule.

1.2.2. Activarea celulelor sistemului imun

In organismul neatacat de intruşi, limfocitele se găsesc în stare inactivă şi în consecinţă nu participă la
elaborarea unui răspuns imun. Atunci când, într-un anumit loc din organism a pătruns un intrus (virus,
bacterie, molecule mari) celulele sistemului imun se activează şi încep să-şi exercite funcţiile lor specifice.
După activare, limofocitele se divid, proliferează şi produc un număr mare de descendenţi, formând ceea ce
se numeşte o clonă celulară. Fiecare tip de celulă implicată în procesul imun dă naştere unei clone. Un astfel
de proces se numeşte expansiune clonală. Procesul de expansiune clonală decurge corespunzător fazelor
ciclului celular al unei celule intrată în diviziune. Aceasta înseamnă că celule stimulate sunt scoase din faza
Go şi forţate să parcurgă fazele Gl, G2, Sl, şi faza M a ciclului celular. La sfârşitul unui astfel de proces de
activare, descendentele care rezultă se numesc celule blaste sau limfoblaste, şi care au proprietatea de-aşi
exercita funcţia lor specifică. De exemplu:
Limfocitele T activate dau naştere la celule T helper, care vor ajuta prin intermediul citokinelor intrarea
în funcţiune a tuturor celulelor implicate în reacţia imună, precum şi la celule citotoxice, celule de memorie şi
supresoare.
Celulele B se vor activa şi vor da naştere la plasmociţi, care vor sintetiza anticorpi împotriva intrusului,
neutralizându-l. Dacă intrusul a fost un virus, celulele T citotoxice, descendente ale limfocitului "T naiv",
devin active, şi în consecinţă vor recunoaşte celula infectată şi o va ucide.
■ Şi alte celule ale sistemului imun pot fi activate în cursul reacţiei sistemului imun Macrofagele, de
exemplu, excitate de celulele T helper care elaborează citokine, se activează şi devin mai "vigilente" şi mai
citotoxice pentru structurile non-self sau pentru celulele modificate, datorită infecţiei virale sau a unui proces
de cancerogeneză. După ce intrusul a fost neutralizat şi apoi distrus, limfocitele revin din nou la stare de
inactivitate. Numai unele dintre ele, aşa numitele celule de memorie continuă să se extindă, ca număr, în
scopul de-a fi pregătite în orice moment să respingă intrusul la un nou contact cu acesta.
 1.3. Antigene şi receptori de antigeni
Răspunsul imun realizat împotriva unui anumit antigen este specific numai pentru structura respectivă.
Din această cauză acesta mai este denumit şi "răspuns adaptativ". Exemplu - un organism vaccinat împotriva
virusului variolei, devine imun numai împotriva acelui tip de virus şi nu împotriva altuia. Gradul de
specificitate al răspunsului imun este însă remarcabil. El poate sesiza nu numai microorganisme ci chiar şi
izomeri optici ai aceleaşi molecule de aminoacizi.
Sistemul imun este atât de sensibil, de variabil şi are atât de multe posibilităţi, încât el poate recunoaşte şi
discrimina un număr foarte mare de molecule cu structură diferită şi mai ales poate să riposteze, prin sinteza
de anticorpi, împotriva oricăreia dintre ele, chiar daca acestea n-au mai fost în organismul respectiv niciodată
înainte.
Recunoaşterea structurilor non-self de către celulele sistemului imun se realizează printr-o legătură care se
stabileşte, prin intermediul receptorilor de antigen, între membrana acestuia, şi molecula străină, folosind o
cale mai mult sau mai puţin specifică. De exemplu, dacă o celulă se ataşează de alta vom spune că prima
celulă a recunoscut-o şi s-a legat de cea de-a doua. Dacă cele două nu se ataşează la o a treia celulă, vom
spune că a treia celulă nu are elemente de recunoaştere comune cu cele două celule de mai înainte.
Sistemul imun funcţionează după un principiu fundamental şi anume: răspunsul celular la o structură
nonself este, întotdeauna, urmarea unor evenimente de recunoaştere. Mecanismul după care se desfăşoară
procesul respectiv este următorul: când «cunoaşterea între celule şi molecule are loc, în acest moment se
naşte un semnal care este condus în interiorul celulei prin citoplasmă până la nucleu. Aici se elaborează un
răspuns adecvat. Dacă o astfel de celulă este un limfocit B, atunci răspunsul va fi: sinteza unui anticorp
solubil sau dacă aceasta este un limfocit T-citotoxic, răspunsul va consta din sinteza unor molecule toxice
care vor fi în stare să neutralizeze, să ucidă, şi să distrugă partenerul cu care s-a legat. De regulă răspunsul
molecular este şi declanşarea replicării celulelor în scopul de-a deveni mai eficiente prin număr (vezi şi fig.
6).
Elementele cu ajutorul cărora celulele recunosc celulele self sau non-self sunt molecule ataşate pe
suprafaţa membranelor celulelor implicate în sistemul de apărare. Astfel de molecule poartă denumirea de
receptori de antigeni. Ele au o configuraţie structurală complementară moleculelor pe care le poate
recunoaşte şi care se numesc liganzi. Aici liganzii sunt constituiţi din antigeni.
Menţionăm că receptorul, întotdeauna, este specific pentru ligantul său. Când cunoaşterea are loc, ligantul
se ataşează de molecula receptoare analog cu ceea ce se petrece cu cheia şi broasca de uşă. în mod firesc
mărimea şi forma ligantului este întotdeauna egală cu mărimea şi forma moleculei-receptorului.
Subliniem că receptorii sistemului imun (receptorii de antigen) nu pot să recunoască decât un anumit
sector din lungimea moleculei unui ligant. Aceasta, de regulă, constituie particularitatea specifică a
microorganismului sau a moleculei nonself respectivă. Sectoarele recognoscibile (de recunoaştere) ale
moleculelor non-self de către receptori de antigeni poartă denumirea de determinanţi antigenici sau epitopi.
 □ Antigenele şi receptorii de antigen ai limfocitelor
Imensa diversitate şi specificitate a răspunsului imun implică de asemenea şi existenţa unui număr tot
atât de mare de receptori specifici pentru moleculele nonself. Ei sunt aşezaţi pe suprafaţa limfocitelor cu
un capăt în afara membranei şi altul care traversează membrana şi ajunge în citoplasmă. Semnalul iniţiat
pe receptor este preluat de alte molecule citoplasmatice care-1 duc la nucleu pentru a iniţia răspunsul
adecvat: sinteză de proteină sau diviziune sau şi una şi alta.
■ Nu toţi receptorii celulelor imune pot recunoaşte toate structurile străine.
Probabil că fiecare celulă din corp are un număr specific de receptori pentru alte molecule produse de
către alte celule. De exemplu există pe suprafaţa celulelor receptori pentru un tip de factor de creştere
necesar pentru inducerea proliferării celulelor. Există şi alţi receptori care permit celulelor să adere la
alte celule precum şi receptori care le permit celulelor să adere la diferite substraturi etc.
Celulele implicate în reacţia imună posedă, însă, receptori de membrană care pot recunoaşte molecule
străine organismului în care ele se găsesc. Ei se numesc receptori de antigeni.
Receptorii limfocitelor B care sunt capabili să recunoască structurile moleculare străine sunt
anticorpii sau imunoglobulinele. În afară de aceasta anticorpii sintetizaţi de către descendentele
limfocitelor B, numite plasmocite, pot să fie eliberate din celulă şi să rămână sub forma solubilă în
compoziţia plasmei sangvine.
Receptori de membrană ai limfocitele T pentru moleculele străine, au o structură similară cu a
celulelor B. Receptorii de pe suprafaţa limfocitelor T se numesc receptori de antigeni ai celulelor T
(RrT). Ei nu sunt anticorpi ca în cazul celulelor B şi nici nu sunt secretaţi în afara celulei T care îi
sintetizează (Fig.8).
Fiecare tip de limfocit descendent din limfocitul inactiv (naiv) posedă un anumit tip de receptor de
antigeni proveniţi printr-un proces de diferenţiere în decursul ontogeniei Iimfocitului T. Din această
cauză ei mai sunt denumiţi şi grupe de molecule de cito-diferenţiere, sau CD (de la cluster of
diferentiation). De altfel în clinică deosebirea dintre limfocitele T-helper, citotoxice, de memorie şi cele
supresoare se face cu ajutorul anticorpilor monoclonali care recunosc o mulţime de tipuri de receptori de
antigen CD. Limfocitul T inactiv posedă receptori CD3, limfocitul T-helper receptorii CD4, limfocitul T-
citotoxice receptorii CDS etc. Prin urmare, fiecare tip de limfocite T sau B posedă un tip caracteristic şi
specific de receptori de antigeni, similar cu structura receptorilor de membrană, pentru alte structuri
implicate în sistemul imun.
Imunologii numesc „antigene" moleculele care sunt prezente pe suprafaţa celulelor
Un antigen este o moleculă care poate fi recunoscută de către un receptor de antigen de pe membrana
limfocitelor, iniţiind în acest fel sinteza unei molecule de proteină, cu structura complementară, numită
anticorp sau imunoglobulină. Deoarece aceste molecule sunt implicate în realizarea imunităţii, se spune
că antigenele de acest fel posedă proprietate de imunogenitate.
Antigenitate şi imunogenitate
Proprietatea moleculelor antigene de a stimula producerea de anticorpi se numeşte
imunogenitate. De asemenea proprietatea antigenelor de a se combina specifîc cu receptorii de suprafaţă ai
celulelor T şi B se numeşte antigenitate.
Antigenele sunt de două feluri: antigene endogene şi antigene exogene sau alloantigene, după cum acestea
se găsesc în organismul propriu sau în afara lui. Antigenele străine sau exogene sunt recunoscute de către
receptorii specifici ai limfocitelor din care cauză mai sunt denumite şi receptori de antigen.
Toate moleculele imunogene care declanşează producerea de anticorpi posedă și proprietatea de
antigenitate. Aceasta înseamnă că ele pot să se combine specific cu receptorii de suprafaţă ai limfocitelor T şi
B şi să.provoace un răspuns imun.
Există însă şi antigene care pot să recunoască receptorii de antigen (au deci antigenitate) dar care nu sunt
şi imunogene. Astfel de molecule se numesc haptene. Ele nu pot declanşa, singure, un răspuns imun din
cauza dimensiunii prea mici a moleculelor lor. Se consideră că moleculele cu greutate moleculară mai mică
de 300 Da (Daltoni) pot să fie recunoscute de receptorii celulelor T şi B, dar ele nu pot să declanşeze un
răspuns imun. Dacă astfel de molecule se leagă de o moleculă cu greutate mai mare, denumită carrier, atunci
ele pot să devină imunogene, sub formă de complexe haptene + carrier. Limfocitele B (plasmocitele) pot să
recunoască haptenele în această stare complexată şi în consecinţă să determine sinteza de anticorpi împotriva
lor. În acest caz palsmocitele sintetizează anticorpi, atât împotriva haptenei, cât și împotriva moleculei
carrier.
Există însă şi molecule care provoacă în organismul animal şi uman un răspuns umoral sau celular
exagerat aşa cum se întâmplă în manifestările alergice. Astfel de molecule se numesc alergene, iar
capacitatea lor de-a declanşa un răspuns exagerat se numeşte alergogenitate.
Aşadar, se poate afirma că, imunogenitatea este o proprietate a antigenelor care se manifestă în funcţie de
mărimea moleculelor de antigene, de structura lor conformaţională, precum şi de gradul de procesare a
imunogenului de către celulele sistemului imun, de genotipul organismului, de vârstă precum şi de calea de
administrare a antigenului.
■ Determinanţii antigenici sau epitopii
Precizăm din nou că macromolecula de antigen nu poate fi recunoscută de receptorii de antigen ai
celulelor imune pe toată lungimea ei. Aceasta se poate înfăptui numai pe anumite sectoare ale
macromoleculei, de regulă, formată din 10-20 aminoacizi. Sectoarele respective se numesc determinanţi
antigenici sau epitopi. Fiecare receptor de antigen ai limfocitelor poate să recunoască un epitop particular din
lungimea antigenului. Ca urmare şi eficienţa sistemului imun depinde de numărul de determinanți antigenici
pe care-i posedă macromolecula de antigen. Într-un fel răspund celulele unui individ împotriva unei molecule
de antigen şi altfel răspund celulele altui individ sau specie de animal, la contactul cu unul şi acelaşi antigen.
Se întâmplă aceasta deoarece unii indivizi cu genetică diferită nu sunt capabili să elaboreeze un răspuns imun
la un antigen particular, deoarece ei nu-i pot sesiza pe toţi epitopii acestuia.
 ■ Există o diferenţă majoră între tipurile de antigen care pot fi recunoscute de către limfocitele B şi T
Anticorpii receptori ai limfocitelor B precum şi cei care sunt liberi în ser pot să recunoască antigene
solubile sau dizolvate liber în lichidele organismului. Ei pot să recunoască şi proteinele străine din
învelişurile (capsida) virusurilor sau membranele bacteriilor. Acest fel de proteine, cu formă nemodificată, se
numesc, antigene native. Ele pot fi recunoscute numai de către receptorii de antigeni ai membranei
limfocitelor B.
Spre deosebire de acestea, limfocitele T nu pot recunoaşte antigenele native. Ele o pot face însă numai
dacă antigenul străin a fost internalizat (fagocitat) de către un macrofag şi apoi procesat, într-un anumit fel, şi
în cele din urmă prezentat pe suprafaţa membranei acesteia.
Un astfel de antigen se numeşte antigen procesat din cauză că el, după fagocitare, de către macrofagele
(mai numite, din această cauză şi prezentatoare de antigen) a fost fragmentat, de către enzimele proteolitice
ale lizosomilor fagocitelor, în mai multe peptide la care se ataşează molecule MHC clasa a II-a. Complexele
formate din fragmente de antigen şi molecule MHC clasa a II-a, sunt apoi prezentate pe suprafaţa
membranelor celulelor fagocitare. Din această cauză astfel de fagocite se numesc prezentatoare de antigen.
Prin urmare se poate spune că limfocitele B supraveghează faza fluidă a organismului, iar celulele T
monitorizează suprafaţa celulelor corpului pentru antigene străine.
■ Receptorii de antigeni sunt foarte diverşi
Enorma diversitate de anticorpi de pe suprafaţa celulelor B sau care sunt secretaţi în plasma sangvină
precum şi a receptorilor celulelor T, este rezultatul unei recombinări complexe a genelor care codifică
structura primară a proteinelor ce vor deveni receptori de membrană.
Moleculele MHC sunt diverse doar într-o populaţie de oameni sau animale luată în ansamblul ei şi mult
mai puţin diverse în celulele unui singur individ. Explicaţia constă în aceea că genele care codifică
moleculele de proteină MHC nu suferă recombinări în ontogonia celulelor, ci doar mutaţii punctiforme care
au avut loc în ancestralitatea speciei, dând naştere unei serii de polialele şi care alcătuiesc pe populaţie, ceea
ce se numeşte polimorfism proteic. Există două clase de molecule MHC şi anume: - molecule MHC: - clasa I
şi molecule MHC clasa a II-a. Fiecare dintre ele posedă însă funcţii diferite.
1.3.1. Selecţia clonală a receptorilor de antigeni
Descifrarea genomului uman a scos în evidenţă că oamenii nu posedă mai mult de 35.000 gene, iar
animalele nu mai mult de 25.000. In natură există, însă, mai multe milioane de tipuri de antigeni. Cum este
posibil, ca sistemul imun al omului şi a animalelor domestice să poată sintetiza aşa de mulţi anticorpi şi
receptori de antigeni (proteine distincte) pentru "a satura" multi-milioanele de antigeni existenţi în natură?
Concluzia la care ajungem, prin logică, este următoarea: în genomul uman şi animal nu pot exista pentru
fiecare antigen din natură, câte o genă specială, care să poată sintetiza un anticorp sau un antigen pentru
fiecare dintre ei. Reiese de aici că organismul animal trebuie să posede un sistem genetic special care să-i
permită să sintetizeze o variabilitate infinită de proteine, anticorpi sau receptori de antigeni ai membranelor.
 Genomul oamenilor sau a animalelor posedă un astfel de sistem care înfăptuieşte diversitatea anticorpilor
şi receptorilor de antigen. Ele se realizează prin recombinare genetică care are loc în limfocitele B şi T, pe
parcursul procesului lor de ontogeneză, de la celula stem la celula funcţională reactivă.
Se ştie, în prezent, că receptorii de antigen de pe suprafaţa limfocitelor B «anticorpii) şi a limfocitelor T
sunt preformaţi în celulele cap de serie şi sunt prezenţi în organism chiar şi înainte ca antigenul să fi pătruns
în interiorul acestuia. Cu alte cuvinte, în măduva hematogenă există un imens număr de receptori de antigeni
gata făcuți în timpul vieţii fetale.
Atunci când în organism pătrunde un antigen străin (nonself) acesta este recunoscut de celula "cap de
serie" care posedă receptorul de antigen, gata făcut (preformat) şi-l selecţionează. Ca urmare celula se
activează şi intră în diviziune dând naștere unei clone de astfel de celule. Numărul mare al acestora reuşeşte
să anihileze intruşii mai puţin virulenţi şi mai puţin numeroşi. Un astfel de proces poartă denumirea de
selecţie clonală a elementelor sistemului imun (Fig.5).

Să ne punem următoarea întrebare: un limfocit posedă, oare, mai mulţi receptori pe suprafaţa membranei
sale sau fiecare dintre ei posedă numai un tip de antigen pentru un anumit epitop ? Răspunsul corect este
următorul: Se pare că receptorii de antigen ai fiecărui limfocit sunt specifici numai pentru un anumit
determinant antigenic, chiar dacă aceştia sunt prezenţi în sute de mii de copii, pentru fiecare tip de celulă.
Receptorii limfocitelor trebuie să fie distribuiţi clonal. Cu alte cuvinte se poate spune că fiecare tip de clonă
de limfocite, posedă propriul său tip de receptor de antigen.
Reiese de aici că într-o clonă pot exista mii de limfociţi care posedă, fiecare, acelaşi receptor de antigen
(anticorp).
Faptul că receptorii de antigen sunt distribuiţi clonal conferă o mare eficienţă sistemului imun în
totalitatea sa. Dimpotrivă dacă fiecare limfocit ar recunoaşte mai mulţi antigeni, din capsida unui anumit
virus, de exemplu, atunci într-o astfel de reacţie s-ar implica toate limfocitele din corp numai în lupta cu acest
tip de virus. Trebuie să recunoaştem că un astfel de mecanism ar constitui un răspuns insuficient şi o inutilă
risipă de energie.
Dacă numai un număr limitat de limfocite răspund la un anumit tip de virus (un anumit antigen), eficienţa
în apărare creşte, deoarece celelalte celule, neimplicate în proces, rămân disponibile pentru alte antigene care
ar putea intra simultan în organism.
Distribuţia clonală a receptorilor de antigen pe suprafaţa limfocitelor, presupune să existe în organism un
număr imens de limfocite diferite pentru a genera o aşa de mare diversitate de răspunsuri. Cercetările au
dovedit viabilitatea acestei ipoteze şi au adus dovezi că într-un organism există sute de mii de milioane de
limfocite diferite (cu receptori de antigeni diferiţi). S-a estimat că în organismul omului există 2x1012 (două
sute de mii de miliarde) tipuri de limfocite diferite concentrate în ţesuturile limfoide.
Din cauză că răspunsul imun este atât de divers el poate să genereze anticorpi şi receptori de antigen
împotriva unui număr enorm de mare de epitopi ai antigenelor din natură.
□ Anticorpii mono şi policlonali
In imunologie se folosesc noţiunile de răspuns imun oligoclonal, policlonal sau monoclonal. Semnificaţia
lor este următoarea: un antigen poate selecta puţine clone limfocitare în funcţie de numărul epitopilor pe
care-i posedă .Dacă ei sunt în număr foarte mic, atunci răspunsul imun se numeşte selecţie oligoclonală. Dacă
ei sunt în număr mare răspunsul este policlonal, pentru că implică un număr mare de clone. Un antigen cu un
singur epitop produce selecţia numai a unei singure clone limfocitare din care cauză se numeşte şi răspuns
monoclonal. Din această cauză şi anticorpul care se sintetizează se numeşte anticorp monoclonal.
□ Discriminarea dintre self şi nonself
Sistemul imun recunoaşte şi elimină structurile străine organismului din care ele fac parte. Deoarece prima
funcţie a sistemului imun este funcţia de distrugere a structurilor străine corpului, recunoaşterea a ceea ce
este propriu organismului (self) şi străin acestuia (non self) este esenţială pentru activitatea şi rolul sistemului
imun. Dacă n-ar exista puterea de recunoaştere a ceea ce este propriu, faţă de ceea ce este străin, atunci
răspunsul imun s-ar putea îndrepta împotriva propriilor structuri din organism, având loc o autodistrugere
(boli autoimune).
 Cum se explică toleranța limfocitelor și macrofagelor la moleculele proprii?
Există mai multe căi prin care sistemul imun poate recunoaşte structurile faţă de cele străine. Acestea sunt
următoarele:
1. primă cale ar putea fi că în stadiul embrionar limfocitele care posedă receptori ce interacțonează cu
moleculele proprii, să fie distruse şi eliminate din repertoriul (fondul) de limfocite care posedă
receptori diferiţi. Un astfel de fenomen poartă denumirea de selecţie clonală pentru antigene self.
2. alternativă a unei astfel de căi ar putea fi că acele limfocite preformate care reacţionează cu
moleculele proprii să fie doar inhibate sau represate pentru a nu mai avea capacitatea să dea un
răspuns autoimun. Fenomenul este cunoscut în imunologie sub noţiunea de energie clonală. În
imunologie se spune despre un individ care nu are capacitatea de-a reacţiona, cu moleculele străine
că el posedă toleranţă imunologică.
Oricare ar fi mecanismul producerii toleranţei imunologice la propriile structuri, este cert că acest
fenomen se petrece în faza embrionară, la prima întâlnire a ceculelor proprii cu capul de clonă a limfocitelor,
determinându-le să devină incapabile să reacţioneze cu propriile molecule. Nu poate fi explicat altfel, de ce
atunci când se realizează un transplant de ţesut străin într-un embrion acesta nu este rejectat imunologic, ci
dimpotrivă este acceptat ca pe un ţesut propriu (self).
Cu toate că astfel de fenomene au loc permanent şi obligatoriu în dezvoltarea individului există totuşi unii
oameni la care limfocitele proprii nu pot recunoaşte structurile propriului organism şi în consecinţă
declanşează o reacţie imună împotriva acestora. Asfel de fenomene sunt cunoscute în patologie ca boli
autoimune, de regulă, cu sfârşit letal. Chiar şi alergia sau hipersensibilitatea provine din imposibilitatea
discriminării de către limfocite a structurilor proprii faţă de cele străine, din care cauză ele le şi atacă.
Grefa şi răspunsul imun
În mod normal o anumită proporţie dintre limfocitele T ale animalului pot să recunoască moleculele
străine dintr-o grefă şi să o respingă. Dacă transplantul se face de la un individ la altul din cadrul aceleaşi
specii el se numeşte allogrefă. Rapiditatea rejetului depinde însă de gradul de asemănare genetică dintre
donatorul şi receptorul de grefă. Reacţia imună în acest caz se numeşte alloreactivitate. Recunoaşterea
molecuelor străine (nonself) din ţesuturile unei grefe transplantate la un individ din altă specie se numeşte
xenoreactivitate. Deoarece între specii există o mare diferenţă xenogrefa este rejectată în decurs de 10-12 ore
de la transplantare. In acest caz se spune că rejecţia xenogrefei este hiperacută.
Cum se desfăşoară procesul de recepţie şi răspuns în celulele sistemului imun ?
Celulele sistemului imun (în special limfocitele T şi macrofagele) posedă molecule receptori (antigene) pe
suprafaţa membranelor, capabile să recunoască specific orice moleculă străină (numit ligand sau antigen
nonself) de organismul în în care găseşte. Şi limfocitele B recunosc moleculele străine prin intermediul
anticorpilor care-i sintetizează specific contra alloantigenilor (antigeni străini) şi care sunt nu numai anticorpi
secretaţi în sânge, ci şi componenţi (receptori) ai membranelor celulare.
 Receptorii antigenici ai celulelor sistemului imun (limfocite helper şi citotoxice, macrofage, limfocite B)
sunt, de regulă, proteine cuplate cu monoglucide (glico-proteine) sau cu acizi graşi (lipoproteine) sintetizate
de genele proprii. De regulă dispunerea receptorilor antigenici pe suprafaţa celulei se face cu un capăt în afara
membranei în timp ce celălalt capăt traversează membrana şi se termină în cito-plasma celulei. Rolul lor este
să recunoască antigenii nonself din exteriorul celulei. Când receptorii antigeni se cuplează cu antigenii străini,
ia naştere un impuls molecular care devine un semnal de activare a unor părţi ale celulei. Semnalul care a luat
naştere, după ce a traversat membrana celulară este preluat de alte molecule citoplasmatice numite
transductori care-1 conduc la receptorii din nucleu. Ei sunt proteine care învelesc promotorul operonului de
pe ADN numiţi factori de transcripţie. Dacă ei sunt activaţi, atunci polimeraza ARN de pe promotor intră în
funcţiune şi iniţiază transcripţia informaţiei din genele structurale pe molecula de ARN-mesager care se
naşte. ARN-m este apoi transportat din nucleu în citoplasmă unde are loc translaţia informaţiei pe o moleculă
de proteină care se naşte. Urmarea va fi, ori replicaţia celulei ori sinteza de substanţe noi cum sunt anticorpii
sau o selecţie clonală a celulelor care au reacţionat cu antigenii.
Pentru facilitarea înţelegerii fenomenului, în fig. 6 redăm o schemă care ilustrează felul cum se formează
semnalul după ce receptorii de membrană se cuplează cu ligandul (care poate fi un antigen sau un hormon) şi
pe ce căi este condus până la nucleu.
 1.4. Sistemul imun este de două feluri
Imunitatea organismului este asigurată, deopotrivă, atât de către celule (leucocite), cât și de către
molecule (MHC sau HLA, citochine etc).
Sistemul imun poate fi împărţit în două subdiviziuni: a) sistemul imun înnăscut și sistemul imun
adaptativ.
1.4.1. Sistemul imun înnăscut
Este complet funcţional chiar înaintea pătrunderii în organism a unui agent străin (molecule,
microorganisme), iar activitatea lui este suficient de viguroasă pentru a-l neutraliza şi a-1 elimina.
Sistemul imun adaptativ intră în funcţiune numai dacă "armele" sistemului imun înnăscut nu sunt
suficient de eficiente pentru a distruge moleculele sau microorganismele invadatoare.
În componenţa sistemului imun înăscut intră: celule, molecule din sistemul complement şi reacţia
inflamatorie (inflamaţia). Să le precizăm, succint una după alta.
Celulele care compun "armata" de apărare înnăscută a organismului sunt: fagocitele, celulele natural
killer şi megacariocitele. In grupul de fagocite sunt cuprinse fagocitele mononucleare (macrofagele şi
precursorii lor monocitele sangvine) precum și leucocitele polimorfonucleare sau granulocitele
(neutrofilele, bazofilele și eozinofilele).
Celulele Natural killer pot recunoaşte şi distruge prin fagocitare celulele propriului organism, dar care
au suferit modificări moleculare în urma fagocitării intrușilor (celule infectate cu virusuri, cu bacterii sau
celule tumorale). Megacariocitele care sunt precursorii plachetelor sangvine, participă şi ele la procesul
imun prin implicarea lor în coagularea sângelui şi în inflamaţie.
Moleculele care participă în procesul de imunitate înnăscut sunt cele care compun sistemul
complement şi care sunt solubile în lichidele organismului. Şi fagocitele sunt capabile să producă
molecule solubile (de natură proteică) care mediază procesul imflamator şi care este cel care declanşează
intrarea în funcţiune a întregului sistem de apărare a organismului.
Inflamația
Reacţia organismului la eliminarea structurilor străine sosite prin infecţie (bacterii, virusuri etc.) sau
la reparaţia unor înjurii ale ţesuturilor, constă, mai întâi, mobilizarea macrofagelor. Pentru a-i întări
eficienţa reacţia este sprijinită de încă două evenimente şi anume: producerea inflamaţiei la locul de
conflict şi declanşarea cascadei sisternului complement.
Inflamația constă în aducerea, la locul unde a pătruns microorganismul sau s-a realizat leziunea
ţesutului, a unei cantităţi mai mari de sânge care transportă cu sine, în scop reparatoriu, un număr sporit
de celule, de proteine şi molecule specifice sistemului imun. Prin urmare prima manifestare a inflamaţiei
este vasodilataţia, creșterea permeabilităţii vasculare, pentru a permite difuzia componentelor la locul
înjuriei şi o infiltraţie masivă de celule: macrofage, natural killer, polimorfonucleare, limfocite T şi B. Din
această cauză locul inflamaţiei devine mai cald (calor) roşu (rubor), dureros (dolar) îndurat (tumor) precum
şi pierderea funcţiei normale (funcţia laesa).
 Sistemul complement
Este format dintr-o mulţime de enzime proteolitice plasmatice (notate C1-C9) care intră în funcţiune
în cascadă pe măsură ce se agravează invazia organismului cu intruşi.
Funcţia fundamentală a sistemului complement este de-a contribui la eliminarea antigenilor străini
(intruşilor) din organism şi de-a amplifica activitatea umorală a răspunsului imun (anticorpi, citokine
etc.)
Majoritatea elementelor sistemului complement sunt prezente în plasma sangvină sub formă inactivă
atâta timp cât organismul nu intră în conflict cu structurile străine (nonself). Când înjuria se produce,
fiecare component în parte din sistemul complement este activat contribuind în felul său la reuşita
apărării. Funcţiile sistemului complementar sunt următoarele:
1) opsonizarea sau facilitarea macrofagelor să fagociteze antigenii străini.
2) liza microorganismelor străine pătrunse în ţesuturi.
3) declanşarea inflamaţiei. Activarea cascadei complementului face să crească producţia biologică de
peptide active cu acţiune anafilactică, declanşatoare de evenimente specifice inflamaţiei (aflux mare de
sânge, celule şi proteine la locul de conflict însoţite de o anumită „chemare" a celulelor la locul infecţiei
numită chemotaxis).
4) solubilizarea complexelor rezultate din conflictul antigen-anticorp.
Activarea sistemului complement sau intrarea lui în funcţie poate fi realizată de către complexele care
se formează din reacţia antigen străin-anticorp sau chiar de către unii anticorpi luaţi individual. Activarea
şi inactivarea sistemului complement este supus unui control precis şi foarte sever. In acest mecanism
sunt implicaţi, atât regiunea F2 a anticorpilor care interacţionează cu unul din componenţii sistemului
complement, cât şi activatorii nonimunoglobulinici aşa cum sunt polizaharidele sau zimogenul din
peretele drojdiilor şi a membranei, bacteriilor. Aceste structuri conduc până la urmă, la activarea
imunoglobulinelor şi facilitarea realizări reacţiei antigen-anticorp.
1.4.2. Sistemul imun adaptativ
"Armele" sistemului imun adaptativ sunt: limfocitele (celule) şi anticorpii (molecule).
Celulele care compun sistemul imun adaptativ sunt limfocitele T şi descendentele lor: celule T -
Hellper, citotoxice (efectuare) şi de memorie; precum şi limfocitele B şi descendentele lor: plasmocitele
şi celulele de memorie
Moleculele care constituie răspunsul imun adaptativ humoral sunt: anticorpii (imunoglobulinele),
sistemul MHC (pentru animal) sau HLA (pentru oameni) şi citokinele (interleukinele, receptorii
limfocitelor T, interferonii etc.).
 Celulele din componenţa sistemului imun adaptativ prin activitatea lor formează așa numita imunitate
mediată celular.
Să precizăm, din nou, câteva caracteristici ale acestora:
Limfocitele B, ca urmare a unei serii de transformări, sunt produse în măduva hematogenă din aşa
numitele celule stem hematogene. Ajunse în sânge şi ţesuturi limfocitele B sunt activate de către antigeni
nonself şi transformate în plasmocite şi celule de memorie.
Plasmocitele odată formate sunt capabile să sintetizeze şi să elimine în sânge cantități mari de anticorpi,
specifici epitopilor, de pe antigenele nonself invadatoare, facilitând în acest fel distrugerea intrusului.
Limfocitele T la rândul lor deşi nu produc anticorpi, au rol crucial în apărarea organismului. Limfocitele
T sunt, fie regulatoare, fie efectoare ale răspunsului imun. Ele controlează răspunsul imun şi elimină intrusul
"nonself. Majoritatea acestor celule sunt inerte (ineficiente) până când un semnal sau stimul nu le induce
activarea transformându-le în celule Helper, celule citotoxice, supresoare şi de memorie.
Celulele T citotoxice sunt celulele efectoare care recunosc şi ucid celulele infectate sau cele care au suferit
modificări neoplazice.
Celulele T-Hellper sunt celulele regulatoare ale sistemului imun care determină, prin activitatea lor de
informare, ca alte celule ale sistemului imun să devină mai active şi mai eficiente. De exemplu celulele
Hellper ajută celulele precursoare T citotoxice să devină cu adevărat ucigaşe, ajută pe limfocitele B să
sintetizeze mai viguros anticorpi, iar pe macrofage le determină să devină mai active în fagocitoză.
Mai există încă o categorie de limfocite T numite supersoare care sunt în stare să inhibe răspunsul imun,
atunci când pericolul a trecut.
Rezultă de aici că organismul omului, dar şi a animalelor superioare, posedă un sistem imun înnăscut
capabil să apere în prima instanţă intrările inoportune a nonselfului, cu o eficienţă medie. Când sistemul imun
înnăscut nu poate face faţă invazia de structuri "nonself, el însăşi este capabil să declanşeze intrarea în
funcţiune a sistemului imun adaptativ care, este mult mai rapid 'în răspuns şi mult mai eficient.
Răspunsul imun adaptativ este de două feluri: primar şi secundar. Datorită dadelor de memorie răspunsul
secundar este mult mai viguros decât cel primar.
1.4.3. Dinamica răspunsului imun
Are loc ,ori de câte ori, pătrund în organism antigene străine (bacterii, drojdii, virusuri, molecule mari de
proteine, glico şi lipoproteine, poliglucide etc). Răspunsul imun se desfăşoară în două etape şi anume:
A. Răspunsul imun înnăscut
Antigenul străin poate intra în corp când ţesuturile pielii sau a mucoaselor sunt deteriorate. Răspunsul
iniţial al organismului este inflamaţia cu rol extrem de important în declanşarea imunităţii înnăscute.
Consecinţa inflamaţiei este intrarea în funcţiune a componentelor complementului (molecule solubile) şi
recrutarea din sânge, la locul acesteia, a celulelor fagocitare (macrofage, celule dendridice). Bacteriile,
drojdiile după fagocitare pot să fie distruse în interiorul citoplasmei de către lisosomi.
 Complementul mai poate fi activat şi direct de către antigenele de pe suprafaţa microbilor cu urmări, în
declanşarea cascadelor care duce la liza osmotică sau opsonizarea intrusului. Declanşarea cascadelor
complementului activat poate fi evitată dacă microorganismul a fost distrus în afara internalizări lui în
fagocite.
Dacă unele celule ale organismului au fost infectate cu virusuri sau mecanismele lor de înmulţire au fost
deteriorate, atunci astfel de celule îşi schimbă structura moleculară a membranelor şi în consecinţă celulele
Natural kiler le recunosc ca fiind nonself şi le ucid, limitând astfel difuzarea infecţiei sau a procesului
proliferativ deteriorat (neoplazic).
Celulele dendritice specializate în fagocitoză, la nivelul pielii recunosc antigenele nonself de la locul
inflamaţiei pe care le fagocitează. Aceste celule intră în vasele limfatice şi în torentul sangvin şi ajung în
nodulii limfatici, splină sau ţesuturile limfoide unde ele iniţiază răspunsul imun adaptativ.
B. Răspunsul imun adaptativ
Din conflictul care are loc între macrofage şi elementele sistemului complement rezultă două situaţii:
a. antigenul "intrus" este fagocitat şi distrus complet. în acest caz nu mai are loc declanşarea intrării în
funcţiune a sistemului imun adaptativ.
b. antigenul "intrus" mai poate rămâne în fluidele corpului ca şi particule "libere" (suspensie) aşa cum
sunt virionii sau sub forma "solubilă" aşa cum sunt resturile de membrane celulare bacteriene sau toxinele
bacteriene. Acestea din urmă mai pot fi prezente şi în interiorul celulelor care au fagocitat bacteriile,
(macrofage sau celulele dendritice) intrate prin soluţia de continuitate (leziune) de la nivelul pielii sau a
mucoaselor. în acest caz trebuie să intre în funcţiune şi sistemul imun adaptativ (limfocitele T şi B şi
moleculele MHC sau HLA) pentru a desăvârşi procesul de epurare început de sistemul imun înnăscut.
Celulele T nu pot sesiza, ca atare, moleculele de antigen nativ, dar nici pe antigenii care au fost procesaţi
şi aduşi la starea de peptide în interiorul macrofagelor. De aceea a fost necesar ca evoluţia să promoveze un
sistem de prelucrare şi combinare cu alte molecule a antigenelor native după care să le "afişeze" pe
membrana celulelor implicate în primul eşalon de apărare. Aşadar macrofagele şi mai ales celulele dendritice,
care iau primele contact cu antigenele nonself, după ce au fagocitat "intruşii" şi le-a descompus în molecule
scurte (peptide), le leagă de moleculele MHC (pentru animale) sau HLA (pentru oameni) clasa Ii-a, formând
un complex hdHC-peptide nonself'şi le afişează pe suprafaţa membranei, în vederea prezentării lor către
limfocitele T inactive. în această situaţie limfocitele T, prin receptorii lor de membrană, recunosc antigenul
nonself după care se activează. Urmarea acestui fenomen este diferenţierea lor în celule limfocite T-helper,
limfocite T-citotoxice. limfocite T de memorie şi limfocite T-supersoare.
Receptorii de pe membrana limfocitelor T au următoarele roluri:
1. în recunoaşterea antigenului,
2. în activarea celulei, şi în elaborarea unui răspuns.
Astfel, un complex de molecule receptor numit CD3 este asociat cu limfocitele T-naive (neactive). Alte
molecule numite CD4 sunt prezente pe membranele limfocitelor
T Helper, iar moleculele CD8 se găsesc pe membrana celulelor T-citotoxice. Aceste molecule mai poartă
denumirea şi de markeri ai celulelor sau markeri fenotipici, deoarece cu ajutorul lor se pot identifica tipurile
de limfocite T.
Cînd intră în funcţiune sistemul imun adaptativ ?
Iniţierea intrării în funcţiune a răspunsului imun adaptativ este realizată de limfocitele T-Helper. Acest fel
de limfocite T sunt primele care recunosc peptidele rezultate din digestia fagocitelor macrofage şi celule
dendridice. Ele sunt primele care intră în contact cu antigenii nonself. Peptidele rezultate din "digestie" în
citoplasma macrofagelor şi celulelor dendritice, se leagă de moleculele MHC (HLA) formând complexul
MHC-peptide "străine" pe care le afişează pe membrană și le prezintă celulelor T.helper:
Celulele dendridice şi macrofagele care au achiziţionat antigenul străin încă în stadiul de precursor, de
dinaintea ajungerii lor în nodulii limfatici, interacţionează cu antigenii receptori specifici ai celulelor T-
Helper. După recunoaşterea complexului MHC-cl-II de pe suprafaţa celulelor dendridice se naşte un semnal
care se propagă în interiorul celulei T-Helper şi determină activarea acesteia.
Cum acţionează sistemul imun adaptativ ?
Limfocitele T-Helper activându-se devin acum capabile să "ajute" răspunsul prin sinteza şi apoi secreţia
unor molecule solubile în fluidele organismului numite cytokine. Aceste molecule constituie "telefonul"
celular al celulelor T-Helper prin care informează limfocitele B, precursorii limfocitelor T-citotoxice, celulele
Normal-killer şi celulele macrofage "cerându-le" să intre în funcţiune şi să efectueze, cu toată puterea
eliminarea intruşilor patogeni sau nepatogeni nonself.
Cum se obţine ca urmare a intrării în funcţiune a sistemului imun adaptativ ?
Procesul de reacţie decurge în felul următor:
1. Ca urmare a elaborării citokinelor de către imfocitele T -Helper, limfocitele B se activează şi dau
naştere plasmocitelor care sintetizează din plin anticorpi necesari ralizării şi distrugerii "intruşilor".
Unii anticorpi sintetizaţi de către plasmocite se leagă de antigeni şi-i opsonizează pentru a putea fi
mai eficient fagocitate de către macrofage, via receptorii “Fc”ai anticorpilor. Alte clase de anticorpi
când se leagă de antigene pot activa complementul ajutând astfel la liza antigenelor nonself sau la
internalizarea lor de către macrofage, via receptorii de complement ai fagocitelor.
2. Ca urmare a elaborării de citokine de către limfocitele T-Helper, macrofagele devin activate şi în
consecinţă îşi îmbogăţesc dramatic capacitatea de distrugere intra-celulară a antigenilor fagocitaţi şi
de recunoaştere a acestora, fie prin intermediul porţiunii Fc a anticorpilor fie prin intermediul
complementului sau a altor receptori de membrană.
3. Citokinele elaborate de limfocitele T-Helper îmbunătăţesc, de asemenea, sinteza via moleculelor
MHC clasa II-a, din interiorul celulelor prezentatoare de antigen, îmbunătăţind substanţial efectul de
distrugere a nonselfului intracelular precum și contactul şi interacţia directă dintre acestea şi celula T-
Helper.
4. Citokinele au acţiune puternică şi asupra precursorilor celular T-citotoxice şi apoi a celulelor T
citotoxice care le dau naştere, îmbogăţindu-le puterea de recunoaştere şi a altor tipuri de molecule
MHC clasa I chiar de pe suprafaţa celulelor organismului propriu, infectate cu virioni sau care au
suferit modificări neoplazice. Când acestea au recunoscut complexele antigen nonself-MHC cl. I pe
suprafaţa celulelor proprii ele vor sintetiza masiv citolizine cu ajutorul cărora distrug celulele
infectate, chiar şi pe cele prezentatoare de antigen, prevenind abilitatea virusului de a se replica
reducând în acest fel capacitatea de infectare şi a altor celule.
5. Şi celulele Natural killer sunt influenţate puternic de citokine îmbogăţindu-le puternic abilitatea de
distingere a celulelor infectate şi tumorale.
În figura 7 redăm o schemă în care se poate observa întregul proces de activare a sistemului imun.
 Curs 2 Molecule implicate în apărarea organismului
1.5. Molecule implicate în apărarea organismului
1.5.1. Sistemul complement
Complementul este un sistem enzimatic multifuncţional format din aproximativ 25-30 de componente care
în cadrul răspunsului imun, îndeplineşte atât funcţia de system efector dar şi de aceea de recunoaştere
imunologică nespecifică a „nonselfului" de “self”. Caracteristicile lui au fost descrise la capitolul unde am
discutat despre sistemul imun înăscut. Din această cauză nu-1 mai descriem aici.

