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Métodos ópticos Se denomina refractometría al

método de calcular el índice de


Los métodos ópticos de análisis refracción (una propiedad física
químico se definen como aquellos fundamental de cualquier sustancia)
que miden la radiación de una muestra para conocer su
electromagnética que emana o composición o pureza.
interactúa con la materia. Estos
métodos, tienen como objeto, la Cambio en la velocidad y dirección de
medida de la radiación que es propagación debido a que pasa de un
emitida, absorbida, o transmitida al medio a otro
interactuar el campo eléctrico o
magnético de la radiación con los Involucra la determinación de:
campos eléctricos o magnéticos de la
materia; o bien la medida de la · El Índice de refracción de una
radiación que es reflejada, refractada, sustancia (n)
difractada, polarizada o dispersada
cuando interactúa con la materia. · El porcentaje de Sólidos Solubles

Los métodos ópticos se dividen en Principio de refracción


espectroscópicos y no
espectroscópicos. Basado en un rayo de luz que pasa
oblicuamente desde un medio hacia
Los métodos espectroscópicos, otro de diferente densidad, cambia su
miden la radiación absorbida y dirección cuando traspasa la
emitida por átomos, moléculas o superficie. Este cambio en la
iones y se conocen como métodos dirección se denomina refracción.
espectroscópicos de absorción o
emisión según sea el caso. Estos Cuando el segundo medio es más
métodos se caracterizan porque denso que el primero el rayo se
existe intercambio de energía entre la aproxima a la perpendicular trazada
radiación electromagnética y la sobre la superficie divisoria en el
materia, además se producen punto de incidencia. La causa
transiciones entre distintos niveles fundamental de este cambio en la
energéticos dirección se debe al cambio en la
velocidad de la luz que se hace más
Los métodos no espectroscópicos lenta cuanto más denso sea el medio
miden cambios en la dirección de la por el que pasa el haz.
propagación de la luz, se caracterizan
porque no tiene lugar intercambio de El ángulo formado entre el rayo en el
energía como consecuencia de la primer medio y la perpendicular se
interacción materia-radiación llama ángulo de incidencia, i,
electromagnética, son cambios en la mientras que el correspondiente
dirección o en las propiedades físicas ángulo en el segundo medio se
de la radiación electromagnética. denomina ángulo de refracción, r.

Refractometría Índice de refracción


Se define como el cociente entre el
seno del ángulo de incidencia (sen i)
y el seno del ángulo de refracción REFRACCIÓN DE LENTES
(sen r) de la luz monocromática, al
pasar de un medio menos denso Antiguamente se sabía que la luz
generalmente aire a un medio más solar, al pasar por cristales
denso. transparentes o joyas, como el
brillante, producía luces de colores.
El índice de refracción depende Fue Newton quien demostró que la
fuertemente de la composición de la luz blanca, al pasar por un prisma, se
muestra, de la temperatura y de la descompone en diferentes colores y
longitud de onda de la luz utilizada. que la función de éste es separar la
luz, refractándola en diferentes
Aplicaciones de la Refractometría: colores.