1.5.2. Moleculele MHC (HLA) şi reuşita transplantului

Complexul major de histocompatibilitate (MHC) este compus dintr-un set de gene strâns legate între ele
(haplotipuri) aşezate pe cromosomul 6 la oameni. El este pentru oameni, sub denumirea de human leucocyte
antigen (HLA) sau RLA (rabbit leucocyte antigen) pentru iepuri sau H2 pentru şoarece şi RTD pentru
şobolan.
Genele complexului MHC sintetizează molecule de glicoproteine numite molecule MHC. Deoarece
structura lor primară şi secundară este diferită, ele pot fi împărţite în două familii de glicoproteine şi anume:
familia MHC clasa I şi familia moleculelor MHC clasa II. Expresia acestor două clase de glicoproteine se
realizează de regulă, pe membranelor celulelor. Din cauză că ele au o strictă specializare constituie un
“sistem de ghidare", pentru celulele T, în recunoaşterea antigenilor proprii, precum și a antigenelor nonself
sau a celor proprii dar care au suferit modificări de structură în urma unor agresiuni (infecţii sau injurii ale
mecanismelor de replicaţie celulară).
În prezent se ştie, cu siguranţă, că sistemul de gene MHC prin moleculele pe care le sintetizează, este
responsabilul major de soarta grefelor de ţesuturi sau organe. El cotrolează dacă grefa de la donator este
acceptată de către receptor (ţesuturile histocompatibile") sau este rejectată (ţesuturile sunt
histoincompatibile).
Pe lângă genele care compun complexul major de histocompatibilitate mai sunt încă multe alte gene,
aşezate pe diferite alte perechi de cromosom, care prin produsele lor de sinteză (tot glicoproteine) controlează
cumulativ, rejetul tardiv al grefei de ţesuturi incompatibili, denumit gene minore de histocompatibilitate.
Moleculele MHC joacă un rol fundamental în fiziologia răspunsului imun prin îmbogățirea abilităţii
limfocitelor T de-a recunoaşte antigenii proprii şi străini (nonself). Antigenul nonself, singur, nu poate fi
recunoscut de către celulele T. Numai antigenul procesat sub formă de fragmente de peptide şi legate în
complex cu molecule MHC poate fi recunoscut de către limfocitele T.
Complexul de gene MHC este prezent la toate vertebratele precum şi la multe nevertebrate şi chiar la
plante. Aceasta sugerează că este partea din genomul vieţuitoarelor în decursul evoluţiei.
Caracteristicile generale ale MHC
Moleculele MHC clasa I şi II mai sunt denumite şi alloantigene sau MHC antigeni. O mare parte dintre
moleculele MHC clasa III sunt componente solubile ale sistemului complement aşa cum sunt: Tumor necrosis
factors (TNFα şi TNFβ) hidrolaza 21, proteinele de şoc termic (HSP-70). Cea mai importantă caracteristic a
lor este polimorfismul produs de un număr de alele aflate în locii genelor MHC care le determină sinteza.
Sectorul de cromosom (ADN) care cuprinde locii genelor care "răspund" de sinteza moleculelor MHC se
împarte în două regiuni:
a) regiunea care cuprinde locii genelor care determină sinteza moleculelor MHC clasa I. Aceştia sunt locii
D, L şi R la şoarece şi HLA-A, B şi C la oameni.
b) regiunea HLA-D care cuprinde locii genelor sau familiilor de gene care răspund de sinteza moleculelor
MHC clasa II. Acestea sunt HLA-DR, HLA-DQ şi HLA-DP. Fiecare dintre aceste grupe conţin cel puţin
două gene funcţionale.
Polimorfismul moleculelor MHC şi HLA în populaţii şi familii diferite, provin* din mulţimea de mutaţii
care au avut loc în genele unui anumit locus în ancestralitatea zoologică. Un astfel de fenomen a dat naştere
la foarte multe gene alele în locusul respectiv (polialelism).
La oameni fiecare locus în care se găseşte o pereche de gene MHC se scrie cu literă mare care desemnează
gena şi o cifră care indică alela din locusul respectiv. De exemplu HLA-A2 sau HLA-B7 sau HLA-DR..
Genele care au fost donate se înscriu prin cifre care poartă un asterix (A* 1101). La şoarece şi şobolan locii
genelor sunt indicaţi cu litere majuscule, iar alelele lor sunt notate cu litere mici la exponent.
□ Haplotipurile MHC
În genetică un haplotip este un grup de gene alele care se transmite împreună de la părinţi la urmaşi. Se
întâmplă acest lucru deoarece ele se găsesc strâns înlănţuite pe acelaşi cromosom, din care cauză şi crossing-
overul, între cromosomii omologi are loc extrem de rar.
La oameni fiecare organism conţine o serie alelică de tipul HLA-A; HLA-BC sau DR. Deşi nu se
întâmplă decât excepţional crossing-over, numărul combinaţiile-posibile între cromosomii omologi depăşeşte,
totuşi, 40 de miliarde.
Din cauză că grupul de gene MHC sunt strâns înlănţuite sistemul de gene HLA se poate reduce la patru
elemente (cromosomi) în cadrul unei familii. Datorită procesului de segregare a cromosomilor pe parcursul
formării gameţilor, fiecare dintre cei care conţin un haplotip MHC pot ajunge individual la descendenţii unui
cuplu. Regulai este următoarea: Din doi cromosomi omologi paterni şi tot atâţia materni nu se pot produce
descendenţi decât cu patru cromosomi parentali. Prin urmare într-o familie cu patru copii există o şansă din
patru (1/4) ca un frate să aibă aceiaşi structură HLA cu altul (în familia cu patru copii doi fraţi din 4 sunt
identici pentru HLA). O astfel de situaţie este extrem de importantă pentru că îi ajută pe chirurgii care fac
transplant de organe să se orienteze pentru găsirea cu uşurinţă a donatorului de organe compatibil cu
primitorul.
1.5.3. Citokinele
Citochinele sunt peptide cu ajutorul cărora celulele de apărare interacţionează între ele în realizarea
răspunsului imun. Ele sunt sintetizate de toate tipurile de leucocite (limfocite, monocite. macrofage) precum
şi de alte celule nelimfoide. Din această cauză ele se mai numesc şi interleukine. Cu alte cuvinte ele sunt
"instrumente" cu ajutorul cărora celule albe ale sângelui "comunică" între ele pentru a-şi coordona
multiplicarea şi activitatea de apărare. Din această cauză citochinele sunt considerate că sunt substanţe
imunomodulatoare de prim ordin. Deşi citokinele sunt elaborate de către celulele limfoide, interleukinele nu
sunt anticorpi.
Deoarece citokinele sunt peptide cu dimensiuni diferite, ele pot fi secvenţializate și apoi sintetizate în
cantităţi corespunzătoare prin tehnologia ADN-recombinat. De aceea biotehnologul este chemat să le
cunoască structura şi activitatea biologică pentru a le putea produce industrial în scopul folosirii lor de către
medic în terapeutică sau pentru prevenirea unor boli infecţioase sau pentru întreţinerea şi dezvoltarea
culturilor de celule.
Citochinele sau limfokinele se clasifică în funcţie de efectul pe care-1 au asupra celulelor ţintă asupra
cărora acţionează. Ele sunt de mai multe feluri şi pot fi clasificate : 1)limfokine (interleukine), 2) factori de
creştere leucocilară şi 3) interferoni.
1.5.3.1. Interleukinele
Interleukinele au fost cunoscute în biologie şi medicină ca factori activatori sau inhibitori ai diferitelor
tipuri de celule.
Tipurile de interleukine sunt de natură proteică, iar numărul şi înşiruirea aminoacizilor, în fiecare lanţ de
peptidă este diferit. Se ştie că rezultatul unei astfel de structuri primare se reflectă în configuraţii spaţiale
diferite ale proteinelor. Se cunosc șase tipuri de interleukine cu structură şi funcţie diferită. Acestea sunt
următoarele:
Interleukina I (IL-1)
Este o proteină formată din două subunităţi IL-α şi IL-β. Cea mai bine cunoscută este IL-tβ. Ea este
formată din 269 aminoacizi (31 kilodoltoni KDa).
Interleukina 1 (IL-1) este sintetizată, în principal, de către macrofagele-monocite, dar și de toate tipurile
de celule cu nucleu (limfocite B, celule dendritice, Langerhans, neutrofile, reticulocite, celule epiteliale).
Stimulii (inductorii operonului) care determină sinteza lor sunt: antigenii, lectinele alte citokine,
microorganismele, endotoxinele, razele ultraviolete.
Celulele ţintă şi activitatea lor biologică
IL-1 acţionează asupra leucocitelor, celulelor endoteliale şi epiteliale, fibroblaste și celule neuroendocrine,
pe care le stimulează în activitatea lor biologică.
IL-1 stimulează eliberarea granulelor din neutrofile şi chimiotactismul (atracţia spre o țintă) neutrofilelor
şi macrofagelor, eliberează prostaglandinele din celulele musculare, participă la resorbţia oaselor şi
cartilagiilor rupte şi stimulează proliferarea limfocitelor T şi B şi a fibroblastelor. Ele acţionează şi asupra
celulelor sistemului nervos central inducând somnul şi anorexina.
IL-1 stimulează răspunsul imflamator la locul de pătrundere a agenţilor patogeni contribuind prin aceasta
la uciderea acestora de către macrofage.
Ele stimulează şi proliferarea limfocitelor T, prin scoaterea lor din faza G0 a ciclului celular (în repaus) şi
instalarea acestora în faza G1 şi faza S (de sinteza de ADN).
 ■ Interleukina 2 (IL-2)
Este o proteină înalt hidrofilică compusă din 133 de aminoacizi, cu o greutate de 15-17
KiloDaltoni(KDa).
Proteina IL-2 este sintetizată de limfocitele T helper şi al celor citotoxice.
Stimulii (inductorul operonului) destinaţi limfocitele T pentru a iniţia sinteza IL-2 sunt: diverşi antigeni şi
lectinele (concovalina şi fitohemoglutinina).
IL-2 produsă de limfocitele T are acţiune proliferativă specifică asupra limfocitelor T aflate în repaos în
faza G1 forţându-le să treacă în faza S şi să-şi termine ciclul celular, replicându-se.
Locul de acţiune a IL-2 asupra limfocitelor T sunt receptorii de membrană specifici care mediază
introducerea ei în celule, cu urmări de stimulare a replicaţiei celulelor precum şi în sinteza intensă a
imunoglobulinelor specifice.
În afara inducerii replicaţiei limfocitelor T şi a sintezei masive de imuno-globuline IL-2, provoacă şi
sinteza interferonului-y de către aceleaşi celule T. Dacă se administrează animalelor de laborator un antigen,
împreună cu IL-2, răspunsul imun al organismului creşte de opt ori, faţă de cazul când antigenul este
administrat singur. De aici reiese că IL-2 este substanţa naturală care potenţează răspunsul imun al
organismului; ea este adjuvantul răspunsului imun.
În afară de aceasta, IL-2 se pare că are un rol important în modularea funcţiilor citotoxice ale limfocitelor
T. Din această cauză IL-2 este folosită şi în terapia cancerului.
■ Interleukina 3 (IL-3)
Mai este cunoscută şi sub denumirea de hemopoetina din cauză că are efecte majore în stimularea
diferenţierii liniei celulelor stern hematopoetice. Ea este o proteină glicozilată produsă de o singură genă şi
este compusă dintr-o înşiruire de 140 de aminoacizi. Ea este sintetizată de limfocitele T deja activate .
Celulele ţintă sunt celulele stern din linia IL-3 limfoidă pe care le stimulează şi produce proliferarea
limfocitelor T şi B
■ Interleukina 4 (IL-4)
Este o proteină glicozilată cu o greutate moleculară de 15-16 KDa produsă de limfocitele liniei T. Celulele
ţintă ale acestei proteine sunt limfocitele B inactive, mastocitele, toate tipurile de celule hematoformatoare pe
membrana cărora s-au găsit receptori ai acestei proteine.
IL-4 are efect major asupra limfocitelor B inactive, determinându-le să crească şi să prolifereze. IL-4
sporeşte expresia moleculelor complexului major de histo-compatibilitate (MHC II) pe suprafaţa celulelor B
şi măreşte afinitatea acestora pentru imunoglobulina E.
■ Interleukina 5 (IL-5)
Este o proteină cu o greutate de 45-65 KDa formată din 112-113 aminoacizi produsă de limfocitele T şi B
ca un factor de diferenţiere nespecific, precum şi de celulele T helper.
IL-5 are acţiune stimulatoare asupra proliferării limfocitelor B şi contribuie substanţial la diferenţierea
celulelor B şi transformarea lor în celule secretoare de imunoglobuline.
 IL-5 poate funcţiona şi ca un factor declanşator în sinteza imunoglobulinelor A ceea ce o desemnează şi ca o
moleculă regulatoare a aparatului imun de la nivelul mucoaselor. Împreună cu IL-2 contribuie la generarea
limfocitelor T citotoxice din precursorii limfocitelor.
Interleukinele 6 (IL-6)
Este o proteină de o mărime de 26 KDa şi mai este cunoscută cu factorul de stimulare a celulelor B (BSF-2)
sau interferonul β2. Ea este produsă de fibroblaste, monocite şi celulele liniei T şi unele celule tumorale
nonlimfoide.
Ea este activă în stimularea proliferării celulelor B şi hepatocitelor şi a celulelor T precum şi a celulelor stem
hematopoetice. Are puternică activitate antivirală din care cauză au mai fost numiţi şi interferonul β2 (IFβ2).
Factorul necrozant al tumorilor (TNF Tumor Necrozis Factor) sau Cachetina
De mulţi ani se cunoaşte că lizatul de bacterii care conţine endotoxine are efecte distructive asupra tumorilor.
S-a descoperit însă un adevărat mecanism de acțiune a acestora. Endotoxinele bacteriene ajunse în organism
stimulează puternic funcțiile macrofagilor care la rândul lor sintetizează şi secretă un factor solubil care este în
stare să ducă la necroza totală a tumorilor. Această substanţă solubilă a fost denumită factorul necrozant al
tumorilor (TNF) sau cachetina.
În prezent se ştie că TNF este o proteină produsă de o genă, înalt conservată în evoluția vieţuitoarelor.
Identificarea şi izolarea genei i-au condus pe cercetători la clonarea ADN-ului care conţine gena respectivă. Pe
această bază s-a precizat şi structura primară a TNF-ului. Ea este o proteină formată iniţial din 223 de aminoacizi
la oameni şi 235 aminoacizi la şoarece. După maturare, TNF sau cachetina de şoarece are în compoziţia ei doar
156 de aminoacizi, iar cea umană 157 de aminoacizi. Este interesant de observat că TNF uman este o proteină
neglicozilată, iar cea murină este glicozilată fără a se putea înţelege semnificaţia biologică a acestei structuri.
Originea TNF sunt macrofagele. Studiile efectuate "in vitro" au demonstrat că aria de macrofage cultivate şi
activate cu endotoxine bacteriene au efect citolitic asupra celulelor tumorale.
Inductorii operonului TNF sunt doi: unul primar format din stimulii sistemului reticulo-endotelial şi altul
secundar care este endotoxina bacteriană.
TNF are şi efecte imunomodulatoare în maturarea celulelor B, în inducţia celulelor Killer precum şi în
maturarea timocitelor şi neutrofilelor. Activitatea antitumorală a TNF face ca această substanţă să fie produsă în
cantităţi mari pe cale biotehnologică şi să fie încercată, împreună cu alte substanţe şi în terapia cancerului. Se fac
multe eforturi pentru obţinerea de TNF modificat structural pentru a-i spori capacitatea de liză a tumorilor şi a
proprietăţilor imunomodulatoare.
Obținerea de citochine în cantităţi mari pe calea tehnologiei ADN-recombinat dă speranță cercetătorilor în
medicină, că în curând vor dispune de un nou arsenal de instrumente mai eficiente, în lupta împotriva bolilor
produse de virusuri, a cancerului precum şi a bolilor autoimune.
Posibilitatea biotehnolgiilor de a modifica, la dorinţă, structura primară a peptidelor deschide calea obţinerii de
noi generaţii de molecule peptidice care să aibă activități imunomodulatoare mult mai mari şi mai intense decât
cele naturale.
 1.5.3.2. Interferonii
Au fost descoperiţi cu peste 30 de ani în urmă, ca pe nişte substanţe proteice naturale pe care le
sintetizează celulele organismului cu proprietăţi de apărare împotriva infecţilor virale. Acum se ştie că
interferonul nu este o singură proteină, ci o familie de proteine cu activitate nu numai antivirală, ci şi
imunomodulatoare al multor funcţii şi a multor tipuri de celule care compun sistemul imun.
Interferonii sunt împărţiţi, după activitatea lor, în trei clase distincte: alfa (α) beta (β), gama (γ). Astăzi se
ştie că interferonii umani alfa şi beta sunt sintetizaţi de o familie de gene multiple.
Interferonii β sunt produşi de două gene, cei alfa de către 15 gene, iar interferonii gama de către una
singură. Prin urmare este firesc ca şi produsul acestora, peptidele sau interferonii să aibe structuri şi funcţii
diverse.
Inductorii operoanelor interferonilor pe care-i produc o varietate de celule sunt, pe de o parte, virusurile a
căror acizi nucleici intră în celule, precum şi produse de sinteză ale bacteriilor şi a celulelor tumorale, pe de
altă parte.
Se cunoaşte că unele tipuri de interferoni sunt produşi, în special, de către limfocitele T Killer, ca răspuns
la un antigen specific sau ai unor substanţe mitogene (care declanşează mitoza).
Principala activitate a tuturor interferonilor este opoziţia lor împotriva proliferării celulelor normale şi a
celor tumorale. Din această cauză ei sunt folosiţi pentru tratamentul cancerelor la om (mai ales a celulelor de
mielom). Se pare că activitatea antiproliferativă, cât şi cea antivirală a interferonilor este produsă de aceiaşi
moleculă proteică a interferonului. Mecanismele lor de acţiune sunt, însă, diferite. In orice caz activitatea
antiproliferativă a moleculei de interferon se traduce prim sporirea perioadei de timp în care celulele rămân
în pauză înainte de intrarea lor în fazele ciclului celular (R1, S, R2, M).
Interferonii reglează producţia de anticorpi, atât "in vivo", cât şi in culturi de celule " in vitro". Efectul lor
poate fi îndreptat, fie în direcţia creşterii, fie în direcţia descreşterii producţiei de anticorpi, în funcţie de
concentraţia lor, de timpul de administrare şi de gazda în care ei sunt puşi să activeze. De exemplu,
interferonii gama pot determina depresia producţiei de anticorpi dacă ei sunt administraţi la începutul răspun-
sului imun. Ei însă vor spori producţia de anticorpi dacă sunt administraţi mai târziu. De asemenea, dacă
interferonii sunt administraţi împreună cu antigenul, supresează producţia de anticorpi, pe când dacă sunt
administraţi înaintea antigenului, fac să crească producţia acestora. Pe această bază s-au realizat posologii
speciale de administrare a interferonilor în terapia cancerului şi a infecţiilor virale ale oamenilor.
Interferonii gama pot acţiona ca un factor de maturare a celulelor B silindu-le să manifeste schimbări ale
suprafeţei acestora şi în consecinţă să secrete anticorpi. Alături de reglarea celulelor B în producţia de
anticorpi interferonii intervin şi în modularea funcţiilor efectoare a răspunsului imun mediat de celule.
Acestea sunt:
1) întărirea efectelor anticorpului dependent de celulele, care mediază citotoxicitatea
2) activarea macrofagelor pentru uciderea celulelor tumorale, a microorganismelor şi a paraziţilor,
3)îmbogăţirea activităţi citotoxice a limfocitelor T şi a celulelor Killer. Din aceste motive se pun
speranţe în folosirea interferonilor în tratarea cancerului.
 4)S-a observat că administrarea alloantigenilor şi a substanţelor mitogene atât "in vitro” şi "in vivo",
determină celulele T supresoare şi Helper să producă cantităţi mari de interferoni. Este interesant că
producţia de interferoni gama, de către celulele T, este dependentă de prezenta interleukinei 1 şi 2. Prin
urmare o combinaţie a acestor substanţe (IL 1 şi 2) cu alloantigene sau mitogene, ar pute întării
activitatea antiinfecţioasă sau anticanceroasă a interferonului gama sau a altora.

1.5.4. Anticorpii (imunoglobulinele)

Anticorpii sunt proteine globulare sintetizate de limfocitele B şi au proprietatea de a
recunoaștemoleculele străine (nonself) faţă de cele ale organismului propriu (self). Această proprietate le
conferă calitatea de-a reacţiona cu moleculele de antigen, care le-au determinat sinteza şi pe care-1
blochează şi-1 neutralizează.
Anticorpii se sintetizează în cantitate foarte mare dacă limfocitele B au avut, în prealabil, contact cu
antigene străine. Acestea au darul de a le determina să se activeze, și să se diferenţieze într-un tip special
de limfocite denumite plasmocite. Acestea sintetizează mari cantităţi de anticorpi cu structură
complementară antigenului străin (nonself) şi pe care-1 secretă, apoi, în sânge.
Limfocitele B, virgine, care nu a avut contact cu un anumit antigen posedă receptori de membrană,
sintetizaţi de maşinăria genetică a acestora cu ajutorul cărora ei pot să discearnă diferenţele dintre
moleculele proprii şi cele străine.
Receptorii de membrană ai limfocitelor B sunt de natură imunoglobulinică sau anticorpi. Prin urmare
limfocitul B sintetizează anticorpi care devin receptori proprii ai membranei limfocitului, pe deoparte, şi
anticorpi care-i eliberează în cantitate mare în plasma sangvină, pe de altă parte.
Limfocitele T au receptori de antigen proprii de natură proteică, diferiţi ca față de cei ai limfocitelor B
(IgM). Ei se numesc receptori T sau prescurtat TcR. Diferenţele de structură dintre aceştia le redăm în
figura 8.
Până acum s-a crezut că receptorii de antigen ai limfocitelor B, care se găsesc în celulele descendente
ale acestora, la sfârşitul ontogeniei lor, sunt identice ca structură cu cei ai celulelor parentale din care
provin. În prezent se ştie, cu siguranţă că, cel puţin pentru limfocitele B, atunci când acestea se divid şi
se diferenţiază în măduva hematogenă, receptorii de membrană sunt cu totul diferiţi faţă de cei existenţi
la celulele originale din care ele provin.
Acest fenomen are la bază recombinările genetice somatice care au loc în genomul celulelor
precursoare ale limfocitului B şi chiar a limfocitului T. Datorită recombinărilor, anticorpii receptori ai
limfocitelor B, sau a celor secretaţi în plasma sangvină, sunt extrem de diverşi. Ei practic pot să
recunoască miile de miliarde de antigeni existenți în natură.
 1.5.4.1. Structura anticorpilor
Toate tipurile de anticorpi sau imunoglobuline, au aceeaşi structură de bază Fiecare moleculă este
compusă din patru lanţuri de polipeptide dispuse sub forma literei Y. Două dintre ele sunt identice şi mai
lungi din care cauză se mai numesc şi lanţuri grele, iar celelalte două sunt mai scurte şi identice între ele.
Din această cauză ele se numesc lanţuri uşoare. Lanţurile grele se notează cu litera H (heavy), iar cele
uşoare cu litera "L" (light)
Lanţurile uşoare sunt unite cu cele grele prin intermediul unor legături disulf-hidrice formând un monomer
(fig. 9).

■ Molecula de anticorp poate fi împărţită în regiuni şi subregiuni

Moleculele de anticorpi pot să fie fragmentate cu ajutorul enzimelor proteolitice, papaina sau pepsina.
Părţile care rezultă, după digestie, se numesc regiuni şi au funcţii diferite. Aceasta sunt următoarele:

1) regiune responsabilă de legare cu antigenul cu care anticorpul reacţionează, numită regiunea Fab
(fragment with antigen binding).
2) regiune a monomerului numită Fc sau receptori Fc comună fiecărei imunoglobuline cu ajutorul căreia
anticorpul se leagă de componenţii sistemul» complement. (Fig.9)

1) Prima regiune, numită Fab a anticorpului, care rezultă din digestia lui cu pepsina, este compusă din
două lanţuri, din care unul este lanţul uşor, iar celălalt este o bucată din lanţul greu. Dimpotrivă regiunea Fc,
este compusă însă numai din două lanțuri grele.
 O analiză mai amănunţită a înşiruirii aminoacizilor în prima regiune Fab cu ajutorul metodelor specifice
de secvenţializare, a dus la concluzia că ea este compusă din două subregiuni şi anume: 1) una care are o
structură extrem de variabilă de la o moleculă de anticorp la celălalt (fig.9). Din această cauză ea a mai fost
numită şi regiunea variabilă a anticorpului (V). Din punct de vedere funcțional această regiune este aceia care
leagă anticorpul de antigen. Cum antigenii cu care organismul vine în contact sunt extrem de diverşi ne apare
firesc ca şi anticorpii să aibe locusul de legare tot atât de divers ca şi antigenii. Subliniem că însăşi regiunea
variabilă a anticorpului la capătului ei proximal are o diversitate foarte mare de aminoacizi aşezaţi unul după
altul. Din această cauză ea se mai numeşte şi regiune supervariabilă a anticorpului.

2) Cealaltă subregiune situată la partea distală a regiunii Fab, spre deosebire de prima, are o structură
constantă. De aceea ea fost numită şi regiune constantă a anticorpului (notată cu litera C).
 Analiza secvenţelor de aminoacizi (înşiruirea aminoacizilor) din lanţurile uşoare au demonstrat că şi
aici primii 100 de aminoacizi, pentru fiecare lanţ uşor. sunt înşiruiţi cu totul diferit, unul faţă de altul,
precum şi de la o celulă la cealaltă. Următorii 100 de aminoacizi au însă o succesiune mult mai
asemănătoare. Datorită acestor diferenţe de structură, lanţurile uşoare ale anticorpului au fost împărţite în
alte două grupe foarte înrudite ca structură, care poartă denumirea de lanţul lambda (λ) iar celălalt lanţul
K. O situaţie asemănătoare se găseşte şi în lanţurile grele. Ele sunt notate cu μ, δ, γ, α, Σ.
Variabilitatea mare de structură a fragmentului Fab sugerează că, în genomul limfocitului B, există
doi poli genetici de informaţie care stau la baza sintezei anticorpilor, dar care se recombină între ei într-o
mulţime de variante de o dimensiune aproape infinită.

Lanţurile uşoare şi grele ale imunoglobulinelor (anticorpilor) pot fi împărţite şi în domenii

Dacă se urmăreşte înşiruirea aminoacizilor în lanţul de imunoglobulină şi compară între ele, se
constată că în lungimea acestora există mai multe unităţi de aminoacizi omoloage. Fiecare unitate
omoloagă este formată din aproximativ 110 aminoacizi care diferă de celelalte. Unităţile homoloage de
aminoacizi se numes domenii, iar numărul lor diferă de la un tip de lanţ (greu sau uşor) la celălalt.
Lanţurile uşoare au două domenii din care unul este variabil (numit VL), iar celălalt constant (numit
CL). Lanţurile grele, în schimb, au patru domenii din care unul este variabil (VH), iar celelalte trei sunt
constante notate cu CH1, CH2, CH3 (figura 9).
Este important să cunoaştem că tocmai domeniile anticorpilor determină împachetarea, într-un
anumit fel, a moleculei acestuia, formând o structură secundară şi terţiară specifică, mai numite şi
pliurile imunoglobulinice. Cu ajutorul lor se realizează comunicarea dintre celule în general şi dintre
limfocitele B şi T, în special.
In rezumat, se poate spune că lanţurile uşoare ale anticorpului (imunoglobulinele) sunt formate din
două lanţuri de proteine globulare, oarecum diferite ca înşiruire a aminoacizilor. Ele sunt lanţul K şi
lanţul lambda (χ).
Lanţurile grele sunt formate şi ele din două catene, una denumită niu (u) formată dintr-un domeniu
variabil (VH) şi patru constante (CH1,2,3,4), iar cealaltă catenă (lanţ) se numeşte delta (σ) şi este formată
dintr-un domeniu variabil şi numai trei domenii constante (fig. 10).

1.5.4.2. Clasificarea imunoglobulinelor (anticorpilor)

Imunoglobulinele sau anticorpii se clasifică în:
1) Clase și subclase
2) Tipuri și subtipuri
 □ Clasele şi subclasele de imunoglobuline (anticorpi)
Imunoglobulinele, fiind nişte molecule mari, îndeplinesc toate condiţiile pentru a fi imunogene
(declanşatoare ale sintezei de anticorpi). Aceasta înseamnă că dacă se izolează imunoglobulinele de
la un individ aparţinător unei specii şi se administrează prin injecţie la alt individ, din altă specie,
leucocitele acestuia din urmă, vor recunoaşte imunoglobulina primei specii ca pe o moleculă străină
(nonself) şi va declanşa sinteza de anticorpi împotriva ei. Dacă acest lucru se va efectua în două
repetiţii, la o distanţă de 1-2 săptămâni, animalul care a primit imunoglobulina străină va avea, în
serul său sangvin, cantităţi importante de anticorpi-antiimunoglobulină. Un astfel de ser se numeşte
xenoantiser şi poate fi folosit pentru caracterizarea şi diferenţierea imunoglobulinelor celor două
specii. Dacă însă acest procedeu se va realiza între indivizii aceleiaşi specii antiserul bogat în
anticorpii care se va obţine se va numi alloantiser. Rezultă de aici că xenoantiserul ne ajută să
"măsurăm" diferenţele genetice dintre specii, iar alloantiserul poate să fie folosit pentru a cuantifica
diferenţele dintre indivizi.
Cu ajutorul acestor două tipuri de antiseruri cercetătorii au putut împărţi imunoglobulinele în
clase şi tipuri. Acum ştim că diferenţele existente în succesiunea aminoacizilor din lanţurile grele
ale imunoglobulinelor, între indivizi, determină clasele şi subclasele de imunoglobuiine, iar
diferenţele dintre aminoacizii lanţurilor uşoare determină tipurile de imunoglobuline.
Receptorii de membrană ca şi anticorpii circulanţi nu recunosc antigenul străin pe toată lungimea
sa. Numai anumite zone din lungimea acestuia sunt recunoscute. Acestea se numesc epitopi sau
determinanţi antigenici.
Aceasta înseamnă că şi anticorpii sunt formaţi din epitopi sau determinanţi antigenici înşiruiţi
într-un anumit fel în lungimea moleculei acestora. Un epitop al anticorpului este constituit din câţiva
aminoacizi. Localizarea diferită a determinanţilor antigenici sau a epitopiilor în lungimea lanţurilor
grele din constituţia imunoglobulinelor determină clasa acestora. Ţinând seama de o asemenea
structură imunoglobulinele (Ig) la mamifere au fost împărţite în mai multe clase. Acestea sunt
IgM=μ; IgG=λ (gama); IgA=α; IgE=∑; IgD=δ.
Unele lanţuri grele nu sunt omogene. Cele heterogene pot să fie divizate imunologic în subclase a
căror epitopi sunt localizaţi într-o succesiune şi structură diferită.
In figura 11 redăm schematic structura claselor de imunoglobuiine.

□ Tipuri de imunoglobuline
Am specificat mai înainte că lanţurile uşoare ale anticorpului pot fi divizate în alte două lanţuri
uşoare, unul K şi altul λ. Prezenţa unuia sau altuia dintre ele, într-o imunoglobulina (anticorp),
formează tipul imunoglobulinei. Imunoglobulinele formate numai din două lanţuri identice (de
exemplu λ.) caracterizează şi clasa de imuno-globuline.

□ Izotipurile de imunoglobulina
Clasele şi subclasele de imunoglobuiine, determinate de variabilitatea lanţurilor grele, precum şi
tipurile şi subtipurile acestor proteine, determinate de lanţurile uşoare sunt prezente, deopotrivă, la
toţi indivizii normali ai speciei. Ele se numesc variante izotipice sau izotipuri. Fiecare tip sau subtip de
lanţuri uşoare, precum şi fiecare clasă sau subclasă de imunoglobulină, sunt produsul de sinteză a unor gene
separate existente în genomul indivizilor. Din cauză că ele sunt comune la toţi indivizii, transferul de
imunoglobuline izotipice de la un individ la altul nu produce elicitarea (declanşarea sintezei) de anticorpi.

□ Allotipurile de imunoglobuline
Spre deosebire de izotipurile de imunoglobuline, care reprezintă o caracteristică comună a fiecărui
individ, există şi unele lanţuri de imunoglobuline care sunt diferite de la un individ la celălalt şi care
determină aşezarea, într-un anumit fel, a determinanţilor antigenici (epitopi) pe molecula de anticorp
(imunoglobuline). Unul poate avea acelaşi lanţ de imunoglobuline şi atunci îi spunem că este homozigot,
iar altul poate să posede lanţuri de formă diferită şi atunci îi spunem că el este heterozigot. O asemenea
situaţie provine din mutaţii care au avut loc în cuprinsul genelor lanţurilor grele şi uşoare, realizându-se
o serie de polialele.
Imunoglobulinele, diverse ca structură, se numesc allotipuri. Din cauză că un allotip dat de
imunoglobuline există la un individ şi lipseşte la altul, ei pot să fie precizaţi cu ajutorul unor antiseruri
speciale. Se înţelege că alloantiserurile nu pot să fie folosite la identificarea izotipurilor de anticorpi,
deoarece aceştia sunt comuni la toţi indivizii unei specii şi în consecinţă transferul lor de la un individ la
celălalt nu declanşează sinteza de anticorpi.
 La oameni s-au identificat allotipuri de imunoglobuline pentru lanţurile grele "γ" şi "α2", iar pentru
lanţurile uşoare, de tip K, sunt cunoscute alotipurile Gm, Am şi Km. Ele sunt folosite pentru
identificarea compatibilităţii dintre ţesuturile donatorului şi primitorului în cazuri de transplantare de
organe.
□ Idiotipuri de imunoglobuline
Sunt date de prezenţa, într-un anumit fel, a determinanţilor antigenici (epitopi) pe molecule de
imunoglobuline care sunt asociate cu specificitatea lor de legare a domeniului variabil al antigenului pe
molecula de anticorp. Variabilitatea de suprafaţă a epitopiilor pe partea variabilă a anticorpului este
diferită de la un limfocit B la altul. Ea este dată de înşiruirea diferită şi particulară a fiecărui aminoacid
în domeniul variabil şi hipervariabil al anticorpului, determinată de gene cu structură diferită pe care le
conţine doua limfocite B una faţă de alta.
Fiecare idiotip este limitat la unul sau la puţini anticorpi pe care-i posedă un anumit individ. Se
înţelege că şi imunoglobulinele, idiotipic diferit, transferate prin injecţie de la un individ la altul
declanşează (elicitează) producerea de anticorpi. Ei se numesc anticorpi antiidiotipici.

1.5.5. Genetica anticorpilor

Cel mai incitant fenomen din imunologie este modalitatea în care un organism viu reuşeşte să
reacţioneze împotriva oricărui antigen nonself, virtual sau existent pe tera şi chiar împotriva unor
microorganisme nou apărute. In prezent se cunoaşte că substanţele, care sunt capabile să recunoască şi
să discrimineze un număr uriaş de structuri cu antigenitate sunt receptorii de membrană ale limfocitelor
B şi al limfocitelor T. Pentru limfocitele B ei sunt imunoglobuline. Receptorii de membrană ai
limfocitelor T, deşi au structură asemănătoare cu ai limfocitelor B, ei nu sunt însă imunoglobuline.
Fiecare clonă de celule B sau T formată din milioane de celule identice, dar diferite de cele existente
la altă clonă, posedă receptorii săi specifici de membrană, dar care sunt capabili să recunoască un anumit
determinant antigenic sau epitop al antigenului cu care vine în contact. Această extraordinară organizare
a sistemului imun duce la concluzia că numărul de receptori diferiţi, existenţi pe suprafaţa celulelor care
sunt prezenţi la un individ este enorm. Ceea ce intrigă pe cercetător este faptul că în ciuda acestei
aproape infinite diversităţi de afinitate a receptorilor, structura lor de bază este însă foarte asemănătoare.
Numai o anumită parte din lungimea receptorilor T sau a imunoglobulinelor care sunt receptori pentru
limfocitele B sau ai anticorpilor circulanţi secretaţi de acestea din urmă, sunt variabile sau hipervariabile.
De aceia ele se mai numesc şi regiuni variabile sau hipervariabile complementare a determinanţilor
antigenici (CDR). Numai această regiune a receptorilor limfocitelor T sau a imunoglobulinelor sunt
implicate direct în recunoaşterea şi interacţiunea lor cu marea diversitate de antigeni existenţi în natură.
 Reamintim că în fiecare moleculă de receptor de antigen, regiunile constante ale antigenului sunt
diferite. Dar şi aceasta numai între clasele şi tipurile de anticorpi (imunoglobuline), în cazul limfocitelor
B, precum şi între diferite forme de receptori ai limfocitelor T.
Dacă moleculele care constituie receptorii de antigeni (indiferent că sunt imunoglobuline de
membrană sau anticorpi solubili în ser şi lichide ale organismului sau sunt receptori ale limfocitelor T)
au structura primară asemănătoare, atunci în mod logic trebuie să admitem ca şi baza lor genetică este
asemănătoare. În cele ce urmează vom descrie genetica receptorilor de antigen şi geneza diversităţii
regiunilor variabile ale acestora. Vom descrie separat genele care determină sinteza imunoglobulinelor şi
separat genele care determină sinteza receptorilor de membrană ai limfocitelor T

1.5.5.1. Genele imunoglobulinelor

Cum oare regiunile constate şi variabile ale imunoglobulinelor (anticorpilor) şi a receptorilor
limfocitelor pot să existe împreună în structura aceluiaşi lanţ de polipeptidă când se ştie că cele două
regiuni (constantă şi variabilă) sunt produse de două genofonduri diferite ? Cum se realizează un număr
aşa de mare (aproape infinit) de variante ale regiunii variabile ale anticorpilor (receptori ai limfocitelor
B) precum şi a receptorilor de membrană ai lifmfocitelor T ?
În prezent se cunoaşte că diversitatea acestora provine din aşa numitul rearanjament sau
recombinare a zonelor din materialul ereditar (ADN) care răspund de sinteza acestor molecule proteice
(receptorii şi anticorpii din umorile organismului). Afirmaţia este susţinută de faptul că proteinele
(anticorpii şi receptorii T) nu sunt altceva decât produsele de sinteză ale genelor care le determină.
Acest fenomen este greu de înţeles deoarece se ştie, din genetica formală, că fiecare proteină este
determinată de o genă separată, iar recombinarea genetică se realizează numai în linia celulară
germinală, atunci când are loc formarea gârneţilor (în pahinemul meiozei).
În prezent se cunoaşte însă că fiecare lanţ de imunoglobulină este codificat de către gene care sunt
separate în două "genofonduri" distincte şi anume:
a) unul foarte cuprinzător care conţine informaţia necesară pentru o sinteză mai restrânsă şi care
conţine numai informaţia pentru domeniile constante ale imunoglobulinelor.
b)Cel de-a doilea genofond conţine genele sau fragmentele de gene care determină domeniile
variabile ale anticorpilor.
În acest caz trebuie să se admită că un lanţ de polipeptide poate să fie codificat de două gene sau chiar
numai de segmente de gene. Dacă fenomenul este real, atunci este de presupus că produsul de sinteză
(lanţul de proteină) a diferitelor regiuni care produc domeniile variabile ale genelor implicate în sinteza
imunoglobulinei (fig.9) ar putea să se combine într-un anumit fel, cu produsul aceloraşi regiuni dar
situate în genele care codifică segmentele (domeniile) constante ale imunoglobulinelor. Un astfel de fenomen
ar putea explica de ce imunoglobulinele, la un capăt al lor pot să recunoască aşa de mulţi determianţi
antigenici (epitopi), deşi au structuri identice în alte părţi ale moleculei, aşa cum sunt regiunile constante ale
acesteia. Dacă se admite o astfel de ipoteză atunci trebuie să acceptăm că genele regiunilor constante ale
imunoglobulinelor trebuie să fie unite împreună încă înainte de transcripţia lor în molecule de ARN-m,
urmată de translaţia informaţiei în molecule de proteine.
În prezent cercetătorii sunt unanim de acord că ipoteza enunţată mai sus este reală şi că numai genele care
codifică, imunoglobulinele (receptorii limfocitelor B), şi receptorii limfocitelor T aşa cum le cunoaştem din
genetica clasică, nu pot să producă un aşa de mare grad de diversitate a acestora. în consecinţă trebuie să
admitem că diversitatea enormă a imunoglobulinelor trebuie să fie rezultatul unui fenomen genetic mult mai
complex, recombinarea genelor.

1.5.5.2. Organizarea genelor moleculelor imune

Genele care sintetizează imunoglobulinele se grupează în familii: unele dintre ele determină sinteza
domenilor variabile iar altele determină sinteza domeniilor constante ale acestor molecule. Fiecare dintre
lanţurile uşoare şi grele precum şi fiecare dintre catenele care le compun sunt sintetizate de segmente de gene
proprii.
Genele imunoglobulinelor care determină sinteza lanţurilor uşoare sunt aşezate pe perechi de cromosomi
diferiţi. Astfel genele care codifică lanţurile uşoare K sunt aşezate pe cromosomii 6 şi 2, iar cele care codifică
şi determină sinteza lanţurilor λ (uşoare Lλ) sunt localizate, atât pe cromosomul 16, cât şi pe cromosomul 22.
Genele pentru imunoglobuline sunt aşezate într-un anumit fel în genomul celulelor liniei germinale care
duc la formarea gameţilor şi cu totul altfel în limfocitele B care sintetizează imunoglobuline. În figura 12
redăm o schiţă a unei astfel de situaţii.
 In figura de mai sus se poate observa că genele care răspund de sinteza lanţurilor grele şi uşoare în
celulele liniei germinale dintr-un embrion sunt aşezate, pe lungimea ADN, în două sectoare, dar care din
punct de vedere fizic sunt diferite. într-un sector sunt aşezate genele care codifică domeniile variabile ale
imunoglobulinelor (VI, V2, V3, V4....Vn) şi în cu totul alt sector sunt aşezate genele care conţin informaţia
genetică pentru structura primară a domeniilor constante (C).
Dimpotrivă în genomul limfocitelor adulte segmentele respective, datorită recombinărilor care au loc în
ontogenia limfocitelor cu fiecare diviziune celulară, genele segmentului variabil pot să ajungă împreună cu
cele ale domeniului constant.
In continuare vom descrie cum sunt aşezate genele care codifică cele două domenii (variabile şi constante)
ale imunoglobulinelor. O vom face separat pentru lanţurile uşoare şi tot separat pentru genele lanţurilor grele
(H).

1.5.5.2.1. Organizarea pe cromozomi a genelor care codifică domeniul variabil al lanţurilor uşoare
In prezent se cunoaşte că structura primară (înşiruirea aminoacizilor) a catenei K, variabilă, a lanţurilor
uşoare ale imunoglobulinelor este înscrisă codificat în două familii de gene. Una este notată cu litera „ V"
(variabilă) şi alta notată cu litera „J" (joint) care face legătura cu altă familie de gene care codifică domeniul
constant al imunoglobulinelor („C").
Familia de gene „V" este formată din 100 fragmente de gene. Familia de gene notată cu litera "J" este însă
mult mai mică. Ea este formată din 5 fragmente de gene la om şi doar 4 la şoarece (figura 13).
Familia de segmente ale genei V codifică înşiruirea majorităţii celor 110 aminoacizi ai catenei K al
lanţului uşor din domeniul variabil. Segmentul de imuno-globulină din domeniul variabil format din
aminoacizii situaţi în poziţia 95/96-100 ai catenei de imunoglobuline este codificat de segmentul de ADN
numit „Joint segment" simbolizat cu litera J. La om el conţine 5 segmente de gene pentru catena K al
lanţului uşor de imunoglobuline. Dintre acestea numai 4 segmente sunt funcţionale. Unul dintre ele este
nefuncţional din care cauză acest fragment se mai numeşte şi pseudogenă.
Şi familia de gene variabile (segmentul V) pentru catena K a lanţului uşor, conţine aproximativ 100 de
segmente de gene. O mare parte dintre ele sunt însă pseudogene (gene care nu pot sintetiza o proteină
funcţională). Se consideră că pseudogenele deşi nu pot sintetiza o proteină normală, ele contribuie, însă,
semnificativ la sporirea diversităţii de informaţie, precum şi la formarea unor noi segmente de gene, prin
fenomenul de conversie şi crqssing-over inegal. Se pare că un astfel de fenomen stă la baza creerii
polimorfismului proteinelor şi implicit a genelor care sintetizează moleculele MHC clasa I şi II.
□ Aranjarea segmentelor de gene în cromosom pentru lanţurile uşoare
In figura 13 redăm o schemă a aşezării în lanţul de ADN a familiilor de gene care stau la baza sintezei
lanţului K şi A al lanţurilor uşoare la om.
 Din figura de mai sus se pot observa următoarele:
Segmentele variabile (V) sunt aranjate una după alta într-o anumită regiune a cromosmului. Ea mai este
numită şi regiune variabilă sau "regiune cu suprafeţe în tandem". Mai trebuie să precizăm că fiecare segment
al genei variabile este precedat de un segment de ADN format din mai multe nucleotide numite conducător
sau lider, implicat profund în biosinteza lanţului uşor de imunoglobuline.
Segmentele "J" sunt localizate în aval de regiunea genelor variabile de pe cromozom. Ele sunt organizate,
de asemenea, în suprafeţe dispuse în tandem şi sunt separate fizic de către introni de segmentele genelor care
sintetizează domeniile variabile ale moleculei de imunoglobuline. în procesul de recombinare şi formare a
lanţului uşor K ei vor fi apoi eliminaţi (fig 13).
■ Organizarea genelor care codifică catena λ a lanţului uşor
Segmentul de ADN care codifică catenele λ ale lanţului uşor este, de asemenea, divizată în trei segmente,
asemănătoare cu cele ale genelor care sintetizează catena K. Şi în acest caz segmentele de gene variabile (V),
precum şi cele ale genei J contribuie la sinteza domeniului variabil al imunoglobulinelor. Segmentele
variabile (V) pentru catena lamda ale omului care sunt în număr mai mic decât pentru catena K, sunt aşezate
pe cromosom în asociaţie cu cele două segmente ale segmentului J (Joint), urmate imediat de segmentele care
codifică domeniile constante („C") ale lanţului lamda (λ).
□ Caracteristica segmentelor de genă care codifică domeniul constant „C" (catenei λ) al
imunoglobulinelor
La oameni s-au identificat peste 20 de segmente de gene care codifică domeniile constante ale lanţului X.
Ele sunt funcţionale. Există însă şi 4 segmente constante (C), care sunt însă nefuncţionale mai numite şi
pseudogene. Este de subliniat că fiecare gena C este, întotdeauna, asociată cu un segment "J" propriu (C-J).
 1.5.5.2.2. Organizarea genelor lanţurilor grele ale imunoglobulinelor
Lanţurile grele ale imunoglobulinelor (anticorpi) sunt codificate de trei segmente de gene şi anume: l)
segmentul variabil (V); 2) segmentul de diversitate (D) şi 3) segmentul J, de joncţiune. O schemă de
aranjare a acestora o redăm în figura 14.

Să se compare schema din figura de mai sus cu cea care redă organizarea genelor lanţurilor uşoare (fig.
12) şi să se observe că în cazul de faţă există trei segmente de gene (V, D şi J). Reamintim că la baza
dezvoltării lanţurilor uşoare există însă numai două segmente de genă (V şi J) şi nu trei ca în lanţurile grele.
A doua caracteristică a determinării genetice a lanţurilor grele este faptul că regiunile constante pentru
lanţurile grele, ale imunoglobulinei sunt codificate împreună de către o familie de gene aşezate într-o regiune
a cromosomului, situat în aval de regiunea segmentelor genelor variabile, atât la şoarece, cât şi la om.
Toate genele care codifică lanţurile grele ale anticorpilor (imunoglobuline) sunt aşezate pe cromozomul 14
al oamenilor şi pe cromozomul 12 al şoarecelui.
 o Caracteristica genelor care determină domeniul variabil al lanţurilor grele
Toate genele care determină domeniul variabil al lanţurilor grele se găsesc împreună în aceeaşi regiune a
cromosomului. Această regiune este alcătuită din trei familii de gene şi anume: segmentul de gene V
(variabil); segmentul de genă D (diversitate) şi segmentul de genă J (de joncţiune).
Precizăm că în cadrul acestei regiuni genele sunt dispuse în segmente aşezate în tandem (una după alta)
de-a lungul cromosomului. Toate împreună codifică domeniul variabil al lanţurilor grele. Acest domeniu este
compus din codonii corespunzători pentru 100 până la 130 de aminoacizi. Cercetările au dovedit că
diversitatea cea mai mare a domeniului variabil al lanţurilor grele ale imunoglobulinelor se găseşte la poziţia
aminoacizilor 31-37; 51-68; 84-91 şi 101-110. Precizăm că pentru lanţurile uşoare acestea se găsesc în
poziţiile aminoacizilor 29-35, 51-65 şi 93-103. Din această cauză ele se mai numesc şi regiuni super sau
hipervariabile şi formează aşa Numitele „Regiuni Complementare Ale Familiilor Determinanţilor
Antigenici" sau CDR (complementary determining regions sau CDR).
Segmentele genelor variabile ale lanţurilor grele care codifică aminoacidul 98 aşezat la capătul V terminal
al domeniului variabil al lanţului greu, include regiuniile CDR1 şi CDR2. Fiecare segment este împărţit în doi
exoni şi anume:
1) Exonul 5' care codifică doar 4 aminoacizi şi se găseşte în secvenţa „lider" al moleculei de ADN.
Precizăm că aceste secvenţe sunt foarte importante deoarece ele au rolul de-a insera lanţurile grele înăuntrul
membranei reticulului endoplas-matic pe timpul sintezei proteinelor.
2) Exonul variabil este separat de primul de către un scurt intron de aproximativ 100 de perechi de
nucleotizi. Exonul variabil codifică ultimii patru aminoacizi al „peptidei lider" precum şi o mare parte din
domeniul variabil al lanţului greu(Fig. 15)
□ Familii de gene care codifică domeniul variabil din lanţurile grele ale Ig
Numărul total de gene care determină segmentul variabil al lanţurilor grele al Ig se poate împărţi în 7-8
familii. Fiecare dintre ele conţin între 4 şi 100 de membrii. Este interesant de observat că toţi membrii care
constituie o familie de gene au o structură cu un mare grad de homologie. Segmentele de genă sunt ţinute
împreună în cadrul familiei. Familiile însă sunt separate unele de alte de către spaţii mari ale moleculei de
ADN, formate din câte 10-20 kilobaze (10.000-20.000 de perechi de nucleotide) şi notate în figura 15 cu
semnul.
În cadrul segmentelor de gene care stau la baza producerii lanţurilor grele ale imunoglobulinelor se găsesc
şi o mulţime de pseudogene. Şi aici vom sublinia că cercetătorii sunt de părere că, deşi pseudogenele nu pot
produce proteine cu funcţie normală de anticorpi, ele contribuie, totuşi, semnificativ la creerea diversităţii
anticorpilor prin generarea de segmente noi de gene, producătoare de domenii variabile ale acestora.
 ■ Particularităţiile familiilor de gene
Familia segmentelor de gene D (density) codifică porţiunea CDR3 a regiunii hipervariabile a
anticorpului. Ea este amplasată între familia de gene variabile (VH) a lanţului greu şi familia (segmentul) JH
,pe o întindere de cea. 80 de kilobaze (Fig. 15). Segmentele DH contribuie substanţial la variabilitatea
lungimii domeniilor hipervariabile şi codifică între 1 şi 15 aminoacizi din molecula de anticorp.
Familia de segmente ale genelor J este amplasată în aval de familiile segmentelor V şi D, dar în amonte
de regiuniunea ocupată de genele domeniilor constante (C) ale imunoglobulinei (Fig. 15). Distanţa dintre ele
este ocupată de o zonă formată din cca 7000 de nucleotizi sau perechi de baze (pb). Au fost identificate până
acum 4 segmente ale genelor J, pentru lanţurile grele ale imunoglobulinelor la şoarece şi un număr de 9 la
om.
Segmentul J codifică porţiunea de aminoacizi între poziţia 16-12 din domeniul variabil al lanţurilor grele
ale Ig. Pentru ca o genă să funcţioneze normal, şi deci să producă domeniul variabil al lanţurilor grele, ea
trebuie să ajungă alături şi să se lege, neapărat, cu cel puţin câte un membru din fiecare familie de gene
încadrat în segmentele VH, DH şi JH.(Fig.l5.).
□ Genele care determină regiunile constante ale imunoglobulinelor
S-a constatat că genele care conţin informaţia pentru sinteza regiunii constante a lanţurilor grele ale
anticorpilor (imunoglobulinele) se găsesc pe cromosom în aval de segmentele J ale lanţurilor grele şi ocupă
un spaţiu, pe molecula de ADN, de aproximativ 200 kilobaze (nucleotide). în figura 16 redăm o schemă de
amplasare a acestora în lanţul de ADN.
Să se observe în figura 15 că genele care codifică regiunile constante ale lanţului (μ (Cμ) şi δ(Cδ) sunt
localizate foarte aproape de segmentele JH. Primele sunt localizate genele care codifică regiunea constantă a
lanţului δ, urmată de cele ale lanţului γ şi urmată, apoi, de cele ale lanţurilor α şi ε (Fig. 15). Ordinea aşezării
lor pe cromosom reflectă de fapt şi ordinea în care sunt sintetizate şi diferitele clase de imunoglobuline. De
exemplu IgM şi IgD sunt primele sintetizate, atunci când se realizează transcrierea propriilor gene.
Regiunile constante ale genelor lanţurilor grele ale imunoglobulinelor sunt cuprinse între două şi patru
domenii. Numărul domeniilor depinde de clasa lanţului greu, la care se adaugă şi regiunea balama a
anticorpului. Fiecare domeniu este codificat structural de către un exon separat. O schiţă de amplasare a
acestora este redat în fig. 16.

Se mai poate observa din figura de mai sus că lanţurile u. au patru domenii constante. Acestora le lipseşte
însă regiunea balama. Pentru lanţurile 5 există numai două domenii constante (Cδ1, şi Cδ3) Fiecare dintre ele
sunt codificate de către un exon.
 1.5.5.3. Modalităţi de recombinare a genelor producătoare de imunoglobuline
Genele imunoglobulinelor rămân în configuraţia lor originală numai în celulele liniei germinale. În
limfocitele B responsabile de sinteza anticorpilor şi aflate în diferenţiere, configuraţia lor se modifică.
Subliniem încă odată că regiunea variabilă a lanţurilor grele şi uşoare ale imunoglobulinelor sunt codificate
de mai multe segmente de gene. Numai un singur segment de gene din cadrul fiecărei arii ale cromosomului
sunt selectate pe timpul diviziunii şi apoi rearanjate în spaţiu, pentru a forma o genă funcţională.
În decursul diferenţierii limfocitelor B, primele gene care se asamblează în procesul de recombinare sunt
genele lanţurilor grele. Ele sunt rearanjate (recombinate) în două etape şi anume: prima implică legarea
segmentului de gene DH cu segmentul j. În cea de-a doua etapă are loc legarea segmentului VH, la complexul
DH-JH.
Există credinţa că în timp ce se realizează rearanjarea segmentelor de gene VH, DH, J pe unul din
cromozomii pereche, rearanjarea genelor pentru domeniul variabil al lanţurilor grele, pe celălalt cromosom
homolog al perechii, ea este represată. Are loc aici ceea ce se numeşte în genetică, exclusie alelică. Aceasta
înseamnă că atunci când, în urma rearanjării genelor lanţurilor grele, nu rezultă o combinaţie reuşită şi
funcţională se va declanşa un proces care duce la repetarea rearanjării acestora, dar pe celălalt cromozom
omolog.
o Mecanismele rearanjărilor genelor imunoglobulinelor
Mai multe modele au fost imaginate de către cercetători. Pe unele dintre ele le vom descrie în continuare
1) Regula celor 12-23 de perechi de nucleotide
Mecanismul precis după care se desfăşoară legătura dintre segmentele VH, DH, şi JH (pentru lanţurile grele)
sau dintre segmentele VL şi JL (pentru lanţurile uşoare) nu este bine cunoscut. Câteva observaţii speciale ne
pot conduce, însă, la descifrarea acestui mecanism. Aceasta este aşa numita regula de legare 12-23 perechi de
nucleotide.
Să urmărim în continuare cum se petrece acest fenomen.
S-a observat, că secvenţele de nucleotide care flanchează segmentele de gene sunt nişte secvenţe
particulare, amplasate în aval de segmentele de gene VH şi VL, dar în amonte de segmentele JH şi JL O parte
din ele sunt amplaste de fiecare parte a segmentului de gena DH. Acestea se numesc secvenţe consensuale şi
participă aproape exclusiv la declanşarea şi oprirea transcripţiei genei, printr-un proces de metilare şi
demetilare. Fiecare dintre ele se prezintă ca un palindrom (heptamer format din 7 nucleotide) la care se
adaugă un nanomer (format din 9 nucleotide). Un exemplu de aşezare şi structură a acestora este redat în
figura 17.
Atât în genele care produc lanţurile k, cât şi în genele care produc lanţurile λ, s-au identificat doi
heptameri diferiţi, precum şi secvenţele de nucleotide care constituie nanomerul.
Secvenţele consens care flanchează fiecare parte a segmentelor de gene au rolul de-a se lega una de alta
după principiul complementarităţii nucleotidelor în direcţii opuse. Aceasta înseamnă că ele au posibilitatea să
facă o buclă dublu catenară asemănătoare unei agrafe de păr (partea inferioară b a figurii 17).
 O altă caracteristică a secvenţelor consens este că ele sunt separate unele de altele de un număr fix de
nucleotide. Întotdeauna 12±1 nucleotide. Acest număr de nucleotide corespunde buclei unde ADN-ul a
devenit dublu catenar (în agrafă). În acest fel spaţiile şi orientarea secvenţelor consens în jurul fiecărei
segment de gene se leagă unele de altele cu mare precizie (poziţia A din figura de mai sus). În prezent se
consideră că sevenţele consens cu proprietatea lor de-a se lega complementar pe o distanţă de 12 nucleotide,
constitue un mecanism de control al evenimentelor care au loc pe parcursul recombinării genelor
imunoglobulinelor.
Fenomenul descris mai sus este cunoscut sub numele de regula celor 12-23 perechi de nucleotide. Aceasta
înseamnă că un segment de gene cu 12 perechi de nucleotide (de baze) se poate recombina şi se poate lega
numai cu un segment flancat de 23 de perechi de baze şi viceversa. În felul acesta segmentele de gene ale
lanţurilor grele ale imunoglobulinelor nu pot să se aşeze pe timpul recombinării decât în direcţia
 DH-JH şi VH (DH-JH)- în conformitate cu regula 12-23 perechi de baze altfel de rearanjări cum ar fi DH-DH
sau VH-JH nu sunt posibile. De aici rezultă că secvenţele consens joacă un rol foarte important în controlul
rearanjarilor genelor pe parcursul ontogeniei limfocitelor B.
2) Modelul deleţiei
Este un model după care se desfăşoară recombinarea segmentelor de gene care răspund de sinteza
lanţurilor grele şi uşoare ale imunoglobulinelor. Acest mecanism implică numai o cromatidă a cromozomilor
care conţine gene pentru imunoglobulină. Pentru a se putea lega porţiunea care conţine informaţia dintre două
segmente de gene este, mai întâi excizată şi eliminată (deletată). Se realizează astflel un eveniment de
legătură. De exemplu heptamerul consens şi secvenţele nanomer din aval de segmentul VL care a fost
selectat, ajung împreună cu cel din amontele segmentului JL şi formează o structură stern mai numită şi ac de
păr (agrafă). În figura 18 redăm mecanismul unui astfel de proces.

În acest caz formaţiunea stem (trunchi) a segmentelor de gene V, precum şi a celor J care au fost selectate
sunt excizate şi apoi aşezate în apropiere pentru a se lega unele de altele. într-o altă variantă segmentele de
gene V şi J se interpun şi formează o buclă în forma acului de păr.
Se presupune că aceste structuri particulare numite şi "trunchi" sau „stem" şi "ac de păr" sunt stabilizate de
proteine specifice care se leagă de molecula de ADN. Legarea unele de celelalte a segmentelor V şi J, se
realizează cu ajutorul acţiunii unei enzime numite recombinază care poate să taie şi să lege apoi fragmentele
moleculei de ADN. Acest mecanism de rearanjare a fragmentelor de gene duce automat la deleţia ADN-ului
dintre segmentele care apoi trebuie să se lege între ele. Modelul este cunoscut cu numele de model stem -
agrafă sau modelul deletiei agrafelor structurale (stern and loop structure).
 3) Modelul de recombinarea de- a lungul cromatidelor
Acest mecanism implică ambele cromatide ale cromosomului purtător de gene ale imunoglobulinelor. El
constă într-o recombinare de tip crossing-over inegal. în acest caz segmentele V şi J nu sunt deletate, ci
transferate pe parcursul diviziunii de pe o cromatidă pe cealaltă. Se poate înţelege uşor că în acest caz nu are
loc o pierdere de informaţie de pe cromatidă, ci are loc doar o deplasare a ei de pe cromatida soră pe cealaltă
(fig. 18)
Au fost identificate proteinele enzime (recombinaze) care participă la procesul de recombinare a
cromatidelor surori. Ele au secvenţe heptamer şi nanomer şi au fost numite RAG-1, RAG-2. Suntem siguri,
că acestea sunt substanţele enzimatice care conduc procesul de recombinare între cromatidele surori, deoarece
atunci când genele acestor două proteine sunt transferate din genomul limfocitelor în cel al fibroblaştilor,
frecvenţa de recombinare a cromatidelor acestora creşte de 1000 de ori.
Alături de aceste două gene, la procesul de recombinare mai participă şi o altă genă numită TdT. Este
interesant de subliniat că cele două gene RAG-1, şi 2 sunt gene ancestrale care au fost păstrate pe scara
evoluţiei vieţuitoarelor. Din această cauză ele se găsesc în genomul tuturor speciilor de animale.
Descoperirea unei suşe de şoareci de laborator numit "suicid mouse" cu imuno-deficienţă severă
înnăscută, a confirmat valabilitatea mecanismului de recombinare, descrise mai sus prin crossing-over
somatic inegal, a cromatidelor surori ale cromosomilor purtători ai genelor imunoglobulinelor.
Imunodeficienţa acestei suşe de şoarece provine tocmai din imposibilitatea realizării legăturilor normale între
segmentele VJ şi VDJ în realizarea proteinelor care devin receptori de antigeni pentru limfocitele B şi T.
■ Rearanjările cromosomale duc şi la schimbarea clasei imunoglobulinelor în ontogenia individului.
Clasa imunoglobulinelor sintetizate de către limfocitele B poate să se schimbe în decursul dezvoltării. S-a
observat că dacă, într-un stadiu, al dezvoltării unui limfocit un anumit sector de ADN ocupat de genele
anticorpilor, sintetizează un ARN-m care, după translaţie, producea doar imunoglobulina M şi D, într-un alt
stadiu al dezvoltării acelaşi limfocit B poate să întrerupă sinteza acestora şi să sintetizeze o altă clasă de
imunoglobuline.
■ Cum se realizează un astfel de fenomen ?
Atunci când are loc contactul limfocitului cu antigenul, acesta este stimulat şi ca urmare se declanşează
rearanjarea sectorului de ADN care conţine informaţia pentru imunoglobuline. Intr-o astfel de situaţie poate
avea loc o întrerupere de legătură între segmentul care conţine fragmentele variabile VHDHJH şi genele
domeniului constant al lanţurilor grele CH- Urmarea va fi înreruperea sintezei de către gena respectivă a
sintezei IgM sau D şi trecerea la sintetizarea, în locul acesteia, a unui alt tip de imunoglobuline. Noul
aranjament al segmentelor de ADN pentru imunoglobuline formează o genă nouă care se numeşte gena
comutator de clasă sau class switching.
 O astfel de genă permite limfocitului B să sintetizeze imunoglobulinele cu aceiaşi specificitate de antigen,
dar care posedă o regiune constantă şi care este diferită de a celor sintetizate de limfocitul B virgin. Se
înţelege că o astfel de modificare poate să medieze apariţia unui set de funcţii efectoare diferite ale noilor
imunoglobuline care se sintetizează. S-a stabilit, deja, că expresia fiecărui isotip nou de lanţ greu, în afara
celui 8, este rezultatul unui mecanism de recombinare propriu. El este însă distinct faţă de cel pe care-1
implică rearanjamentul VDJ şi VJ.

1.5.5.4. Modalităţi de generare a diversităţii imunoglobulinelor

Ruperea şi apoi rearanjarea fragmentelor de gene în decursul ontogeniei limfocitului B are ca urmare
formarea unui număr imens de combinaţii ale acestora. Toate dau naştere prin translaţia ARN-m, care se
formează, la imunoglobuline cu particularităţi proprii.
Pentru realizarea diversităţii imunoglobulinelor sunt propuse mai multe mecanisme. Acestea sunt:
1. Combinaţia dintre legăturile segmentelor lanţurilor grele VDJ cu lanţurile uşoare VJ.
Am precizat mai înainte că domeniile variabile ale lanţurilor grele şi uşoare sunt codificate de 3 şi
respectiv 2 segmente de gene. Prezenţa unei mulţimi de segmente ale genei VH VL DH JH şi JL în linia
germinală, contribuie semnificativ la producerea unui număr divers de lanţuri grele şi uşoare ale regiunii
variabile ale imunoglobulinelor care poate fi produsă de către un individ.
Fiecare limfocit B luat individual are însă capacitatea să selecteze şi apoi să lege împreună oricare
segment al genei din fondul de fragmente pe care-1 are la dispoziţie. Asocierea combinatorie şi întâmplătoare
a mulţimii de fragmente diferite a mulţimii de fragmente de gene care compun segmentele VD şi J, duce la
formarea unei diversităţi impresionante a regiunilor variabile ale imunoglobulinelor. în tabelul 1 redăm, după
I.Austin şi K.Wood, o estimare a numărului de combinaţii diferite care sunt posibile de înfăptuit între
segmentele genei VD şi J în realizarea lanţurilor grele şi uşoare a imunoglobulinelor. Se poate observa că
rearanjările acestora pot duce la un număr, de combinaţii posibile, echivalent cu lOllcombinaţii. Se înţelege
că acestea vor da naştere la tot atâtea variante de imunoglobuline.

Tabelul 1. Diversitatea lanţurilor imoglobulinice

Lanţ greu Lanţ uşor
Segmentele genelor V 250-1000 250
Segmentele genelor D 10 0
Segmentele genelor J 4 4
Segmentele Ds prezentate în toate situsurile rar
Adiţia regiunii N V-D, D-J lipseşte
Combinaţiile regiunii variabile 62500-250000
Combinaţiile joncţionale 1011
 2. Diversitatea de legături
Diversitatea moleculelor de imunoglobuline poate fi sporită şi de către imprecizia legăturilor care se
realizează la graniţele dintre fragmente DH-JH; "VH-DHJH şi VL-JL. O astfel de variabilitate poate fi produsă pe
mai multe căi şi anume:
a) Legarea poate avea loc oriunde între cele trei nucleotide ale unui codon sau între codonii genelor sau a
fragmentelor de gene. Rezultatul va fi schimbarea codonului. Are loc în acest fel o mutaţie punctiformă.
Consecinţa va fi sinteza unei imunoglobuline care va avea unul sau doi aminoacizi substituiţi de către alţi
aminoacizi. Se înţelege că o astfel de imunoglobulină va avea, fie o funcţionalitate diferită de cea normală, fie
că ea va fi nefuncţională
b) Legarea fragmentelor în lanţul ADN poate avea loc în aşa fel încât ele să conducă la apariţia de mutaţii
frame schift. O astfel de mutaţie alterează nu numai un singur codon din constituţia genei, ci pe toţi codonii
care urmează după locul unde s-a înfăptuit inserţia şi până la capătul terminal al genei Aceasta are ca rezultat
o schimbare completă în succesiunea aminoacizilor din domeniul variabil al imuno-globulinei. Fireşte că în
unele cazuri mutaţiile frame-schift sunt non productive, deoarece în cuprinsul genei pot apărea codoni stop,
care întrerup în acest loc translaţia informaţiei în lanţul de proteină născândă. Proteina care se sintetizează va
fi nefuncţională.
c) O altă posibilitate prin care se poate realiza o diversificare de lanţuri grele şi uşoare este inserţia în
lanţul de ADN de extranucleotide „N". Acestea se pot produce în cuprinsul sau între fragmentele de gene pe
parcursul procesului de legare a acestora şi de formare a genei funcţionale. Un astfel de fenomen poartă
denumirea de adiţie regională de secvenţe. Urmarea va fi creşterea dimensiunii domeniului imuno-globulinei.
S-a stabilit că în procesul de adăugare de secvenţe N este implicată enzima deoxinucleotid transferaza
terminală. Prezenţa acestor nucleotide inserate în gena lanţului greu poate avea un efect dramatic asupra
specificităţii imunoglobulinei pe care o sintetizează şi implicit în sporirea diversificării repertoarului imuno-
globulinei. Se presupune că există între 250-1000 de segmente VH, 10 segmente DH şi 4 segmente JH în
genomul limfocitelor B. Dacă în acest caz luăm în considerare toate posibilităţile de legare în locusul D-J şi
V-(DJ) atunci vom ajunge la concluzia că se pot produce un număr de cea. 10.000 de feluri de lanţuri grele
(250 x 10 x 4 posibilităţi de legare) (vezi şi tabelul 1).
3. Mutaţiile somatice
Şi mutaţiile somatice pot să genereze diversitate în lanţurile grele ale imunoglobulinelor.
Oricare dintre nucleotide (A, T, C şi G) poate să fie adăugată sau să fie pierdută producând mutaţii
somatice. Ele nu se limitează doar la regiunile hipervariabile care sunt implicate direct în legarea
imunoglobulinei cu antigenul. Mutaţiile somatice care au loc în unele părţi ale domeniului variabil al genei
poate duce la alterări drastice în structura proteinei. Se înţelege că un astfel de fenomen duce la avortul clasei
respective de limfocite B. Numai mutaţiilor somatice reuşite care au loc în limfocite şi ca urmare
achiziţionează o creştere a afinităţii imunoglobulinei pentru antigen sunt promovate în procesul de clonare.
 1.5.5.5. Controlul recombinării şi expresia genelor imunoglobulinelorîn ţesuturile specifice
□ Controlul recombinării pe parcursul dezvoltării
Mecanismul de control al rearanjării genelor care are loc pe timpul dezvoltării limfocitului B virgin (nu a
luat contact cu un antigen) nu este încă prea bine cunoscut. Suntem siguri, însă, că recombinarea genelor
imunoglobulinelor este controlată de către gene. Nu poate fi altfel explicat de ce rearanjarea genei V, D, J are
loc într-o manieră succesivă şi cu respectarea fenomenului de exclusie alelică care are loc în cele două
cromatine ale cromosomului limfocitului B.
Exclusia alelică este un proces care are loc în limfocitul B atunci când are loc expresia genelor lanţului
greu şi uşor. Ea constă în următoarele: dacă recombinarea care are loc în structura unei genei este productivă
(sintetizează imunoglubuline normale), atunci o astfel de recombinare se petrece numai pe unul din
cromozomii homologi. într-o astfel de situaţie nu se mai produce nici un fel de recombinare pe cromozomul
omolog. Dacă însă rearanjarea genelor imunoglobulinelor pe unul din cromosomii omologi nu este o reuşită,
atunci rearanjarea genei se declanşează şi pe cromozomul omolog.
■ Rearanjamentele fragmentelor genei au loc într-o succesiune precisă
De exemplu: fragmentele care se leagă primele sunt genele regiunii variabile ale lanţului greu DH cu JH.
Numai după ce acest eveniment s-a înfăptuit are loc legarea de acest complex şi a segmentului VH.
Trebuie menţionat că rearanjările lanţului greu precede rearanjarea genelor lanţului uşor. Se pare că
celulele limfocitului B încearcă să rearanjeze genele imunogobulinei, până la obţinerea unei recombinări
funcţionale atât pentru lanţurile grele, cât şi pentru cele ale lanţului uşor. Odată ce acest lucru s-a înfăptuit
apare o blocare a rearanjării, pe mai departe, a genei.
Toate aceste constatări vin să sprijine ideia că procesul de rearanjare a genelor imunoglobulinelor sunt
coordonate de alte gene şi în consecinţă ele nu se înfăptuiesc la întâmplare.
□ Controlul expresiei genei în ţesuturile specifice
Expresia genei imunoglobulinelor este foarte fin controlată. Este strict necesar ca expresia genelor
imunoglobulinelor să aibe loc numai în limfocitele B şi numai după ce genele au fost rearanjate. Momentul
constă în următoarele: Fiecare segment de gene VH şi VL este procedat de un promotor care iniţiază
transcripţia genei lanţului greu rearanjată. Segmentul V al genei are un promotor format din opt nucleotide
(TATATATA) ale boxei TATA care se aliniază în aval de ea, în locul unde se iniţiază transcripţia. Boxa
TATA este recunoscută de către o enzimă numită polimeraza ARN II care catalizează transcripţia genei
imunoglobulinei în molecula de ARN-m. Prezenţa promotorilor este obligatorie, pentru că în cazul în care
promotorii genei V sunt pierduţi (deletate) atunci transcripţia genei imunoglobulinei nu va mai avea loc.
Alături de promotori se mai găseşte şi o regiune formată dintr-o înşiruire de câteva zeci de nucleotide care
pot modula expresia genei. Această regiune a ADN este cunoscută sub numele de amplificatori sau enhancer.
Ei sunt de mare importanţă pentru funcţionarea completă a promotorului genei V, precum şi pentru expresia
în ţesuturi specifice ale genelor imunoglobulinelor.
Este interesant de specificat că secvenţele amplificator sunt localizate într-un intron aşezate între
segmentul de genă J şi C al genelor lanţului greu, precum şi a lanţului K uşor, de la om, dar nu şi în genele X
de la şoarece. În mod obişnuit ele sunt prezente pe aceiaşi catenă al ADN-ului în calitate de gene de
control. Poziţia lor poate să fie situată, fie alături, fie la o distanţă mai mare de 500 pb unele de altele
(acţiune cis).
■ Cum acţionează secvenţele amplificator ?.
Se presupune că specificitatea de funcţionare a celulelor este dată de prezenţa proteinelor enhacer
(amplificator). Prin urmare pentru imunoglobuline ele trebuie să fie specifice unui ţesut dat şi să
acţioneze numai în limfocitele B, şi împreună cu promotorul regiunii V. In interiorul regiunii se mai
găsesc aşa numiţii factori nucleari de legare şi transcripţie a genelor. Ei contribuie în mod esenţial la
declanşarea expresiei genei. În cel puţin cinci locuri înăuntrul regiunii „enhancer" al lanţului K s-au
găsit factori nucleari de legare şi transcripţie.
Un situs de legare conţine un octamer de secvenţe consens şi legături pentru cel puţin 2 factori de
transcripţie. Ei sunt: Oct-1 şi Oct-2. Factorul Oct-2 este specific numai pentru celulele limfoide. Se pare
că acest factor dă specificitatea de ţesut al regiuniii amplificator.
Transcripţia genelor imunoglobulinelor are loc numai după ce s-a săvârşit rearanjarea ADN-ului în
limfocitul B. Şi aceasta pare a fi legată de specificitatea de ţesut a amplificatorilor care declanşează
expresia genelor imunoglobulinelor.
■ Există rearanjări ale genelor imunoglobulinelor şi în structura ARN-m după transcripţia
acestora.
Şi rearanjările care se înfăptuiesc în structura ARN-m după sinteza acestuia pot duce la creerea de
variabilitate în structura anticorpilor. S-a observat, că rearanjările ADN-ului din zona genelor V, J, D
este suficientă doar pentru declanşarea transcripţiei genei imunoglobulinei pe molecula de ARN-m. Până
la declanşarea sintezei imuno-globulinei codificate mai au loc, încă, „rectificări" ale moleculelor de
nucleotide din ARN-ul mesager primar nou sintetizat. Multe secvenţe de nucleotide din ARN-m pot să
fie înlocuite înainte de translaţie. S-a demonstrat că în ARN-m primar al lanţului K la şoarece, splicingul
(îndepărtarea intronilor) are loc în două etape. Unul constă din îndepărtarea intronilor, urmată de legarea
exonilor care codifică peptidele lider cu segmentele V şi apoi C. Acest proces are loc înainte de
ajungerea ARN-m în citoplasmă. Ultima etapă a splicingului este înlocuirea intronilor care separă
secvenţele V şi C făcând astfel ca regiunile codificatoare V şi L să devină contigue una faţă de alta.
o Rezumat
Rearanjările genelor imunoglobulinelor în ontogonia limfocitelor B se desfăşoară după anumite
reguli. Acestea sunt următoarele în:
□ Lanţurile uşoare
ADN care codifică regiunea variabilă a lanţurilor uşoare este divizat în două familii de segmente de
genă VL şi JL. Segmentul de genă VL codifică majoritatea domeniilor variabile ale anticorpilor formate
din 96-110 aminoacizi. Restul domeniului este codificat de segmentul de genă JL. Aria segmentelor VL şi
JL se întinde şi pentru lanţurile K şi X. Fiecare dintre ele este aranjată în tandem (unul după altul) în
lungul cromosomului pe care se găseşte. Numărul precis de segmente în fiecare genă şi organizarea lor
variază de la o specie de animal la altul. In decursul dezvoltării celulelor B un segment VL şi altul JL sunt
selecţionate din fiecare arie ale segmentelor similare şi sunt apoi legate împreună. Acest proces de legare
implică rearanjarea ADN-ului aşa încât segmentul V şi J să fie aduse şi puse alături unul de altul. După
ce acest fenomen s-a înfăptuit are loc şi legarea complexului de fragment V-J de regiunea constantă a
lanţului uşor (CL) formând în acest fel gena funcţională codificatoare a lanţului uşor al imunoglobulinei.
□ Lanţurile grele
ADN care codifică regiunea variabilă a lanţului greu (VH) este divizat în trei familii de segmente şi
nu în două ca cea a lanţului uşor. Acestea sunt segmentele VH DH (variabile) şi JH de legătura (Joint).
Câte un segment de gene va fi selectat din fiecare familie şi apoi legate împreună pentru a forma gena
funcţională care produce domeniul variabil al lanţului greu, funcţional al anticorpului (imunoglobulină).
Prima legătură se face între segmentul DH şi JH formând unitatea DH – JH. Al doilea pas al procesului
constă în legarea de această unitate (DH - JH) şi a segmentului VH.
Genele care codifică regiunile constante ale lanţului greu (CH), în număr de -100 sunt de asemenea
aranjate şi ordonate în arii specifice de-a lungul cromozomului realizând, o formaţiune, cu următoarea
succesiune: C(l urmată de C6, Cy şi aşa mai departe. Gena regiunii constante a imunoglobulinei pentru
fiecare isotip conţine mai mulţi exoni codificatori. Fiecare exon codifică separat un domeniu funcţional
constant. Odată ce s-a format unitatea funcţională V-D-J aceasta poate să se asocieze cu diferite gene ale
regiunii constante formând ceea ce se numeşte o clasă comutator de isotipuri (switch isotips) care
produce o schimbare a funcţiei efectoare a imunoglobulinei. Ea se produce însă fără să altereze
specificitatea de legare a antigenului.
□ Generarea diversităţii anticorpilor
1) Oricare din segmentele de genă VH DH şi JH sau VL şi JL din genofondul prezent în linia germinală
poate să fie selectat şi legat împreună pentru a produce o regiune variabilă a lanţurilor uşoare şi grele.
2) Mecanismul de legare este imprecis. In molecula de ADN răspunzătoare de sinteza
imunoglobulinelor se mai pot insera şi aşa numitele secvenţe N aduse aici din afara ADN-ului. Rezultatul
va fi formarea unor altfel de legătură între segmentul V, D şi J care dau naştere unor regiuni variabile cu
specificitate diferită de legare a antigenului.
3) Mutaţiile somatice pot să aibă loc după rearanjarea ADN-ului. Aceasta duce la o sporire a
diversităţii anticorpilor.
4) Oricare lanţ uşor poate să se asocieze cu oricare lanţ greu pentru a forma un situs diferit de legare a
antigenului.
 1.5.6. Genele receptorilor celulelor T
Limfocitele T nu recunosc antigenii nativi, ci numai după ce ei au fost internaliazaţi de fagocite,
fragmentaţi în peptide şi legate, apoi, de moleculele MHC cl. II şi afişaţi pe membrana fagocitelor care se
numesc prezentatoare de antigen.
Recunoaşterea antigenilor se realizează cu ajutorul receptorilor de membrană. Ei sunt de natură proteică şi
sunt sintetizaţi de propriul genom. Se cunosc două tipuri de receptori T şi anume: receptori αβ (sau TcR2) şi
receptori γδ (sau TcR I).
□ Structura receptorului αβ şi γδ a limfocitelor T
A fost elucidată cu ajutorul anticorpilor monoclonali. Ei nu sunt imuno-globuline ca şi receptorii celulelor
B, ci sunt nişte proteine lineare formate din mai multe lanţuri (catene). Ele se sintetizează separat şi apoi se
unesc una cu alta cu ajutorul legăturilor disulfitice după care sunt apoi glicozilate formând aşa numiţii
heterodimeri (două molecule diverse unite între ele). Receptorii de membrană T (ai limfocitelor T), similar cu
receptorii limfocitelor B (imunoglobuline) posedă două domenii. Unul în afara membranei numit domeniul
extracelular, cu structura foarte variabilă şi altul aşezat în interiorul membranei numit domeniul trans
membranar precum şi un domeniu mai scurt intracelular (Fig.8 şi 18 b). Domeniul transmembranar are o
structură constantă (succesiunea aminoacizilor este constantă) de la o celulă la alta. Domeniul
extramembranar este variabil (V) şi este format din aproximativ 20 de aminoacizi între care predomină
cisteina. El se leagă de domeniul constant (C) transmembranar şi citoplasmatic care este foarte bogat mai ales
în aminoacidul lizină. în limfocitul virgin (care nu a avut contact cu antigenul), receptorul de membrană se
mai numeşte şi receptor CDR3 (cluster diferentiation receptor).
La fel ca şi receptorii limfocitelor B şi domeniul extracelular al receptorilor T au, în regiunea variabilă, o
zona hipei-variabilă unde succesiunea aminoacizilor este foarte diferită de la o celulă la cealaltă. Cu ajutorul
acestei zone receptorul limfocitului T se leagă de complexul peptide-MHC de pe membrana celulelor
prezentatoare de antigen, care constituie singurul tip de antigeni pe care el îl poate recunoaşte.
Receptorii limfocitelor T se modifică structural şi funcţional pe parcursul ontogeniei lor, dar mai ales
după ce ei vin în contact cu antigenul prelucrat şi afişat pe membrana celulelor prezentatoare de antigen. Ei se
transformă odată cu diviziunea de diferenţiere a limfocitului T. Ţesuturile unui fetus care nu a venit încă în
contact cu antigenul prelucrat are un anumit tip de receptor, iar limfocitul T „instruit" adult sau activat în
urma contactului cu antigenul are un alt tip de receptor de membrană. Limfocitul T„virgin" posedă receptorul
CDR3 (cluster diferentiation receptor), iar cel activat CDR4 pentru limfocitul T helper şi CDR8 pentru
limfocitul citotoxic.
□ Genele receptorilor T
Sunt cunoscute patru gene diferite care codifică polipeptidele care constituie receptorii T: α, P, γ, δ. Ele
sunt aranjate foarte asemănător cu cele ale.lanţurilor grele şi uşoare ale imunoglobulinelor. In toate cazurile
zonele de ADN cu informaţie pentru structura receptorilor sunt divizate în două regiuni sau genofonduri. Una
pentru domeniile variabile ale receptorului care este divizată în mai multe segmente de gene şi alta este
regiunea ocupată de gene care codifică domeniul sau regiunea constantă a receptorilor.
 Trebuie să subliniem că în genele receptorilor limfocitelor T se petrec rearanjări între fragmentele de gene
încă înainte ca ele să fie transcrise în moleculele ARN-m şi apoi translate în molecula de proteină.
1.5.6.1. Organizarea genelor lanţurilor β ale receptorilor CDR
Şi domeniul variabil a lanţului β este codificat de trei segmente de gene denumite Vβ Dβ şi Jβ asemănător
cu ceea ce se realizează la imunoglobuline. In figura 19 redăm o schiţă a structurii locusului responsabil de
sinteza receptorului β la şoarece. Să se observe că baza genetică a domeniului variabil al receptorilor T este
foarte asemănătoare cu organizarea genelor lanţului greu ale imunoglobulinelor. Segmentele regiunii
variabile Vβ sunt aranjate pe arii mici, aşezate una după alta (în tandem) de-a lungul cromozomului şi în
amonte de segmentele Dβ şi Jβ.(Fig. 19).
 La şoarece segmentele genei variabile Vβ sunt localizate pe o arie de cea 330 kb în amonte de celelalte
segmente ale domeniului variabil (Dβ şi Jβ). Acestea sunt orientate în opoziţie transcripţională faţă de celelalte
segmente ale domeniului variabil, dar în aval de gena care codifică domeniul constant Cβ2 al receptorului.
Dintr-o astfel de organizare rezultă şi posibilitatea imensă de recombinare a genelor receptorilor pe parcursul
diviziunilor celulei.
Mai trebuie să subliniem şi faptul că organizarea segmentelor Dβ şi Jβ ale domeniului variabil, precum şi
exonii domeniului constant (Cβ) este diferită faţă de cea existentă pentru lanţurile grele la imunoglobuline
(fig.14).
În zona ADN-ului care răspunde de sinteza receptorilor T a fost găsită şi o duplicaţie (zonă dublă
provenită din translocaţie) care conţine segmentele Dβ şi Jβ ale genei precum şi gena domeniului constant Cβ .
în avalul segmentelor Vβ există un singur segment Dβ numit Dβ-1 care este situat separat de alte 7 segmente Jβ
(1-7) prin intermediul a cea 600 de perechi de baze.
Fiecare segment Jβ codifică între 15-17 aminoacizi din regiunea variabilă a receptorilor dar numai şase
sau şapte sunt funcţionali. Alături de acesta se mai găseşte şi ultimul segment Jβ, denumit Jβ-7 şi care se
învecinează cu exonul Cβ-l. Această duplicaţie a genei lanţului β rezultă din prezenţa unor segmente
secundare ale setului de segmente Dβ, Jβ şi Cβ. Dintr-un număr de şapte astfel de segmente Jβ numai şase sunt
funcţionale, la şoarece, dar sunt total funcţionale la om.
Pentru domeniul constant Cβ, fiecare genă este împărţită în patru exoni şi anume: primul codifică acelaşi
domeniu ca şi cel al imunoglobulinei, la care se adaugă o parte din peptidele care leagă domeniul extracelular
al receptorului, cu regiunea transmembranară. Următorii aminoacizi care au mai rămas din acest domeniu de
conexiune sunt codificaţi de cel de al doilea exon, precum şi de partea treia a acestuia care codifică regiunea
transmembranară a receptorului. Există şi patru codoni pentru „coada" citoplasmatică a receptorului T.
Aceasta sugerează că la baza producerii acestui domeniu, cu structura similară, stau două gene şi nu una
singură.
1.5.6.2. Organizarea genelor pentru lanţul α
Domeniul variabil al genei lanţului a este compus din două segmente şi anume: segmentul V şi
segmentul J. Organizarea acestei gene cu două segmente o redăm în schema din figura 20.
 Din figura de mai sus se poate constata că şi pentru acest fel de receptor, ca şi pentru receptorul
limfocitului B există o familie de segmente ale genei regiunii variabile, care sunt localizate împreună sub
forma unor suprafeţe (array) aşezate în tandem (una după alta).
Numărul de gene care răspund de sinteza domeniului variabil al receptorului celulelor T este estimat la un
total de 50-100. Segmentele Vα pot să fie împărţite în cel puţin 10 familii. Fiecare familie de segmente este
compus din una până la 10 membrii.
Segmentele genei Jα se întind, în genomul celulei pe o distanţă de aproximativ 100 kilobaze. Repertoarul
genei Jα este foarte mare. El cuprinde aproximativ 50 de segmente de genă. Trebuie să recunoaştem că
aceasta reprezintă un număr considerabil de segmente, care întrece cu mult numărul lanţurilor receptorilor
limfocitelor T, dar şi a genelor imunoglobulinelor.
Gena care determină regiunea constantă (Cβ) a receptorului este şi ea împărţită în trei exoni. Primul
exon care codifică partea extramembranară a regiunii constante receptorului limfocitului T are o structură şi
configuraţie asemănătoare cu ce-a a buclelor imunoglobulinelor. Cel de al doilea exon codifică peptidele care
leagă lanţul de peptide care sunt incluse în regiunea transmembranară a receptorului. Al treilea exon codifică
atât regiunea transmembranară a receptorului, precum şi regiunea „cozii" citoplasmatice a acestuia.
1.5.6.3. Organizarea genelor pentru lanţul γ
S-a dovedit experimental că lanţul γ al receptorului limfocitului T este interconectat cu lanţul 6 al acestuia,
formând un heterodimer, legate împreună de către punţi disulfitice. In felul acesta se formează un al doilea
tip de receptor faţă de cel format din lanţurile α şi β Fiecare dintre ele sunt determinate în sinteza lor, de către
gene proprii, poziţionate asemănător pe ADN, dar identice una faţă de cealaltă. In figura 21 redăm
organizarea genelor lanţului δ şi γ pe catena de ADN a acestor gene şi o comparaţie între structura lanţurilor
α,β,γ ale receptorilor limfocitului T.
Din figura 21 se poate observa că genele domeniului variabil al receptorului γ sunt împărţite în două
segmente ale genei funcţionale şi anume: segmentul Vγ, şi segmentele Jγ Dδ..
Ele sunt diferite la şoarece faţă de om. La şoarece segmentul V este format dintr-un set de 7 segmente
(Vγ), din care numai şase sunt combinaţii funcţionale. La om, însă, există 8 segmente ale genei Vγ dar care
sunt grupate în patru subgrupe.
La oameni organizarea genelor pentru lanţul γ al receptorilor limfocitului T este oarecum diferită de cea de
la şoarece. Aici numai două segmente ale genei Cγ (a domeniului constant) sunt separate unele de altele de
către un sector de ADN format din 20 kilobaze, spre deosebire de situaţia de la şoarece, unde patru gene
contribuie la producerea acestui domeniu al receptorilor.
Trei dintre segmentele Jγ sunt aşezate în aval de gene Cγ-1 şi două în amonte de gena Cγ-2. Toate aceste
segmente J ale genei sunt utilizate pentru a sintetiza lanţul γ al receptorului limfocitului T uman.
 Genele Cy sunt împărţite în trei exoni cu contribuţii diferite la sinteza receptorului în întregimea sa. Primul
codifică domeniul extracelular, al receptorului, al doilea codifică peptidele pentru domeniul transmembranar
al receptorului şi al treielea codifică cei 12 aminoacizi din domeniul cozii citoplasmatice al receptorului.
Subliniem că gena Cγ-1 conţine mai mulţi codoni ai aminoacidului cisteină, care este componentul de bază
a domeniului extramembranar al receptorului. Datorită cisteinei se pot realiza legături disulfitice pentru a
putea realiza heterodimerul lanţului γ-δ caracteristic receptorului T. Dimpotrivă gena Cγ-2 nu conţine codoni
pentru cisteină şi în consecinţă nu se pot forma legături disufidice între lanţurile γ şi σ al receptorului (fig.
22).
 1.5.6.4. Organizarea genelor pentru lanţul δ (delta) al receptorului limfocitului T
Am precizat mai sus că lanţul de proteină γ se alipeşte de lanţul δ şi formează un heterodimer, constituind
receptorul de membrană al limfocitului T. Acest proces are loc în timus pe parcursul ontogeniei limfocitului
T, când la mijlocul locusului genei delta (δ) se interpune o zonă codificatoare care separa una de alta familia
V de familia J al receptorului.
Organizarea genei lanţului delta este neobişnuită şi constă în aceea că segmentele genei Vδ sunt localizate
în interiorul segmentului Vα începând de la capătul 3'. Reamintim că domeniul variabil al acestui lanţ este
codificat de către un număr de două sau trei segmente Dδ şi Jδ.
1.5.6.5. Rearanjările genelor receptorului limfocitului T
Mecanismul recombinărilor segmentelor de gene care au drept ţintă formarea unei gene funcţionale în
genomul limfocitului T, este similar cu cel care se desfăşoară în genele imunoglobulinelor sintetizate de
limfocitul B. Şi aici se petrece o combinaţie şi recombinaţie a genelor multiple în celulele liniei germinale,
pentru a genera un repertoar extrem de divers al receptorilor limfocitului T. De asemenea pe parcursul
diferenţierii (maturării) limfocitului T, de la celula hematoformatoare la limfocitul adult, au loc o serie de
recombinări între segmentele de gene care codifică receptorii de membrană.
Să ne reamintim că recombinarea între genele care codifică imunoglobulinele în limfocitul B are loc în
două faze. Recombinarea genelor în limfocitele T are loc tot în două faze: una în faza embrionară a
individului şi alta în celulele T mature ale adultului. De exemplu, în ficatul fetusului segmentele genei
codificatoare ale peptidelor care constituie receptorul T, sunt separate unele de altele, formând mănunchiuri
(familii) de segmente similare, de-a lungul cromosomului. în limfocitul T matur segmentele aceloraşi gene
care codifică domeniului variabil al receptorului sunt rearanjate aşa încât ele devin mult mai strâns legate
împreună, devenind contigue (suprapuse pe o porţiune ale capetelor) cu cele ale domeniului constant.
 Fenomenul decurge în felul următor: în primul rând are loc legarea împreună a segmentelor domeniului
variabil (V) şi numai în al doilea rând are loc asocierea acestora la genele domeniului constant (C) al
polipeptidelor receptor T.
Se pare că mecanismul de legare a acestora este similar cu cel descris la genele irnunoglobulinelor.
Aceleaşi secvenţe de nucleotide consens heptamer şi nanomer care flanchează segmentele variabile ale genei
lanţurilor grele şi uşoare la gena imunoglobulinei, flanchează şi segmentele genei regiunii variabile ale
receptorului limfocitului T, pentru toate cele patru gene α, β,γ, δ (fig.23).