1. Cualitativamente: A este fenómeno de esparcimiento


angular de todos los colores se le
Para describir (Identificar y llama dispersión de la luz, y a los
Caracterizar) una especie química colores producidos espectro.
por ejemplo aceites y grasas
Cuando los medios en donde se
En la identificación de compuestos produce la refracción tienen sus
puros, correlacionado con los puntos superficies curvas se llaman lentes,
de ebullición y fusión las cuales son utilizadas para la
construcción de diferentes aparatos
2. Cuantitativamente: ópticos, tales como microscopios,
telescopios, cámaras fotográficas o
Identifica productos proyectores de cine; o bien los
simples pero importantes lentes para
Determina purezas de muestras corregir los defectos de la vista de los
seres humanos.
Evaluación de calidad en grasas y
aceites Las lentes se clasifican en cóncavas
o divergentes y convexas o
Determinación de sólidos solubles en convergentes.
frutas y productos de frutas como
mermeladas, néctares, pulpas, etc. Las lupas son las lentes
convergentes más conocidas, cuando
Mide concentraciones de azúcar los rayos de luz se refractan, inciden
presentes en el producto a analizar. en un punto llamado foco principal,
dentro de las lentes convergentes
Determinación de sólidos totales en existen algunos elementos
productos de tomates, jugos cítricos, importantes para la formación de
proteínas, huevos, leche, y productos imágenes, y son el eje principal, el
lácteos, cerveza, vinagre, alcohol. centro óptico y los ejes secundarios;
cuando los rayos se refractan, se
interceptan en un punto; dando origen
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a la imagen que puede ser real o ángulo para el cual el ángulo de
virtual. refracción es de 90°, y tras el cual la
reflexión total es obtenida.
La imagen real es aquélla que puede
ser proyectada en una pantalla, y la
virtual es la que se forma del mismo
lado del objeto. Un ejemplo de
imagen real es la que se obtiene al
proyectarse una película en pantalla, Refractómetro portátil
y el de una virtual es la que se
observa con una lupa. El prisma queda sumergido en la
muestra y sobre la cara del prisma se
En las lentes divergentes existen los refleja la luz blanca procedente de un
mismos elementos que en las espejo. Posee un solo prisma Amici el
convergentes, y el tipo de imagen que cual es un compensador que permite
se forma es virtual, siempre de menor el uso de radiación de una fuente de
tamaño, lo mismo sucede con el foco, tungsteno, ya que compensa la luz
que es virtual. dispersada en luz blanca en función
de la línea D del sodio. (Figura 4) las
Refractómetro características del Refractómetro de
Inmersión son:
Instrumento que se utiliza en el
laboratorio para medir el índice de 1.1. Es el más sencillo de los
refracción de distintas sustancias Refractómetros de ángulo crítico
líquidas
1.2 Rango de n = 1.32 a 1.54
Tipos de refractómetros:
1.3. Apreciación de 0.0002 unidades
a) Los que se basan en la medición
del ángulo crítico 1.4. Dificultad para mantener
constante la temperatura
b) Los basados en la determinación
del desplazamiento de una imagen 1.5. Usado extensamente en análisis
cuantitativo de soluciones acuosas
Refractómetro de Ángulo Crítico:
Son los instrumentos más usados Refractómetro de ABBE

El ángulo crítico se forma, cuando el Es el más cómodo y más usado, la


ángulo del rayo incidente se muestra queda contenida como una
encuentra a un nivel tal que el ángulo capa delgada de 0.01mm entre dos
de refracción llega a ser de 90°, es prismas. El prisma superior puede
decir la radiación no pasa del medio 1 rotar ya que presenta un punto de
al medio 2, pero viaja a lo largo de la apoyo, el inferior forma bisagra con el
superficie de la división perpendicular superior para permitir su limpieza e
a la normal, en forma rasante a la introducción de la muestra (Figura 5)
superficie. En otras palabras es el

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2.1. Versátil, práctico Cada sustancia ópticamente activa
tiene su propia rotación específica,
2.2. Más generalizado determinada por la siguiente ecuación

2.3. Requiere muestras pequeñas [α](t,λ) =α(t,λ) / cI

2.4. Rango de n de 1.3 a 1.7 Dónde:


[α] =Rotación específica a una
2.5. Precisión 0.001, °Brix 0.5 determinada longitud de onda,
unidades
α =rotación óptica, c = concentración,
2.6. Más usado en alimentos I = paso óptico a través de la
muestra, t = temperatura, λ = longitud
2.7. Sistema comparador formado por de onda
2 prismas Amici
La luz polarizada se obtiene cuando
Polarimetría se logra que la radiación vibre en un
solo plano con respecto al haz de la
Es un método de análisis químico que trayectoria (Figura 1). La vibración se
nos permite medir el cambio que da en un solo plano en el espacio. La
sufre el plano de luz polarizada luz polarizada se obtiene por reflexión
cuando atraviesa un medio y por refracción.
transparente formado por sustancias
ópticamente activas ¿Qué es un La luz polarizada linealmente se
compuesto ópticamente activo? Un obtiene a partir de la luz natural,
compuesto es considerado cuando con los dispositivos ópticos
ópticamente activo si la luz adecuados (por ejemplo prismas de
linealmente polarizada sufre una Nicol, filtros de polarización) se
rotación cuando pasa a través de una eliminan todos aquellos componentes
muestra de dicho compuesto. cuyas vibraciones no se producen en
una determinada superficie, el
La actividad óptica rotatoria de una denominado plano de polarización
sustancia, tiene su origen en la
asimetría estructural de las Principios de la polarimetría La luz
moléculas. polarizada es aquella que ha pasado
a través de un “polarizador”, que
Rotación óptica: Es una técnica no fuerza ondas electromagnéticas
destructiva consistente en medir la aleatorizadas hacia un plano. Cuando
actividad óptica de compuestos tanto esta luz polarizada en un plano pasa
orgánicos como inorgánicos, puede a través de una sustancia
darse tanto en sólidos, como en ópticamente activa, el plano de
líquidos y soluciones. La rotación polarización se gira en una cantidad
óptica viene determinada por la que es característica de la sustancia
estructura molecular y la examinada. Los polarímetros
concentración de moléculas quirales detectan la posición del plano y la
comparan con su posición original
siendo la diferencia la rotación, que
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se expresa normalmente en grados 3. La temperatura: es casi
angulares (ºA). lineal

Aplicación:

Actividad óptica 1. Cualitativo:

Medida de la capacidad de ciertas 1.1. La rotación óptica de un


sustancias de hacer girar la luz compuesto puro es una constante
polarizada plana. física útil para fines de identificación
junto con la medida de otras
En el polarímetro se trabaja con propiedades físicas.
sustancias ópticamente activas que
se clasifican en: 1.2. Para identificar ciertos líquidos o
soluciones como aminoácidos,
Dextrógiras: Desvían la luz hacia esteroides, alcaloides y carbohidratos
la derecha
2. Cuantitativo:
Levógiras: Desvían la luz
polarizada hacia la izquierda 2.1. Para medir la concentración de
compuestos que son ópticamente
Los azucares son compuestos activos por ej.: carbohidratos como
ópticamente activos, algunos como la sacarosa, azúcar invertido y glucosa
fructosa (ver tabla 1) son o almidón (medición cuantitativa de
levorrotatorios (giran la luz hacia la hidratos de carbono) o medir el grado
izquierda) y otros son dextrorotatorios de conversión de ellos en procesos
(glucosa, sacarosa) cada azúcar tiene químicos o enzimáticos.
una rotación específica característica.
2.2. Análisis del azúcar de la
Rotación remolacha.

La rotación de radiación 2.3. Análisis de otros azucares


polarizada plana puede variar comerciales como la dextrosa, la
desde varios cientos de grados lactosa y la maltosa y productos que
hasta unas pocas centésimas contienen estos azucares
de grado, las variables
experimentales que pueden 2.4. Se utiliza la rotación óptica para
influir son: la valoración de sustancias que son
ópticamente activas
1. Concentración de la disolución a
medir 2.5. Se pueden realizar curvas que
relacionan la rotación óptica con la
2. La naturaleza del solvente usado concentración. Estas pueden ser
(generalmente se emplea agua) lineales, parabólicas sin embargo el
uso más extenso de la Polarimetria
es en la industria de azúcar, para