Mai mult decât atât, secvenţele consens sunt de asemenea separate de o zonă de nucleotide formate,
fiecare, din câte 12-23 de nucleotide descrisă cu ocazia rearanjării genelor irnunoglobulinelor (regula 12-23
nucleotide).
Toate segmentele genei V ale receptorului T au secvenţe heptamer şi nanomer (7 şi respectiv 9 nucleotide)
separate între ele de câte 23 de perechi de baze sau două spire ale răsucirii dublului helix începând cu direcţia
3'. Pe partea 5' al segmentelor Dβ şi Dγ, secvenţele consens se găsesc într-o orientare inversă, dar separată de
cele 12 nucleotide. Se ştie că o singură buclă a spirei helixului ADN poate să recunoască un semnal. Pe
capătul 3' ele sunt separate de 23 nucleotide. In acest caz două bucle ale spirei recunosc un semnal. Pe latura
5' al fiecărui regiuni J, segmentele sunt separate unele de altele de către un semnal cu un singur sens.
Pentru genele β şi δ sunt selectate mai întâi segmentele D şi J după care urmează legarea lor împreună.
Aceast complex D-J se leagă apoi şi de segmentul V selectat în prealabil. In acest fel se formează o unitate
funcţională numită V-D-J.
Segmentul genei Dβ-1 poate să se rearanjeze întâmplător, fie cu familia Jβ, fie cu Jβ-1 sau Jβ-2. În acest fel
rezultă o mare diversitate de structură a lanţului β şi δ a receptorilor celulelor T.
 Pentru genele δ şi γ care nu posedă segmentele D au loc rearanjări numai între segmentele V-J. Este
aproape sigur că rearanjarea segmentelor genelor lanţurilor α, β, γ şi δ este controlată de către timus.
1.5.6.6. Geneza diversităţii receptorului limfocitului T
Existenţa unui mare număr de segmente în cadrul fiecărei gene (genele V, D, J) care participă la sinteza
polipeptidelor care devin receptori de membrană pentru limfocitul T, dar care în fiecare diviziune se pot
recombina în toate felurile la care se adaugă achiziţionarea de regiuni V, are ca rezultat realizarea unor gene
unice de o diversitate aproape infinită.
In tabelul 2 redăm o estimare rearanjărilor posibile care se repercutează în creerea diversităţii structurii
receptorilor αβ, pe deoparte şi γδ, pe de altă parte. Să se observe că diversitatea lor depăşeşte ordinul de
mărime 1015 şi respectiv 1018.

Tabelul 2. Diversitatea celulelor receptorilor T

TCRαβ TCRγδ
α β γ δ
Segmentele genelor V 100 25 7 10
Segmentele genelor D 0 2 0 2
Segmentele genelor J 50 12 2 2
Segmentele Ds prezentate în - frecvent - frecvent
toate situsurile
Adiţia regiunii N V-J V-D, D-J V-J V-D, D-D,
D-J
Combinaţiile regiunii variabile 2500 70
Combinaţiile joncţionale 1015 1018

Dacă la acestea se mai adaugă şi formarea unor receptorii de legare a antigenului, prin asocierea lanţurilor
α şi β, precum şi a celor γ, δ care duce la formarea de noi receptori cu structură şi funcţie diversă,
variabilitatea receptorilor T sporeşte şi mai mult.
1.5.6.7. Controlul recombinării genelor receptorilor T
Recombinările fragmentelor din constituţia genelor care participă la sinteza receptorilor de membrană a
limfocitelor T, ca şi în cazul limfocitului B, sunt conduse genetic, în decursul dezvoltării individului şi a
ontogeniei celulelor T. Argumentul în favoarea acestei afirmaţii o constituie faptul că cinetica recombinărilor
are loc după un program prestabilit, în dezvoltarea embrionului de şoarece. Aici primele recombinări au loc
în genele lanţului γ şi δ şi numai ceva mai târziu fenomenul are loc şi în genele lanţurilor α şi β. Se ştie că la
vârsta de 4 zile a embrionului, transcripţia informaţiei de pe genele lanţurilor γ şi δ se realizează deja cu
destul de mare intensitate. Dimpotrivă sinteza lanţurilor α şi β are loc cu o oarecare întârziere. Transcripţia
genelor, însă, nu începe decât după ce embrionul atinge vârsta de 15 zile.
 Partea a 2-a
IMUNOMODULAREA PRODUCȚIILOR ANIMALE
Curs 3 Imunomodularea producțiilor animale
Agricultura este o afacere foarte complexă. Omul care face afaceri în agricultura are ca scop fundamental
producerea laptelui, a cărnii şi a ouălor, a grâului şi a furajelor, cu ajutorul animalelor şi a plantelor.
Produsele pe care le obţine fermierul cu zootehnie, constituie o marfă, iar animalele, solul şi plantele sunt
mijloacele de producţie cu ajutorul cărora el transformă materia primă (furajele) într-o marfă. O afacere
are succes numai dacă marfa obţinută este de calitate superioară, se obţine în cantitate cât mai mare, de la un
mijloc de producţie şi se produce la costuri cât mai joase. Aceasta presupune că şi materiile prime
reprezentate prin furaje, trebuie să fie ieftine şi de calitate superioară.
Numai ştiinţele naturii şi tehnologia, ştiinţele economice,şi sociale, informatica şi cele de piaţă aplicte cu
pricepere, cu atenţie şi perseverenţa pot să ne ajute să respectăm regulile fundamentale ale unei afaceri de
succes. Alegerea cunoştinţelor din mulţimea de domenii ale ştiinţelor, şi articularea lor într-un tot unitar în
scopul de-a le folosi pentru obţinerea de marfă vandabilă şi rentabilă, constituie o ştiinţă aparte, cunoscută
sub denumirea de inginerie.
Deşi ingineria are reguli general valabile pentru toate produsele este totuşi specifică pentru fiecare tip de
marfă, pe care o obţine omul într-o afacere. Prin urmare marfa ca să fie rentabilă trebuie să se realizeze pe
baza unei inginerii a produsului, în care toate activităţile converg spre un singur ţel şi anume: obţinerea de
produse de calitate superioară şi la costuri joase.
Orice domeniu al ştiinţei, prin cunoştinţele pe care le oferă, poate contribui la rentabilizarea produselor
obţinute în zootehnie. Cunoaşterea elementelor sistemului imun şi a modului lor de intercondiţionare în
funcţionare şi la parametrii necesari unei situaţii concrete, existente în organism la un moment dat, poate
contribui la rentabilizarea produselor obţinute din zootehnie, cu ajutorul animalelor.
Pe baza înţelegerii mecanismelor şi a modului cum ele funcţionează, specialistul poate elabora
biotehnologii care să-1 ajute pe fermier să obţină marfă mai multă pe unitatea de timp şi mijloc de producţie,
de o mai mare calitate şi mai ieftină.
In zilele noastre s-a conturat un nou domeniu de activitate în zootehnie. El se numeşte "imunomodularea
producţiilor animalelor". Metodele care le foloseşte, se bazează pe mecanismele imunomodulatoare, care se
petrec în mod natural în organism şi care însemnează iniţierea deliberată a unui răspuns imun, intensificarea
activităţii sale şi menţinerea la acest nivel o anumită perioadă de timp sau inhibarea acesteia, atunci când
răspunsul intens nu mai este necesar momentului.
S-au obţinut, deja, progrese în modularea sistemului imun pe cale artificială, cu consecinţe pozitive în
ameliorarea costului produselor obţinute în zootehnie. Prin imunomodulare se pot obţine performanţe mai
bune, în reproducerea asistată a animalelor, precum şi în dirijarea sau manipularea funcției de creştere şi
dezvoltare a ţesuturilor (muscular, adipos, osos), a funcţiei de apărare, a funcţiei de digestie şi absorbţie,
precum şi a funcţiilor glandei mamare.
 In cele ce urmează vom descrie câteva căi de conducere, prin imunomodulare, a producţiei obţinute de la
animale.

2.1. Imunomodularea sistemului imun, pentru sporirea rezistentei la îmbolnăviri

□ Vaccinarea este o cale de întărire eficientă a sănătăţii animalelor

Întărirea sănătăţii animalelor este pârghia cea mai eficientă în realizarea producţiilor animale. Cu ajutorul
ei fermierul poate să menţină în funcţiune un timp îndelungat mijloacele sale de producţie - animalele. Numai
un animal sănătos poate performa superior în cât mai multe cicluri de producţie. Din această cauză
biotehnologii caută soluţii mai eficiente pentru întărirea sănătăţii animalelor. Una dintre ele este obţinerea de
vaccinuri pe căi neconvenţionale, mai sigure, mai eficiente, mai ieftine şi mai uşor de păstrat.
Cunoaşterea faptului că imunitatea mediată celular se pune în funcţiune în mod natural datorită depistării
de către macrofage a antigenilor străini, din structura microorganismelor sau a moleculelor care străbat prima
barieră de apărare (piele, mucoase), urmată de declanşarea şi punerea în mişcare a sistemului imun adaptativ,
a condus la ideea că şi aducerea deliberată, pe cale parenterală a structurilor străine într-un organism, ar putea
declanşa înfăptuirea unui proces asemănător. Se ştie că recunoaşterea de către celule sau anticorpi a
antigenului străin ca urmare a apariţiei celulelor de memorie, cu viaţă lungă, duce cu siguranţă, la sinteza şi
apoi vărsarea în plasma sangvină a anticorpilor specifici împotriva structurilor străine, care pot rămâne în
circulaţie ani de zile.
Practica a dovedit că un astfel de fenomen se înfăptuieşte indiferent dacă microorganismul, care poartă
antigenul cu epitopii lui, se găseşte pe suprafaţa membranei unui microorganism viu sau este omorât. De aici
şi până la folosirea microorganismelor care produc boli la oameni şi animalele domestice, omorâte sau care
posedă o activitate infecţioasă atenuată, în calitate de declanşatori ai reacţiei imune specifice, nu a fost decât
un pas. Vaccinarea oamenilor şi a animalelor împotriva unor boli infecţioase cu microorganisme omorâte sau
cu virulenţa atenuată, se realizează în scopul întăriri rezistenţei organismului împotriva acestora. Scopul este,
să creeze, deliberat, în organism apariţia celulelor imune de memorie şi a anticorpilor, pentru ca organismul
să fie pregătit şi să poată învinge, atunci când el se va întâlni în realitate cu agentul infecţios virulent.
Trebuie să recunoaştem că vaccinarea animalelor constituie o modalitate de modulare deliberată a
sistemului imun. Modularea sistemului imun, în scopul exacerbării funcţiei unor categorii de celule
participante la apărare contra intruşilor, mai poate fi realizată şi prin adaosul parenteral de citokine aşa cum
sunt interleukinele, interferonii, factorii de creştere sau factorul necrozant al tumorilor (TNF). Toate acestea
nu fac altceva decât să reproducă procese naturale de activare a reacţiei imune, făcându-le să funcţioneze mai
intens şi prin această să devină mai eficiente. Realizarea de vaccinuri pe cale neconvenţională, folosind doar
epitopi ai antigenelor din compoziţia membranelor, a bacteriilor sau a capsidei virusurilor şi nu
microorganismul în totalitatea lui, constituie cea mai modernă cale de imunomodulare a rezistenţei
organismului la îmbolnăviri.
 2.1.1. Principiile generale ale vaccinării, tipurile de vaccinări

Acţiunile de vaccinare au un rol deosebit în profilaxia şi combaterea bolilor infecţioase ale animalelor,
acţiune ce trebuie corelată cu un complex de măsuri antiepizootice.
Într-o zootehnie modernă, unde în multe boli sunt recomandate şi se produc simultan pentru utilizare în
practică mai multe tipuri de vaccinuri contra aceleaşi boli, se impune mai mult ca oricând, alegerea variantei
optime de vaccinare în funcţie de avantajele şi dezavantajele pe care le are vaccinul.
Toate cercetările în domeniul imunoprofilaxiei trebuie să fie axate nu doar pe amplificarea acţiunilor
imunoprofilactice, ci mai ales pe eradicarea a cât mai multor boli infecţioase.
Vaccinurile, în general, se utilizează, atât în profilaxia efectivelor îndemne, cât şi în focare pentru
vaccinarea de necesitate a animalelor sănătoase. In funcţie de gravitatea bolii şi modul de difuzare al acestora,
precum şi în funcţie de cunoaşterea cu exactitate a agentului etiologic principal, unele vaccinări se execută în
mod obligatoriu pe tot cuprinsul ţării, iar altele se execută numai în anumite zone, fie profilactic, fie de
necesitate.
Rezultatele vaccinării sunt diferite. In unele cazuri rezultatele postvaccinale sunt deosebit de eficiente, iar
în alte cazuri eficienţa vaccinurilor este mai slabă. Vaccinurile inactivate, spre deosebire de cele produse din
microorganisme omorâte, conferă în general o imunitate mai slabă şi de scurtă durată Ia animale. în general
vaccinarea implică un antigen care se administrează omului sau animalelor derivat de la un agent infecţios în
scopul de a obţine un răspuns imun care să pună sub protecţie, pe termen lung, indivizii vaccinaţi împotriva
agentului etiologic în cauză. Poate fi considerat un vaccin ideal, acela care asigură imunitate rapidă şi de
lungă durată, care nu necesită cheltuieli mari pentru obţinerea lui şi nu produce efecte secundare
postvaccinale.
Obţinerea oricărui vaccin necesită respectarea următoarelor criterii:
1) Primul criteriu se referă la identificarea absolută a microorganismului care produce în mod direct
boala.
Pe parcursul cercetărilor întreprinse în domeniul imunoprofilaxiei în numeroase cazuri sau produs şi erori
în obţinerea şi utilizarea unui vaccin care să dea rezultate bune în profilaxia şi combaterea unor boli. O mare
parte dintre erori pot fi puse fie pe seama dificultăţilor întâlnite în identificarea agentului etiologic, pe de o
parte, fie din cauza interpretării greşite a rolului pe care îl joacă microorganismele luate în considerare, în
evoluţia boli, pe de altă parte.
2) Al doilea criteriu îl reprezintă cunoaşterea puterii imunogene a vaccinului întrebuinţat, atât din punct de
vedere al eficienţei lui, cât şi a perioadei de timp necesar pentru ca vaccinul să fie capabil să pună sub
protecţie animalele împotriva unei anumite boli.
In anemia infecţioasă a calului precum şi în boala aleutină de la nurci, răspunsul imun însuşi este
responsabil pentru multe din stadiile evolutive ale bolii.
 În unele boli infecţioase s-a putut constata că imunitatea instalată după vaccinare este trecătoare şi într-o
perioadă scurtă de timp. în altele vaccinul s-a dovedit a fi ineficient astfel că animalele care au fost vaccinate
au devenit complet susceptibile la reinfecţie.
3) Al treilea criteriu se referă la cunoaşterea avantajelor şi dezavantajelor obţinute prin utilizarea unui
vaccin.
În unele cazuri de boală dozarea anticorpilor se poate face cu uşurinţă, după vaccinare, prin teste simple de
laborator. In alte cazuri de boală detecţia anticorpilor după vaccinare necesită o muncă laborioasă, bazată pe
tehnici serologice fapt ce îngreunează diagnosticul şi eradicarea bolii.
Acţiunea de vaccinare trebuie analizată şi din punct de vedere economic astfel că înainte de luarea unei
decizii de vaccinare, trebuie să se cunoască în ce mod este mai rentabil să se vaccineze efectivul de animale
împotriva bolilor produse de către agenţi infecţioşi.

2.1.2. Procedee de imunizare

Există două metode cu ajutorul cărora un animal poate fi pus sub protecţie faţă de bolile infecţioase.
Una dintre procedeele de imunizare este imunizarea pasivă ce se realizează prin transferul de anticorpi de
la un animal rezistent la altul sensibil. Animalele imunizate pe această cale sunt puse sub protecţie imediată,
dar numai pentru o perioadă de timp relativ scurtă, deoarece anticorpii sunt treptat catabolizati şi în
consecinţă este posibilă, o nouă infecţie.
O altă cale de imunizare este imunizarea activă, care se bazează pe administrarea antigenului specific
fiecărei boli urmată de sinteza de anticorpii împotriva acestuia.
Deşi protecţia animalelor împotriva unei anumite boli, prin vaccinare, nu este imediată, imunitatea activă
are avantajul că durează mult, iar cantitatea de anticorpi acumulată poate fi îmbunătăţită prin reimunizare.

2.1.3. Vaccinuri clasice (convenţionale)

2.1.3.1. Imunizarea activă

Punerea sub protecţie imunologică a animalelor timp mai îndelungat, precum şi realizarea unei imunităţi
eficiente poate să fie făcută numai prin imunizare activă (vaccinare).
Vaccinul ideal poate fi considerat numai acela care este stabil, ieftin, tolerabil la vaccinarea în masă şi
care să producă un răspuns imun, net superior, faţă de cel realizat de boala naturală.
Atât antigenitatea înaltă, cât şi absenţa reacţiilor adverse postvaccinale, considerate a fi criterii de bază în
obţinerea şi utilizarea unui vaccin nu pot fi valabile în toate cazurile. Ideal ar fi dacă vaccinul utilizat ar
produce o imunizare pe tot parcursul vieţii animalului şi chiar să conducă la eradicarea bolii.
In protecţia imunologică a sănătăţii animalelor sunt utilizate două tipuri de vaccinuri şi anume: vaccinuri
vii dar cu activitate infecţioasă atenuată şi vaccinuri moarte. Ambele categorii de vaccinuri prezintă şi
avantaje, dar şi dezavantaje.
 Vaccinurile ce conţin microorganisme vii, conferă o imunitate înaltă, de lungă durată, dar sunt
responsabile de provocarea multor reacţii adverse. Faptul că ele au o antigenitate crescută, face ca doza de
inoculare să fie foarte mică.
Vaccinurile ce conţin microorganisme "moarte", realizează o imunitate mult mai scăzută, decât cele care
conţin microorganisme vi cu activitate atenuată, animalul este pus sub protecţie pe o perioadă scurtă de timp.
Avantajul lor constă în aceia că sunt mai puţin producătoare de efecte adverse.

2.1.3.2. Imunizarea pasivă

Anticorpii specifici produşi de animalele domestice care au fost în prealabil imunizate activ, pot să fie
administraţi, prin transfer la alte animale cu scopul de a le conferi o protecţie imediată faţă de o anumită
boală. Chiar dacă anticorpii specifici au fost obţinuţi pe o anumită specie, antiserul respectiv pot să fie
utilizaţi şi la altă specie de animale. De exemplu anticorpii împotriva antraxului care au fost obţinut de la
vacă pot să fie utilizaţi şi la câini pentru protecţie împotriva acestui micro-ogranism.
Anticorpii specifici declanşaţi împotriva toxinelor unor microbi periculoşi care produc boala denumiţi
antitoxici pot să fie utilizaţi în vaccinarea pasivă a animalelor şi omului. Ei s-au dovedit a fi foarte eficienţi în
vaccinarea pasivă împotriva microorganismelor toxigene aşa cum sunt Clostridium tetani sau Clostridium
perfingens.
Toxinele acestor microorganisme periculoase nu sunt altceva decât proteine dar care pot fi făcute netoxice
prin tratarea lor cu formol. Aceste toxine tratate cu formol sunt cunoscute sub numele de toxioide sau
anatoxine. Anticorpi specifici antitoxici se obţin în felul următor: iniţial se procedează la injectarea cailor
tineri cu toxioide în scopul declanşării sintezei de anticorpi împotriva lor. Pentru realizarea nivelului maxim
de anticorpi, în etapele următoare se poate administra chiar toxină purificată fără ca animalul să fie pus în
pericol.
Anatoxina tetanică obţinută pe animale tinere este injectată la animale în scopul de a conferi acestora o
protecţie imediată împotriva tetanosului. Activitatea imunologică a anatoxinei se măsoară pe cobai vaccinaţi.
Se consideră că doza optimă este acea cantitate de anatoxina care după vaccinare poate pune sub protecţie un
cobai căruia i se injectează o doză cunoscută de toxină tetanică pură.
Anatoxina tetanică obţinută pe cal, este foarte bine tolerată de specia respectivă, fără să se producă
hipersensibilizare ca la o proteină străină şi persistă în organism o perioadă foarte mare de timp, protejând în
felul acesta animalele împotriva tetanosului.
Trebuie însă să se aibă în vedere că în cazul administrării repetate a anatoxinei tetanice la altă specie,
există pericolul instalării unor reacţii adverse anafilactice faţă de proteina străină.
Pentru obţinerea unui vaccin sunt necesare parcurgerea următoarelor etape:
1) Identificarea microorganismului care produce boala
2) Cultivarea microorganismului şi inactivarea lui
3) Cunoaşterea puterii imunogene a vaccinului
4) Cunoaşterea avanajelor şi dezavantajelor
 2.1.3.3. Procedee de inactivare şi atenuare a microorganismelor utilizate în calitate de vaccinuri

Indiferent de procedeul de inactivare utilizat acesta nu trebuie să influenţeze antigenitatea

microorganismelor. Puterea antigenică a microorganismelor care comportă un astfel de tratament, trebuie să
fie similară cu cea a microorganismelor vii.
Datorită virulenţei crescute a unor microorganisme şi a pericolului apariţiei bolii în cazul în care acestea ar
fi fost utilizate în calitate de vaccinuri vii, a fost necesar să se intervină în scopul reducerii virulenţei
acestora. Reducerea virulenţei microorganismului se numeşte antenuare. Metodele de inactivare a
microorganismelor ţintesc să producă transformări la nivelul proteinelor microorganismelor luate în
considerare.
Dintre procedeele clasice utilizate pentru scăderea virulenţei microorganismelor pot fi enumerate
următoarele: căldura, substanţele chimice aşa cum sunt formaldehida, acetona sau alcoolul.
Rezultatele obţinute în urma utilizării acestor factori de inactivare nu sunt întotdeauna satisfăcătoare.
Şi alte metode pot fi utilizate pentru atenuarea virulenţei microorganismelor. Ele se bazează pe adaptarea
„forţată" a microorganismelor la condiţii de viaţă care sunt diferite faţă de gazdă lor obişnuită. Câteva
exemple sunt edificatoare în acest sens. O suşă de Mycrobacterium tuberculozis, a fost făcută avirulentă prin
forţarea ei să crească pe un mediu de cultură saturat cu bilă. O suşă de antrax a fost adusă la stadiul de
avirulentă, prin cultivarea ei în 50% ser-agar, şi în atmosferă bogată în C02. în felul acesta ea a pierdut
proprietatea de incapsulare.
Dacă în cazul bacteriilor, patogenitatea acestora poate fi redusă prin cultivarea în alte condiţii decât cele
întâlnite la gazda lor obişnuită, în cazul virusurilor, patogenitatea lor poate fi redusă prin cultivarea acestora
în celulele unor specii de animale la care nu sunt adaptate în mod natural.
O altă modalitate de a realiza vaccinuri este aceia care foloseşte microorganisme înrudite antigenic cu cele
care cauzează boala luată în considerare, dar care provin de la alte specii. De exemplu Just şi Jenner la
începuturile imunologiei au utilizat virusul variolei bovine ca vaccin pentru protejarea omului împotriva
variolei.
Există şi situaţii când pentru vaccinare împotriva unei boli nu se găseşte vaccinul corespunzător. în aceste
cazuri se utilizează, cu prudenţă însă, microorganisme care posedă virulenţă completă. Acest procedeu a fost
pus în practică mai ales în cazurile în care nu există o altă tehnică mai bună. aşa cum este în cazul ectimei
contagioase a oilor. în această boală vaccinarea mieilor sănătoşi se face în mod obişnuit prin inocularea la
aceştia a crustelor uscate, recoltate de la mieii bolnavi.
În medicina veterinară, în mod obişnuit vaccinurile moarte şi toxioide sunt asociate cu adjuvanţi pentru
potenţarea imunogenităţii lor.
Dintre adjuvanţii cel mai des întrebuinţaţi pot fi enumeraţi: hidroxidul de aluminiu, fosfatul de aluminiu,
apa în ulei şi saponina.
O excepţie de la acest caz o întâlnim la vaccinul contra antraxului unde se foloseşte ca adjuvant saponina
pentru a facilita germinarea sporilor la locul injecţiei.
 2.1.3.4. Căi de administrare a vaccinurilor

Când vaccinarea se face la un număr mic de animale metoda cea mai simplă de vaccinare este prin injecţie
subcutanată sau intramusculară.
Pentru alte boli şi la un efectiv mare de animale, se practică vaccinarea sub formă de aerosoli, încât
vaccinul să poată fi inhalat de către toate animalele din turmă. Această tehnică se practică mai ales în
vaccinarea împotriva bolii lui NEWEASTLE la păsări, în enterita nurcilor, bronşita păsărilor etc.

□ Oportunitatea vaccinării
Orice acţiune de vaccinare, pentru imunizarea activă a animalelor, presupune existenţa unui program
specific de vaccinare.
Acest lucru nu este valabil şi la animalele nou născute, deoarece acestea primesc prin colostru, de la
mamă. anticorpii necesari care să-i protejeze faţă de anumite boli pentru o anumită perioadă de timp.
Deoarece nu se ştie data exactă a dispariţiei imunităţii noului născut primită de la mamă prin colostru este
necesar ca animalul foarte tânăr să fie vaccinat de cel puţin două ori. De aceea pentru asigurarea unei
imunităţi sigure a animalelor tinere este bine ca vaccinarea a doua, să se facă la aproximativ 15 săptămâni
după naştere, iar a celor adulte Ia aproximativ 6 luni de la prima injectare. De altfel intervalul dintre vaccinări
diferă în funcţie de tipul de vaccin care se utilizează precum şi de specificul boli.
Pentru vaccinurile vii, care conferă o imunitate de lungă durată, este suficient ca vaccinarea să se facă
după fiecare 2 sau 3 ani.
Pentru vaccinurile moarte la care imunitatea instalată este slabă şi de scurtă durată din care cauză necesită
chiar repetări frecvente, vaccinarea optimă trebuie să se facă la fiecare 6 luni.
Legat de specificul bolii se poate spune că în cazul bolilor cu caracter sezonier, vaccinarea trebuie să se
facă înaintea perioadei în care, în mod obişnuit, apare boala. Aşa este cazul vaccinării împotriva viermilor
lungi, a vaccinării împotriva antraxului etc, când vaccinarea este oportună înainte de sezonul de apariţie a
bolii naturale.
Pe lângă succesele mari obţinute în imunoprofilaxie, de-a lungul timpului s-a putut constata că răspunsul
imun ca de altfel în orice proces biologic, a dat şi numeroase insatisfacţii
Faptul că un vaccin nu conferă o protecţie identică şi egală la toţii indivizii vaccinaţi, aceasta poate fi pusă
pe seama acţiunii unui număr mare de factori, care limitează răspunsul imun. pentru fiecare individ în parte.
Redăm în figura de mai jos o schemă din care se poate observa că în obţinerea imunităţii unui animal concură
numeroşi factori:
 Distribuţia neuniformă a vaccinului în aerosoli şi furaje
Accidentali Nerespectarea dozei de vaccin

Structura genetică necorespunzătoare a unor animale care

diminuează răspunsul imun.
Potenţialul animalelor de a Starea de sănătate
răspunde la vaccin Dereglări de metabolism
Factorii care Parazitoze
influenţează negativ Calitatea vaccinului Prezenţa microorganismelor vii în
răspunsul imun Reali vaccinurile moarte
Infectarea unor vaccinuri cu alte
microorganisme
Utilizarea la prepararea
vaccinului a unei alte surse de
microorganisme decât cea care
produce boala naturală

2.1.4. Vaccinuri neconventionale

Progresele realizate de metodele biologiei moleculare, a permis cercetătorilor să nu mai folosească la
producerea vaccinului microorganismul atenuat sau omorât în întregimea sa, ci numai moleculele care posedă
imunogenitatea specifică. Pentru aceasta se folosesc proteine mai scurte numite peptide, formate din câţiva
aminoacizi produse prin tehnologia ADN-recombinat.
□ Proteine şi peptide utilizate pentru formarea de vaccinuri neconventionale
Proteinele sunt substanţe cu azot formate din înşiruirea într-un anumit fel, a celor 20 de aminoacizi
prezenţi în natură. Ordinea aminoacizilor în lanţul de proteină formează structura primară a acesteia.
Proteinele au însă şi o structură secundară, terţiară şi cuaternară. Fiecare din ele este dată de răsucirea şi
împachetarea lanţului de proteină după ce ea s-a sintetizat.
Este interesant de subliniat că nu numai structura primară ci şi celelalte structuri ale proteinei îi conferă
acesteia o anumită proprietate. Structura secundară şi terţiară a proteinei se formează datorită unei anumite
structuri primare a proteinei. Se ştie că orice proteină care se găseşte în organismele vii trebuie să fie
sintetizată de către o genă proprie. Prin urmare, înşiruirea într-un anumit fel a aminoacizilor în lanţul de
proteină este înscrisă în segmentul de ADN care constituie gena responsabilă de sinteza acesteia.
În toate celulele vii, atât la eucariote, cât şi la procariote sinteza fiecărei proteine se realizează prin
punerea în operă a operonului respectiv. În esenţă procesul de sinteză a proteinelor constă din transcrierea
prin complementaritate pe o moleculă de ARN-mesager (ARN-m) a înşiruirii nucleotizilor din segmentul de
ADN care constituie gena unde este înscrisă, sub forma de codoni, informaţia structurii primare a proteinei
respective.
ARN-m, odată format, migrează în citoplasmă, se aşează pe poliribozomi unde are loc naşterea proteinei.
Acum se produce citirea de către ARN-ul de transfer (ARN-t) cu ajutorul anticodonilor a mesajului genetic
de pe ARN-m. Fiecare tip de moleculă de ARN-t aduce după sine aminoacidul propriu pe care-l poartă şi se
racordează, cu ajutorul anticodonului său, la codonul ARN-m. Dacă fiecare codon care urmează, (începând de
la stânga Ia dreapta) pe ARN-m se cuplează cu o moleculă de ARN-t, atunci aminoacizii pe care aceştia îi
aduc aici, fiind alăturaţi se pot lega unul de celălalt prin legături peptidice (NH2-HOOC). Urmarea unui astfel
de proces este naşterea unei anumite proteine.
Decodificarea ARN-m de către anticodonii ARN-t poartă denumirea de translaţie deoarece informaţia
structurii primare a proteinei care a fost înscrisă în ADN, cu ajutorul codonului este tradusă în succesiuni de
aminoacizi în lanţul de proteină.
Aşadar proteinele sunt compuse din aminoacizi care se leagă unul de altul cu ajutorul unei legături
peptidice între cele două capete ale aminoacidului unde se găsesc grupările amino (NH2) în stânga şi în
carboxil (COOH) în dreapta. Legarea unul de celălalt a doi aminoacizi cu ajutorul unei legături peptidice
duce la formarea unui peptid. Prin urmare o "proteină" formată din doi aminoacizi este un dipeptid, din trei
tripeptid din zece aminoacizi este un decapeptid. Moleculele de proteine care sunt formate din puţini
aminoacizi mai poartă denumirea de oligopeptide (cea 10 aminoacizi) sau peptide. Mai mult de zece
aminoacizi legaţi unul de celălalt formează o proteină.
□ Metode de sinteză
In afara sintezei naturale, peptidele mai pot fi obţinute şi prin: a) sinteze chimice în laborator, b) prin
sinteze enzimatice şi c) prin folosirea culturilor de celule procariote sau eucariote pe calea tehnologiei ADN-
recombinat.
□ Metode chimice
Obţinerea de peptide pe cale artificială are avantajul că se poate substitui, la dorinţă, un aminoacid dintr-o
anumită poziţie a lanţului cu un altul. Modificarea de structură primară astfel obţinută poate fi folosită la
înţelegerea mai facilă a interacţiunii structurii unei proteine-hormon sau enzimă sau proteină de constituţie,
cu activitatea acesteia în procesul metabolic sau de apărare a organismului.
Deşi prima peptidă a fost sintetizată de către Curtius încă în anul 1881, numai după anul 1932 s-au pus
bazele moderne ale sintezei peptidelor de către BERGMAN şi ZERVAS (1932). Metoda generală de sinteză
a unei peptide pe această cale este aceia care foloseşte un grup de protecţie care poate fi oricând îndepărtat
din reacţie denumit, t-butoxicarbonil (t-BOC). Pentru a susţine reacţia se utilizează şi o răşină sintetică în
calitate de fază solidă (clorometil răşină).
În linii generale sinteza începe de la gruparea terminală de carboxil a aminoacidului (COOH) protejată de
t-BOC şi în prezenţa clorometil răşină. La 80°C se leagă BOC-T cu aminoacidul respectiv de răşină. In altă
etapă de reacţie se poate lega de un al doilea aminoacid formând un dipeptid. Această metodă are avantajul că
aminoacidul ataşat de polimer (răşină) este permeabil la reagenţi şi solvenţi, permiţând astfel îndepărtarea
excesului părţilor solubile prin simpla filtrare.
Metoda are însă dezavantajul că este foarte greu de realizat şi este foarte laborioasă şi în plus are
productivitate mică. Din această cauză s-au găsit alternative mai economice la metoda grupului de protecţie t-
butoxilcarbonil. Aceste noi metode folosesc enzime (peptidaze) pentru a determina, legarea rapidă prin
cataliză a grupărilor terminale a doi aminoacizi.
 □ Metodele tehnologiei ADN-recombinat
Pentru sintezapeptidelor, de diferite mărimi, folosite în diverse scopuri se folosesc în prezent metode ale
tehnologiei ADN-recombinant. Acestea constau, în esenţă, din sinteza pe cale chimică a segmentului de ADN
care codifică peptida necesară, după ce în prealabil s-a cunoscut succesiunea aminoacizilor acesteia.
La rândul său fragmentul de ADN după ce a fost introdus într-o celulă procariotă sau eucariotă se donează
şi va produce prin sinteza naturală peptidul pe care-1 codifică folosindu-se de sistemul de sinteză al celulei
gazde.
Fragmentul de ADN care codifică o peptida de interes mai poate fi obţinut plecând de la o moleculă de
ARN care participă în mod natural la sinteza peptidei. Prin folosirea enzimei revers-transcriptaza se obţine
ADN-ul corespunzător. Acesta odată obţinut poate fi introdus, prin metoda transformării sau a transfectiei, în
celule aflate în cultură şi determinat să sintetizeze peptidul de interes pe poliribozomii celulei, prin
transcripţie pe ARN-m şi translaţie cu ajutorul ARN de transfer.
In munca cu peptide apare uneori şi necesitatea legării unui segment de ADN de altul. In acest caz
legăturile dintre ele se obţin folosind enzime de legătură numite ligaze care sunt în stare să catalizeze acest
proces.

2.1.4.1. Peptidele virale pot fi folosite în calitate de vaccinuri

Virusurile sunt particule de viaţă care nu pot să trăiască şi să se înmulţească (replice) decât în celule vii
(celule animale, vegetale, bacterii, drojdii etc). Foarte multe dintre speciile de virusuri produc boli la oameni,
animale şi plante. Dorinţa oamenilor de a se proteja imunologic, pe ei şi pe animalele lor, de agresiunea
virusurilor patogene, i-a determinat să studieze multilateral "viaţa" tuturor speciilor de virusuri cunoscute.
Rezultatul acestui demers s-a soldat cu realizarea unor vaccinuri, care după administrarea lor la oameni şi
animale, pun sub protecţie solidă individul vaccinat împotriva agresiunii acestora.
Deşi vaccinurile virale existente azi sunt realizate din microorganisme moarte sau cu activitate atenuată,
există o posibilitate reală ca unele din ele să fie "reconver-tite" în particule de viaţă active, capabile să
declanşeze boala. In afară de aceasta păstrarea vaccinurilor realizate din microorganisme integrale devine o
problemă costisitoare şi greu de realizat, în regiunile foarte călduroase sau defavorizate. Din această cauză în
prezent se încearcă găsirea unei alternative la vaccinurile realizate din microbi integrali. Una dintre ele ar
putea fi realizarea de vaccinuri nu din virusuri integrali, ci din proteinele de înveliş sau numai din unele
segmente ale acestora care constituie determinanţii antigenici sau epitopii.
Calea pentru atingerea unui astfel de obiectiv este cunoaşterea elementelor structurale ale virusurilor care
pot provoca sinteza de anticorpi după ce aceştia au pătruns în celulele unui om sau a unui animal şi mai ales
înţelegerea proceselor care concură la realizarea sintezelor de anticorpi în interiorul limfocitelor B.
Se cunoaşte că un virus (Fig.24) este constituit dintr-un înveliş format din câteva tipuri de proteine numit
capsidă, în interiorul căreia se găseşte materialul ereditar (ADN sau ARN). Unele virusuri au capsida
acoperită de un strat de lipide şi este de regulă de formă sferică. Capsida virusului se continuă cu o porţiune
mai îngustă (coada virusului) de care sunt ataşate câteva fibrile cu ajutorul cărora acesta se adsoarbe pe
membrana celulei pe care o atacă (Fig.24). Coada virusurilor este formată din proteine care prin contracţie
(ele sunt contracţile) ajută la introducerea în celulă a materialului său ereditar.

Pe calea microscopiei electronice, combinată cu tehnicile de separare şi analiza modernă a

macromoleculelor, inclusiv precursori radioactivi ai acizilor nucleici, a proteinelor şi polizaharidelor,
imunologii sunt în stare să „disece" în componentele sale anvelopa proteică sau lipoproteică a virusurilor.
Chiar şi la virusurile a căror capsida este acoperită cu un înveliş lipidic pot fi disecate şi separate
proteinele de înveliş constitutive, după dizolvarea acestuia cu un detergent aşa cum este nonidet sau
deoxicholat de sodiu.
Pentru virusurile cărora le lipseşte învelişul lipidic, aşa cum este şi virusul febrei aftoase, eliberarea
proteinelor de înveliş se realizează cu reagenţi de denaturare aşa cum sunt ureea, guanidin hidroclorid sau
sodiu dodecil sulfatul.
■ Fragmentele de proteină de înveliş separate unele de altele pot fi studiate pentru activitatea lor
imunologică
Experimentele care s-au efectuat cu injectarea separată a proteinelor de înveliş la animale au adus dovezi
că acestea pot induce sinteza de anticorpi neutralizatori în organismul gazdei, la un astfel de nivel, încât îl
pot proteja împotrva infecţiei experimentale. Titrul anticorpilor sintetizaţi împotriva proteinelor de înveliş are
însă valori mult mai scăzute decât atunci când aceştia au fost provocaţi să se sintetizeze prin injectarea
virusului întreg (cca 1%).
Este foarte probabil că activitatea imunologică, mai redusă, a proteinelor izolate din capsida, în comparaţie
cu cea a virusului întreg, să fie datorată deteriorării configuraţiei secundare şi terţiare a proteinelor care, în
mod sigur, au contribuţia lor specifică în declanşarea sintezei de anticorpi. Există dovezi în sprijinul acestei
ipoteze. Cercetătorii au inclus proteine virale izolate în structuri mai complexe legăndu-le de un glicoid
vegetal numit saponină. În felul acesta activitatea imunologică a suprafeţei virusurilor a fost restaurată.
Din cele spuse mai înainte reiese că proteinele izolate din anvelopa virusurilor pot constitui antigene
specifice care injectate animalelor provoacă sinteza de anticorpi, într-un titru care le pune sub protecţie
împotriva infecţiei cu germenii cu care ele au fost obligate să se sintetizeze. Cu alte cuvinte proteinele izolate
din virusuri pot deveni vaccinuri tot atât de eficiente ca şi cele realizate din microorganisme integrale care au
fost în prealabil ucise sau atenuate. Ele au avantajul că sunt stabile, se pot păstra pe o lungă perioadă de timp,
independent de temperatura ambiantă, sunt mult mai ieftine şi mai ales nu prezintă nici un pericol de infectare
involuntară a animalelor vaccinate.
Dacă acest lucru este posibil de înfăptuit atunci trebuie să recunoaştem că acum se deschide calea
realizării de vaccinuri sintetice care vor fi, nu numai mai uşor de realizat, ci şi mai eficiente decât cele
clasice.
Sinteza de peptide artificiale la orice dimensiune a lanţului de proteină, prin tehnologia ADN recombinant
este astăzi facilă şi deosebit de eficientă. Pentru realizarea însă a peptidelor, folosite în calitate de vaccinuri
trebuie să se cunoască în prealabil situsurile (locurile) imunogenice ale proteinei (epitopii) virale şi
succesiunea aminoacizilor acestora pentru a se putea constitui "de novo" fragmentele de ADN care vor trebui
donate în interiorul bacteriilor sau a celulelor cultivate.

2.1.4.2. Modalităţi de identificare a situsurilor imunogenice în lanţul de proteine

Epitopii sau situsurile imunogenice ale unei proteine sunt sectoare ale lanţurilor de proteine liniare
(nepliate) care sunt în stare să provoace sinteza de anticorpi împotriva acesteia. Prin urmare un epitop este
constituit din peptide de diverse dimensiuni care au o anumită succesiune de aminoacizi (cea.5-6 aminoacizi).
In lungul lanţului său, o proteină poate avea mai mulţi epitopi. Deşi epitopii sau situsurile imunogenice ale
unei proteine nu sunt aşezaţi unul după altul în capsida virală, ei se găsesc întotdeauna împreună datorită
plierii lanţului de proteină impus de arhitectura virusului. Aceasta sugerează că structura secundară şi terţiară
sau cuaternară a proteinei conferă acesteia proprietăţi noi faţă de cele pe care le dictează structura primară a
ei (succesiunea de aminoacizi).
Prin analize citografice cu raze X şi de rezonanţă magnetică ale proteinelor se pot decela locurile unde se
găsesc amplasate aceste peptide generatoare de anticorpi atunci când sunt injectaţi unui animal, străin genetic
cu cel de la care sau recoltat. Din astfel de studii se cunoaşte că regiunile amfipatice a-helicoidale şi buclele
(coturile) (3 care se formează atunci când proteina formează structura secundară şi terţiară constituie
situsurile imunogenetice al acesteia. In figura 25 redăm o schiţă a unei astfel de stări.
 Regiunile ocupate de aminoacizii hidrofilici pot indica poziţia unui epitop
Se pare că grupările terminale NH2 şi COOH ale proteinelor posedă o activitate antigenică net superioară
mediei antigenităţii pe care o are proteina luată în ansamblul său.
In afară de buclele unei proteine predicţia localizării unui epitop poate fi făcută şi prin cunoaşterea
secvenţelor (înşiruirea) aminoacizilor dintr-o anumită zonă a lanţului de proteină. În prezent se cunoaşte că
determinanţii antigenici (epitopii) sunt asociaţi cu secvenţele de aminoacizi care conţin un număr mare de
sarcini şi reziduuri polare aşa cum sunt reziduurile (aminoacizii) hidrofilice.
Vom aduce un argument care susţine această supoziţie. In prezent se cunoaşte că virusul febrei aftoase
injectat la animale formează 7 serotipuri diferite de anticorpi. Aceasta înseamnă că un animal care a fost
infectat cu un virus care aparţine unui serotip el nu va avea protecţie imunologică decât împotriva acelui
serotip al virusului. El nu are anticorpi împotriva virusurilor care aparţin celorlalte 6 serotipuri. Se întâmplă
acest lucru deşi structura primară formată din secvenţele (succesiunile) de aminoacizi din proteina capsidei
denumită VP1 este aceiaşi la toate suşele virusului febrei aftoase aparţinătoare celor 7 serotipuri.
Se cunoaşte în prezent că în lanţul de aminoacizi care formează proteina virală VP1 al virusului febrei
aftoase se găsesc 3 regiuni variabile din care două sunt hidrofilice. Se pare că imunogenitatea unei proteine
este dată tocmai de aceste regiuni hidrofilice.
 Afirmaţia este susţinută de faptul că atunci când sau injectat unui animal peptide sintetizate artificial
alcătuite numai din aminoacizi specifici epitopilor care produc regiuni hidrofilice păstrând însă succesiunea
normală a acestora, ele au fost mult mai imunogene, decât celelalte regiuni ale proteinei.
□ Anticorpii monoclonali pot identifica poziţia epitopilor într-un antigen
Pentru aceasta se utilizează două variante ale uneia şi aceleiaş proteine. Una dintre ele are mutaţii în
regiunea variabilă şi alta normală (sau se utilizează suşe de virus normal şi mutant). Dacă ambele vor fi
introduse într-o eprubetă unde se găseşte un anticorp monoclonal neutralizam pentru proteina virală normală,
atunci virusul sau proteina normală va fi blocată de anticorpi, iar mutanta sa va rămâne liberă în soluţie. Dacă
se determină înşiruirea aminoacizilor (secvenţializează), atât din proteina normală, cât şi a celor din proteina
mutantă sa va putea afla, indirect, succesiunea nucleotidelor din acidul nucleic al acesteia, în sectorul
responsabil de sinteza respectivei proteine. In felul acesta se poate afla regiunea din proteină responsabilă de
declanşarea sintezei anticorpilor.
□ Fragmentele izolate de ADN şi produsul lor de sinteză, pot preciza locul epitopilor în proteine
NUMBERG şi colab (1984) citaţi de BROWN şi BOMFORD (1989) au utilizat fragmente de ADN viral
extrasă din virusul leucemieifeline secţionate cu DNA-aze care corespund genelor sau unor sectoare din
proteinele din capsidă formând aşa numita bibliotecă genică. Prin testarea fiecărui fragment de ADN din
această bibliotecă genică (prin produsul peptidic care-1 sintetizează) cu ajutorul anticorpilor monoclonali
neutralizatori, s-a reuşit să se precizeze poziţia regiunilor (determinanţilor antigenici) antigenice din lanţul
proteinei respective.
GEYSEN şi colab (1984) au reuşit să dovedească că în constituţia proteinei VP1, extrasă din capsida
virusului febrei aftoase (prin sinteza separată a unor hexa-peptide păstrând succesiunea aminoacizilor
proteinei naturale VP1, numai hexapep-tidele formate din aminoacizii 1-6; 2-7; 3-8; şi 208-213 constituie
determinanţii antigenici de pe acest tip de proteină a anvelopei virusului febrei aftoase.