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determinar la concentración de contiene el líquido (solución) a
sacarosa. Si ella está sola en una examinar de más baja
solución la rotación óptica es concentración. Observe la luz
directamente proporcional a la de la fuente a través del
concentración. Si están presentes analizador y determine si se
otros materiales ópticamente activos presentó algún cambio en la
el procedimiento es más complejo, Se intensidad luminosa como
tiene que hacer una inversión del producto de la solución que se
azúcar entonces la concentración colocó.
será proporcional a la diferencia de la 5. 4. Mirando la fuente a través
rotación óptica antes y después de la del analizador, rótelo en el
inversión. sentido de las manecillas del
reloj hasta que vuelva a
Instrumentación establecer el mínimo de
intensidad. Establecido dicho
El instrumento empleado es el estado, mida y anote el ángulo
polarímetro y sacarímetro cuyos que roto el analizador. Esa
componentes básicos son: una fuente cantidad son los grados que
de luz monocromática, un prisma esa concentración de la
polarizador producir radiación solución giró el plano de
polarizada, un tubo de muestra, un polarización del campo
prisma analizador con escala circular eléctrico.
y un detector como se observa en la 6. 5. Vacíe el tubo porta-
figura 2. soluciones y coloque en él un
poco de la muestra siguiente.
TECNICA DEL MANEJO DE Agite el líquido y luego tírelo. A
MUESTRAS PROBLEMA continuación, llénelo de la
misma solución y coloque el
1. Ponga en cero grados el tubo en el lugar indicado.
analizador y encienda la Observe la luz de la fuente a
fuente. través del analizador y
2. Mire la energía luminosa de la determine si se presentó algún
fuente a través del analizador y cambio en la intensidad
rote el polarizador hasta que la luminosa.
intensidad de la luz que 7. 6. Cada vez que trabaje con
observe sea mínima. una nueva solución o
3. Llene el tubo porta-soluciones sustancia, repita el paso 6 para
con agua destilada y colóquelo eliminar los residuos de la
entre los dos elementos anterior y no se provoque un
polarizantes. Observe la luz de error experimental.
la fuente a través del
analizador y determine si el Polarímetro
agua le produjo un cambio
notable a la intensidad Las partes fundamentales de la
luminosa, si no es así. operación de un polarímetro son:
4. Vacíe el tubo porta-soluciones
y llénelo de la muestra que
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1) Una fuente de luz (por lo general puede determinarse con seguridad
una lámpara sodio) por el ojo por lo que se dispone de
dispositivos de media sombra, un
2) Un polarizador pequeño prisma de nicol llamado
prisma Lippich. Este dispositivo
3) Un tubo para mantener la intercepta la mitad del haz que sale
substancia (o solución) ópticamente del polarizador, entonces si se ajusta
activa en el rayo luminoso a 90° el prisma polarizador con
respecto al analizador, se observa un
4) Un analizador campo claramente dividido, en una
porción oscura y otra iluminada. La
5) Una escala para medir el número porción iluminada corresponde a la
de grados que el plano de la luz mitad del haz que ha sido girado por
polarizada ha girado. el prisma auxiliar y la porción oscura
corresponde al haz no obstruido. (Por
Componentes: motivos prácticos, los aparatos más
utilizados trabajan de modo visual,
1. Fuente: Como la rotación óptica llamados polarímetros de
varía con la longitud de onda, se semisombra en ellos el campo visual
emplea la luz monocromática. Por lo aparece partido en dos mitades
general una lampara de vapor de diferenciadas que durante la medida
sodio lampara de mercurio se comparan para ver si son igual de
oscuras.
2. Polarizador Analizador: Es la pieza
central de un polarímetro llamado 3. Tubos de muestra: Tubos
frecuentemente prisma de Nicol o de cilíndricos de 10 a 20 cm construidos
Glan-thompson, que trabajan con el de vidrio
principio de doble refracción y que
sirven paras seleccionar el rayo 4. Sacarímetro: Sacarosa y azucares
polarizado linealmente (el rayo de luz comerciales. Este instrumento es más
Extraordinario) el polarizador mas comúnmente utilizado en análisis de
alejado de la fuente de luz (por lo azúcar que el polarímetro. Las
general la línea D del sodio) se diferencias entre un polarímetro y un
denomina analizador sacarímetro, es que el polarímetro
emplea luz monocromática y da
Si se ajustan ambos prismas a una lecturas del ángulo de rotación,
porción cruzada en ausencia de mientras que el sacarímetro emplea
muestra se observa un mínimo de luz blanca y una cuña de cuarzo
intensidad de luz, al colocar la compensadora además da lecturas
muestra la rotación del haz causa un del porcentaje de azúcar
aumento de la intensidad de luz que directamente.
es contrarrestada por rotación del
prisma analizador. Este cambio Microscopio
angular requerido para reducir al
mínimo la intensidad corresponde a la El microscopio en un instrumento que
potencia rotatora de la muestra. La permite observar objetos no
posición de intensidad mínima no perceptibles a simple vista. Esto se
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logra mediante un sistema óptico movimiento y sujeción de los
compuesto por lentes, que forman y sistemas ópticos y de iluminación así
amplifican la imagen del objeto en como de los objetos que se van a
observación. observar.

Existen dos tipos de microscopios • Base o pie. Es un soporte


que emplean la luz como fuente de metálico, amplio y sólido en donde se
energía para formar imágenes apoyan y sostienen los otros
aumentadas y detalladas de objetos componentes del microscopio.
que a simple vista no es posible
observar: • Brazo, estativo o columna.
Permite la sujeción y traslado del
a) Microscopio fotónico simple o lupa. microscopio. Soporta al tubo óptico, a
la platina y el revolver.
b) Microscopio fotónico compuesto.
• Platina. Superficie plana de
El microscopio simple o lupa es un posición horizontal que posee una
instrumento de amplificación de perforación circular central. En ella se
imágenes que consiste en la apoya la preparación (lámina
utilización de una o más lentes portaobjetos que contiene a la
convergentes en un solo sistema muestra que se va a examinar) que
óptico. se sujeta a la platina mediante pinzas
o con un carrito o charriot que,
Los microscopios fotónico mediante mandos especiales facilitan
compuestos se denominan el movimiento de la preparación de
compuestos porque la imagen se derecha a izquierda y de adelante
forma mediante la utilización de tres hacia atrás.
sistemas de lentes, cada uno de ellos
constituidos por lentes convergentes • Tubo óptico. Consiste en un
y divergentes. cilindro metálico que suele medir
160mm o 170 mm de longitud
En la actualidad, el microscopio (dependiendo del fabricante del
fotónico es un instrumento de uso microscopio) el cual en un extremo,
cotidiano en los laboratorios de está conectado al revolver o porta
investigación y de diagnóstico así objetivos y en el otro se relaciona con
como en las aulas de enseñanza de el (los) ocular(es).
Biología, Embriología, Histología,
Microbiología y Patología. • Revolver o porta objetivos. Es un
componente que gira alrededor de un
COMPONENTES DEL eje con la finalidad que los objetivos
MICROSCOPIO FOTÓNICO. El que sostiene coincidan de manera
microscopio fotónico compuesto está perpendicular con la perforación
integrado por tres tipos de central de la platina. En su superficie
componentes: inferior posee varios agujeros donde
se atornillan los objetivos.
a) COMPONENTES MECÁNICOS:
Son aquellos que sirven de sostén,
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• Tornillos macrométrico y sistemas de lentes establecen la
micrométrico. Generalmente están calidad de la imagen en cuanto a su
situados en la parte inferior del brazo nitidez y la capacidad que tiene para
o columna. Pueden estar separados captar los detalles de la misma.
(en los 2 microscopios antiguos) o el
tornillo micrométrico está incorporado • Ocular: Es otro componente óptico
en la circunferencia del tornillo del microscopio, debe su nombre
macrométrico (microscopios porque la imagen final se observa a
actuales). Ambos tornillos permiten el través de él acercando el ojo a la
desplazamiento de la platina hacia lente “ocular” del componente.
arriba y hacia abajo con la finalidad
de acercar o alejar la preparación • Prismas: Estructuras transparentes
hacia los objetivos y así conseguir un que, en el caso de los microscopios
enfoque óptimo de la imagen. monoculares, sirven para desviar los
rayos luminosos de la trayectoria
• Engranajes y cremallera. rectilínea del eje óptico del objetivo y
Constituyen mecanismos de dirigirlos hacia el tubo óptico
desplazamientos de las diferentes ligeramente inclinado y luego hacia el
partes del microscopio. ocular.

• Cabezal. Es un componente C) COMPONENTES DE


situado en relación con el tubo del ILUMINACIÓN: Se consideran dentro
microscopio que alberga de este grupo a los instrumentos que
principalmente prismas o espejos que proporcionan energía luminosa al
sirven para acondicionar en él dos o microscopio. Las fuentes de energía
más oculares, o sistemas mecánicos luminosa son de dos tipos natural y
que soportan cámaras fotográficas, artificial.
de vídeo o sistemas de proyección de
la imagen. La luz natural, emitida por el sol, se
obtiene de manera indirecta mediante
B) COMPONENTES ÓPTICOS: Son un espejo que posee una superficie
los objetivos, los oculares, el plana y otra cóncava. El espejo está
condensador y los prismas. Los tres situado en la superficie superior de la
primeros están constituidos por base o pie. Un mecanismo especial
sistemas de lentes positivos y permite orientarlo hacia un lugar
negativos. iluminado indirectamente por el sol
(una ventana, por ejemplo) y luego
• Condensador: Es el componente dirigir el haz luminoso hacia la lente
óptico que tiene como función del condensador.
principal concentrar y regular los
rayos luminosos que provienen de la La luz artificial se genera a través de
fuente luminosa una lámpara de bajo voltaje
(generalmente de 6 voltios) que,
• Objetivos. Los objetivos están mediante un reóstato regula la
considerados los elementos más emisión y la intensidad de luz. Al igual
importantes en la formación de la que el espejo, este sistema de
imagen microscópica, ya que estos
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iluminación se inserta en la base o CROMATOGRAFIA
pie del microscopio.
Tswett, un científico ruso, informó en
TIPOS DE MICROSCOPIOS 1906 acerca de la separación de los
FOTÓNICOS. Las características componentes de diferentes colores
descritas, de los componentes del procedentes de hojas al hacer pasar
microscopio fotónico, así como la un extracto de éstas a través de una
formación de las imágenes de los columna de carbonato de calcio,
objetos observados corresponden al alúmina y sacarosa. Acuñó el término
microscopio fotónico de mayor uso en cromatografía con las palabras
los ámbitos académicos docentes y griegas que significan “color” y
de investigación el denominado: “escribir”.