2.1.4.3. Utilizări practice ale peptidelor sintetice

Interesul pentru sinteza artificială de peptide este justificat deoarece ele pot fi folosite în mai multe feluri:
a) fie pentru realizarea de vaccinuri viralele căi neconvenţionale;
b) fie pentru manipularea producţiilor animalelor domestice prin neutralizarea unor hormoni sau enzime
implicate în dirijarea principalelor funcţii ale organismului;
c) fie prin utilizarea lor în calitate de surogate, foarte active, pentru unele substanţe naturale (hormoni,
enzime. etc.).
Dezvoltarea în ultimii ani a metodelor de izolare, donare, fragmentare (digestie) şi legare a fragmentelor
de ADN. precum şi a celor de secvenţializare a acestor molecule (în succesiuni de nucleotide) au făcut posibil
studiul structurii şi funcţiei proteinelor şi sinteza artificială de peptide de orice dimensiune şi în orice
combinaţie a aminoacizilor care le compun.
 2.1.4.3.1. Peptide folosite în calitate de vaccinuri antivirale
Până nu demult selecţia virusurilor, cu spectru larg de antigenitate, au fost studiate şi selecţionate empiric,
pe deoparte, pe baza testelor de neutralizare a virusurilor de către anticorpii pe care i-au produs împotriva lor,
precum şi pe baza gradului de protecţie asigurată la infecţia experimentală, pe de altă parte.
Metodele biologiei moleculare specificate mai sus dau posibilitate imunologilor să înţeleagă, la nivel
molecular, variaţiile antigenice ale virusurilor şi să precizeze care componentă a capsidei sau care regiune a
unei proteine este responsabilă de sinteza anticorpilor. Pentru producerea de peptide utilizate în calitate de
vaccinuri este necesară în primul rând să se identifice epitopii imunogeni. Pentru aceasta se folosesc mai
multe metode.

1. Identificarea şi donarea genelor care codifică un antigen de interes

Pentru a putea realiza vaccinuri virale, pornind de la unele peptide izolate din capsidă, este necesar să se
realizeze, mai întâi, sinteza artificială apeptidelor imunogene de interes. Cea mai eficientă şi precisă cale de
sinteză a acestora este cea care foloseşte metodele tehnologiei ADN-recombinat. Aceasta presupune, însă, să
se cunoască mai întâi cu precizie secvenţele de nucleotide ale genei structurale care răspund de sinteza
proteinei respective. După cum se cunoaşte, de succesiunea codonilor în genă depinde mărimea şi
succesiunea aminoacizilor în proteina care se va sintetiza pe baza acestei informaţii genetice. Aşadar
cunoaşterea succesiunii aminoacizilor în lanţul de proteină sau numai în sectorul epitopilor, sau cunoaşterea
succesiunii codonilor în lanţul de ARNm, ar putea constitui căi sigure de identificare a proteinei de interes.
Concretizând raţiunea de mai sus se poate afirma că identificarea unor proteine sau peptide în scopul
donării acestora poate fi realizată: a) fie plecând de la cunoaşterea succesiunii aminoacizilor în proteina
antigen;b) fie folosindu-ne de succesiunea nucleotizilor din ARN-mesager (ARN-m) ale genei de interes.
Se ştie însă că mărimea unei proteine antigen nu poate să fie indicată, în toate cazurile, de către mărimea
ARN-m. De exemplu dacă antigenul de interes este un produs care provine dintr-un clivaj al unei poliproteine
precursor atunci ARN-m al acestuia din urmă poate fi mult mai mare decât proteina antigen care ne
interesează. Dimpotrivă dacă peptida antigen este modificată în mod natural după sinteză, prin glicozilare sau
fosforilare atunci ARN-m pe care s-a sintetizat aceasta este mult mai mic decât mărimea prevăzută.
Mai trebuie spus încă ceva: ARN-m găsit în celulele unde gena se exprimă este produsul "procesat" al
ARN-m şi sintetizat în lungimea genei (ADN). Prin urmare el nu conţine decât exonii genei. Intronii au fost
eliminaţi în procesul de maturizare a ARN-m secundar.

2. Identificarea genei plecând de la ARN-m

ARN mesager al virusului poate fi izolat din celulele infectate imediat după ce a avut loc infecţia acestora
prin injectarea materialului ereditar al virusului folosindu-ne de cromatografia de afinitate deoarece
majoritatea ARN-mesager al eucariotelor conţine la capătul 3 secvenţe de nucleotide poli A cu ajutorul cărora
se fixează pe oligonucleotidele dT de pe celuloza folosită în calitate de filtru. ARN-m astfel izolat şi purificat
este apoi tradus (translat) "in vitro" în secvenţe de aminoacizi într-o proteină care se naşte, fie utilizând
sistemul germeni de grâu sau sistemul de reticulocite de iepure. Produsul astfel obţinut poate fi apoi
identificat prin reacţie imunologică, cu ajutorul unor anticorpi monoclonali în reacţia antigen-anticorp. O
astfel de peptidă poate fi apoi utilizată pentru a i se afla succesiunea de aminoacizi. Gena de interes mai poate
fi obţinută şi altfel. ARN-m al virusului prin revers-transcripţie poate fi transformat într-un ADN. Molecula
care se obţine va fi chiar gena de interes.

3.Identificarea antigenului prin hibridarea acizilor nucleici

Codonii ARN-m specifici pentru peptida de interes mai pot fi identificaţi utilizând fie metodele de
hibridizare a acidului nucleic, fie secvenţializarea directă a nucleotidelor. Secvenţele de nucleotide sau
înşiruirea nucleotidelor în genomul viral pot fi apoi utilizate pentru a identifica scheletul antigenului sau
înşiruirea aminoacizilor din constituţia acestuia.
După ce se cunoaşte structura nucleotidică a genomului viral care răspunde de sinteza antigenului de
interes se poate trece la construirea lui chimică şi apoi utilizat pentru a fi clonat într-o celulă gazdă.

4.Peptidele legate de o moleculă mai mare de proteină le sporeşte antigenitatea

Peptidele imunogenice noi sintetizate prin tehnologia de ADN-recombinat pot fi folosite în calitate de
vaccinuri, fie singure, fie ataşate de o altă proteină. Cercetările lui BROEKUIJSEN şi colab.(1987) au arătat
că peptidele sintetice realizate cu secvenţe de aminoacizi 141-160 pot forma singure anticorpi neutralizând ai
virusului febrei aftoase, atunci când au fost injectate la cobai. Ele. însă, provoacă un titru de anticorpi mult
mai mare dacă acest fragment de peptidă este ataşat la o moleculă de (3-galactozidază la azotul terminus al
peptidei 141-160.
Peptidele formate din secvenţele de aminoacizi 141-160 mai pot fi ataşate şi la o proteină "miez" (core)
izolată din virusul hepatitei "B" umane. Injectarea acestor complexe la cobai de către CLARKE şi
colab.(1987). au demonstrat că ele provoacă un răspuns imun, net superior situaţiei când la cobai se
injectează singură doar peptida pură.

Vaccinurile sintetice sunt eficiente numai dacă conţin mai multe situsuri imunogene
Atunci când se doreşte să se prepare un vaccin pe căi neconvenţionale (tehnologie ADN-recombinat) se
pleacă de la ideia de bază potrivit căreia inducţia sintezei de anticorpi se realizează de către determinanţii
antigenici de pe suprafaţa antigenilor (mai ales proteine). Prin urmare un vaccin trebuie să conţină, în mod
obligatoriu, regiunile antigenice sau epitopii de pe suprafaţa antigenelor, fie singure, fie legate de alte
substanţe. In consecinţă un vaccin polivalent capabil să inducă sinteza de anticorpi neutralizatori ai virusului
trebuie să fie compus din subunităţi peptidice care reprezintă epitopii esenţiali care se găsesc în capsida
acestuia.
 Neutralizarea virusurilor este mediată mai ales de legarea anticorpilor la una sau mai multe sectoare ale
suprafeţei capsidei proteice virale. în afara de aceasta la iniţierea realizării unui vaccin format numai din
peptidele care constituie determinanţii antigenici de suprafaţă, mai trebuie ţinut cont şi de faptul că anticorpii
neutralizanţi singuri, uneori, nu sunt suficienţi pentru a realiza protecţia animalului sau omului împotriva
infecţiei virale. Se pare că pentru a realiza o protecţie completă animalului sunt necesari, pe lângă un număr
de determinanţi antigenici (epitopii) de suprafaţă, şi aşa numiţi antigeni interni care provoacă (elicitează)
producerea de anticorpi numiţi nonneutralizanţi. Se pare că astfel de anticorpi pot stopa replicaţia viruşilor în
interiorul celulelor pe care le-au infectat, opunându-se în acest fel continuării infecţiei în celulele gazdă. Un
astfel de fenomen a fost observat de către BOERE şi colab (1983), atunci când au produs anticorpi împotriva
antigenului "miez" (core) al virusului hepatitei B la cimpanzeu.
Afirmaţiile de mai sus sugerează că un vaccin care să asigure imunitate completă şi de lungă durată,
produs pe bază de peptide sintetice, trebuie să conţină, atât epitopii de suprafaţă care induc sinteza de
anticorpi neutralizatori ai virusului, cât şi antigene care sunt în stare să declanşeze producţia de anticorpi non-
neutralizatori.

2.1.4.3.2. Vaccin anti-aftos

În medicina veterinară realizarea unui vaccin pe bază de peptide care să nu aibe dezavantajele vaccinurilor
clasice, pentru a pune sub protecţie imunologică bovinele, ovinele, caprinele şi porcii împotriva infecţiei cu
virusul febrei aftoase, este de mare importanţă economică.
În prezent boala este ţinută sub control de vaccinarea profilactică a animalelor, folosind vaccinuri
preparate din virusul febrei aftoase, replicat în culturi de ţesut epitelial lingual prelevat de la bovine, sau în
culturi de celule folosind linia celulară BHK-21 în monostrat sau în suspensie.
Virusul astfel obţinut pentru a fi transformat în vaccin este inactivat cu formal-dehidă sau cu o imină,
adsorbit pe gel de hidroxid de aluminiu. El se injectează, cu sau fără adăugarea unui adjuvant, aşa cum este
saponina. Experienţa multor ţări a demonstrat că astfel de vaccinuri sunt eficiente, iar dacă sunt injectate la
animale, răspândirea febrei aftoase este ţinută sub control.
Motivele care-i determină pe imunologi să caute alternative la vaccinurile clasice pentru prevenirea febrei
aftoase sunt legate de faptul că ele au o activitate antigenică foarte variabilă. Virusurile clasice existente în
prezent aparţin la 7 serotipuri, ceea ce înseamnă că atunci când un animal este vaccinat cu microorganisme
aparţinătoare unui anumit serotip, el devine rezistent numai împotriva unui astfel de virus. In acest caz
animalul va putea face boala dacă este infectat de viruşi care aparţin celorlalte 6 serotipuri. Sunt dovezi că
chiar în cadrul aceluiaşi serotip există variaţie de antigenitate.
Reiese de aici că realizarea unui vaccin cu spectru larg şi fără riscul de-a produce boala la animalele
vaccinate prin reconvertirea virusurilor atenuate, cu posibilităţi de prezervare indefinită ar avea avantaje
considerabile. Biologia moleculară oferă o posibilitate de realizare a unui astfel de deziderat prin sinteza
artificială de peptide imunogene specifice.
 □ Caracteristicile moleculare ale virusului febrei aftoase
Prin ultracentrifugare s-a dovedit că virusurile sedimentează printr-o centrifugare în soluţie Ia 146 S (146
unităţi Svedberg). Materialul lor ereditar este format din ARN cu greutate moleculară 2,6x106. Materialul
ereditar este inclus într-o anvelopă proteică (capsida) formată din 60 de copii aparţinătoare la 4 tipuri de
proteine. Cele 4 tipuri de proteine sunt notate cu VP (virus proteins) de la 1-4. Primele 3 proteine VPi; VP2;
VP3, au o greutate moleculară asemănătoare: cea 24xl03. Cea dea patra proteină VP4 are, însă, o greutate
moleculară mult mai mică 10x103.
Virusul are două proprietăţi importante:
a) la pH sub 7,0 se dezagregă în două părţi: un ARN care deţine caracteristica de infectiozitate şi de pe
care se sintetizează şi proteina V?4 precum şi o subunitate proteică formată dintr-un agregat a lui VPrVP3.
Aceasta din urmă este un pentamer al proteinelor VP1-VP3 care sedimentează în ultracentrifugă la 12S. Este
interesant de subliniat că mixtura tuturor acestor fragmente nu are activitate imunogenică decât în proporţie
de 1% din activitatea care o dezvoltă virusul întreg (particule 146S);
b) particula virală este susceptibilă de-a fi digerată cu tripsina. Un tratament cu această enzimă are ca
urmare pierderea infectivităţii, iar la unele suşe aceasta atrage după sine şi pierderea activităţii imunogenice.
Cercetările au dovedit că numai proteina VP1 poate fi clivată cu ajutorul tripsinei. celelalte tipuri de proteine
rămân neafectate de un astfel de tratament.
Izolarea proteinei VP1 şi secvenţializarea ei în aminoacizi a dus la aflarea succesiunii codonilor în lanţul
de ADN corespunzător şi la sintetizarea lui. Transferul acestuia (a genei) în bacteria E.coli a dus la obţinerea
de proteină recombinată, în cantităţi suficient de mari. Injectarea acestui produs la animale de experienţă a
scos în evidenţă că acest tip de proteină (VP1) are activitate imunogenică semnificativă (SÂNGER şi colab
1977, KLEID şi colab 1981).
Fracţionarea succesivă a proteinei VP1 cu cyanogen bromide în prima etapă, urmată de tripsina şi apoi de
o protează izolată din glanda submaxilară a dus la obţinerea unor fragmente peptidice. Utilizarea separată a
acestor fragmente (peptidice) în imunizări, a dus la descoperirea determinanţilor antigenici care se găsesc în
lanţul proteinei VP1. S-a stabilit că proteina VP1 are doi determinanţi antigenici: unul format din aminoacizii
146 până la 154, iar al doilea este format din aminoacizii 200-213. (BITLLE şi colab. (1982)
Analiza succesiunii aminoacizilor în lanţul lung al proteinei VP1 izolată din virusurile febrei aftoase
aparţinătoare la trei serotipuri diferite, a dus la concluzia că secvenţele de aminoacizi sunt aceleaşi la toate
serotipurile. Numai trei regiuni din lanţul de proteină au poziţii de aminoacizi variabili care constituie
epitopii. Ele sunt cele formate din aminoacizii 42-61; 138-160 şi 194-204. Deoarece regiunea formată din
aminoacizii 42-61 este hidrofobă ea se găseşte înăuntrul capsidei virale şi deci este improbabil să formeze un
determinant antigenic. Celelalte două fiind hidrofile se găsesc la suprafaţa virusului şi constituie, cu
siguranţă, situsurile imunogene (epitopii) ale acestei proteine. Redăm în figura următoare o schiţă a localizării
epitopilor în proteina (P1) a virusului febrei aftoase şi procedeele de fracţionare a acesteia.
 2.1.4.3.3. Alte vaccinuri realizate pe cale neconvenţională
Până în prezent s-a reuşit sinteza de vaccinuri sintetice, peptidice, împotriva mai multor virusuri care
produc boli, mai ales, la oameni. In compoziţia lor s-au inclus proteine capsidice care diferă de la o specie de
virus la altul. Astfel vaccinul sintetic antipoliornielitic foloseşte proteina din capsida VP1 (34KD), care
conţine un determinant antigenic major neutralizant, în situl care cuprinde aminoacizii 93-103. Vaccinul este
însă eficient numai dacă conţine toate cele cinci situsuri antigenice independente care se găsesc pe proteinele
VP1; VP2 şi VP3. (EMLNI şi colab (1984).
In cazul virusului influenţei un vaccin eficient trebuie să conţină cel puţin 4 situsuri antigenice care se
găsesc pe moleculele proteice HA şi NA, iar un vaccin împotriva virusului pojarului trebuie să conţină în
mod obligatoriu proteinele HA şi F.
In calitate de antigene antivirale în vaccinurile sintetice neconvenţionale ar putea fi folosite aşa numitele
proteine nonstructurale, produse de gene speciale, implicate în reglare a unor fenomene biochimice
intracelulare. Acest fel de proteine mai numite şi trans-acting sunt absolut necesare atunci când materialul
ereditar al virusului care a fost "injectat" în celulă trebuie să se replice pentru a forma noi particule virale.
Anticorpii formaţi împotriva unor astfel de proteine nonstructurale ar putea interfera cu replicarea virusurilor
stopând astfel avansarea infecţiei.
 2.1.4.4. Tehnologia de donare a unei gene izolate
□ Producerea peptidelor pe cale industrială necesită metode speciale
Acestea ţintesc:
a) donarea genei izolate în sisteme celulare;
b) procesarea lor pentru a le spori eficienţa imunogenă.
Înainte de-a preciza cum se donează o genă şi cum ea se exprimă în proteina care o sintetizează trebuie să
precizăm următoarele:
1) Clonă de ADN care provine dintr-un ARN-m poate fi mult mai util decât un clon provenit dintr-un ADN
genomic, din cauză că previne problemele care pot să se ivească din apariţia unei secvenţe de intervenţie care
ar stânjenii expresia genelor donate. ARN-m conţine doar secvenţele informaţionale (exonii genei), iar gena
din constituţia ADN - conţine, pe lângă exoni, şi intronii acesteia (secvenţele neconvenţionale).
2) La genele donate trebuie să se ataşeze întotdeauna un promotor pentru că numai astfel se poate declanşa
transcripţia ARN-m viral în vederea declanşării sintezei de proteină.
3) Genele donate trebuie să fie inserate într-o orientare corectă, iar codonii lor să fie „citiţi" începând de la
promotor.
4) Produsul genei (proteina antigen) să poată fi rapid şi uşor identificat.

2.1.4.5. Clonarea şi expresia genei de interes în celule gazdă

Pentru clonarea genelor (ADN) izolate pot fi folosite celule procariote şi eucariote. Deoarece fiecare
dintre ele prezintă avantaje şi dezavantaje vom descrie în continuare cum se comportă un fragment de ADN
străin în diferitele feluri de celule folosite în calitate de gazdă.

2.1.4.5.1. Clonarea genelor în celule procariote

Escherichia coli (E.coli) este cea mai utilizată bacterie pentru clonarea şi expresia fragmentelor de ADN-
străin, prelevat de la eucariote sau procariote. într-o astfel de gazdă s-au obţinut clonarea şi expresia genelor
care răspund de sinteza insulinei umane, a diverselor specii de interferon uman, a hormonului de creştere
(STH), a activatorului de plasminogen tisular etc. Pe această cale se produc acum cantităţi imense din astfel
de produse, utilizate pe scară largă în medicina umană.
Am amintit mai înainte că atunci când se doreşte să se obţină clonarea unui fragment de ADN (gena de
interes) într-o celulă gazdă, este obligatorie ataşarea de aceasta a unui promotor care nu este altceva decât o
succesiune de nucleotizi pe care se insera polimeraza ARN. Este ştiut că fără intervenţia acestei enzime
desfăşurarea (despiralizarea) celor două catene ale ADN-ului şi sinteza "de novo" a ARN-mesager, pe gena
de interes, este imposibilă.
Promotorii utilizat pentru legarea de gene de interes care urmează să fie introduse prin transformare sau
conjugare în E.coli sunt de regulă de origine bacteriană şi virală. Cei mai utilizaţi promotori de origine
bacteriană sunt: trp, lac UV5, hybrid, trp-lac (tac). Promotorii de origine virală folosiţi sunt prelevaţi de la
fagul lambda PL şi de la fagul T7 şi 75.
 □ Celulele E.coli nu pot "maturiza" proteinele străine sintetizate
Deşi s-au obţinut succese în sinteza de proteine imunogene (antigen), pe baza genelor transferate în E.
coli, o mare parte din produsele obţinute au activitate antigenică scăzută. Se pare că aceasta se datorează
"imaturizării" peptidelor obţinute pe această cale. Se cunoaşte că în interiorul bacteriilor proteina străină nu se
poate maturiza deoarece aici nu pot avea loc glicozilarea, fosforilarea şi împachetarea acesteia. Fără astfel de
modificări proteina nou sintetizată nu poate funcţiona corect. Activitatea proteinei străine produsă de bacterii
mai este stânjenită şi de faptul că deseori aminoacidul terminus ale acesteia fuzionează cu unele proteine
bacteriene. Aceasta are ca urmare afectarea structurii terţiare a proteinei cu repercursiuni negative asupra
epitopilor de origine eucariotă. Prin urmare celulele procariote pot fi utilizate pentru sinteza de proteine
străine, numai dacă pentru activitatea acestora nu sunt necesare glicozilări, fosforilări sau alte procesări
posttranslaţie.

□ Literatura de specialitate citează unele succese în donarea şi expresia unor gene virale care au
avut drept gazdă E.coli
Proteine virale s-au realizat deja prin transferul ADN-complementar (ADN-c), în bacteria E-coli, obţinut
de la virusul influenţei A (proteina HA) sau de la virusul hepatitei B (DAVIS şi colab.1980).
De asemenea în bacteria E.coli s-a putut clona şi gena "ssb" izolată de la o bacterie la care s-a ataşat un
promotor al fagului lambda PL. Pe această cale s-a putut obţine cea 3 mg de proteină pură "ssb" pe gram de
broaiat de E.coli. (MATT şi colab. 1985).
Din multiple cercetări efectuate cu scopul de-a obţine proteine virale cu activitate antigenică ridicată a
reieşit totuşi că E. Coli nu este o gazdă adecvată pentru un astfel de scop. Concluzia este susţinută de faptul
că o proteină pentru a avea activitate antigenetică trebuie să sufere, după sinteză, o mulţime de procese de
glicozilare, fosforilare, clivaje şi asamblări. E.coli nu oferă în citoplasmă ei condiţii adecvate pentru
înfăptuirea unor astfel de procese biochimice.

□ Un sistem celular eficient trebuie să aibă proprietatea de-a elimina în mediul de cultură produsul
de sinteză
Un alt dezavantaj pe care-1 prezintă folosirea bacteriei E.coli în calitate de gazdă pentru expresia genelor
străine este şi faptul că aceasta nu posedă mecanisme care să permită secreţia proteinei nou sintetizate în
mediul înconjurător. Din această cauză izolarea şi purificarea produsului genei străine devine posibilă numai
după liza bacteriilor transformate. De aceia se caută alte specii de microorganisme în calitate de gazdă pentru
gene străine care să fie capabile să elimine proteinele după sintetizare în mediul în care se cultivă bacteria.
Din această cauză atenţia a fost îndreptată spre unele bacterii gram pozitive din genul Bacillus care posedă
o astfel de proprietate. Bacteria Pseudomonas aeruginosa, deşi este gram-negativă, s-a dovedit că este o bună
gazdă pentru expresia genelor fosfatazei alcaline, exotoxina A, hormonul de creştere uman. Ea are avantajul
că după sinteza proteinei urmează eliminarea produsului de sinteză în mediul de cultură (GRAY şi colab.
1984).
 2.1.4.5.2. Clonarea genelor în celule de eucariote

Am stabilit deja că celulele procariote aşa cum sunt bacteriile, nu posedă "instrumentele" necesare
modificărilor de structură secundară terţiară şi cuaternară a proteinelor, imediat după ce ele s-au sintetizat pe
ARN-m. Din această cauză s-a căutat să se găsească altfel de celule gazde care să primească gene izolate şi să
le facă să producă proteine în cantităţi mari şi cu structuri normale. Acestea sunt drojdiile, culturile de celule
de mamifere şi de insecte.
1. Drojdiile
Ele sunt celule primitive eucariote şi au avantajul că permit proteinelor ca imediat după ce s-au sintetizat
să sufere glicozilări şi plieri corespunzătoare structurii lor primare. Drojdiile mai au o calitate. Ele au şi
capacitatea să secrete în mediul lor de cultură proteinele pe care le sintetizează ceea ce uşurează izolarea şi
purificarea produsului de sinteză a genelor străine transferate.
In anul 1980 BEGGS şi colab., au demonstrat experimental că gena fi-globinei (proteine hemoglobinei),
izolată de la iepuri precum şi gena interferonului uman efectuat de HITZEMAN şi colab.(1981) cărora li s-au
ataşat promotori adecvaţi pot fi transferate în drojdia Saccharomyces cerevisiae şi făcute să funcţioneze. Ele
produc β -globina şi respectiv interferon în cantitate suficient de mare şi la costuri acceptabile.
C.YONG KANG (1989) pe baza unor lucrări efectuat de alţi autori aduce dovezi care susţin că S.
cerevisiae este o bună gazdă pentru transferul şi expresia unei variate game de gene străine prelevate de la
eucariote sau virusuri. S.cerevisiae a permis producerea în cantităţi mari a proteinelor de mamifer. Acestea
sunt următoarele: proteina sintetizată de gena activatorului de plasmogen, proteina sintetizată de către gena
albuminei serice umane, gena α-interferonului uman, stomatitelor Sindbis şi veziculare, B şi încă multe
altele.
■ Promotorii utilizaţi trebuie să determine expresia genei de interes în celula de drojdie Promotorii
utilizaţi pentru genele izolate destinate să fie transferate şi să funcţioneze în S.cerevisiae au fost: promotorul
genei gliceraldehid-3-fosfal dehidr-ogenaza drojdiei, promotorul alcohol dehidrogenaza 1, promotorul 3-
fosfoglicera-tkinaza şi a fosfatazei acide de drojdie. Toate genele izolate la care li s-au ataşat unul din
promotorii de mai sus au fost legate de o plasmidă izolată de la E.coli care posedă markeri selectivi şi
repliconi şi apoi transferate, în celulele de drojdie.
Cu toate succesele obţinute în laborator, arunci când s-a încercat industrializarea tehnologiei s-a constatat
că S.cerevisiae în calitate de gazdă pentru gene străine are mari neajunsuri şi anume:
a) vectorii plasmidici utilizaţi pentru expresia genelor heteroloage (străine) sunt prezenţi într-un număr
prea mic de copii pentru a fi foarte productivi. In plus de asta ei au o stabilitate de scurtă durată.
b) unii promotori utilizaţi pentru a face să funcţioneze gena structurală sunt constitutivi şi deci nereglabili,
ceea ce constituie un dezavantaj selectiv. Unii
 promotori care sunt reglabili (neconstitutivi) aşa cum este cel al genei galactokinazei şi cel al fosfatozei
acide, au nevoie de o cantitate prea mare de galactoză, iar al doilea de o concentraţie prea scăzută de fosfat, în
mediu de cultură pentru a induce intrarea lor în funcţiune (producerea de ARN-m şi începerea sintezei de
proteină).
Se pare însă că drojdia metilotrofă Pichiapastoris permite dezvoltarea sintezei genelor străine, dacă
acestora Ii se ataşează promotorul genei care controlează în mod natural alcooloxidaza 1 ale acestei specii de
drojdii unde se găseşte în proporţie de 30% din totalul proteinelor (la drojdiile care folosesc glucoza această
genă lipseşte). Acest promotor fiind reglabil poate fi indus cu uşurinţă să intre în funcţiune. Succesele
obţinute de GREGG şi colab (1987) în expresia genei HBsAg (gena antigenului de suprafaţă a virusului
hepatitei B) atestă că drojdia Pichia pastoris este o gazdă adecvată pentru genele izolate, în scopul obţinerii
de peptide de interes care să aibe toate proprietăţile de structură identice cu cele naturale. Pe această cale ei
au putut produce din 60 grame de celule de drojdie recombinată uscate, 400 mg de proteină antigen HBsAg.

2. Celule de mamifere folosite pentru sinteza de proteine străine

Culturile de celule prelevate din ţesuturile mamiferelor, deşi sunt costisitoare, sunt cele mai bune mijloace
pentru transferul, donarea şi expresia genelor izolate din genomul virusurilor care infectează animalele.
Structurile primare, secundare, terţiare şi quaternare a proteinelor sintetizate de genele transferate în celule
de mamifere sunt identice cu cele naturale. Aceasta înseamnă că ele funcţionează ca antigene, similar cu cele
naturale şi în consecinţă pot fi folosite pentru producerea de vaccinuri neconvenţionale. Celulele de
mamifere cele mai utilizate sunt: celulele ovariene de hamster, celulele renale de mamimuţă, fibroblaste de
şoarece, linii celulare hepatoma umană.
Succesul transferului genelor izolate, donarea şi expresia lor în celule de mamifere este condiţionat de
plasmida cu care se cuplează gena de interes şi de promotorul utilizat. Reamintim că este necesară legarea
genei de interes la capătul unei plasmide, nu numai în calitate de vehicol pentru a putea fi transferată în
celulă, ci şi pentru că aceasta posedă calitatea de a se replica în sute de exemplare (are replicon), donând în
acest fel şi gena de interes. Este necesară de asemenea ataşarea la capătul genei a unui promotor de care să se
prindă ARN polimeraza. Absenţa polimerazei ARN-m de pe promotor face imposibilă transcrierea şi în
consecinţă nu se va putea începe sinteza proteinei corespunzătoare.
Promotorii cei mai utilizaţi pentru gene izolate şi transferate în celulele de mamifere aflate în culturi
continue sunt: a) promotori timpurii şi târzii ai virusului SV40 (Simian virus 40), b) a virusului Papilloma
bovine şi a promotorilor unor retrovirusuri, c) precum şi a promotorului genei metalotioninei de la şoarece.
Plasmidele folosite în sintezele de proteine străine în culturi de celule eucariote sunt: a) fie pBR322
recoltate de la E.coli, b) fie cosmide, c) fie plasmide compozite construite în mod special pentru atingerea
scopului dorit.
 □ Un exemplu concret de sinteză a unei peptide virale în culturi de celule eucariote
Pentru a putea distinge care sunt treptele de obţinere a unei peptide virale imunogene în celule de
mamifere şi calea tehnologiei ADN-recominat vom descrie experimentul reuşit a lui SIMANSEN şi
LEWISON (1983) citat de YOUNG KANG (1989). Ei au produs, pe calea tehnologiei ADN-recombinat, un
vaccin neconvenţional împotriva virusului Herpes simplex (HSV) izolând gena gD din genomul acestuia şi
transferând-o, după o prealabilă procesare. într-o linie de celule cultivate, prelevate din ovar de hamster
chinezesc . Pentru aceasta ei au constituit o plasmidă complexă care a conţinut următoarele:
l)Gena truncată gD izolată din genomul virusului Herpes simplex (HSV) la care au ataşat promotorul
timpuriu izolat de la virusul SV40 pentru ai conferi genei un control transcripţional. La aceasta au mai
adăugat terminaţia transcripţională 3' şi semnalele poliadenilate ale genei antigenului HBsAg de la virusul
hepatitei B.
2) La unitatea de mai sus ei au mai legat secvenţele unui ADN-complementar care codifică enzima
dihidrofolat reductaza (DHFR). De el au legat un promotor timpuriu secund al virusului SV40 care permite
selecţia împotriva celulelor din culturi care au în genomul lor o deficienţă a genei dihidrofolat reductaza
(DHFR).
3) La cele de mai sus autorii au mai adăugat o unitate compusă din gena care conferă rezistenţă la
penicilină precum şi originea repliconului bacterian de la plasmidă pBR322 a bacteriei E.coli.
Plasmidul constituit din cele 3 elemente descrise mai sus denumit "pgDtrunc DHFR " a fost introdus prin
transfecţie. pentru clonare, într-o linie de celule ovariene de hamster chinezesc deficiente în DHFR. plus mai
multe linii celulare care erau capabile să crească în mediu de cultură fără aminoacizii hipoxantină, glicină şi
timidină. Două linii celulare donate au produs şi secretat în mediu proteinele gD ale capsidei virusului Herpes
simplex (HSV). Aceste proteine injectate la şoareci au produs imunitate 100% atunci când aceştia au fost
infectaţi cu o cantitate mare de virus virulent. în felul acesta a devenit clar că peptida sintetizată de gena
transferată are toate atributele structurale ale celor existente în mod natural în capsida virusului.
Aceste rezultate au demonstrat, în mod indubitabil, că modificarea, într-un anumit fel, a liniilor celulare
prin metodele ingineriei genetice le face pe acestea capabile să producă vaccinuri neconvenţionale foarte
eficiente şi de mare perspectivă şi nu numai pentru oameni, dar şi pentru animalele domestice.
Succese asemănătoare au fost obţinute şi în sinteza artificială a proteinei imunogene HBsAg a virusului
hepatitei B prin transfecţia celulelor renale de maimuţă precum şi a glicoproteinei hemaglutinina (HA) a
virusului influenţei.

2.1.4.6. Clonarea genelor în celule de la insecte

Culturile de celule prelevate din ţesuturile insectelor s-au dovedit a fi mijloace ieftine şi eficiente pentru
clonarea genelor străine şi expresia lor în proteine nou sintetizate. Ele au avantajul că permit procesarea
secundară a proteinelor nou sintetizate (glicozilare, fosforilare. pliere. împachetare) ceea ce le conferă
proprietăţi funcţionale, similare cu cele naturale. în plus celulele insectelor, aflate în culturi, secretă în mediul
înconjurător proteinele străine sintetizate, cu excepţia celor care în mod natural nu părăsesc celula după ce au
luat naştere.
Linia celulară cea mai utilizată este stabilizată din anul 1970 şi provine din celule prelevate din ovarele
fluturelui de noapte Spodoptera frugiperda.
In calitate de vehicul este utilizat baculovirusul, polihidrozei nucleare numit Autographa colifornica
(AcNPV). De la baculovirus se păstrează atât promotorul, care se leagă de gena de interes, cât şi gena care
răspunde de sinteza proteinei polihedrina care protejează particulele virale de activarea enzimelor
distrugătoare a celulei gazdă.
POSSEE (1986 şi MATSUURA şi colab.1987) citate de YONG KANG (1989) au construit în calitate de
vehicul o plasmidă recombinată formată din gena de interes la care i s-a ataşat promotorul baculovirusului
AcNPV şi regiunea non-codificatoare 5' a genei polihedrina şi codonul ATC. Codonul de iniţiere ATC, care
declanşează translaţia genei polihedrina, are importanţă crucială în expresia genei străine.
Transfecţia acestui vehicol compozit în cultura de celule ovariene a moliei Spodoptera frugiperda are ca
urmare donarea şi expresia genei străine în interiorul celulei prin producerea unei mari cantităţi din proteina
de interes.
Pe această cale s-au obţinut cantităţi apreciabile şi complet funcţionale de proteine specifice, sintetizate de
gena beta a interferonului uman, de gena inter-leukinei-2, a interferonului a, a antigenelor S a virusului
limphocytic choriomeningitei, a genei hemaglutininei HA a virusului influenza, a antigenului Ta polyoma, a
antigenelor de suprafaţă a virusului hepatitei B etc.
Este interesant de remarcat că celulele insectelor sunt capabile să doneze şi să dea expresie de translaţie
unor gene străine chiar şi atunci când ele se găsesc în ţesuturile unor larve vii. Pentru susţinerea afirmaţiei
relatăm experimentele lui MAEDA şi colab. (1985) care au realizat un vector recombinat format dintr-o
regiune a baculovirusului care produce polihidroza nucleară la viermele de mătase (Bombix mori), format din
cea 100 kbase de ADN circular, de care a legat gena a-interferonului uman. Acest construct genetic a fost,
apoi, introdus prin transfecţie în larvele de Bombix mori. Rezultatul a fost că ADN-recominant, realizat ca
mai sus, s-a replicat în celulele larvelor şi a sintetizat aproximativ 50 μg de interferon a pe care l-au eliberat
în hemolimfa acestora.
□ Peptidele sintetice cu moleculă mică folosite ca vaccinuri trebuie să fie cuplate cu molecule
purtătoare de dimensiuni mai mari
În general, peptidele sunt formate dintr-un număr mic de aminoacizi (cca.20). In consecinţă din punct de
vedere a activităţii imunologice ele sunt haptene. După cum se ştie haptenele au activitate antigenică, dar nu
sunt şi imunogene (nu pot elicita sinteza de anticorpi).
Prin urmare o moleculă imunogenă ideală ar trebui să fie un multimer format dintr-un număr maxim de
determinanţi antigenici (epitopi) cuplat la o altă moleculă cu greutate moleculară mai mare în calitate de
vehicol (carrier). Se ştie din imunologie că prezentarea corectă a determinanţilor antigenici (epitopilor) în
molecula de antigen este cheia producerii unor subunităţi de vaccinuri sintetice.
 De aici rezultă că producerea pe căi biotehnologice a unor proteine în calitate de antigeni cu structură
primară incorectă, urmată de amestecul lor, nu va avea decât un minimum de şanse pentru a se obţine un
vaccin polivalent.
Din această cauză pentru producerea de vaccinuri sintetice polivalente trebuie căutată altă cale. Ea ar
putea fi:
1. Obţinerea de proteine antigene chimere folosind tehnologiei ADN-recombinat. Aceasta presupune
formarea, mai întâi, a unui material genetic compozit format din cuplarea, pe o anumită cale, a genelor de
interes (responsabile pentru sinteza antigenelor dorite), urmat de introducerea şi donarea lui într-o cultură de
celule eucariote (de mamifere sau insecte). Expresia genelor legate împreună ar duce la formarea de proteine
himere cuplate care păstrează toţi determinanţii antigenici pe locul lor firesc.
2. Altă metodă a fost deja încercată şi dovedită că este fiabilă. Ea foloseşte proprietăţile naturale ale
proteinei antigenice HBsAg a virusului hepatitei B şi ale proteinelor de înveliş ale virusului mozaicului
tutunului (VMT), de a se asambla, spontan, de alte proteine care sosesc în vecinătatea lor (VALENZUELA şi
colab. 1985 şi HAYNES şi colab, 1986). Prin urmare, inserţia genei de interes care sintetizează antigenul
dorit cu gena care sintetizează o proteină din capsida VMT urmată de transfecţia acestui compozit în celule
eucariote, va produce o proteină de mari dimensiuni formată din antigenul interesant cu greutate moleculară
mică şi din proteina mai mare a capsidei VMT.
Următorul experiment realizat de VALENZUELA şi colab.(1985) aduce argumente care susţin afirmaţia
de mai sus. Ei au izolat gena care produce antigenul de suprafaţa 1 gD din genomul virusului herpes simplex
şi a inserat-o la gena care produce epitopi neutralizând din codonul antigenului HbsAg de la virusul hepatitei
B. După introducerea acestui material compozit în celule eucariote a rezultat o proteină hibridă (himeră)
formată din particule de antigen gD şi HbsAg care păstrează în totalitate proprietăţile funcţionale ale celor
două componente.
HAYNES şi colab.(1986) au reuşit să lege o genă sintetică care codifică o proteină de înveliş a VMT la
care s-a inserat promotorul lac UV5 de la E.coli, de o regiune din genomul Polivirusului responsabil de
sinteza unei peptide care posedă epitopul antigenic Polio 3. Celulele eucariote transformate cu acest material
ereditar compozit au produs, în cantitate mare, o proteină hibridă (himeră) VMT-Polio 3. Această proteină
himeră injectată la şobolan a indus (elicitat) formarea de anticorpi neutralizând anti poliovirus foarte eficienţi.

2.1.4.7. Ameliorarea imunogenităţii proteinelor poate fi realizată şi prin conjugarea lor cu o

moleculă purtătoare
Am precizat mai înainte că proteinele antigene, obţinute ca subunităţi vaccinale, prin tehnologia ADN
recombinat, sunt în general mult mai puţin imunogene faţă de particula virală integrală.
In scopul sporirii imunogenităţii glicoproteinelor sintetizate pe cale biotehnologică s-a încercat ca ele să
fie incluse înăuntrul unui bistrat de liposomi preformaţi obţinând aşa numiţi imunosomi. Ideea a pornit de la
faptul cunoscut că moleculele de proteine în interiorul unui liposom (picătura de lipide) au o orientare
spaţială similară cu cea pe care o au în virusul natural. Liposomii sunt particule de lipide sferice care sunt
preparate de către cercetători în scopul includerii în interiorul lor a unor molecule de interes (antigeni.
medicamente etc). Una de proprietăţile lor, care este folosită de către cercetători, este uşurinţa cu care
liposomii sunt introduşi în interiorul celulelor. Odată cu ei vor pătrunde în celule şi moleculele de interes
incluse în interiorul lipososmilor.
Injecţia la animalele de experienţă a imunosomilor formaţi din liposomi şi glicoproteina G a virusului
rabic, a dus la constatarea că un astfel de conjugat antigen-liposomi este în stare să eliciteze formarea de
anticorpi neutralizând specifici, la un titru de aproximativ 7 ori mai mare, decât atunci când proteina a fost
injectată singură (THIBODEAN şi colab.1984).
Exemplul de mai sus şi încă multe alte experimente dovedesc că antigenele sintetizate prin tehnologia
ADN-recombinat pot fi determinate să devină mai imuno-gene dacă ele sunt conjugate cu membrana
liposomilor sau cu lipide de tipul lecitinei.

□ Inserţia genei virale de interes în genomul unui virus atenuat este o alternativă pentru producerea
vaccinurilor sintetice
Dacă o genă de interes care răspunde de sinteza unei proteine antigene este forţată să se integreze în
locusul homolog sau într-unui heterolog al unui alt virus se va obţine un virus hibrid recombinat. Dacă
genomul, care primeşte gena aparţine unui virus atenuat atunci recombinatul poate fi folosit pentru
vaccinarea oamenilor sau animalelor împotriva virusului de la care provine gena inserată.
Un astfel de virus atenuat care este folosit în calitate de gazdă poate fi făcut recombinat pentru mai multe
gene provenite de la 2 sau 3 specii de virusuri. In acest caz vaccinul devine polivalent.
Virusul vaccinia (care produce variola la animale) are materialul ereditar format dintr-un ADN dublu
catenar de o mărime impresionantă. El conţine cea 187 mii de perechi de baze. Dimensiunea neobişnuită a
genomului a făcut din virusul vaccinia un model experimental excelent pentru producerea virusurilor
recombinate. El mai are avantajul că posedă toate calităţile pentru a putea fi folosit în prepararea vaccinului
atenuat pentru eradicarea variolei. Din această cauză „vaccinia virusul" a fost ales ca model experimental
pentru obţinerea virusului recombinat.
în esenţă metodologia de obţinere a unui virus recombinat constă în următoarele: a) se construieşte "in
vitro" o genă himeră (un ADN-compozit) formată din secvenţele de nucleotide ale genei răspunzătoare de
transcripţia ADN-ului vacciniei şi a proteinei antigen care ne interesează, b) Această genă sintetică himeră
este introdusă apoi în cultura de celule care au fost proaspăt infectate cu vaccinia virus, c) Acesta pătrunzând
în celula în care se găseşte deja ADN-ul vacciniei se va insera la locusul homolog al secvenţei genei
reglatoare a transcripţiei, formând un ADN-recombinat care va conţine, pe lângă genomul propriu şi gena
străină, d) Atunci când începe în interiorul celulei replicarea genomului recombinat în mii de copii, pentru a
forma noi particule de viruşi se va replica şi gena străină, e) După replicare fiecare copie a ADN-recombinat
începe sinteza proteinelor de înveliş printre care se găseşte, cu siguranţă, şi proteina străină produsă de gena
transferată.
 Se înţelege că toate particulele de virus vor fi recombinate şi vor avea proprietăţi imunogene atât pentru
proteinele proprii cât şi pentru proteina străină pe care o conţine în propria sa capsidă. Evident că folosirea
acestui virus recombinat în calitate de vaccin va pune sub protecţie animalul sau omul, atât împotriva
variolei, cât şi împotriva virusului din care sa adus gena de interes.
Printr-o astfel de tehnică s-a obţinut de către SMITH şi colab. (1983) Virusul Vaccinia recombinat, care
conţine în capsidă lui proteine proprii, plus o proteină specifică virusului hepatitei B şi în plus o proteină
hemaglutinina Virusului influenţei.
Să observăm că virusurile recombinate obţinute prin tehnica descrisă mai sus folosesc sectoare omoloage
cu ale genomului viral gazdă care se leagă de gena de interes înainte de introducerea lui în cultura de celule
eucariote care au fost în prealabil infectate cu virusul atenuat care este normal. Din această cauză acest vector
poartă numele de vector homolog.
□ Vectori heterologi pentru sinteza de peptide virale
Este posibil să se construiască, prin biotehnologie, şi vectori heterologi înainte de a-1 administra în cultura
de celule deja infectate cu virusul normal, pentru transfecţie. Dacă acest lucru este posibil atunci folosirea ca
vehicol a unui virus "paşnic" neinfecţios ar duce la obţinerea unui virus recombinat care ar produce numai
proteine străine produse de genele transferate în genomul virusului. în acest caz virusul ar putea fi folosit în
calitate de vaccin, absolut inofensiv pentru animal şi om care ar elicita anticorpi numai împotriva antigenelor
produse de genele străine. în felul acesta se pune sub protecţie imunologică omul sau animalul numai
împotriva infecţiilor cu virusurile de la care au provenit aceste gene. Un astfel de virus paşnic este
adenovirusul uman tipurile 4 şi 7. El s-a dovedit că nu este, în nici un caz, oncogenic atunci când s-a
administrat oamenilor.
Prin urmare construirea artificială "in vitro" a unui vehicul format din genele de interes, izolate din
genomul unor virusuri patogene urmată de introducerea lui într-o cultură de celule umane, care au fost
infectate în prealabil de adenovirusul uman, ar determina intrarea acestuia în celule şi ataşarea lui de genomul
adenovirusului, imediat după promotor. Urinarea va fi producerea unui adenovirus recombinat heterolog care
va sintetiza, pe lângă proteinele proprii de inveliş, şi proteinele genelor străine transferate.
Folosirea lui ca vaccin va elicita anticorpi împotriva virusurilor de la care s-au prelevat aceste gene.
Evident că un astfel de vaccin este sigur şi stabil, şi posedă toate calităţile unui vaccin sintetic.
Adenovirusul tip 5 (Ad5) normal nu poate încorpora în ADN-ul său un fragment de ADN străin mai mare
de 2Kpb (2000 perechi de baze). Prin îndepărtarea regiunii 3 şi 1, care nu sunt esenţiale pentru replicarea lui
Ad5 în celulele infectate, se va putea obţine un vector viral deletat (cu o anumită zonă lipsă). în aceste
condiţii genomul rămas poate primi un fragment de ADN străin de mărime egală cu7 Kb.(7000baze). în felul
acesta construirea unui ADN recombinat, format din zona Ad5 şi gene străine, devine posibil. Un astfel de
ADN introdus în cultura de celule eucariote va sintetiza proteina de interes in cantitate suficientă şi de mare
utilitate în crearea de vaccinuri sintetice.
 Curs 4 Anticorpii monoclonali
2.2. Anticorpii monoclonali
Am discutat deja că în cazul în care o proteină, o glicoproteină, un polizaharid sau chiar o peptidă
(proteină scurtă) denumite antigen este injectată unui animal, limfociţii B ai gazdei sintetizează împotriva
acesteia o proteină foarte asemănătoare, structural, cu cea administrată animalului denumită anticorp.
Cea mai importantă proprietate a anticorpului constă în aceia că atunci când el întâlneşte antigenul îl
recunoaşte şi se cuplează cu el realizând ceea ce se numeşte reacţia antigen-anticorp. Proprietatea
anticorpilor de-aşi recunoaşte antigenul (de regulă proteine sau glicoproteine) a sugerat cercetătorilor ideea
de-ai folosi pentru identificarea, localizarea şi izolarea unor proteine existente, fie în membrana celulelor, fie
într-un amestec de specii de macromolecule (proteine sau glioproteine).
O asemenea idee este fezabilă deoarece anticorpii mai au încă două însuşirii deosebite şi anume:
1. Ei se pot fixa prin adsorbţie fizică sau legături covalente pe suporturi solide cum sunt: polistirenul,
poliamida, policlorura de vinii discuri de hârtie CNBr-Sepharoza, tiol-sefaroza.
2. In afară de aceasta anticorpii pot fi marcaţi prin legare cu fluoresceine sau rhodamina făcându-i vizibili
la microscopul optic cu florescenţă sau cu ferritina când pot fi văzuţi la microscopul electronic. Anticorpii de
asemenea mai pot fi marcaţi cu izotopi radioactivi. In acest caz prezenţa lor poate fi sesizată cu ajutorul
aparatelor denumite RIA (radioimunoassay).
Rezultă de aici că în cazul în care avem la dispoziţie un anticorp sintetizat de limfocitele B împotriva unei
anumite proteine şi apoi îl marcăm cu substanţele de mai sus, şi-1 depunem într-o cultură de celule, sau în
contact cu un ţesut, sau într-un amestec de molecule, acesta se va fixa cu multă precizie numai pe locul unde
se găseşte proteina împotriva căreia s-a sintetizat. Dacă vom privi structura respectivă la microscop vom şti,
cu siguranţă, unde este localizată proteina respectivă. Dacă acest lucru s-a realizat într-un amestec de mai
multe specii de proteine, anticorpul se va cupla numai cu proteina-antigen pe structura căreia s-a sintetizat. în
cazul în care amestecul de proteine este pus pe un suport poros (gel de agaroză, poliacrilamidă, amidon), şi
aşezat în câmp electroforetic ele se vor separa una de alta în funcţie de sarcina şi greutatea lor moleculară.
Dacă vom privi gelul în lumină ultravioletă, după trecerea unui timp corespunzător, acolo unde vom observa
fluorescenta vom şti, cu siguranţă, că acolo se găseşte proteina căutată. Dacă se decupează locul respectiv,
proteina aflată acolo poate fi izolată şi purificată.
Acelaşi fenomen se va întâmpla şi când de anticorp se leagă o enzimă cum ar fi peroxidaza sau fosfotaza
alcalină. Singura deosebire este că ele nu mai pot fi observate în lumină ultravioletă, ci numai cu ajutorul
spectofotometrului.
Rezultă de aici că anticorpii pot deveni instrumente de mare fineţe pentru identificarea, localizarea sau
izolarea unor molecule-antigeni, oriunde s-ar afla ele. Condiţia care trebuie să fie respectată este ca anticorpii
să fie singulari şi purificaţi.
 Atunci când injectăm probe de antigeni la oaie, iepure sau capră provocăm formarea unei cantităţi mari de
anticorpi împotriva acestora mai ales dacă aceasta o facem de două ori, la un interval de şapte zile. Serul
recoltat după 14 zile conţine anticorpul căutat dar se găseşte într-o mixtură cu o mulţime de alţi anticorpi. Ei
se numesc anticorpi policlonali. Din această cauză anticorpii policlonali (amestecaţi) obţinuţi ca mai sus sunt
inutilizabili pentru identificarea, izolarea şi purificarea unor antigeni de interes.
În ultimii ani însă a fost pusă la punct o metodă elegantă cu ajutorul căreia se obţin anticorpi singulari şi
de o puritate superioară. Aceştia se numesc anticorpi monoclonali.
Ei se obţin cu ajutorul donării unui hibrid celular denumit hibridoma.

2.2.1. Tehnologia obţinerii hibridoamelor

Primii cercetători care au realizat un hibrid celular între o celulă normală şi o celulă canceroasă au fost
MILSTEIN şi KOHLER în anul 1975. Pentru această realizare ei au şi primit premiul Nobel. Cei doi
cercetători au reuşit să determine fuziunea unei limfocit-B normal (care sintetizează anticorp) cu un limfoc'it
B-tumoral, leucemie (mielom) care nu poate sintetiza anticorpi. In felul acesta se obţine un hibridom. El are
două proprietăţi importante: a) cromosomii de la limfocitul B pot sintetiza anticorpi; b) limfocitul B tumoral
(numit mielom) conferă hibridomului proprietatea de-a se înmulţi într-un timp nelimitat (fără sfârşit). A fost
nevoie să se obţină un astfel de hibrid celular deoarece deşi limfocitele B pot fi cultivate "in vitro" ele nu pot
fi menţinute în cultură decât un timp foarte limitat.
In esenţă tehnologia de obţinere a unui hibridom constă în următoarele:
1. Obţinerea limfocitelor B
Sursa de limfocite B normale este splina sau ganglionii unui animal care a fost hiperimunizat cu antigenul
faţă de care se doreşte să se obţină anticorpii monoclonali. Pentru aceasta se fac două sau mai multe imunizări
cu antigenul dorit. Se poate folosi orice antigen de orice dimensiune cu condiţia ca cele cu dimensiuni
moleculare mici denumite haptene, să fie cuplate cu molecule proteice mai mari numite carrier (ex. Keyhale
Limpet Hemocyanin, KLH) şi, în plus, să i se adauge adjuvantul Freund pentru a obţine amplificarea
răspunsului imun.
Imunizarea limfocitelor B poate fi realizată şi "in vitro". In acest caz limoficitele B care trebuie imunizate
se găsesc în cultură. într-o astfel de variantă cantitatea de antigeni folosită pentru imunizare este mai mică şi
nu mai este necesar să se folosească cuplarea antigenilor de dimensiuni mici haptene cu carrier şi nici
suplimentarea lor cu adjuvanţi.
Ca urmare a imunizării ei pot produce 45-55% imunoglobuline G, 5-10%, IgA şi 45-55% imunoglobuline
M. Toţi sunt anticorpi monoclonali.
În prealabil, se imunizează animalul de la care se doreşte să se preleveze limfocitele B pentru a declanşa
transformarea lor în limfocite active. Acele limfocite care recunosc antigenul vor fi selecţionate şi vor suferi
diferenţierea dând naştere la clone deplasmocite. Serul imun rezultat va fi policlonal şi deci heterogen.
 Izolarea unei singure clone plasmocitare şi cultivarea sa "in vitro" va determina sinteza unui singur tip de
anticorp corespunzător unui singur determinant antigenic de pe suprafaţa antigenului folosit la imunizare. De
aceia el se numeşte anticorp monoclonal. Important de reţinut este că o astfel de clonă cultivată "in vitro" nu
va putea fi menţinută mult timp în cultură deoarece ele, după câteva generaţii, mor. Din această cauză ele
trebuie "salvate" prin fuziune cu un mielom care este un limfocit tumoral cu proprietăţi de multiplicare
accelerată şi cu o durată indefinită în timp, în condiţii de cultură (capătă caracteristici de imortalitate).
Limfocitele B se recoltează din splină. Ele se numesc splenocite.

2. Obţinerea de celule de mielom

Celulele de mielom (leucemii) sunt limfocite B care au suferit un proces neoplazic. Pentru a putea fi
utilizaţi în producerea hibridoamelor aceste celule, în afară de-a se menţine în cultură timp nedefinit, ele
trebuie să mai aibe şi o defecţiune metabolică implicată în sintetizarea substanţelor purinice. Ele trebuie să nu
poată sintetiza enzima HFR7"(hipoxantin-guanin fosforibozil transferaza). De asemenea ele trebuie să nu
poată sintetiza enzima Timidin-kinaza (TK). Din această cauză, astfel de celule pentru a putea trăi trebuie să
preia timidina din mediul de cultură. In consecinţă celulele de mielom vor trebui să fie de genotip HPRT TK
spre deosebire de cele normale care sunt HPRT TK. Este necesară această condiţie pentru a putea permite
selecţia ulterioară a celulelor de hibridom prin manipularea conţinutului substanţelor acestor două enzime în
mediul de cultură.
Hibridomul are două proprietăţi importante. în momentul în care cele două feluri de celule, splenocitele B
normale şi imunizate şi cele mielomatoase sunt puse în contact şi tratate într-un anumit fel vor fuziona
formând hibridomul. în momentul fuzionări lor celulele mielomatoase preiau cele două activităţi enzimatice
(sinteza enzimei HFRT şi TK) de la limfocitele B normale. în acest fel un hibridom cultivat pe un mediu
nutritiv care nu conţine cele două substanţe, aşa numitul mediu HAT (hipoxatina-aminopterina-timidina) le
va permite supravieţuirea, deoarece ele şi le pot sintetiza. Deoarece aminopterina blochează transformarea
substanţelor din mediu în purine, celulele din cultură sunt obligate, pentru a supravieţui, să-şi sintetizeze "de
novo" nucleotidele necesare încorporării în ADN-ul care se replică. în consecinţă numai celulele cu genotip
normal HPRT+, TK+ pot să se înmulţească într-un astfel de mediu cu aminopterina. Se înţelege că celule care
pot supravieţui într-un astfel de mediu sunt doar hibridoamele. Limfocitele B nefuzionate sau hibrizii
limfocite B / limfocitele B, vor muri în cursul primelor 1-2 săptămâni de la începutul cultivării lor. în
consecinţă în cultură vor rămâne doar hibridoamele pe care dorim să le obţinem.
Prin urmare, după realizarea fuziunii celor două celule în vederea selecţiei hibridoamelor, cultura de celule
este trecută pe mediul HAT (hipoxatina-amino-pterina-timidina).
în tehnica realizării hibridoamelor pentru obţinerea celulelor mielomatoase (plasmocitoamelor) se folosesc
şoareci singenici din suşa BALB/c. Dacă acestor şoareci li se injectează intraperitonial ulei mineral (Pristane),
după cea 120-300 de zile se dezvoltă, la majoritatea indivizilor, tumora (mielomul).
 3. Fuziunea celulelor
Pentru a obţine o rată acceptabilă de fuziune între limfocitele B normale şi cele mielomatoase este necesar
să se utilizeze un agent de fuziune. Cel mai utilizat agent de fuziune este polietilen-glicolul (P.E.G). Mai pot
fi utilizaţi în acest scop şi virusul Sendai sau dimetil sulfoxidul (DMSO). Se mai poate folosi pentru aceasta şi
sistemul avidină-biotină. în acest caz antigenul folosit pentru imunizare este cuplat, în prealabil, de avidină
care se fixează pe suprafaţa splenocitelor imunizate. Moleculele de biotină care se adaugă în mediu au
capacitatea de-a îmbrăca celule de mielom. Afinitatea existentă între avidină şi biotină, mijloceşte cuplarea
celor două celule.
Fuziunea se realizează amestecând într-un tub celule splenice, celule mielomatoase şi PEG. în urma
acestui procedeu rezultă:
a) celule splenice fuzionate cu cele mielomatoase,
b) celule splenice nefuzionate,
c) celule mielomatoase nefuzionate.
Pentru a elimina din cultură celulele nefuzionate şi a face să rămână doar celulele care au format
hibridomul, este necesar ca întreaga cultură de celule să fie trecută pe mediul HAT. într-un astfel de mediu,
celulele purtătoare a unei deficiente enzimatice nu pot să utilizeze din mediu hipoxatina şi timidina şi nici nu
pot să-şi sintetizeze singure precursorii nucleotidelor, deoarece calea de biosinteză endogenă a acestora este
blocată de aminopterină. în consecinţă ele vor muri. La fel vor muri în decurs de câteva zile toate limfocitele
B normale şi nefuzionate. Dimpotrivă o celulă mielomatoasă, fuzionată cu un limfocit normal va beneficia de
un genom normal al limfocitului B şi, în consecinţă, va putea realiza replicarea. Ca urmare după cea. o
săptămână vor rămâne în cultură doar hibrizi celulelor care au moştenit, pe deoparte proprietăţile de
imortalitatea ale celulei canceroase, precum şi echipamentul enzimatic al celulelor normale (a limfocitului B).
într-o cultură de celule prelucrată ca mai sus se găsesc mulţi hibrizi celulari care pot să fie selecţionaţi,
prin donare, cu ajutorul antigenelor şi să producă clone care să-l sintetizeze numai pe acel anticorp pe care-1
dorim. Un astfel de anticorp se numeşte anticorp monoclonal.
4. Clonarea hibridoamelor
Clonajul se realizează distribuind în câte un godeu câte o celulă, în mediu HAT dintre cele hibride rămase
în cultură. După 24 ore se va observa cultura la microscop, în godeurile unde s-a produs multiplicarea celulei
iniţiale se încearcă să se identifice cu ajutorul metodelor RIA sau ELISA prezenţa anticorpului în mediu de
cultură. în godeul unde s-a identificat anticorpul se repică celulele în alte godeuri cu conţin mediul HAT
pentru o nouă donare a hibridoamelor selectate
După ce s-a obţinut cultura pură de hibridom selecţionată, o parte din aceasta va fi conservată, prin
congelare, în azot lichid. Cealaltă parte va fi folosită în continuare pentru producerea de anticorpi
monoclonali.
□ Producţia de anticorpi monoclonali poate fi obţinută "in vitro" sau "in vivo"
Atunci când se utilizează producerea anticorpilor monoclonali "in vitro" se ţine seama că aceştia se vor
găsi dizolvaţi doar în mediul de cultură. De aceea pentru obţinerea anticorpilor monoclonali dintr-o cultură de
celule hibridate, acestea vor fi recoltate , puse în eprubete de centrifugă şi centrifugate. Supernatantul obţinut
va conţine anticorpul monoclonal în cantitate mare care va fi izolat şi apoi purificat.
Pentru producerea de anticorpi monoclonali "in vivo", se utilizează următoarea tehnologie: o anumită
cantitate de hibridoame se vor injecta, intraperitoneal, la animale de experienţă. In acest caz din fiecare
hibridom care se grefează pe peritoneu sau pe suprafaţa mezenterului se va forma o tumoară care va sintetiza
anticorpul şi-1 va secreta în lichidul peritoneal (numit lichid ascitic). Se recoltează apoi lichidul ascitic, fie
prin puncţie intraperitoneală, fie după sacrificarea animalului. Se purifică imuno-globulinele din lichid şi se
obţin anticorpi monoclonali în stare pură.
Avantajele anticorpilor monoclonali:
1) Posedă o mare specificitate pentru antigenul împotriva căruia s-a sintetizat.
2) Se pot obţine în cantităţi mari fără a-şi schimba caracteristicile cu trecerea timpului.
3) Relevă chiar şi diferenţele minore dintre antigeni care nu ar putea fi sesizaţi pe alte căi.

2.2.2. Aplicaţiile anticorpilor monoclonali

Ei pot fi folosiţi atât în domeniul apărării sănătăţii animalelor, cât şi în domeniul imunomodulării
producţiilor animalelor domestice.
T.J.G. RAYBOULD (1989) împarte utilizarea anticorpilor monoclonali în patru domenii care se
intercondiţionează:
a) imunocaracterizarea substanţelor;
b) imunopurificare;
c) imunodiagnostic
d) imunoterapie.
Imunocaracterizarea implică studiul anticorpilor monoclonali în scopul precizării specificităţii izotipului,
a constantei sale de afinitate şi activitatea sa biologică în prezenţa antigenului care 1-a provocat. Acestea
sunt: a) neutralizarea (în cazul virusurilor) b) fixarea complementului sau c) aglutinarea. La un anticorp
monoclonal trebuie să i se cunoască harta epitopilor antigenici împotriva cărora sunt funcţionali, precum şi
natura epitopilor.
Imunopurificarea anticorpului monoclonal presupune imobilizarea sa pe un suport solid (matrix) cum ar fi
gelul de agaroză sau poliacrilamida ca imunoabsorbant.
□ Anticorpii în imunoterapie
Odată ce anticorpul de interes a fost purificat, el poate fi folosit, fie în lucrări care ţintesc detecţia
antigenului folosind metoda ELISA sau RIA, fie pentru imunoterapie în cazul unor boli. In acest din urmă
caz anticorpii monoclonali se folosesc prin injectarea lor ca atare la animalul bolnav în scopul de-a obţine o
protecţie imediată împotriva agentului infecţios sau pentru imunizarea animalului în scopul de-a obţine
anticorpi anti-idiotip.
 ■ Anticorpii monoclonali servesc şi la precizarea speciei în parazitozele animalelor
GAMBLE şi GRAHAM (1983) au produs un anticorp monoclonal pentru depistarea imunologică
a prezenţei parazitului Trichinella spiralis în organismul porcilor.
Anticorpul monoclonal a fost selectat şi purificat pentru imunoafinitate la antigenul stichocyte.
Acest antigen trichinella-spiralis specific, a fost apoi utilizat pentru depistarea porcilor purtători ai
parazitului când încă aceştia sunt în viaţă. Testul prezenţei sau absenţei Trichinellei în organismul
porcilor se face prin metoda ELISA, din probe de ser recoltate de la porcul viu.
Metoda ELISA foloseşte anticorpul monoclonal Trichinella-specific în reacţia cu antigenul
parazitului care este prezent în serul animalului atunci când acesta este parazitat. Experienţa practică
a ţărilor occidentale a dovedit că folosirea antigenului monoclonal în depistarea animalelor
purtătoare de Trichinella spiralis, este foarte precisă şi elimină reacţiile pozitive false, cauzate de
prezenţa în ser a anticorpilor altor paraziţi cu care ar putea reacţiona încrucişat.
■ Şi pentru alte specii de paraziţi s-au realizat anticorpi monoclonali
WRIGHT şi colab. (1983) au reuşit să producă un anticorp monoclonal purificat care are imuno-
afinitate deosebită pentru antigenul specific al parazitului Babesia bovis.
Anticorpi monoclonali specifici au fost produşi şi pentru caracterizarea şi detecţia altor paraziţi
cum ar fi Trypanosoma cruzi, Fasciola hepatica, Theileria sergenţi (RAYBOULD, 1989).
■ Anticorpii monoclonali pot fi utilizaţi şi în precizarea agentului etiologic în diareea neonatală
Încă din anul 1983 GREENBERG şi colab. au obţinut anitcorpi monoclonali împotriva unei
proteine în mărime de 42 kilodatoni (KDa) din capsida rotavirusurilor recoltaţi de la multe specii de
animale domestice. Ei au ajuns la concluzia că anticorpii monoclonali realizaţi cu ajutorul unor
antigeni din capsidă şi folosiţi în metoda ELISA pot fi utilizaţi pentru serotipizarea diferitelor suşe
de rotavirusuri sau coroa-navirusuri implicaţi în provocarea diareei neonatale la mai toate speciile
de animale domestice (purcei, viţei).
Mari progrese s-au făcut prin creerea şi folosirea anticorpilor monoclonali şi în diagnosticul şi
combaterea diareei neonatale la purcei provocată de spirocheta Treponema hyodisenteriae.
Diareea provocată de E. Coli enterotoxigenică de la viţeii şi purceii nou născuţi poate fi
diagnosticată şi apoi controlată cu ajutorul anticorpilor monoclonali. Este posibil astăzi să se
precizeze, direct, cu ajutorul anticorpilor monoclonali antigenele specifice din fimbriile bacteriei
E.coli enterotoxigenice care sunt implicate în adeziunea bacteriei pe mucoasa intenstinului subţire.
Aceasta are avantajul că nu mai este necesară cultivarea bacteriei în vederea diagnosticului suşei (K-
88 sau K-99 şi F 41). Metoda ELISA care utilizează anticorpul monoclonal specific poate preciza
prezenţa E.coli enterotoxigenică, în mod direct, din probe obţinute din fecalele animalului bolnav.
 ■ Anticorpii monoclonali în diagnosticul bolilor respiratorii
Anticorpii monoclonali împotriva virusurilor şi a bacteriilor care produc boli respiratorii la animalele
domestice se folosesc cu multă eficienţă în precizarea agentului patogen care le produc. Virusul Herpes Bovin
(BHV-1) care produce rinotraheita mfecţioasă a bovinelor este depistat cu uşurinţă şi cu o precizie deosebită
folosind anticorpi monoclonali realizaţi împotriva antigenelor glicoproteice din capsida acestuia. Cu ajutorul
lor s-a putut identifica, care din glicoproteinele BHV-1 ale acestui virus sunt responsabile în neutralizarea lui
şi în liza celulelor infectate dependente de complement. Ei au fost folosiţi şi în cartarea epitopilor de pe
suprafaţa antigenilor capsidici. Se pare că neutralizarea virusului poate fi făcută numai cu ajutorul unei
combinaţii de anticorpi monoclonali care au efect sinergie asupra mai multor epitopi care conferă
proprietăţile biologice ale virusului.
În arsenalul laboratoarelor de diagnostic există deja multe tipuri de anticorpi monoclonali cu ajutorul
cărora se pot preciza prezenţa bacteriilor Pasteurella haemolitica. P.multocida, Haemophilus
pleuropneumoniae, Micoplasma sp., la animalele care manifestă boli ale aparatului respirator.
■ Anticorpii monoclonali în alte boli infecţioase
În Canada şi Statele Unite ale Americii producerea unui set de anticorpi monoclonali împotriva lui
Brucella abortus a contribuit mult la eradicarea brucelozei la bovine, ovine şi caprine. Cu ajutorul lor se
poate stabili dacă anticorpii existenţi în serul sangvin al unei vaci sau oi sunt rezultatul vaccinărilor sau ei
provin din reacţia organismului la infecţia acestuia cu B.abortus. Anticorpii monoclonali produşi împotriva B
abortus şi a antigenilor de suprafaţă a acesteia pot fi folosiţi acum pentru ameliorarea preciziei testelor de
serodiagnostic al purtătorilor de B.abortus (RAYBOULT T.J.G, 1989). A devenit astfel posibil să se găsească
în populaţii indivizii purtători ai germenului şi să fie eliminaţi prin sacrificare.
Multe feluri de anticorpi monoclonali au fost produşi împotriva epitopilor antigenelor de pe suprafaţa
capsidei unor virusuri care produc boli infecţioase la animalele domestice. Folosirea lor în sistemul ELISA,
metoda indirectă sau competitivă a dus la imunocaracterizarea şi imunodiagnosticul multor boli virale. Cu
ajutorul anticorpilor monoclonali specifici s-a putut carta epitopii capsidei virusului fibrei aftoase, a virusului
Maedi-visna la oi şi capre, caracterizarea aşa numitei proteine "prion" care cauzează "scrapia" la ovine, o
boală foarte asemănătoare cu sindromul "vacii nebune" (encefalopatia spongiformă bovină) precum şi
detecţia prezenţei virusului limba albastră la bovine şi ovine.
■ Alte aplicaţii ale anticorpilor monoclonali
Anticorpii monoclonali pot fi folosiţi şi pentru caracterizarea componenţilor sistemului imun şi a depistării
toxinelor sau a diferitelor chimicale sau medicamente din furaje şi alimente. S-au produs anticorpi
monoclonali împotriva unei varietăţi de mediatori ai răspunsului imun cu ajutorul cărora pot fi identificate
celulele implicate în acest sistem precum şi imunoglobulinele circulante. Cu ajutorul lor este astăzi posibil să
se precizeze:
 1) harta epitopilor implicaţi în diferite funcţii ale imunoglobulinelor;
2) cuantificarea nivelului diferitelor clase şi subclase de imunoglobuline necesare în precizarea statusului
imun al animalelor;
3) cuantificarea răspunsului diferenţiat al animalului în producerea diferitelor clase de imunoglobuline
împotriva unui agent infecţios.
Cu ajutorul anticorpilor monoclonali pot fi detectate diverse toxine în nutreţuri sau resturi de mediamente
în alimente. Anticorpii monoclonali specifici pentru micotoxine folosiţi în sistemul ELISA, ne ajută la
detecţia, cu precizie, a aflatoxinelor produse de diferite mucegaiuri care parazitează furajele sau chiar
reziduuri de antibiotice în alimentele de origine animală.
■ Anticorpii monoclonali în terapie
Am precizat deja că un animal poate fi pus sub protecţie împotriva infecţiilor, în două moduri:
l)prin vaccinare preventivă folosind vaccinuri preparate din microorganisme
moarte, vii sau atenuate;
2) prin administrarea animalului bolnav a unui ser (antiser) bogat în anticorpi specifici antigenului patogen
care a produs boala.
Prima cale poartă denumirea de protecţie activă (imunizare activă), iar a doua este cunoscută sub numele
de protecţie pasivă împotriva unui germen patogen cunoscut. Când se administrează vaccinuri animalelor, în
sângele acestora se nasc anticorpi polivalenţi (policlonali), care recunosc o mulţime de epitopi de pe suprafaţa
învelişului agentului patogen. Protecţia animalului împotriva unei infecţii ar fi însă, mult mai eficientă dacă s-
ar realiza producerea de anticorpi numai pentru un anumit epitop principal. Aceasta poate fi realizată dacă
anticorpii monoclonali se folosesc, într-un anumit fel în vaccinare.

2.2.3. Anticorpi monoclonali anti-idiotip

1. Imunizarea activă cu anticorpi monoclonali anti-idiotip

După injectarea unui antigen la un animal, în serul acestuia limfocitele secretă anticorpi policlonali care
recunosc mai mulţi epitopi de pe suprafaţa antigenului. Fiecare parte a anticorpului care recunoaşte un epitop
poartă denumirea de idiotip.
Prin urmare un anticorp monoclonal poate fi asimilat cu un idiotip. Dacă un anticorp monoclonal este
injectat, repetat, unui animal el determină sinteza de anticorpi împotriva lui. Structura chimică mono, di şi tri
dimensionale a acestui anticorp va fi foarte asemănătoare cu a anticorpului monoclonal folosit ca antigen
pentru imunizare. Ea însă va fi modificată spaţial faţă de aceasta. Structura lui va fi imaginea "în oglindă" a
anticorpului monoclonal. Un astfel de anticorpi monoclonal se numeşte anti-idiotip.
Cu alte cuvinte se poate spune că la un anticorp anti-idiotip secvenţele de aminoacizi ai regiunii
hipervariabile, care constituie structura lui primară, vor fi asemănătoare celor din epitopul antigenului
original care 1-a determinat să se sintetizeze (anticorpul monoclonal).
 Dacă însă după purificarea anticorpilor anti-idiotip ei vor fi din nou administraţi unui alt animal acesta va
forma anticorpi împotriva anticorpului anti-idiotip. Ei se vor numi anticorpi monoclonali antianti-idiotip.
Structura lor primară (înşiruirea aminoacizi-lor), structura secundară (helicoidală), terţiară (plierea lanţului de
proteină) şi quaternară (împachetarea lanţului) vor fi identice cu cele ale anticorpului monoclonal original
folosit în imunizare. Evident că ei vor avea antigenitate identică cu anticorpul original.
De aici se desprinde ideea că în cazul în care dispunem de anticorpi monoclonali anti-idiotip, pentru un
anumit agent patogen, în cantitate suficientă, pe aceştia îi vom putea folosi la vaccinarea animalelor împotriva
respectivului germen. După o astfel de vaccinare titrul anticorpilor specifici va fi aşa de mare încât animalul
va fi imun chiar la o infecţie experimentală cu agentul infecţios. Un astfel de procedeu poate fi urmărit în
figura 26.

Aici autorii au presupus că un antigen X (un germen patogen) care are pe suprafaţa lui un epitop E
produce o boală infecţioasă. Dorim să imunizăm prin vaccinare animalele noastre cu un anticorp monoclonal
anti-idiotip împotriva epitopului E. Pentru aceasta se va proceda în felul următor: un animal A va fi hiper-
imunizat cu antigenul X. Ca urmare el va produce anticorpi anti X cu o largă specificitate pentru toţi epitopii
de pe antigenul X. Un mic număr din aceşti anticorpi vor fi specifici pentru epitopul E (anticorpi anti E). În
conformitate cu cele descrise mai înainte situsurile de combinaţie cu epitopul E al antigenului acestor
anticorpi vor fi "imaginea în oglindă" a structurii epitopului E de pe antigenul X.
Anticorpii anti E pot fi izolaţi cu ajutorul metodelor de purificare cu imuno-afinitate care conţin epitop E
imunoabsorbant sau prin donarea liniei celulare care-i secretă (vezi producerea anticorpilor monoclonali).
 Pasul următor care trebuie făcut este următorul: anticorpii anti E purificaţi vor fi utilizaţi pentru
hiperimunizarea unor şoareci de laborator (animalul B din fig.26). Ca urmare ei vor produce anticorpi cu
specificitate pentru epitopul E. Structura acestora va fi "imaginea în oglindă" a epitopului anti E original. Ei
vor fi anticorpi anti-idiotip.
Pentru a obţine peptide în cantitate suficientă cu structura identică epitopului E şi care ar putea fi folosite
în continuare în calitate de vaccin, este necesar ca anticorpul anti-idiotip să fie administrat unor animale de
laborator (animalul B din schema de mai sus). Aceştia vor produce anticorpul anti-anti-idiotip "E" care va
putea fi folosit la vaccinarea animalelor (animalul "c" din figura de mai sus) care îl va pune sub protecţie
imunologică împotriva agentului infecţios care posedă antigenul "X" în constituţia căruia se află epitopul "E".
Dacă antigenul presupus este un virus sau bacterie, atunci o astfel de cale de imunizare ca cea descrisă mai
sus, va fi foarte eficientă pentru protejarea animalelor faţă de agenţii etiologici respectivi.
Avantajele utilizării anticorpilor antiidiotip pentru imunizarea activă a animalelor constă în aceia că sunt
mai puţin toxici şi previne riscul de contaminare a animalelor cu acizii nucleici ai virusurilor împotriva cărora
se face protecţia imunologică.
Anticorpii monoclonali anti-idiotip mai au avantajul că pot mima determinanţii antigenii glucidici sau
lipidici care sunt mai puţin imunogenici Ia antigenul nativ şi care nu pot fi obţinuţi uşor prin tehnologia ADN
recombinat.
Unul din dezavantajele utilizării anticorpilor monoclonali antiidiotip, în calitate de vaccinuri îl reprezintă
metabolizarea rapidă a acestora, la locul de injectare, ceea ce scurtează durata de imunizare a animalelor.

2. Anticorpii monoclonali în protecţia pasivă împotriva bolilor infecţioase

Un animal infectat cu un anumit agent infecţios poate fi tratat dacă acestuia i se administrează anticorpi
specifici obţinuţi de la un alt animal infectat în prealabil în acest scop. In cazul în care dispunem de anticorpi
monoclonali în cantitate suficientă, iar agentul etiologic care a produs boala este identificat ( cu anticorpi
monoclonali în sistem ELIZA) atunci administrare anticorpilor monoclonali specifici epitopilor acestuia va
avea ca urmare neutralizarea şi distrugerea agentului patogen viral sau bacterian.

2.2.4. Anticorpii monoclonali în manipularea producţiilor animalelor domestice

Producţiilor animalelor domestice sunt rezultatul desfăşurării unor procese biochimice îndreptate spre
sinteza de substanţe noi la nivelul celulelor şi ţesuturilor. Durata şi intensitatea acestor procese sunt reglate
prin mecanisme fiziologice, la baza cărora stau mai ales enzime şi hormoni. Deoarece aceste substanţe sunt
de natură proteică, la reglarea producerii acestora intervin operoanele cu întregul lor sistem de inducţie -
represie. Numai în măsura în care înţelegem modul în care se desfăşoară procesele fiziologice din celule, la
nivel molecular şi cunoaştem cu precizie care elemente intervin în reglarea proceselor specifice din fiecare
etapă în care se desfăşoară sintezele, vom putea intui şi alege căile cele mai eficiente în manipularea
producţiilor animalelor domestice.
 2.2.4.1. Manipularea funcţiei de reproducere a animalelor prin imunomodulare
"Nu vom putea "interveni cu eficienţă în manipularea funcţiei de reproducere a ani-maîeîoT domestice
mimai dacă vom înţeiege cu exactitate raecamsTneîe cate participă la realizarea spermatogenezei sau
ovogenezei, a fecundaţiei, a instalării şi menţinerii gestaţie!. De asemenea nu vom putea şti de ce elemente să
ne folosim în manipularea funcţiei de creştere şi dezvoltare a animalelor dacă nu cunoaştem mecanismele
care participă la desfăşurarea acestui complicat proces de la nivelul celulelor şi ţesuturilor.
Dacă se doreşte să se intervină în desfăşurarea proceselor de reproducere fără de care nu pot exista
produse animale (toate produsele au ca punct de plecare reproducerea), atunci este necesar, mai întâi, să se
cunoască celulele, ţesuturile, organele şi substanţele care intervin în funcţionarea şi reglarea acestora. Dacă ne
referim numai la procesele de reglare a producerii spermatozoizilor şi ovocitelor mature, atunci trebuie să
înţelegem care sunt organele şi moleculele care participă la aceasta.
Din fiziologie se cunoaşte că maturarea gonadelor şi producerea gârneţilor se găsesc sub comanda
hipotalamusului şi a hipofizei. Primul este organul care sesizează necesitatea şi apoi producerea de honnoni
pentru declanşarea maturizării ovocitelor şi a fenomenelor care le însoţesc de la nivelul oviductului, uterului
şi vaginului. Hipotalamu-sul singur nu poate sintetiza hormoni care să aibe în calitate de organ ţintă, celulele
şi ţesuturile, aparatului genital. El sintetizează şi elimină în sânge numai peptide (hormoni) care au rolul de-a
elibera în circulaţie hormonii sintetizaţi de către glanda hipofiză.
Hormonii hipofizari foliculo-stimulatori numiţi FSH (follicle stimulating hormone) şi LH (luteinzing
hormone) se sintetizează în glanda hipofiză dar nu sunt eliberaţi din celule în circulaţie decât la "comanda"
hormonilor de eliberare hipotala-mici (releasing hormone). FSH şi LH au ca organe ţintă gonadele pe care le
stimulează, în scopul maturizării ovocitelor şi ovulelor. In afară de aceasta ei mai declanşează sinteza şi
eliberarea hormonilor sexuali steroizi. Redăm în schema din figura 27 cele precizate mai sus.
Mai trebuie să remarcăm că hormonii de eliberare a hormonilor hipofizari sintetizaţi în hipotalamus, aşa
cum este factorul de eliberare a hormonului luteinizant (leutinizing hormone-LHRh) care contribuie, atât la
maturarea foliculilor şi ovocitei, cât şi la procesul de ovulaţie este de natură proteică (o peptidă) formată din
10 aminoacizi.
Dacă se doreşte să se intervină în manipularea funcţiei de producere a spermatozoizilor sau ovulelor, în
scopul declanşării sau intensificării maturării spermatozoizilor sau ovulelor, este suficient să se observe
elementele care compun mecanismul după care se desfăşoară acest proces. Se poate observa că atât hormonii
hipotalamici de eliberarea LH şi FSH (LHRh şi FSHRh), cât şi hormonii hipofizari, atunci când se
sintetizează şi se secretă în circulaţia sistemică, sunt stimulatori ai funcţiilor ovarului şi testiculului.
 Prin urmare atunci când se doreşte ca ovogeneza (sau spermatogeneza) să se declanşeze la animalul
impuber sau să se intensifice la animalul puber, formând mai multe ovocite decât în mod natural (să se
producă superovulaţie), este necesar să se adauge hormoni prin injecţie, amplificând funcţia propriilor gene.
O asemenea conduită a pătruns deja în producţia zootehnică şi constituie o etapă obligatorie (superovulaţia)
în tehnologia embrio-transferului clasic. Hormoni FSH şi LH utilizaţi în biotehnologia de manipulare a
reproducerii femelelor se obţin, fie extrăgându-le din hipofize recoltate în abator de la porci sau de la oi, fie
produse pe calea tehnologiei ADN recombinat prin transgeneza genelor acestora în bacteria E.coli.

2.2.4.2. Anticorpii monoclonali în neutralizarea sexuală

Dacă există interes ca funcţia de reproducţie a masculilor şi femelelor să fie abolită, atunci factorii de
elaborare hipotalamici LHRh sau FSHRh sau chiar hormonii hipofizari însuşi LH şi FSH, atunci ei trebuie să
fie făcuţi nefuncţionali, pe o lungă perioadă de timp. O astfel de activitate este posibilă numai pe cale
imunologică. Având în vedere că atât hormoni hipotalamici, cât şi cei hipofizari sunt de natură proteică este
posibilă creerea, prin vaccinare, de anticorpi anti LHRh sau LH şi FSHRh sau FSH. Se pot crea, de asemenea,
anticorpi monoclonali de înaltă specificitate pe cale hibridoamelor, urmată de selecţia clonală.
Prin urmare scoaterea din funcţie a gonadelor masculilor şi a femelelor poate fi realizată pe două căi:
a) prin imunizare activă (vaccinare);
b) prin imunizare pasivă.
 □ Castrarea animalelor prin imunizare activă
Dacă am bloca pe o lungă perioadă de timp somatocrineJe hipotalamice (LHRh) aceasta ar avea ca
urmare, implicit şi scoaterea din funcţiune a tuturor celor care intervin în controlul funcţionării gonadelor,
deoarece ei se găsesc în fruntea ierarhiei mecanismului de reglare a acestor organe.
Acest lucru poate fi realizat prin administrarea repetată de hormoni LHRh în calitate de vaccin. Ca
urmare organismul animalului va sintetiza anticorpi anti LHRh care vor reacţiona cu hormonul propriu
blocându-i activitatea. In consecinţă va avea loc o castrare imunologică autentică a animalului care a suferit
un astfel de tratament.
ENGLISH şi colab.(1983) JRFFCOATE li colab (1982 şi 1984) prin imunizare activă a animalelor de
laborator şi a berbecilor şi taurilor foarte tineri, împotriva LHRh au obţinut abolirea de lungă durată a funcţiei
de reproducere, atât la masculi, cât şi la femele. Ei au demonstrat în acest fel că o castrare imunologică
(imunocastrare) a animalelor domestice este posibilă. Ca urmare a unui astfel de procedeu testicolele se
atrofiază, iar funcţia spermatogenetică şi ovogenetică este oprită pentru o lungă perioadă de timp.
Imunocastrarea animalelor domestice este foarte importantă pentru producţia animalelor domestice,
deoarece ea poate fi făcută fără anestezie generală, la vârsta când animalele au manifestat deja dimorfismul
sexual pentru mărimea şi calitatea carcaselor. Prin urmare o castrare la acest stadiu al dezvoltării taurilor sau
vierilor nu mai are efecte negative în calitatea cărnii şi dezvoltarea masei vii.
Imunocastrarea este de asemenea importantă şi pentru animale de agrement sau la animale sacre şi din
grădinile zoologice, deoarece ea nu este traumatizantă şi poate fi chiar reversibilă.
Este posibilă imunocastrarea femelelor şi masculilor şi prin utilizarea în calitate de vaccin a anticorpilor
monoclonali antiidiotip împotriva LHRh. Pentru înţelegerea fenomenului vezi şi subcapitolul 2.2.3.
□ Castrarea animalelor prin imunizare pasivă
Am descris mai înainte tehnologia de producere a anticorpilor monoclonali. Am precizat atunci că este
posibil să se obţină anticorpi monoclonali împotriva oricărei molecule mari care are proprietăţi antigenice. Ei
mai pot fi produşi şi prin vaccinarea unui animal cu anticorpi anti-idiotip. Dacă hormoni hipotalamici sunt
peptide suficient de mari ne apare logic să fie posibil să se selecţioneze hibridoame care să sintetizeze
anticorpi monoclonali şi împotriva LHRh. Prin metodologia descrisă într-unui din subcapitolele anterioare se
pot obţine cantităţi suficiente de anticorpi monoclonali anti LHRh. Administraţi masculilor sau femelelor
anticorpii anti LHRh pot să determine sporirea titrului acestora în serul sangvin pentru o lungă perioadă de
timp. Dacă ei vor fi în cantitate suficientă se vor cupla la moleculele de LHRh secretate sau existente în
celulele secretoare din hipotalamus şi-i vor neutraliza. Rezultatul va fi depleţia funcţiei gonadelor urmată de
atrofia acestora. Va avea loc ceea ce se numeşte imunocastrarea respectivului animal.
 2.2.4.3. Anticorpii monoclonali în producerea de animale din sexul dorit de crescător
Un management performant în fermele de vaci cere, în mod necesar, înlocuirea anuală a unui procent de
cea 25% din totalul femelelor dintr-o fermă. Având în vedere raportul sexelor de 1:1 şi coeficientul de
natalitate la animalele monotocice (care nasc un singur pui), de 80% se poate spune că, în fiecare an, mai
mult de jumătate din totalul femelelor din fermă trebuie să fie folosite pentru a produce descendenţa de sex
feminin, destinată să înlocuiască efectivul, care se reformează din diferite cauze.
Dacă într-o fermă de vaci de lapte este posibil să se producă animale numai din sexul pe care-1 doreşte
crescătorul, atunci proporţia de femele destinată să înlocuiască efectivul în fiecare an se reduce considerabil.
Aceasta ar avea ca urmare sporirea eficienţei selecţiei şi creşterea rentabilităţii fermei prin utilizarea unei
proporţii mai mari dintre femele pentru producerea de hibrizi de carne destinaţi comercializării.
□ Două căi sunt posibile pentru producerea de animale unisex
Una dintre ele este sexarea spermatozoizilor şi cealaltă este sexarea embrionilor preimplantationali
obţinuţi prin fecundaţia „in vitro" sau recoltaţi din coarnele uterine ale unor femele cărora li s-a indus în
prealabil superovulaţia.
Să le descriem pe rând.
a) Sexarea spermatozoizilor
Spermatozoizii dintr-un ejaculat pot fi împărţiţi în două categorii şi anume: spermatozoizi purtători de
gonosomi X (cromosomi sexuali) Y şi spermatozoizi purtători de gonosomul Y.
în cazul în care un spermatozoid, purtător al cromosomului sexual (gonosom) Y, va fecunda o ovocită,
(care nu poate avea decât un gonosom X), va rezulta, cu siguranţă, un mascul. Dimpotrivă dacă un
spermatozoid purtător de gonosom X va fecunda o ovocită cu gonosom X va rezulta o femelă. Prin urmare
numai spermatozoizii purtători de cromosomul Y sunt în stare să determine sexul descendenţilor.
De aici uşor se ajunge la ideia că identificarea şi separarea, într-un anumit fel, a spermatozoizilor care
poartă cromosomul Y de cei care poartă cromosomul X, numit şi „sexajul" spermatozoizilor, ar putea să ne
ajute să obţinem animale numai din sexul pe care-1 dorim.
Toate metodele destinate să conducă la identificarea şi separarea celor două categorii de spermatozoizi se
bazează pe existenţa diferenţelor biochimice şi de greutate specifică determinate de constituţia lor genetică şi
de dimensiunea celor doi cromosomi ai sexului: X şi Y. Cromosomul Y, pe lângă faptul că posedă gene
diferite faţă de cromosomul X, şi care duce la sinteza unor proteine diferite, afişate pe membrana acestora, are
şi o dimensiune mult mai mică decât cromosomul X.
Se ştie că proteinele diferite din constituţia spermatozoizilor pot să fie detectate cu ajutorul anticorpilor
mono sau policlonali. Prin urmare un anticorp produs împotriva cromosomilor sexuali numit şi anticorp
anticromosom X sau Y, ar putea ucide categoria de spermatozoizi corespunzători lui, lăsând în viaţă doar
cealaltă categorie de spermatozoizi.
 ■ Separarea celor două tipuri de spermatozoizi prin reacţie imunologică.
Proprietăţile antigenice diferite ale membranei celor două categorii de spermatozoizi oferă posibilităţi de
separare a acestora prin reacţii imunologice. Cu ajutorul anticorpilor mono şi policlonali, creaţi special
împotriva unor proteine specifice aparţinătoare numai spermatozoizilor Y şi X, s-a reuşit să se separe cele
două categorii de spermatozoizi la şoarece, taur şi iepure. Metoda are însă inconvenientul că în urma reacţiei
antigen-anticorp, rămân în viaţă numai unul dintre categoriile de spermatozoizi, şi aceasta în funcţie de
anticorpul utilizat.
Metoda foloseşte o proteină formată din câţiva epitopi, alcătuiţi fiecare din 8-11 aminoacizi (o peptidă)
care face parte din complexul major de histocompatibilitate (MHC) şi care se găseşte în compoziţia
membranei spermatozoizilor numit antigenul HY. Proteina este sintetizată de către o genă aşezată pe braţul
lung sau în regiunea centromerică a cromosomului Y.
Proteina H-Y existentă în membrana spermatozoizilor, dar şi în cea a celorlalte celule de la unul din sexe.
este suficient de lungă încât să poată elicita (să provoace) producerea de anticorpi atunci când este injectată,
repetat, în organismul celuilalt sex. Ea este specifică şi deci diferită de la un sex la celălalt, chiar în cadrul
aceleiaşi linii, puternic consangvinizate sau a unei familii. Aceasta este şi cauza respingerii grefelor de piele
sau de alte organe, atunci când se încearcă să se facă transplanturi de piele de la un sex la celălalt chiar între
animale sau oameni care sunt foarte asemănătoar genetic între ei.
Producerea de anticorpi, policlonali şi monoclonali împotriva epitopilor proteinei HY se realizează prin
injecţia de membrane izolate din celulele splinei, rinichilor, ficatului (de regulă de origine fetală) sau chiar
celule întregi recoltate de la unul dintre cele două sexe şi transferate, repetat, la celălalt sex. In felul acesta se
vor obţine seruri citotoxice numite anticorpi antimascul sau antifemel.
Metoda care ţinteşte identificarea spermatozoizilor purtători de gonosom X sau Y cu ajutorul anticorpilor
se face punând în contact, în două eprubete separate, spermatozoizii suspendaţi într-un mediu HEPES salin şi
TALP, (concentraţie 50x106) cu ser antifemel şi separat cu un ser antimascul şi incubate la 38,5°C în
atmosfera de 5% C02 în aer, timp de 60 minute. Spermatozoizii purtători al cromosomului Y datorită reacţiei
conflictuale antigen-anticorp vor fi aglutinaţi şi deci omorâţi atunci când vin în contact cu anticorpii
antimascul, iar cei purtători de X vor fi aglutinaţi şi omorâţi atunci când vin în contact cu anticorpii
antifemel.
Separarea spermatozoizilor care rămân în viaţă, de spermatozoizii morţi se efectuează cu ajutorul testului
swim-up. Aceasta constă în diluarea şi apoi centrifugarea uşoară a conţinutului eprubetei în care se găsesc
spermatozoizii cu mediu HEPES şi TALP, urmată de lăsarea ei în repaos în poziţie verticală. Procedeul va
avea ca urmare separarea, prin înot, a spermatozoizilor vii de cei morţi. Spermatozoizii vii vor ajunge prin
înot la capătul superior al eprubetei, iar la fund se vor depune aglutinatele cu spermatozoizii care au
reacţionat cu anticorpul. Repetarea acestei operaţiuni duce în cele din urmă la separarea spermatozoizilor X
de cei Y Spermatozoizii vii vor putea fi, apoi, folosiţi, mai ales, la fecundaţie „in vitro" sau la fecundaţie
intracitoplasmatică cu pipeta (ICSI).
 În laboratorul nostru Cornelia Vintilă a încercat separarea spermatozoizilor purtători de cromosom X de
cei purtători de Y ai taurului cu ajutorul unui anticorp policlonal antimascul de şoarece. Anticorpul a fost
obţinut prin injecţii repetate la femele, timp de 7 săptămâni, a unui triturat de celule splenice recoltate de la
masculi. Experimentele efectuate au demonstrat că anticorpii antimascul de şoarece sunt capabili să realizeze
o reacţie încrucişată antigen-anticorp cu membrana spermatozoizilor de taur. Prin testul de coloraţie eozină-
negroină care evidenţiază celulele moarte de cele vii ea a demonstrat că jumătate dintre spermatozoizii de taur
au fost omorâţi prin citotoxicitate de către anticorpii antimascul de şoarece.
b) Sexarea embrionilor prin metode imunologice
Pentru sexarea embrionilor se utilizează acelaşi anticorp care se foloseşte şi pentru sexarea
spermatozoizilor. Este vorba despre anticorpul HY care recunoaşte o anumită proteină (antigenul cu acelaşi
nume) de pe membrana blastomerelor. Precizăm că genomul embrionului incipient, ca de altfel şi cel al
gârneţilor maturi, este blocat. In acest stadiu nici o genă nu funcţionează. Proteinele care se sintetizează în
această perioadă se realizează doar pe seama ARN-ului mesager, ,,cu viaţă lungă", sintetizat într-o perioadă
anterioară şi înmagazinat în citoplasmă. Primele gene încep să funcţioneze (să-şi realizeze expresia),
sintetizând o proteină, doar când embrionul are 2 sau 4 blastomere, depinzând de specie. Gena HY din
complexul de histocompati-bilitate intră în funcţiune când embrionul are 8-6 celule, la rozătoare şi în stadiul
de morulă sau blastocist, la embrionul de bovine. Aceasta înseamnă că începând cu această vârstă embrionii
pot să fie sexaţi cu ajutorul anticorpului HY, deoarece ei pot întâlni în membrana blastomerelor antigenul
împotriva căruia au şi fost sintetizaţi.
Mai trebuie să mai precizăm încă un fenomen interesant. Gena HY este prezentă în genomul tuturor
mamiferelor şi are una şi aceiaşi structură. Aceasta înseamnă că anticorpul HY, mono sau policlonal, realizat
pe şoareci, poate recunoaşte proteina antigen, care se găseşte în membrana blastomerelor embrionilor tuturor
speciilor de mamifere.
Cercetările efectuate, până în prezent, au demonstrat că anticorpul policlonal sau monoclonal, produs prin
injectare repetată la femele, la interval de 7 zile, timp de 5 săptămâni, a celulelor splenice recoltate de la
masculii de şoarece aparţinătoare aceleaşi linii puternic consangvinizate (linie izoigienică), are acţiune
puternic citotoxică asupra embrionilor de sex masculin. Pentru imunizarea reciprocă între sexe este necesar să
se utilizeze şoareci foarte asemănători genetic, aşa cum sunt cei din liniile puternic consangvinizate (linii
izogenice), deoarece numai în acest fel cresc şansele să se obţină anticorpi, mai ales, împotriva proteinei HY
şi mai puţin împotriva altor proteine. Prin urmare atunci când se doreşte să se obţină viţei, purcei, miei, etc,
numai de un singur sex (animale unisex), embrionii obţinuţi trebuie să fie cultivaţi timp de 2-3 ore într-un
mediu de cultură în care s-au adăugat anticorpi HY împotriva sexului care nu se doreşte să se obţină. Aceştia
vor recunoaşte proteina HY din membrana blastomerelor, se vor lega de ea şi va ucide embrionii care o
conţin. Acei embrionii care fac parte din sexul dorit vor rămâne în cultură nevătămaţi şi în consecinţă vor
putea fi transferaţi în cornul uterin al unor mame surogat. Din experimente multiple a rezultat, însă, că
metoda are eficienţă, pentru obţinerea de animale unisex într-o proporţie foarte variabilă (10-100%).
 2.2.4.4. Îmbunătăţirea ratei ovulaţiei şi a gestaţie! prin imunomodulare
□ Efectul imunizării oilor împotriva androstendionei
S-a constatat că imunizarea oilor împotriva androstendionei (precursor al androgenilor) a determinat o
creştere a ratei ovulaţiei, şi implicit o sporire a numărului de miei născuţi vii. Deşi un astfel de tratament
sporeşte rata ovulaţiei, ea are ca urmare o scădere semnificativă a ratei gestaţiei la oile imunizate împotriva
andro-stendionului
Din experimente a reieşit că pentru o stimulare eficientă a fătărilor este necesar controlul foarte precis al
titrului anticorpilor la animale imunizate, întrucât s-a constatat că rata ovulaţiei descreşte proporţional cu
creşterea titrului anticorpului respectiv. S-a stabilit că titrele anticorpului cuprins în scara de 1:500-1:3000
determină o bună stimulare a ovulaţiei şi o rată crescută de fâtări. S-a sugerat că un titru ridicat de anticorpi în
timpul împerecherii poate cauza o creştere a fertilităţii.
Imunizarea împotriva androstendionei care duce la obţinerea unor titruri excesiv de ridicate ale
anticorpului induce lipsa ovulaţiei şi chiar a estrusului. Secreţia redusă de estrogeni, datorată unei cantităţi
inadecvate de androgen precursor, ca urmare a unei concentraţii ridicate de anticorpi circulanţi
antiandrostendionă, poate justifica existenţa anestrusului la unele oi imunizate.
□ Efectul imunizării femelelor împotriva estradiolului 17 β
La oile imunizate împotriva estradiolului-17β s-a observat o reducere a fertilităţii şi o descreştere a
numărului de embrioni recoltaţi de la oile superovulate. Au fost semnalate de asemenea şi unele efecte
negative asupra dezvoltării embrionilor preimplantaţionali care poate duce la „moarte embrionară" crescută.
Administrarea exogenă de progesteron după fecundaţie ar putea deveni o cale adecvată pentru obţinerea
unei descreşteri a nivelului mortalităţii embrionare la oile imunizate. Administrarea de progesteron exogen,
între zilele 5-15 la oile tratate cu Fecundin sau PMSG, nu a produs însă o creştere a ratei gestaţiei sau a
numărului mieilor nou născuţi. Experimente efectuate în Australia, au dus la concluzia că, atunci când
progesteronul este administrat în zilele 10-25 după împerechere, produce un efect benefic asupra
supravieţuirii embrionilor.
Administrarea de progesteron la oile imunizate şi neimunizate împotriva estradiolului 17β în ziua întâi
după montă, a redus fertilitatea la oile normale, dar nu a avut nici un efect !a cele imunizate. Se pare că
patternul (modelul) anormal al secreţiei de progesteron poate fi responsabilă de rata ridicată a mortalităţii
embrionare.
Concluzia la care se ajunge este că o concentraţie mare de progesteron, în preajma momentului ovulaţiei
sau la scut timp după ce ovulaţia a avut loc, poate avea efecte majore negative asupra supravieţuirii
embrionilor.
 2.2.4.5. Ameliorarea reacţiei ovarelor la tratamentul pentru inducerea superovulaţiei prin
imunomodulare
Supraovulaţia la vaci şi sincronizarea estrului donatoarelor cu primitoarele de embrioni constă în
administrarea de gonadotropine serice, bogate în FSH şi LH pentru a susţine creşterea şi maturizarea până la
ovulaţie a tuturor foliculilor preovulatorii, plecaţi în dezvoltare pe ovare într-un ciclu ovarian. Un astfel de
procedeu împiedică recrutarea foliculului dominant şi în consecinţă evită atrezia celorlalţi. Din experimentele
noastre a rezultat că numărul mediu de foliculi, ajunşi la ovulaţie, într-o superovulaţie este de 15. Numărul de
embrioni care pot fi recoltaţi este 11. Dintre aceştia numai 5-7 sunt morfologic, normal dezvoltaţi.
Noi am constatat, însă, o mare variaţie printre vacile donatoare de embrioni în privinţa ovulaţiei. Numai
aproximativ 25% dintre vacile tratate în vederea inducerii superovulaţiei au mai mult de 2 foliculi care s-au
deschis şi au ovulat. O proporţie de 33% dintre vacile tratate cu PMSG şi 25% dintre cele tratate cu FSH, nu
produc embrioni care să se preteze la congelare. Se pare că variaţia individuală, în realizarea superovulaţiei
este cauzată de puritatea preparatelor de gonadostimulatoare, de populaţia de foliculi ale donatoarelor , de
genetica diferită a vacilor donatoare precum şi faptul că încă nu cunoaştem corect reglarea fiziologică a
dezvoltării foliculilor şi a maturizării ovocitelor a fiecărui individ, pentru a acţiona în cunoştinţă de cauză.
Pentru stimularea sporirii ratei de ovulaţie la vacile şi oile tratate pentru inducerea superovulaţiei este
necesară înlăturarea efectelor inhibitorii ale foliculului dominant, care suprimă dezvoltarea altor foliculi din
mulţimea de foliculi aflaţi în dezvoltare. Creşterea tranzitorie a secreţiei de FSH, imediat după ce a avut loc
ovulaţia, stimulează recrutarea în 2 sau 3 valuri, a unei mulţimi formate din 7-8 foliculi care pornesc în
dezvoltare. Pe măsură ce foliculii cresc în dimensiune are loc şi o creştere a nivelului inhibinei şi a
estradiolului care inhibă activitatea FSH-ului. Ca urmare foliculii se opresc din dezvoltare. Datorită efectelor
paracrine (din jurul foliculului) unul (la monotocice) sau mai mulţi foliculi (la politocice) este protejat,
probabil, de creşterea IGF-1 (factorul de creştere asemănătoare insulinei) şi devine mai puţin reactiv la
diminuarea secreţiei FSH-ului. Datorită acestor proprietăţi el se transformă în folicul dominant care îşi va
continua dezvoltarea până la ovulaţie.
Se pare că relaţia strânsă între FSH, inhibina folicul ară şi estradiol este responsabilă de nivelul ratei
ovulatorii a foliculilor la vacile şi oile supuse tratamentului pentru inducerea superovulaţiei.
Reiese de aici că metodele care folosesc imunoneutralizarea efectelor hormonilor steroizi şi a inhibinei, ar
putea duce Ia sporirea ratei ovulaţiei la vaci şi Ia oi şi implicit la eficientizarea tehnologiei de embrio-transfer.
□ Efectul superovulaţiei la oile imunizate contra androstendionei (Fecundin)
Administrarea repetată a fecundinului, la 8 şi 4 săptămâni înaintea împerecherii duce la imunizarea
împotriva androstendionei. Oile imunizate în acest fel au fost supuse tratamentului pentru inducerea
superovulaţiei separat cu FSH şi PMSG. Rezultatele obţinute au demonstrat că imunizarea contra
androstendionei influenţează pozitiv proporţia de embrioni viabili recoltaţi de la oile donatoare de embrioni
superovulate.
 ■ Imunizarea femelelor împotriva estradiolului 17β (E2) influenţează realizarea superovulaţiei
Cel mai puternic steroid inhibitor al FSH-ului si LH-ului este estradiolul (E2). Cercetările apeciale au dus
la concluzia că imunizarea activa a oilor împotriva lui E2, blochează ovulaţia şi duce la formarea de chişti
foliculari. De asemenea imunizarea oilor împotriva estradiolului 17β (E2) duce şi la descreşterea intensităţii
reacţiei estrale la oile superovulate, la o rata scăzută a ovulaţiei, precum si la o descreştere a proporţiei de
embrioni recoltaţi „buni pentru transfer". Nu toţi cercetătorii sunt de acord cu aceste rezultate. Unii susţin
dimpotrivă că o combinaţie între imunizare împotriva lui E2 şi tratamentul pentru inducerea superovulaţiei nu
are efecte notabile asupra ratei ovulaţiei, dar are efecte benefice asupra ratei de fertilizare a ovocitelor.
Efectul imunizării împotriva lui E2 la vaci este mai puţin clar. La această specie imunizarea blochează rata
ovulaţiei în unele stadii şi nu are nici un efect în altele.
Experimentele efectuate pentru scoaterea lui din funcţiune prin imunizare au scos, însă, în evidenţă
proprietăţile hormonului E2 de a interveni, atât în exprimarea comportamentului estral, cât şi în controlul
feed-back a concentraţiilor serice de gonadotropine. Un experiment efectuat pe oi, a evidenţiat că imunizarea
împotriva unui complex "haptenă-carrier" format din E2-6-CMO : HAS, a afectat reacţia estrală şi producţia
de embrioni, la două doze diferite de PMSG injectat pentru inducerea superovulaţiei. Anticorpii creaţi prin
imunizare au avut un efect negativ major asupra proporţiei de oi la care s-a produs ovulaţia. Aceste rezultate
sugerează că titrul ridicate ale anticorpului anti E2 în sânge supresează rata ovulaţiei.
Experimentele au arătat însă că la un titru al anticorpului de numai (100-1000), adaosul parenteral de 1500
u.i. PMSG, are ca urmare o sporire puternica a ratei de ovulatie a foliculilor De Graff. Creşterile mai înalte
ale titrului de anticorpi denaturează însă acest efect. La un nivel al titrului de anticorpi de 10000-1000000,
rata ovulaţiei se reduce semnificativ, dar nu are efect şi asupra dezvoltării foliculilor de mari dimensiuni.
Existenţa pe ovar, la oile imunizate împotriva lui E2, a unui mare număr de foliculi De Graff inovulatorii
i-a determinat pe cercetători să încerce adaosul parenteral de GnRH pentru a induce intrarea acestora în
ovulatie. Rezultatele obţinute au dus la concluzia că la oile imunizate, administrarea de GnRH face să
crească proporţia foliculilor care ovulează. Concluzia este susţinută şi de faptul că GnRH administrat în
aceiaşi cantitate şi la oile din lotul martor neimunizat nu a determinat nici o sporire a ratei de ovulatie.
□ Efectul imunizării vacilor împotriva hormonilor androgeni asupra inducerii superovulaţiei
In literatura de specialitate sunt publicate date puţine despre efectele imunizării vacilor împotriva
steroizilor ovarieni. Unii cercetători susţin că vacile imunizate împotriva androstendiolului reacţionează mai
bine la tratamentul pentru inducerea superovulaţiei, decât cele neimunizate, iar rata de ovulatie creşte
semnificativ. Tot mai mulţi cercetători scot în evidenţă că la vaci este foarte probabil, ca androgenii ovarieni
să reacţioneze puternic asupra ovarelor făcând sa crească frecvenţa atreziei foliculare. Luând ca bază un astfel
de fenomen se poate presupune că imunizarea vacilor împotriva unuia sau a mai multor androgeni, ar putea
face posibila scăderea numărului de foliculi care ar intra in atrezie. Injectările repetate de lichid (fluid)
folicular (FF) au darul, la început, să facă să scadă concentraţia serică de FSH la oi şi la vaci. In faza
următoare însă reacţia este urmată de un efect rebound (de revenire la iniţial) care face ca FSH-ul să revină la
concentraţia sa iniţială. Cercetătorii sunt de părere că un astfel de efect este exact ceea ce trebuie, pentru a
obţine o super-ovulaţie de succes.
Un număr de 22 vaci alese în calitate de donatoare de embrioni au fost imunizate împotriva testosteronului
cu ajutorul complexului "haptenă-carrier" format din testosteron-3-CMO-albumină serică umană, cu 7 zile
înainte de începerea tratamentului pentru inducerea superovulaţiei. Separat au fost alese alte 20 de vaci care
nu au fost imunizate, servind ca lot de control. La jumătate din vacile donatoare de embrioni, li s-a
administrat prin injecţie lichid folicular (FF) timp de 3 zile. Ultima injecţie a fost administrata la 40 de ore
înaintea administrării PMSG-ului destinat să inducă super-ovulaţia. Toate vacile donatoare de embrioni au
fost tratate cu 2500 u.i. PMSG precum şi cu prostaglndina F2α: administrata două zile mai târziu conform
posologiei clasice de tratament pentru inducerea superovulaţiei. In timpul estrului toate vacile donatoare au
fost însămânţate de 2 ori la un interval de 12 ore.
Reacţia ovariana a fost estimată la 3-7 zile după estrus folosind laparatomia medio-ventrala.
Rezultatele obţinute au scos în evidenţă ca imunizarea antitesteron are efecte semnificative in creşterea
ratei de ovulaţie ca urmare a tratamentului cu PMSG. Experimentele au mai scos în evidenţă că lichidul
folicular administrat singular determină face doar să crească proporţia de foliculi anovulatorii. Concluzia este
întărită şi de faptul că un astfel de efect nu s-a manifestat şi la vacile imunizate împotriva androgenilor
(testosteronului).
□ Efectul imunizării femelelor de mamifer împotriva inhibinei
Inhibina este un hormon glicoproteic, secretat de celulele granuloasei foliculilor ovarieni. FSH-ul
stimulează secreţia de inhibina "in vivo" şi "in vitro", în timp ce inhibina are efect supresiv asupra FSH - ului
atât "in vitro" cât şi "in vivo".
Ciclul estral la bovine este caracterizat ca având 2 sau 3 perioade de creştere foliculară. In ciuda plecării în
dezvoltare a unui număr mare de foliculi (10-30), într-un ciclu ovarian, numai unul dintre ei va deveni
dominant şi va ajunge la ovulaţie. S-a emis ipoteza că jocul dintre concentraţia de FSH şi inhibina, constituie
mecanismul care reglează numărul de foliculi care ajung la ovulaţie. Menţinerea unei concentraţii mari de
FSH în sânge după a 10-a zi a ciclului estral, face să plece în dezvoltare şi să ajungă la ovulaţie mai mulţi
foliculi decât în mod natural. Scăderea concentraţiei de FSH datorită sporirii concentraţiei de inhibina duce
la stoparea dezvoltării foliculilor şi la atrezia lor. Rezultă de aici că scoaterea din funcţiune a inhibinei ar da
frâu liber FSH - ului şi LH - ului să-şi menţină concentraţia serică şi să determine maturizarea tuturor
foliculilor plecaţi în dezvoltare pe cele două ovare.
Una dintre cele mai bogate surse de inhibină este lichidul folicular. Primele experimente de imunizare a
femelelor împotriva inhibinei cu ajutorul fluidului folicular, în calitate de imunogen, au fost realizate la
ovine.
Henderson şi colab. au evidenţiat o creştere semnificativă a ratei ovulaţiei la oile imunizate cu lichid
folicular bovin comparativ cu oile martor, neimunizate. Numărul de miei fătaţi de oile imunizate a fost mai
mare decât la oile neimunizate.
 Unii autori au demonstrat, prin experiment, că reacţia ovariană crescută la oile imunizate împotriva
inhibinei din lichidul folicular bovin este numai tranzitorie. De aici ei au tras concluzia că pentru a obţine rate
ovulatorii ridicate şi în al doilea sezon de fătare, este necesară imunizarea din nou a oilor.
Imunizarea viţelelor cu ajutorul lichidului folicular ovin injectat intramuscular a avut ca urmare creşterea
ratei ovulaţiei şi la această specie. Şi în acest caz reacţia ovariană a fost de asemenea trecătoare. Este de
subliniat că provenienţa lichidului folicular (de la ovine, ecvine sau porcine) nu influenţează rezultatele
experimentelor.
în prezent se produce inhibină pură pe calea tehnologiei ADN - recombinant, utilizând pentru aceasta
gena izolată a inhibinei. Pe această cale s-au obţinut doi noi produşi de inhibină: (a)-fragmente de inhibină
sintetică şi (b)- inhibină recombinată care au fost utilizate în studii de imunizare a femelelor de mamifer.
Rezultatele au fost următoarele:
♦ La ovine
Imunizarea oilor cu peptide sintetice de inhibină recombinată care au inclus doar primii 30 de aminoacizi
de la inhibină de porcine, primii 25 de aminoacizi de la inhibină de ovine şi primii 29 sau 26 de aminoacizi ai
lanţului a a inhibinei bovine, a dus la concluzia că acest procedeu are ca urmare creşterea semnificativă a
ratei ovulaţiei, comparativ cu cele obţinute de la oile din lotul martor, neimunizat.
♦ La bovine
Sporirea ratei ovulaţiei, datorită imunizării femelelor contra inhibinei, s-a obţinut şi la viţele deşi s-a
folosit pentru aceasta în calitate de imunogen atât inhibină bovină (primii 26-29 de aminoacizi) cât şi inhibină
porcină (primii 30 de aminoacizi).
Scanlon şi colab. (1992) au adus date experimentale care demonstrează că imunizarea contra inhibinei la
vacile de carne se realizează numai după repetate injecţii cu astfel de peptide recombinate. Confirmarea
acestor rezultate a fost adusă de datele lui Glencross şi colab. (1990) care au obţinut o imunizare completă
numai după administrarea repetată a mai mult de 8 injecţii de peptide separate din molecula de inhibină. Şi în
acest caz creşterea ratei ovulatorii a fost doar trecătoare, având un maximum în ziua a 23-a după
administrarea antigenului. Reacţia are o fază de platou între zilele 23-46 şi o fază de declin EL reacţiei, după
ziua 69 care urmează ultimei administrări a antigenului.
Pentru creşterea antigenităţii peptidelor separate din molecula de inhibină, care au rol de haptenă, ele
trebuie să fie conjugate cu aşa numitele proteine de transport (carrier). Cu toate că s-au folosit diferite
proteine de transport cum ar fi ovalbumina, albumina serică umană, şi aglobulina umană, s-a înregistrat o
mare variaţie a ratei ovulatorii după imunizare.
 2.3. Manipularea imunologică a funcţiei de creştere şi dezvoltare
Biotehnologiile moderne care folosesc inginereşte molecule sau surogate ale acestora pentru a obţine
produse şi servicii competitive, au încercat să manipuleze şi principalele funcţii ale organismelor domestice.
Cunoaşterea mecanismelor şi a substanţelor care coordonează şi controlează principalele funcţii ale
organismului sugerează conduita de urmat în încercarea de manipulare sau dirijare a acestora. Adaosul
moleculelor potrivite, la timpul potrivit şi în doza corespunzătoare au darul să aducă funcţiile respective la un
nivel de eficienţă peste limitele atinse de zootehnia clasică.
Manipularea funcţiei de creştere şi dezvoltare a animalelor domestice ar duce la obţinerea de carcase mai
atrăgătoare pentru consumator, dar şi o sporire considerabilă a eficienţei economice a activităţilor
producătorului de carne.
□ Câteva principii de conducere şi reglare a procesului de creştere şi dezvoltare la animale
Creşterea şi dezvoltarea organismului animalelor domestice sau cum i se mai spune „dezvoltarea
ontogenetică" a individului, se desfăşoară continuu de la fecundaţie la senescenţă. Ea se realizează, în esenţă,
prin diferenţierea şi replicarea celulelor diferitelor ţesuturi numită hiperplazie precum şi prin sporirea în
dimensiune a celulelor numită hipertrofie.
Hiperplazia celulelor musculare striate şi ale celor adipoase are loc numai în stadiul embrionar şi fetal al
animalelor. La naştere indivizii tuturor speciilor de animale domestice posedă toate celulele musculare striate
pe care le va avea animalul în viaţa postnatală. Se pare că şi numărul de adipocite pe care le posedă animalul
se formează înainte de naştere. In decursul vieţii postnatale ele sunt doar mobilizate din ţesutul adipos şi
determinate să sintetizeze grăsimi (trigliceride) pe care le depozitează în citoplasmă.
Sporirea în dimensiune şi în greutate a organismului animalelor după naştere are loc, mai ales, prin
hipertrofia celulelor musculare şi hiperplazia şi hipertrofia oaselor. întregul proces de creştere are loc sub
coordonare hormonală. O seamă de hormoni produşi de hipofiză, tiroidă, suprarenale, pancreas, glande
sexuale, ficat şi ţesuturi, de la nivelul organelor iau parte la conducerea procesului de creştere şi dezvoltare.
Toţi sunt însă dependenţi în sinteza lor de hormonii speciali ai hipo-talamusului. El (hipotalamusul) este
organul înzestrat cu senzori care sesizează necesitatea nutrientelor pentru ţesuturi şi le dirijează spre cele care
sunt mai importante la un moment dat.
Mecanismele hormonale ale reglării procesului de creştere şi dezvoltare sunt ierarhizate şi supuse
comenzilor etajului imediat superior. în linii generale acestea pot fi schiţate ca şi în schema redată mai jos:
 2.3.1. Utilizarea hormonului de creştere în manipularea procesului de creştere şi dezvoltare
Din schemă se poate observa că procesul de creştere şi dezvoltare este condus de hipotalamus. El este
organul care sesizează necesităţile celulelor în nutriente şi sintetizează peptide-hormoni denumite generic
somatocrinine care au rolul de a comanda sinteza şi eliberarea în circuitul sangvin a hormonului de creştere
de către hipofiză denumit somatotrop hormon (STH) şi a altor hormoni tiroidieni, suprarenali, sexuali,
insulina etc. Din această cauză hormonii hipotalamici se mai numesc şi factori de eliberare (realising
factor)luând denumiri speciale pentru fiecare glandă căreia i se adresează FSHRh pentru STH, LHRli pentru
LH, TRH pentru hormonul tiroidian etc.
Principalul hormon care dirijează creşterea organismului este STH-ul sau somatotrop hormonul
(somatotropina) care este sintetizată de către celulele speciale ale hipofizei (glanda pituitară). El însă nu
acţionează direct asupra ţesutului muscular striat, osos sau adipos deoarece celulele acestora nu posedă
receptori de membrană pentru STH. In consecinţă activitatea stimulatoare a STH-ului asupra acestor ţesuturi
se exercită prin intermediul altor hormoni denumiţi somatomedine secretate de ficat şi alte ţesuturi.
 Principalele somatomedine care constituie "ajutoarele" STH-ului în stimularea creşterii ţesuturilor sunt:
factorul de creştere asemănător insulinei I şi II (IL-1 şi IL-2).
Somatomedinele pătrund în celule prin intermediul receptorilor de membrană şi declanşează, în primul
rând, sintezele de proteine de pe operoane care se implică apoi în sintezele de substanţe din celule care
contribuie la hipertrofia acestora şi implicit a ţesutului întreg.
Să observăm din schema anterioară că peptidele hipotalamice denumite generic somatocrinine stimulează,
atunci când este nevoie, eliberarea hormonilor hipofizari şi a celorlalte glande care participă la desfăşurarea
procesului de creştere (în schemă ele au semnul plus). Atunci când hipotalamusul sesizează, cu ajutorul
senzorilor săi, că nivelul sangvin al concentraţiei hormonilor este suficient, el sintetizează un hormon special
(o peptidă) denumit somatostatina care opreşte eliberarea hormonului de creştere (STH) din celulele
somatotrope ale hipofizei (în schemă somatostatina are semnul minus). Elementele care compun mecanismul
de reglare a creşterii organis-mului redat în schema de mai sus, sugerează pârghiile de care am putea
beneficia atunci când se pune problema manipulării acestei funcţii cardinale ale producţiei de carne.
Dacă se doreşte stimularea funcţiei până dincolo de limitele de reacţie a genotipului la factorii de mediu,
atunci trebuie să se recurgă la amplificarea artificială a genelor care participă la procesul de creştere a
principalelor ţesuturi (ţesutul muscular striat participă la producţia de carne cu peste 75% din masa vie la porc
şi 50% la bovine). Cu alte cuvinte dacă se doreşte o creştere mai intensă şi mai eficientă a ţesuturilor trebuie
să se intervină cu adaos exogen fie de somatocrinine (hipotalamice) care face să se sintetizeze şi să se
elibereze mai mult STH, fie cu hormon de creştere (STH) sau somatomedine (factori de creştere).
Hormonul de creştere sau STH-ul în prezent este utilizat în America, dar nu şi în Europa pentru sporirea
vitezei de creştere a porcilor şi viţeilor. O injecţie de 100 micrograme de STH retard la 100 kg greutate vie,
odată la 15 zile în perioada cuprinsă între 20-80 kg are ca urmare îmbunătăţirea semnificativă, atât a
performanţelor de creştere a porcilor, cât şi a compoziţiei carcasei.
□ Un experiment care dovedeşte că adaosul parenteral de STH influenţează puternic procesul de
creştere
Colaboratorii mei şi cu mine {Cornelia Vintilă, H. Vogel şi I. Vintilă) au organizat un experiment special
pentru a cuantifica în ce măsură adaosul parenteral de STH accelerează procesul de creştere. Pentru aceasta
noi am administrat la 11 purcei 100 micrograme de STH-retard/kg greutate vie, odată pe lună în perioada
când ei au traversat greutatea vie de la 28 kg la 75 kg. Performanţele obţinute la purceii din lotul
experimental au fost comparate cu cele obţinute, în acelaşi condiţii de întreţinere şi furajare, de alţi 11 purcei
fraţi buni cu ei şi care au constituit lotul martor.
Rezultatele obţinute le redăm în cele ce urmează.
 ■ Efectul hormonului de creştere (STH) exogen asupra sintezei zilnice de substanţe Sintezele de proteine,
lipide şi acumularea de substanţe minerale însoţite de multiplicarea celulară şi creşterea ţesuturilor care au loc
pe parcursul vieţii animalului, mai intense în unele etape ale dezvoltării decât în altele, se traduc în principal
în hipertrofia ţesuturilor. Cuantificarea globală a desfăşurării acestor procese diverse poate fi efectuată prin
estimarea sporului mediu zilnic de greutate pe care-1 înregistrează animalul. Diferenţa de masă vie a
animalului, constatată într-un interval cunoscut de timp, împărţită la numărul de zile care s-a realizat în 12
ore, constituie sporul mediu zilnic de masă vie.
Sporul mediu zilnic de masă vie la animalele care fac obiectul studiului nostru, pe perioade distincte de
câte 30 de zile, îl redăm în tabelul care urmează (tabelul 3).
Tabelul 3. Efectul STH adăugat parenteral la porci asupra sintezelor şi acumulării
studiului de substanţe, în 24 de ore (sporul mediu zilnic, în grame)
Sporul mediu zilnic
Primele 30-60 60-90 90-120 Pe
Lotul de animale 30 zile exp. zile de exp. zile de exp. zile de exp. întreaga
perioadă
Martor 257 433 393 567 413
Experimental 323 517 470 570 470
Faţă de martor + 126% + 119% + 119% +101% +114%

Din tabel se poate observa că animalele pe care am făcut studiul de faţă, sintetizează şi acumulează în
corp, în medie, în 24 de ore peste 400 grame substanţe (proteine, lipide, glicogen, săruri).
În cursul perioadei de dezvoltare, sintezele sunt însă diferite. Când tineretul în creştere parcurge etapa
cuprinsă între 30-40 Kg greutate vie, sintezele de substanţe se realizează mai lent şi mai ales în cantităţi mai
puţine decât după ce aceştia au trecut de această vârstă. în perioada respectivă, un porc în creştere, dintr-o
raţie de hrană care cuprinde 3000 calorii şi 15% PD, nu sintetizează în 24 de ore mai mult de 260 grame de
substanţe care se depun în organism. Pe măsură ce animalele înaintează în vârstă şi acumulează masă vie,
puterea de sinteză de substanţe a celulelor creşte la peste 430 g şi chiar 570 g în 24 de ore.
Dacă însă tineretului porcin aflat în procesul de creştere i se adaugă un plus de hormon de creştere (STH-
100 micrograme/kg greutate vie), care sensibilizează permanent celulele ţintă, puterea de sinteză ale acestora
creşte cu cca.26%, chiar din prima lună de la începutul tratamentului. Cantitatea de substanţe sintetizate
depăşeşte 320 grame la astfel de animale în primele 30 de zile de tratament şi 500 grame după această dată.
Analizând ceea ce se petrece pe întreaga perioadă, putem spune că la consumul unei raţii de furaje care
asigură 3000 kcal şi 15% PB în perioada care urmează după ce ei au atins greutatea vie de 30 Kg, porcii
sintetizează şi depun în medie, pe zi, o cantitate de 413 grame substanţe proteice, lipide, glicogen, grăsime şi
săruri. Dacă. însă, unor animale cu genotip asemănător cu cele cuprinse în lotul martor, aşa cum s-a realizat
în experimentul nostru, li se adaugă parenteral 100 micrograme STHP retard pe 1 kg greutate vie, o dată pe
lună, sintezele de substanţe se intensifică cu 14%. Aceste animale sintetizează şi depun în 24 de ore, în
medie, pe toată perioada de creştere, 470 g de substanţe, faţă de 413 g cât realizează animalele care nu au
beneficiat de un aport exogen crescut de STH.
■ Efectul STH-ului adăugat parenteral asupra dezvoltării lungimii corpului porcilor Lungimea corpului
porcilor a fost măsurată cu panglica, de la articulaţia occipi-
toatloidiană până la baza cozii.
Rezultatele obţinute le redăm în tabelul 4.

Tabelul 4. Influenţa administrării hormonului de creştere asupra lungimii corpului (cm)

Data la care s-au efectuat măsurătorile
14X 14XI 14XII 18I 18 II
Lotul
X±Sx CV X±Sx CV X±Sx CV X±Sx CV X±Sx CV
Martor n= 11 84,9 5,5 88,1 5,6 91,8 5,9 107, 3,5 122 7,0
±1,5 ±1,4 ±1,6 ±3,5 ±1,3
Experimental n= 11 77,0 10,0 83,0 ± 6,3 90,8 8,0 107, 7,8 126 8,2
±2,7 1,6 ±1,6 ±2,6 ±1,8
-7,9 -5,1 -1,0 -0,4 -4,0
Diferenţe lot exp. faţă de lot martor

Datele înscrise în tabelul 4 evidenţiază valoarea lungimii medii a corpului porcilor cuprinşi în cele două
loturi de animale luate în studiu.
Dacă în tabelul de mai sus urmărim lungimea corpului pe care au realizat-o animalele din lotul martor,
constatăm că, în mod normal acesta creşte cu o rată din ce în ce mai mare de la 24 până la 95 Kg.
Dacă urmărim dimensiunile lungimii corpului porcilor, cuprinşi în lotul experimental, vis-a-vis de cele la
care au ajuns animalele din lotul martor (tabelul 4), constatăm că lungimea corpului la animalele care au
beneficiat de un surplus de STH exogen, creşte mult mai intens decât la animale care nu au beneficiat de
acest tratament. Deşi la începutul experimentului, porcii care au primit STH aveau lungimea corpului cu
aproape 8 cm mai mică decât cei din lotul martor, pe parcursul procesului de creştere, diferenţa dintre ele se
micşorează până spre sfârşitul experimentului. Mai mult decât atât, după 90 zile de creştere, sub influenţa
STH porcii din lotul experimental cresc cu aşa de mare intensitate, încât devin mai lungi cu 4 cm faţă de cei
din lotul martor.
Pe întreaga perioadă cât a durat experimentul nostru (120 de zile), porcii trataţi cu STH cresc în lungime
în fiecare zi cu 0,100 cm mai mult decât porcii care se dezvoltă în mod natural, fără surplus de STH (0,309
cm la lotul martor faţă de 0,408 la lotul experimental). Aceasta înseamnă că hormonul de creştere
supraadăugat peste cel existent în mod natural, în organismul porcilor, determină o alungire a corpului
acestora cu 32% mai mult decât cei care nu au beneficiat de un astfel de tratament
 (pe parcurusul dezvoltării, superioritatea vitezei de creştere la porcii trataţi faţă de cei netratţi este cuprinsă
între 66-100%).
Se pare că STH are eficienţă mai mare asupra creşterii în lungime a porcilor mai puţin dezvoltaţi decât a
celor încadraţi în categoria „plusvariante". Nu poate fi altfel interpretată scăderea pe parcursul creşterii a
valorii coeficientului de variaţie (CV) la porcii din lotul experimental.
■ Efectul hormonului de creştere exogen asupra dezvoltării perimetrului toracic
Perimetrul toracic al animalelor dă informaţii, prin dimensiunea Iui, despre formatul corporal al
animalului şi, mai ales, asupra dezvoltării masei musculare şi osoase, cât şi a aparatului respirator.
Dimensiunile perimetrului toracic al animalelor cuprinse în cele două loturi pe care le-am folosit în
experimentul de faţă, le redăm în tabelul 5.

Tabelul 5. Evoluţia perimetrului toracic în dezvoltarea porcilor trataţi sau netratţi

cu STH (cm)
Data la care s-au efectuat măsurătorile
14X 14XI 14XII 18I 18 II
Lotul
X±Sx CV X±Sx CV X±Sx CV X±Sx CV X±Sx CV
Martor n= 11 71,4 10,3 75,6 7,3 87,6 7,7 94,4 107 8,0
±1,8 ±1,6 ±2,0 ±2,3 ±2,0
Experimental n= 11 68,0 10,3 71,9 10,2 84,5 8,5 93 7,5 109 8,9
±2,3 ±2,2 ±2,1 ±2,1 ±1,5

Diferenţe lot exp. -3,4 -3,7 -3,1 -1,4 -2,0

faţă de lot martor

Datele cuprinse în tabelul 5 sugerează că perimetrul toracic al animalelor netratate cu STH creşte de la
greutatea de 29 kg până la greutatea de 95 kg cu o rată inconstantă şi diferită de cel al animalelor care au
beneficiat de un plus de STH.
■ Concluzii
Din experimentul nostru, în care am testat influenţa adaosului de STH asupra creşterii şi dezvoltării
porcilor, se pot desprinde următoarele concluzii:
1. Adaosul parenteral de STH, în doză de 100ug/kg greutate vie, influenţează puternic viteza de creştere a
porcilor. Sporul mediu zilnic pe toată perioada de administrare a STH (de la 24 kg la 95 kg) a fost mai mare
cu 14% la porcii trataţi cu STH faţă de cei netrataţi.
2. Acumularea superioară de masă vie la porcii trataţi cu STH faţă de cei netrataţi cu hormon se manifestă
cu putere şi în lungimea trunchiului. Sporul de creştere a corpului în lungime (în medie pe 24 ore) Ia porcii
trataţi cu STH pe întreaga perioadă a fost mai mare cu 32% decât la cei care se dezvoltă în condiţiile unui
status endocrin normal.
3. Adaosul de STH la porcii aflaţi în plină perioadă de creştere (24-100 kg) are efecte benefice şi asupra
perimetrului toracic, sporindu-i dimensiunea cu 11%.
 4. Superioritatea dezvoltării corpului porcilor în lungime şi dimensiunea circumferinţei toracelui pe toţ
parcursul creşterii demonstrează că STH exogen are efecte puternice şi în creşterea oaselor (a vertebrelor,
coastelor şi sternului) şi a dezvoltării masei musculare, care compun aceste regiuni ale corpului.
□ Scoaterea din funcţiune a somatostatinei în manipularea procesului de creştere a animalelor
tinere
Rezultatele obţinute de noi dar şi de alţi cercetători sunt încurajatoare pentru crescători pentru că acest
procedeu aduce fermei un plus de rentabilitate. Din cauză însă că manipularea creşterii organismului se
realizează cu adaos exogen de hormon (STH retard), deşi este o substanţă naturală produsă pe calea
tehnologiei ADN-recom-binat, opinia publică europeană nu priveşte cu îngăduinţă astfel de intervenţii şi în
consecinţă le refuză.
Pentru a exclude intervenţia cu hormoni în dirijarea procesului de creştere a organismului pentru care
oamenii au o adevărată "fobie", cercetătorii şi-au îndreptat atenţia asupra elementelor care compun
mecanismele de reglare a acestei funcţii.
In figura 31 se poate observa că eliberarea hormonului de creştere (STH) din hipofiză are loc atâta timp
cât hormonul somatostatina are o concentraţie redusă în sângele circulant. Creşterea nivelului acestui peptide
hipotalamice determină sporirea eliberării STH din celulele somatotrope ale hipofizei. Aceasta înseamnă că,
în cazul în care printr-un procedeu oarecare am putea să scoatem din funcţiune somatostatina, sinteza şi
eliberarea STH-ului din hipofiză s-ar desfăşura fără întrerupere. Ca urmare procesele de creştere a ţesuturilor
s-ar intensifica peste limitele de reacţie a genotipului.
Din cursul anterior a reieşit că în prezent imunologia dispune de mijloace, cu ajutorul cărora să producă
peptide care să fie în stare să recunoască şi să blocheze somatostatina, lăsând, în acest fel, loc liber STH-ului
să se sintetizeze şi mai ales să se elibereze în sânge în mod continuu.
Deoarece somatostatina este o peptidă formată din 14 aminoacizi este de presupus că poate fi folosită la
imunizări pentru a declanşa sinteza de anticorpi împotriva ei. Structura ei este următoarea:
Ala-Gli-.Cis-Li-Asm-Fe-Fe-Tri-Liz-Tr-Fr-Tre-Ser-Cis
Prin urmare este de presupus că prin imunizare activă (vaccinare) sau pasivă, cu ajutorul anticorpilor
monoclonali se poate realiza un titru de anticorpi antisomato-statină suficient de crescut care ar scoate-o din
funcţiune pe o lungă perioadă de timp.
SPENCER G.S.G. (1983-1986),. GALBRAITH şi colab. (1985) prin injecţii repetate de somatostatina au
reuşit să imunizeze activ miei în creştere, cu rezultate pozitive şi semnificative în intensificarea procesului de
creştere, faţă de lotul martor. Prin analize adecvate ei au dovedit că urmare a creşterii titrului de anticorpi
anti-somatostatină concentraţia sangvină a factorului de creştere asemănător insulinei (IGF) a crescut
semnificativ. Aceasta constituie o dovadă indubitabilă, că somatostatina a fost scoasă din funcţiune.
Administrarea pasivă de anticorpi antisomatostatina la şobolani de către CHIHARA şi colab (1978) a dus
la creşterea semnificativă a hormonului de creştere în circulaţia sangvină.
 MACCEICHIN1 (1986) au obţinut anticorpi monoclonali antisomatostatina care administraţi animalelor
în creştere s-au dovedit a fi promotori ai creşterii organismului, asemănător în eficientă cu administrarea de
hormon de creştere (STH).
□ Probleme de imunogenitate
în experimentele de imunizare a animalelor cu peptidele hipotalamice LHRh şi somatostatină, în scopul
formării de anticorpi, nu s-au obţinut întotdeauna rezultate satisfăcătoare. Cauzele nereuşitei constau în
dimensiunea prea mică a acestor două molecule de peptide. Şi într-un caz şi în celălalt se bănuieşte că din
cauza dimensiunii mici al acestora, organismul supus vaccinării le primeşte ca pe un self şi în consecinţă nu
toţi indivizii sintetizează şi anticorpi specifici în concentraţie suficientă. Ele sunt haptene
Din această cauză imunologii au recurs la sporirea dimensiunii acestora prin legarea lor covalentă de o altă
moleculă sau prin folosirea unor molecule în calitate de cărăuşi (carrier) aşa cum sunt alfaglobulina umană
sau triglobulina.
Cercetările amănunţite au dovedit că chiar şi numai amestecul acestor două substanţe, nelegate de altă
moleculă - cărăuş, pot face să se sintetizeze anticorpi specifici care recunosc, fie epitopi specifici din
lungimea lanţului peptidic, fie întreagă moleculă.
Cercetătorii din domeniu sunt de părere că producerea anticorpilor monoclonali împotriva LHRh sau a
somatostatinei este calea cea mai sigură şi mai eficientă în manipularea funcţiei de reproducere şi a celei de
creştere şi dezvoltare.

2.4. Manipularea proporţiei de carne şi grăsime în carcasa porcilor

Civilizaţia actuală a modificat substanţial stilul de viaţă al oamenilor, cu consecinţe în schimbarea
compoziţiei raţiei alimentare. Tot mai mulţi oameni doresc să consume alimente, în 24 de ore, care să conţină
tot atâta energie, cât se consumă prin activitatea musculară în aceeaşi unitate de timp. Prin urmare carnea de
porc şi cea de vită trebuie să conţină o cantitate de grăsime mult mai mică decât cea tradiţională. Numai în
acest fel scade cantitatea de energie din came. Selecţia animalelor în acest sens a dus la obţinerea unor
progrese semnificative. A sosit timpul utilizării şi a altor metode, cu ajutorul cărora se poate scădea cantitatea
de grăsime din carcasele animalelor. Să precizăm doar câteva dintre ele.

2.4.1. Adaosul parenteral de STH influenţează compoziţia şi calitatea carcasei porcilor

Orice produs ca să poată fi vandabil trebuie să aibă calităţi mai bune faţă de alte produse similare. Carnea
de porc poate rezista competiţiei cu carnea de pasăre sau de vită, numai dacă ea va avea un conţinut scăzut de
grăsimi şi se va putea produce la costuri care să aducă rentabilitate producătorului.
 Carnea de porc este ameninţată să-şi piardă competitivitatea pe piaţă din cauza conţinutului prea mare de
ţesut adipos (grăsime). Grăsimea animală foarte bogată în acizi graşi saturaţi este considerată de cardiologi
un factor de risc pentru contractarea bolilor cardiovasculare. Faţă de această situaţie producătorii de carne de
porc sunt nevoiţi să găsească mijloace ştiinţifice pentru obţinerea de carcase cu mai multă carne şi mai puţină
grăsime.
In ţările cu zootehnie avansată se încearcă, în prezent, rezolvarea acestei probleme pe lângă selecţie şi
hibridare şi pe calea „amplificării" genelor (adaos parenteral de produse ale genelor) care sintetizează
hormoni şi enzime, implicate în metabolismul material, prin modelarea imunologică a dezvoltării ţesuturilor,
prin nutriţie şi transgeneză. In experimentul efectuat de colaboratorii mei şi cu mine {Cornelia Vintilă, H.
Vogel, I. Vintilă) şi pe care l-am descris în secţiunea anterioară, noi am cuantificat şi efectul pe care îl are
adaosul a 100 micrograme STH-retard /kg greutate vie administrat purceilor odată pe lună, asupra proporţiei
de carne de calitate şi grăsime care se realizează în organismul porcilor până la 100 kg. Rezultatele obţinute
le redăm în cele ce urmează.
□ Efectul hormonului de creştere adăugat parenteral asupra compoziţiei carcasei porcilor la 100 kg
greutate vie
Când purceii care au fost luaţi în experiment au atins greutatea de 95-100 kg, au fost sacrificaţi (n=8
pentru lotul experimental şi n=8 pentru lotul martor), iar carcasele după răcire au fost măsurate şi disecate în
porţiuni anatomice „de măcelărie". Datele obţinute le redăm în tabelul 7.
Tabelul 7. Greutatea porţiunilor anatomice de măcelărie la cele două loturi luate în
studiu.
Denumire UM LotM LotE Diferenţă LE faţă de LM
kg %
Greutatea carcasei (rece) Kg 76 78,5 12,5 13,3
Randament la sacrificare % 69,7 74,7 - 7,2
Muşchiuleţ Kg 0,45 0,78 +0,33 +73,3
Cotlet Kg 3,4 5,1 + 1,7 +50,0
Ceafă Kg 5,8 7,2 + 1,4 +24,8
Antricot Kg 5,3 6,3 + 1,0 +18,9
Spată Kg 5,9 7,0 + 1,1 + 18,6
Jambon Kg 11,4 14,2 +2,8 +24,6
Rasoale Kg 2,66 2,8 +0,14 + 15,2
Piept Kg 15,3 16,3 + 1,0 18,9
Fleică Kg 2,2 2,3 +0,1 +4,5
Cap Kg 6,2 5,3 +0,9 -14,5
Picioare Kg 1,6 1,6 0,0 0,0
Grăsime + osânză kg 25,8 19,6 -6,2 -24,0
LE = lotul experimental: LM = lotul martor
 Din tabelul de mai sus se poate constata că toate porţiunile anatomice ale carcaselor provenite de la porcii
care au alcătuit lotul experimental (LE) sunt mult mai grele decât cele provenite de la porcii încadraţi în Iotul
martor (LM). Să observăm că acele porţiuni anatomice care conţin mai mulţi muşchi (cotlet, jambon, ceafa),
sunt mult mai grele la porcii care au primit STH parenteral, faţă de cei care sau dezvoltat natural.
Din tabelul 7 reiese că muşchiuleţii sunt mai grei la lotul experimental cu 73%, iar cotletul cu 53%, faţă de
greutatea lor la lotul martor. Jambonul şi ceafa recoltate de la porcii cuprinşi în lotul tratat cu STH întrec cu
25% greutatea acestora la porcii netrataţi cu STH, iar spata, antricotul şi pieptul cu 18%. Randamentul la
tăriere a porcilor cuprinşi în lotul experimental este, de asemenea, cu 7% mai mare decât la cei din lotul
martor. Faptul acesta susţine concret afirmaţiile noastre, făcute în subcapitolul anterior, potrivit cărora, un
plus de STH are ca urmare o dezvoltare mai intensă a masei musculare şi o scăderea acumulărilor de grăsime.
Pentru a scoate în evidenţă cu mai multă pregnanţă că adaosul de STH la porcii în creştere face să crească
cantitatea de carne din carcasă în dauna grăsimii, am cântărit cantitatea totală de carne şi grăsime din carcasă
şi am grupat părţile din carcasă după calitatea cărnii, obţinând ceea ce se numeşte „carne specialităţi" şi
"carne calitate superioară". în felul acesta am putut să o calculăm în procente, cât din carnea totală din
carcasă reprezintă carnea de „calitate superioară" şi „carne specialităţi" şi care este raportul carne / grăsime
existent în carcasă. Rezultatele sunt redate în tabelul 8.

Tabelul 8. Procente de carne, grăsime şi specialităţi în carcasă

Specificare UM Lot martor Lot Diferenţa lot experim.
experim. faţă de lot martor
Kg %
Total carne % carne Kg 50,55 58,88 +8,6 16,5
carcasă % grăsime % 66,07 75,00 +8,9
carcasă % 33,93 25,00 -8,9
Carne specialităţi % Kg 3,85 5,88 12,03 152,3
carne specialităţi din total % 7,66 8,89 12,2
carcasă
Carne calitate superioară Kg 20,37 34,70 -14,33 +70,3
% carne calitate superi- % 40,56 58,9 +18,3
oară din tot.carne
Raport carne/grăsime 1,94/1 3/1

În tabelul 8 sunt puse faţă în faţă rezultatele obţinute la cele două loturi de animale. De aici rezultă că,
carcasele porcilor care s-au dezvoltat „sub presiunea" unui adaos parenteral de STH, conţin cu 8,33 kg mai
multă carne în carcasă decât cele care provin de la porcii crescuţi fără adaos de STH. Reiese de aici că \a
aceeaşi greutate vie, porcii trataţi cu STH au cu 17% mai multă carne în carcasă decât cei netrataţi. Din
tabelul 8 se mai poate constata următorul fapt: carcasele obţinute de la porcii din lotul experimental conţin o
cantitate de grăsime net inferioară celor din lotul martor. Ea reprezintă 26,4% din greutatea carcasei la porcii
care au crescut sub influenţa unui conţinut sporit de STH, faţă de 34% cât reprezintă aceasta la porcii cărora
nu li s-a administrat hormonul de creştere.
Cantitatea de carne din carcasă, încadrată în categoria „carne specialităţi" (formată din cotlet şi
muşchiuleţi) la porcii din lotul experimental reprezintă 5,9% din total carne, faţă de doar 3,9% la lotul martor.
Rezultă de aici că la porcii care au primit STH pe cale parenterală odată pe lună, cotletul şi muşchiuleţul
se dezvoltă, până la sacrificare, cu 52 % mai intens decât la porcii care se dezvoltă numai sub imperiul
structurii lor genetice.
Aceiaşi situaţie se întâlneşte şi în cazul sortimentului „carne de calitate superioară". Ponderea acestui
sortiment de carne din carcasă atinge valori de 59% la porcii trataţi cu STH şi numai 41% la cei netrataţi.
Diferenţa de carne „superioară", în plus cu 18% la porcii din lotul experimental faţă de cei din lotul martor, se
datorează, cu siguranţă aportului exogen de hormon de creştere de care au beneficiat aceste animale.
Dacă observăm în tabel ce valoare a avut raportul carne/grăsime în carcasele porcilor analizaţi, vom
constata diferenţe nete între loturi. Raportul carne/grăsime, la porcii care au constituit lotul experimental, este
compus din trei părţi carne la o parte grăsime. Dimpotrivă Ia porcii din lotul martor, cantitatea totală de carne
din carcasă reprezintă numai 1,9părţi carne la o parte grăsime. Din cele specificate mai înainte, rezultă că
administrarea la porcii în creştere de peste 25 kg, odată pe lună a unei cantităţi de 100 micrograme STH la un
kg greutate vie, are ca urmare o exacerbare a funcţiei de sinteză şi depozitare a proteinelor în muşchi şi o
frânare a sintezei şi depunerilor de grăsime în ţesutul adipos. Acesta are ca urmare hipertrofierea fibrelor
musculare, care se repercutează în sporirea masei musculare, în dauna grăsimilor din constituţia carcasei.
Toate acestea stau, în mod indiscutabil, şi la baza sporirii randamentului de tăiere a porcilor trataţi cu STH,
faţă de cei care sau dezvoltat în mod normal (lotul martor).
■ Calitatea carcaselor la porci şi taurine poate fi manipulată şi cu ajutorul steroizilor anabolizanţi
Utilizarea steroizilor anabolizanţi care a fost permisă iniţial şi în Europa, dar respinsă de către
Comunitatea Europeană este însă practicată în continuare în Statele Unite.
Hormonii, după structura sau natura lor se împart în hormoni proteici şi hormoni steroizi. Din punct de
vedere al activităţi lor în raport cu alţi, ei se împart în două: hormoni agonistici, care acţionează în acelaşi
sens cu altul şi hormoni antagonistici, care acţionează împotriva unui alt hormon. Urmare a acestui fapt a dus
la dezvoltarea a două strategii alternative, ambele având drept ţel scăderea grăsimii din carcasa animalelor.
Una constă în folosirea hormonilor ca atare, pentru activitatea lor singulară şi alta constă din folosirea
hormonilor pentru activitatea lor agonistică.
Prima dintre ele se bazează pe utilizarea parenterală a compuşilor agonistici (3 - adrenergici aşa cum este
noradrenalina care a condus la creşterea masei musculare şi la scăderea conţinutului de grăsime din carcasă.
Dezavantajul metodei constă în ceea că β - adrenergicii, fiind structuri steroide cu efect anabolizant, pot
traversa bariera intestinală intrând în circulaţia omului care consumă carne bogată în noradrena-lină,
influenţându-i negativ metabolismul.
Mai promiţătoare s-a dovedit a fi însă cea de-a doua metodă care utilizează forme recombinate ale
hormonului de creştere (STH), atât la bovine, cât şi la porcine.
 ■ Hormonul de creştere (STH) nu este periculos pentru sănătatea consumatorului
Utilizarea în trecut a hormonilor steroizi anabolizanţi, mai ales a testosteronului şi analogii săi în
manipularea creşterii şi dezvoltării tăuraşilor, a avut efecte negative asupra metabolismului oamenilor,
fetusului sau a copiilor care au consumat carnea acestora. De aici a rezultat interdicţia oficială a folosirii
acestor hormoni în producerea cărnii şi naşterea unei adevărate „fobii" la auzul cuvântului hormon. Fiziologia
digestiei şi absorbţiei din intestin în sânge a nutrientelor ne învaţă, însă, că proteinele nu pot fi absorbite în
sânge la nivelul intestinului subţire, decât după ce acestea au fost scindate în aminoacizii care le compun.
Numai în această stare ei pot fi absorbiţi în sânge.
Cum hormonul de creştere este de natură proteică, el nu poate traversa bariera intestinală a omului decât
după descompunerea lui în aminoacizi. Aminoacizii ajunşi în sânge nu mai pot reconstitui hormonul de
creştere din care s-au desprins. Interesant este că hormonul de creştere porcin sau bovin nu este activ la om
chiar şi atunci când el se administrează pe cale parenterală. Hormonul de creştere (GH) nu numai că
îmbunătăţeşte compoziţia carcasei, dar el determină şi o creştere a producţiei de lapte, a vacilor dovedindu-se
de un real interes în industria producerii laptelui.
Dimpotrivă hormonii sexuali (androgeni şi estrogeni) şi ai glandei cortico-suprarenalei, fiind însă de
natură sterolică pot trece ca atare bariera intestinală a omului şi pătrund în sânge. Din această cauză
metabolismul consumatorului de carne sau produse animale bogate în hormoni steroizi poate fi influenţat
negativ, cu consecinţele nefaste pentru dezvoltare şi sănătate.
Aşadar biotehnologul şi zootehnicianul trebuie să facă distincţie între hormonii steroizi şi hormonii de
natură proteică. Primii sunt nocivi pentru consumator, iar cei din urmă sunt benefici pentru fermieri şi
inofensivi pentru consumatori.

2.4.2. Imunomodularea în ameliorarea calităţii carcaselor

Organismul este rezultatul creşterii şi dezvoltării ţesutului muscular, a celui osos, şi adipos, a pielii şi a
organelor interne parenchimatoase.
Cantitatea totală de grăsime găsită, la un moment dat, în corpul unui animal, este constituită din grăsimea
depozitată în celulele ţesutului adipos, precum şi din cea care se găseşte ca atare, sub formă de precursori, în
circulaţia sanguină. Depunerea de grăsimi în corpul animalelor nu se face pasiv, prin "decantare", ci ele se
depozitează numai după ce au fost „construite" ca rezultat al unor procese active care au loc în celulele
specializate, denumite adipocite. In interiorul lor nu pătrund grăsimile ca atare ci doar procesării lor aşa cum
sunt glucoza, acizi graşi şi glicerol, pe care echipamentul enzimatic al celulei le transformă, prin legare, în
grăsimi.
 Celulele grase sau adipocitele neîncărcate cu grăsimi încă din viaţa fetală, au formă ovoidă, de câteva zeci
de microni, cu nucleu central şi citoplasmă hialină. Ele se organizează, împreună cu o ţesătură de fibre de
colagen, într-un ţesut special, cunoscut sub denumirea de ţesut adipos. El, de regulă, este situat între fibrele
musculare în jurul vaselor sangvine, a organelor interne şi sub piele.
Un animal prin hrană introduce în organismul său noi cantităţi de energie (glucide, grăsimi) şi substanţe
plastice (proteine), necesare desfăşurării normale a proceselor de: termoreglare, de locomoţie, de înmulţire
celulară, a funcţionării cordului, aparatului respirator, digestiv, de reproducere şi excreţie. Toate împreună
sunt mari consumatoare de energie. In cea mai mare parte energia necesară desfăşurării acestora este preluată
din desfacerea moleculelor de grăsimi şi glucide, în componen-tele lor de bază.
Prin urmare un organism care funcţionează normal trebuie să-şi asigure permanent şi cu intermitenţă un
flux exogen de energie prin hrană şi un depozit în care îşi stochează surplusul de energie ajuns în circulaţia
sangvină. Stocul de energie trebuie să fie asigurat pentru a se putea realiza un echilibru între consumul de
energie de la nivelul celulelor şi organelor, pe de o parte, şi aportul exogen al acesteia, pe de altă parte.
Depozitul de energie este necesar şi pentru a compensa necesarul de energie de la începutul lactaţiei când se
înregistrează un bilanţ energetic negativ sau după o perioadă de stress. La toate animalele, inclusiv la om,
energia este stocată sub formă de grăsime în celule specializate denumite adipocite.
□ Reglarea diferenţierii adipocitelor
Adipocitele provin, prin diferenţiere, din celulele multipotente mezodermice. Diferenţierea este condusă
de către hormonul tiroidian şi hormonul de creştere (GH (growfh hormon) sau STH) care joacă rol de
inductori ai operoanelor insulinei, tiroxinei şi a factorului de creştere asemănător insulinei, a factorului de
transformare celulară, a hormonilor sexuali şi a catecolaminelor suprarenaliene.
Ţesutul adipos din jurul rinichiului şi de sub piele se găseşte deja format în a doua treime a vieţii fetale.
După naştere el se dezvoltă, prin hipertrofia adipocitelor care se încarcă cu grăsime precum şi prin achiziţia
de noi preadipocite. Se estimează că în corpul viţelului după naştere, numărul adipocitelor trece de 10
miliarde. Numărul lor sporeşte la 124 de miliarde la vârsta adultă. S-a estimat că datorită umplerii
adipocitelor cu grăsime volumul acestora se măreşte de cea. 30 de ori. Intre momentul naşterii şi vârsta
adultă, numărul adipocitelor achiziţionate sporeşte, la bovine, de 6 ori.

2.4.2.1. Procentul de grăsime din carcasă poate fi redus şi prin imunomodulare

□ Vaccinarea" pasivă împotriva adipocitelor

Adipocitele fiind celule specializate posedă în membrana lor antigeni specifici. Izolarea lor ar putea
deveni o cale de obţinere a imunogenilor care să eliciteze sinteza de anticorpi împotriva lor. Pe această bază
DJ Flint a izolat membrane adipocitare şi le-a folosit în calitate de antigeni pentru a obţine anticorpi
monoclonali împotriva celulelor adipoase. Imunizarea purceilor imediat după naştere cu ajutorul anticorpilor
monoclonali obţinuţi pe această cale a dus la scăderea semnificativă a depozitului de grăsime subcutanată,
mai ales în jurul locului unde acesta a fost administrat.
 Rezultă de aici că anticorpii monoclonali anti-adipocite, recunosc doar celulele preadipocite şi adipocitele
adulte şi le ucid. Procesul acesta poate fi asemănat cu cel care se înfăptuieşte în vaccinarea pasivă cu
anticorpi a animalelor.
Rezultatele obţinute de către Flint sugerează că este posibil să se obţină carcase cu un conţinut mai mic de
grăsime pe calea imunomodulării ţesutului adipos.
□ Tehnici de imunomodulare
In literatura de specialitate sunt citate mai multe tehnici de imunomodulare cu ajutorul anticorpilor produşi
împotriva hormonilor. Acestea sunt:
1) Imunoneutralizarea unde anticorpii sunt folosiţi în calitate de simple mijloace de legătură între ligant
şi receptorii de antigen care împiedică funcţiile biologice ale hormonilor.
2)Imunointensificarea în care se consideră că anticorpi legaţi de hormonul de creştere duc la formarea de
complexe care intensifică puternic activitatea anticorpului pentru adipocite.
3)Imunosimuiarea se bazează pe utilizarea unor anticorpi care funcţionează asemănător hormonilor.
În ceea ce urmează le vom descrie, pe rând.

2.4.2.1.1. Imunoneutralizarea
Se cunoaşte că somatotrop hormonul (STH) sau hormonul de creştere (GH growth hormon) se sintetizează
în glanda hipofiză, dar el nu se eliberează decât numai la comanda factorului de eliberare hipofizar secretat în
hipotalamus denumit GnRH. Sinteza şi secreţia hormonului de creştere în hipofiză este supusă controlului
unui alt hormon hipotalamic denumit somatostatina. Ea este structura organică care are sarcina să oprească
sinteza şi eliberarea STH- ului din hipofiză, atunci când hipotalamusul sesizează o concentraţie crescută de
STH în sânge. în aceste condiţii blocarea activităţii somatostatinei prin imunoneutralizare, ca un comutator, ar
lăsa "cale liberă" sintezei şi eliberării STH - ului fără oprire. Urmarea va fi menţinerea permanentă în sânge
a unei concentraţii crescute de STH, care la rândul ei va influenţa, prin intermediul somatomedinelor
(factorul asemănător insulinei), hipertrofia fibrelor musculare striate, dirijarea cu predilecţie a substanţelor
energetice spre masa musculară şi sporirea proceselor catalitice (de desfacere) ale grăsimilor din constituţia
adipocitelor.
Experimentele făcute pe porci, oi, şoareci şi şobolani au demonstrat că imunizarea animalelor împotriva
somatostatinei are ca urmare o sporire semnificativă a ritmului de creştere şi o îmbunătăţire a calităţii
carcaselor, prin sporirea masei musculare în dauna ţesutului adipos.

2.4.2.1.2. Imunointensificarea
Anticorpii sunt în stare să identifice şi să lege structuri ţintă şi să-i neutralizeze. S-a constat însă că
anticorpii monoclonali, conjugaţi cu hormoni are ca urmare intensificarea activităţii hormonilor. Legarea
anticorpilor monoclonali la hormonul de creştere şi administrarea lor la organismul viu sau în culturi de
celule are ca urmare o inhibiţie a activităţii hormonului "in vitro", dar şi o sporire a activităţii acestora, atunci
când sunt utilizaţi "in vivo". Se pare că stimularea activităţii hormonului de creştere atunci când este legat de
anticorpul monoclonal corespunzător se datorează măririi concentraţiei în sânge a factorului de creştere
asemănător insulinei (IGF) care este ligandul specific al hormonului de creştere pe celulele musculare şi
osoase şi a hipertrofiei musculare. S-a constatat că STH - ui legat de anticorpii săi monoclonali devine de 10
ori mai activ decât atunci când el este administrat singular la animalele în creştere.
Se pare că o astfel de stimulare provine din capacitatea anticorpilor de a se complexa cu STH - ui
endogen. într-adevăr insulina injectată intravenos la oaie a indus o scădere semnificativă a glucozei din sânge.
Hormonul de creştere administrat parenteral, în acest caz, a avut efect antagonist asupra efectului insulinei,
frânând într-o oarecare măsură, reducerea glucozei din sânge. Este interesant de subliniat că atunci când
hormonul de creştere a fost complexat cu anticorpul său monoclonal şi injectat animalelor, efectul lui a fost
atât de eficient, încât a anulat complect tendinţa de scădere a glucozei datorită injecţiei parenterale de
insulina.
Mult mai practic este procedeul care utilizează identificarea epitopilor din cadrul moleculei de STH pe
care se leagă anticorpii monoclonali atunci când se realizează complexarea hormonului cu anticorpul său.
Identificarea şi apoi sintetizarea peptidei care cuprinde numai aminoacizii epitopului poate duce la obţinerea
unui anticorp monoclonal care se limitează numai la această regiune. Atunci când se va încerca legarea
hormonului la anticorpul său se va realiza, de fapt, un complex format numai din anticorpul anti-epitop şi
molecula STH- ului. S-au obţinut deja anticorpi monoclonali împotriva unor peptide epitop derivaţi dintr-un
sector al moleculei de hormon de creştere. Injectat la animal acesta produce un antiser cu specificitate redusă
care va reacţiona numai cu epitopul moleculei de STH, împotriva căruia a fost sintetizat.
Administrarea acestui complex (hormon+anticorp monoclonal) la vaci a avut ca urmare, creşterea
concentraţiei factorului asemănător insulinei (IGF) cu mult peste nivelul provocat de injecţia hormonului de
creştere administrat în mod singular. Urmarea acestui efect de stimulare a activităţii hormonului de creştere a
fost sporirea producţiei de lapte a vacilor datorită menţinerii în platou a sintezei laptelui, în perioada în care
în mod normal aceasta diminua. Se poate trage concluzia de aici, că hormonul de creştere complexat cu
anticorpul său monoclonal sau corespunzător altor epitopi ai acestuia îşi intensifică activitatea catabolică de
"desfacere" de substanţe noi.

2.4.2.1.3. Imunosimularea sau producerea de anticorpi similari hormonilor naturali

Prin imunizarea animalului cu anticorpi monoclonali se obţin anticorpi anti-anticorpi mai numiţi şi anti-
idiotip. Structura lor este similară anticorpilor monoclonali care le-a provocat sinteza.
Anticorpii produşi împotriva hormonilor, pot fi utilizaţi ei înşişi în calitate de imunogeni, determinând
obţinerea de anti-anticorpi anti-hormoni. Ei se mai numesc şi anticorpi anti-idiotipici care au structura unei
adevărate imagini în oglindă a hormonilor originali. Pentru a înţelege mai uşor acest proces vezi şi capitolul
2.2.3.
 Producţia anticorpilor care imită structura şi funcţiile hormonilor este de mare interes în numeroase
cercetări, deoarece ei joacă, probabil un anumit rol în bolile autoimune.
Anticorpii anti-idiotipici au fost deja produşi pe scară largă pentru acetilcolină, insulina, compuşi β -
adrenergici, TSH şi GH (growth horomon). Aceşti anticorpi pot să acţioneze, fie în calitate de hormoni
antagonişti, fie că sunt capabili să inducă un răspuns biologic similar cu al hormonilor. Anticorpii anti -
idiotipici pentru compuşi (3 - adrenergici şi hormonul de creştere (growth horomon - GH) sunt de mare
interes atât în cercetare, cât şi în zootehnie. Ambele tipuri de hormoni sunt acum produşi cu succes şi în
cantitate mare. în studiile în care au fost implicată producţia de anticorpi anti - idiotipici policlonali la
hormonul de creştere (GH) de şobolan, s-a scos în evidenţă că aceştia pot imita activitatea hormonului de
creştere (GH), inhibând legarea GH la receptori. Anticorpii anti-idiotipici împotriva hormonului de creştere
(GH) administraţi la oaie şi la şobolan au scos în evidenţă că ei sunt lipsiţi de capacitatea de inhibare a
legării prolactinei şi a insulinei. Administrarea acestor anticorpi la şobolanii hipofizectomizaţi a determinat
sporirea greutăţii corpului într-un mod analog cu administrarea la animal a hormonului GH pur.
Studiile aprofundate ale lui Thomas şi colab. (1987) au demonstrat că anumiţi comutatori au putut inhiba
legarea hormonului de creştere (GH) uman numai la anumiţi receptori de GH, dar nu la toţi. Anticorpii anti
GH au putut inhiba legarea GH în ficat, numai în cazul şoariceilor cu multă came în carcasă, dar nu şi în
cazul celor obezi (foarte graşi).
Anumite cercetări indică existenţa de receptori distincţi pentru GH, care recunosc epitopi singulari ai
moleculei de GH. Proprietăţile acestui fel de receptori se pot schimba în funcţie de starea fiziologică a
animalului. Studiile lui Elbashir şi colab (1990) au arătat că anticorpii monoclonali anti-idiotipici la GH
umani au manifestat efecte diferite, dependente însă de receptorii specifici pentru GH la care ei s-au legat.
Fenomenul sugerează că diferiţii epitopi ai GH pot să fie implicaţi în legarea diferitelor populaţii de receptori.
Anticorpii anti-idiotipici care sunt similari epitopilor moleculei de GH, sunt mai eficienţi decât hormonul
de creştere (GH) însuşi. Ei pot stimula, fie creşterea şi dezvoltarea masei vi, fie doar producţia de lapte, fie
că produc efecte diabetogene.
■ Anticorpii anti-idiotipici au şi alte avantaje practice.
Un anticorp idiotipic la un hormon poate fi utilizat în imunizarea animalelor, în sensul de a induce
producţia endogenă a hormonului cu o structură asemănătoare imaginii în oglindă a acestuia. Un asemenea
procedeu constituie un proces de amplificare genică specială. Ei au avantajul că în cantităţi mici au efecte
mari iar „timpul de viaţă" a anticorpului sporeşte la câteva săptămâni, comparativ cu timpul de existenţă a
GH - ului narural care durează aprox. 20 min. Prin utilizarea anticorpilor anti-idiotipici la un hormon pentru
obţinerea unui anumit efect nu mai este necesară injectarea frecventă aşa cum acesta se realizează atunci când
se injectează hormonul de origine.
 2.4.2.1.4. Anticorpii citotoxici
Anticorpii obţinuţi de către D.J.Flint de la oaie orientaţi împotriva mebranei plasmatice a adipocitelor de
şobolani, au indus liza adipocitelor de şobolani "in vitro". Ei au avut efecte şi "in vivo", atunci când ei au fost
injectaţi la şoboblanii tineri. După injectarea şobolanilor, timp de 4 zile, cu acest fel de anticorpi, distrugerea
(liza) adipocitelor a fost vizibilă, ea fiind însoţită de infiltrarea ţesutului adipos de către limfocite.
După 7 zile depozitul major de grăsime din corpul şobolanilor, (depozitul parametrial), s-a redus cu 50 %
din greutatea lui. Cercetările microscopice au arătat că reducerea masei depozitului de grăsime s-a realizat ca
urmare a reducerii la jumătate prin moarte a numărului de celule adipoase. La animalele care nu au fost
tratate secvenţial cu extract de membrane de celule adipoase, după opt săptămâni , greutatea acestui depozit a
fost redusă doar cu 25%. Este interesant de subliniat că adipocitele pierdute prin moarte nu au fost înlocuite
cu altele noi. Interesant este şi faptul că adipocitele care nu au fost lizate de anticorpi, au fost totuşi afectate în
integritatea lor funcţională. Ele au devenit mai puţin capabile să sintetizeze şi să stocheze trigliceride,
comparativ cu adipocitele de la şobolanii din lotul de control. La animalele vaccinate cu anticorpi anti-
andipocite grăsimea totală diseminată pe tot corpul s-a redus cu 30%. Este interesant de observat că reducere
grăsimii a fost compensată prin înlocuirea ţesutului gras cu proteine.
Efectele tratamentului cu anticorpi antimembrane adipocitare au fost chiar mai evidente în cercetările de
lungă durată (6 luni). Animalele tratate în acest fel, au sporit în greutate cu 40% faţă de cele aparţinătoare
grupului de control. Planul de masă vie la animalele din lotul experimental s-a realizat pe seama unui consum
cu 20%> mai mult furaj decât animalele aparţinătoare lotului de control. Se poate trage concluzia că sporul de
masă vie Ia animalele tratate cu anticorp anti-adipocite este un rezultat al creşterii eficienţei conversiei
furajelor în carne, cu aproximativ 15%. Paralel cu creşterea greutăţii corpului, după şapte săptămâni de la
prima injecţie, autorii acestui experiment au observat o reducere a cantităţii de grăsime în toate depozitele
majore existente în corpul şobolanului.
În tabelul următor redăm datele experimentale obţinute de D.J.Flint atunci când a administrat anticorpii
anti-membrane adipocitari la şobolani.

Tabelul 9
Caracterul Controlul Tratate
Greutate (g) 247,0±7,0 269,0±17
Lungime (cm) 18,9±0,3 19,8±0,3
Proteine (g) 50,8±2,2 56,5±2,3
Grăsime (g) 41,5±1,8 34,1±5,1
Depozitul de grăsime parametrial (g) 7,1 ±0,6 3,3±0,8
Depozitul de grăsime subcutanat (g) 4,3±8,1 2,9±0,5
 Reducerea depozitelor de grăsime, ca urmare a injecţiilor subcutanate cu anticorpi antiadipocite, la scroafe
şi oi, au fost raportate de mai multe echipe de cercetători. Astfel administrarea intraperitoneală de anticorpi
anti-adipocite la scroafe tinere, a determinat reducerea stratului de grăsime de pe spinare cu 30% iar conţi-
nutul de grăsime al jambonului la porci şi ajigoului la oi cu 25%). Este interesant de subliniat că reducerea în
greutate a grăsimii totale din corpul animalelor tratate cu anticorpi antigrăsime (anti-adipocite) a fost
compensată, în decurs de 14 săptămâni de sporirea masei de carne macră, în carcasă.
Redăm în tabelul de mai jos rezultate experimentale obţinute de cercetători atunci când anticorpii
monoclonali antimembrane adipocitare au fost injectaţi la porci.
Tabelul 10
Grosimea stratului de grăsime de pe Control Tratate
spinare (mm) 12,9±0,7 9,0±0,7
Greutatea pulpei Grăsime (Kg) 1,01±0,10 0,76±0,11
din faţă (Kg) Carne macră (Kg) 2,00±0,07 2,23±0,14

2.4.3.2. Hormonul de creştere (STH) adăugat parenteral influenţează puternic şi producţia de lapte
a vacilor
Curba de lactaţie a vacilor urmează un traseu general comun pentru toate vacile. Ea are forma celei redate
în figura 29. Din figură reiese că imediat după fătare se declanşează sinteza şi excreţia laptelui la un anumit
nivel cantitativ. Producţia de lapte creşte, apoi, cu o rată din ce în ce mai mare pe parcursul primelor două
luni de lactaţie. Ea rămâne în platou până în luna 3-a când începe să scadă constant, până în preajma fătării
(dacă vaca nu este înţărcată şi introdusă deliberat în repaus mamar).
 Cauza unui astfel de fenomen este modul de distribuire a nutrientelor la diferitele feluri de ţesuturi ale
organismului. Repartiţia lor, la toate speciile de mamifere, se realizează în funcţie de importanţa acestora,
pentru economia organismului la un moment dat. „Responsabil" pentru distribuirea nutrientelor sosite în
organism, după digestia furajelor şi absorbţia lor în intestin, este hormonul de creştere (GH) sau STH-ul. El
este „dispecerul" care, prin creşterea concentraţiei sale în sânge, distribuie cu preponderenţă nutrientele, la
muşchi, în perioada de creştere intensă, la fetus, în perioada de gestaţie avansată, sau la glanda mamară, în
perioada de lactaţie. Cu toţii am observat, desigur, că orice femelă de mamifer (vacă, scroafă, oaie sau căţea)
se îngraşă progresiv după ce a rămas gestantă. Ea slăbeşte, de asemenea progresiv, după naştere şi în perioada
de lactaţie maximă. Vom înţelege acum că hormonul de creştere (STH) este acela care, în perioada care
urmează după ce femela a rămas gestantă, repartizează o mare proporţie dintre nutrientele sosite în organism
din intestin, la celulele ţesutului gras (adipos) pentru a fi depozitate sub formă de grăsime. Fireşte că în acest
caz la glanda mamară vor ajunge din ce în ce mai puţine nutriente şi în consecinţă producţia de lapte va
scădea, cu o cantitate corespunzătoare cu energia conţinută în cantitatea de nutriente care nu ajung aici.
Cercetările speciale au scos în evidenţă că faza descendentă a curbei de lactaţie este declanşată şi apoi
susţinută de scăderea, în aceiaşi măsură, a concentraţiei STH-ului din serul sangvin. De aici a rezultat ideia că
o suplinire parenterală (prin injecţie) a concentraţiei STH-ului sangvin care începe să scadă în această
perioadă cu o cantitate de STH-exogen, ar face ca procesul de sinteză a laptelui în celulele mamare să rămână
la aceiaşi intensitate, încă mult timp şi după cea de-a treia lună de lactaţie.
In prezent în America cea. 60% din vacile care produc mult lapte, după 90 de zile de la fătare primesc,
prin injecţie, odată pe lună câte 500 mg STH retard (care se metabolizează greu). Măsurătorile speciale au
arătat că în felul acesta curba de lactaţie rămâne încă câteva luni în platou, şi după 90 de zile de la data fătării.
Consecinţa este obţinerea unui plus de producţie de lapte mai mare cu 10-30%, în funcţie de individ şi de
raţia de furaje.
In figura 30 redăm un grafic care ilustrează producţia de lapte pe care au realizat-o două loturi de vaci
tratate (rbGH) şi netratate (martor) cu hormon de creştere recombinat (rbGH). Să se observe că cele două
loturi de vaci în primele două luni după fătare au produs zilnic aceiaşi cantitate de lapte. După două luni de la
fătare când producţia de lapte începe să scadă, în mod firesc, lotului de vaci (notat în figură cu rbGH) i s-a
administrat 500 mg hormon de creştere (GH) odată la 15 zile. Celălalt lot de vaci notat în figură cu „martor"
nu a primit hormon de creştere. Să se observe că producţia de lapte a vacilor care au primit prin injecţie
hormon de creştere a crescut cu 10-20% faţă de cele care nu au fost injectate cu hormon de creştere şi s-a
menţinut la acelaşi nivel şi în următoarele 14 zile de la administrarea hormonului.
 Analizele speciale au demonstrat că sporul de producţie de lapte ca urmare a administrării parenterale a
500 mg STH retard / 14 zile, se datorează unui consum voluntar superior de furaje, cu cea 1,5 kg subtanţă
uscată pe zi. Redăm rezultatul acestor analize în Fig.31 de unde se poate observa că cele două loturi de vaci
în perioada celor 14 zile care au urmat injecţiei hormonului de creştere au consumat, în 24 ore, mai mult furaj
decât vacile cuprinse în lotul martor.

Analizele de lapte au scos în evidenţă că sporul de sinteză de lapte total datorită suplimentării
concentraţiei de hormon de creştere (STH) în sânge se datorează mai ales unei sinteze sporite de grăsime şi
de proteină (Fig.32) care se petrece în celulele glandei mamare.
 Experimentele efectuate de noi (/. Vintilă, Măria Nicula) efectuate pe un lot de vaci în lactaţie, cărora li s-
a administrat intramuscular 500 mg STH retard, odată pe lună, după cea de-a 90 zi de lactaţie, au scos în
evidenţă următoarele:
Efectul adaosului de STH se declanşează după 7 zile de la începerea tratamentului şi se traduce cu o
sporire a producţiei de lapte cu 12%.
Analizele laptelui au scos în evidenţă că paralel cu creşterea producţiei cantitative de lapte, sporesc şi
sintezele de grăsime şi de proteine din lapte. Aceasta are ca urmare sporirea cantităţii de lapte standard (3,5%
grăsime şi 3,0% proteină) în medie pe individ cu 2,8 Kg.

2.4.3.3. Manipularea funcţiei ugerului prin imunomodulare

Deşi, în USA, cea 60% din fermierii producători de lapte utilizează hormonul de creştere (STH) produs
prin tehnologie ADN-recombinat sub forma preparatului „POSILAC", în Uniunea Europeană s-a constituit un
moratoriu care interzice folosirea lui pentru stimularea producţiei de lapte a vacilor. Din această cauză
cercetătorii au căutat altă cale care nu foloseşte injecţiile de STH. Aceasta constă în scoaterea din funcţiune a
somatostatinei, un hormon hipotalamic care constituie principala frână care se opune eliberării STH-ului din
hipofiză.
Am discutat deja că imunizarea porcilor, oilor şi a rozătoarelor de laborator, împotriva somatostatinei are
ca urmare stimularea procesului de creştere şi reducerea cantităţii de grăsime din carcasă. Cercetările speciale
au demonstrat că scoaterea din funcţiune a somatostatinei, prin imunizare sau prin folosirea anticorpilor
monoclonali antisomatostatină, are efect nu numai asupra sintezei laptelui în totalitatea sa, ci şi asupra
compoziţiei sale. Rata de modificare este similară cu ceea ce se constată după adaosul, prin injecţie, a
hormonului de creştere exogen. Deoarece rezultatele obţinute sunt încă controversate, cercetările continuă şi
pe alte căi.
Efectul anticorpilor anti-idiotip asupra sintezei laptelui
a. Anticorpii anti-idiotip se obţin prin imunizarea, repetată, a animalului cu un anticorp. El fiind imunogen
elicitează (provoacă) sinteza de anticorpi împotriva lui. Se obţine astfel un anticorp - anti-anticorp mai numit
şi anticorp anti-idiotip. Structura sa moleculară este imaginea în oglindă a structurii antigenului care a
provocat sinteza lui (vezi şi cap.2.2.3.). Dacă antigenul folosit este somatostatina sau hormonul de creştere
(STH), atunci anticorpul care se sintetizează, ca urmare a injecţiei sale repetate la un animal, va avea structura
epitopilor acestor antigeni. Dacă anticorpii anti-STH sau anti-somatostatină sunt injectaţi repetat la un
animal, ei vor provoca sinteza unor anticorpi împortiva acestor anticorpi (anticorpi antiidiotip) care vor avea
structura (în oglindă) a STH-ului sau a somatostatinei şi care vor „mima" funcţia hormonilor originali. Când
astfel de anticorpi anti-idiotip au fost injectaţi la oaie sau la capră în lactaţie, ei au influenţat pozitiv procesul
de creştere a tineretului, dar mult mai puţin producţia de lapte a acestora. Cercetările în această direcţie
continuă pentru a găsi epitopii singulari sau constituiţi în complexe cu cei care leagă hormonul la receptorii
celulei.
b. Scoaterea din funcţiune a insulinei prin imunizarea animalelor în lactaţie, a scos în evidenţă că acest
hormon, care menţine constant nivelul glicemiei, are şi un efect puternic în sinteza grăsimii în glanda mamară
(lipogeneza) şi în ţesutul adipos. Ca urmare reducerea activităţii insulinei prin imunomodulare, ar avea ca
rezultat o sporire importantă a fluxului de nutriente spre celulele secretorii ale glandei mamare, în dauna
ţesutului adipos şi în consecinţă va avea ca urmare o stimulare a sintezelor şi secreţiei de grăsime şi lactoză în
lapte.
c. Chiar şi reducerea adipocitelor (celulele grase) din ţesutul gras al organismului, prin imunizarea
animalului împotriva membrelor acestora, ar putea contribui la sporirea sintezei de grăsime în lapte (vezi şi
cap.2.4.3.1.4.).
Imunomodularea producţiei de lapte prin scoaterea din funcţiune a unor elemente frenatoare ale
procesului de sinteză a STH-ului ar putea să devină, în viitor, o metodă de producţie, deoarece ea nefiind una
care să ducă la îmbogăţirea organismului cu hormoni exogeni, ci mai degrabă, instrumente care au darul să
producă sinteza influx continuu a hormonului de creştere, sunt acceptate de către consumator.
d. Şi animalele transgenice cu genom îmbogăţit cu gene răspunzătoare de sinteza hormonului de creştere
sau sărăcit de unele gene normale şi înlocuit cu variantele nefuncţionale (knock-out) ale acestora, ar putea fi
acceptată de consumatorul european.
e. Animale transgenice cu gene knock-out codificatoare de enzime lipogenice, care ar reduce sinteza
grăsimilor, sau cu gene normale, care ar produce o supraproducţie de proteine, aşa cum poate fi făcută gena
α-lactoalbuminei, ar putea constitui o alternativă la suplimentarea organismului cu hormoni exogeni pe calea
injecţiei.
 □ Anticorpii amplifică acţiunea hormonului de creştere în sinteza laptelui
În capitolul 2.4.3.1.4 noi am descris, succint, faptul că unii anticorpi mono-clonali conjugaţi la un hormon
are darul să intensifice activitatea hormonului respectiv. Acum revenim şi precizăm că precompiexarea
hormonului de creştere (STH) cu un anticorp monoclonal realizat împotriva peptidului (epitopului) care este
format din aminoacizii 134-154, existent în structura STH-ului şi injectat, apoi, la oile în Iactaţie, a provocat
sporirea producţiei de lapte a acestora, cu o cantitate mult mai mare, decât atunci când STH-ul a fost injectat
singular. Aceasta înseamnă că anticorpul, care s-a ataşat structurii hormonului la acest situs, a avut ca urmare
stimularea puternică a activităţii STH-ului. Mecansimul unui astfel de efect nu este încă înţeles deşi există
mai multe ipoteze (vezi şi cap. 2.4.3.1.2).
□ Imunoneutralizarea hormonului de creştere ne ajută să înţelegem şi mecanismul de secreţie a
laptelui
Scoaterea din funcţiune a hormonului de creştere prin imunizarea animalelor, şi a şobolanilor deficienţi de
prolactină, a scos în evidenţă mecanismul prin care STH-ul injectat vacilor în lactaţie stimulează producţia de
lapte a acestora. Se pare că STH-ul are efecte stimulatoare a producţiei de lapte prin asociere cu efectele pe
care le are prolactină. El este în stare să adaoge şi să menţină, pe mai departe Ia nivel înalt, fluxul de glucoza
şi aminoacizi în interiorul celulelor glandei mamare, provocat şi menţinut până la un anumit nivel de către
prolactină. Efectul său pare să se exercite în mod direct asupra celulelor epiteliale ale acinilor mamari,
independent de activitatea somatomedinelor, reprezentate de factorii de creştere asemănători insulinei IGF I
şi IGF II