Microscopio de transparencia o de
campo claro: Este microscopio se
caracteriza porque emplea luz natural ¿Qué es la cromatografía?
o luz artificial como energía luminosa
para formar las imágenes del objeto La Cromatografía es una técnica de
que se observa. separación en la que los
componentes de una muestra se
Microscopio de campo oscuro: Se separan en dos fases: una fase
denomina así porque la imagen que estacionaria de gran área superficial,
se forma está constituida por una y una fase móvil. El objetivo de la
serie de estructuras brillantes sobre fase estacionaria es retrasar el paso
un fondo oscuro. de los componentes de la muestra.
Cuando los componentes pasan a
Microscopio de contraste de fases: Es través del sistema a diferentes
el microscopio fotónico más utilizado velocidades, estos se separan en
para observar objetos o estructuras determinados tiempos. Cada
transparentes sin teñir. Al igual que el componente tiene un tiempo de paso
microscopio de campo oscuro facilita característico a través del sistema,
la observación de células vivas para
llamado tiempo de retención. La
distinguir y analizar sus componentes
separación cromatográfica se logra
morfológicos y ciertas funciones que
ellas puedan desarrollar cuando el tiempo de retención del
analito difiere del resto de
Microscopio electrónico: Utiliza componentes de la muestra.
electrones en lugar de fotones o luz Según IUPAC:
visible para formar imágenes de
objetos diminutos, consigue una La Unión Internacional de Química
capacidad de aumento superior al Pura y Aplicada (IUPAC) ha
microscopio convencional. propuesto una definición de
cromatografía: “cromatografía es un
método físico de separación, en el
que los componentes a separar se

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distribuyen entre dos fases, una cuya superficie se
estacionaria (fase estacionaria) y otra separan
que se mueve (fase móvil) en una las sustancias.
dirección definida” Fase móvil Fase que se está
moviendo en una
dirección
determinada. Puede
Conceptos en la Cromatografía ser un líquido o
gas. La fase móvil
Concepto Definición se mueve a través
Analito Es la sustancia de una columna que
producto de un lleva la muestra a
proceso separar.
cromatográfico.
Cromatografía Se utiliza para
Analítica determinar la
presencia y
concentración de Tipos de Cromatografía
analito en la
muestra. Aunque hay muchas y variadas
Cromatografía Se utiliza para la técnicas cromatográficas, el objetivo
Preparativa purificación de de todas es separar las sustancias
sustancias con fines que forman una mezcla y enviarlas
específicos (para el secuencialmente a un detector para
análisis). que las determine y cuantifique.
Cromatogram Es una
a representación Todas se basan en el mismo
visual de los fenómeno: permitir que las sustancias
resultados del que forman una mezcla entren en
proceso contacto con dos fases (un líquido y
cromatográfico. Cad un gas, un sólido y un líquido, etc.).
a sustancia Una de las fases es estática (no se
corresponde a un mueve) y tenderá a retener las
cierto pico en el sustancias en mayor o menor grado;
cromatograma. la otra, fase móvil, tenderá a
Cromatógrafo Instrumento para la arrastrarlas. Cada sustancia química
realización de la tiene distinta tendencia a ser retenida
cromatografía.
y a ser arrastrada.
Tiempo de Tiempo durante el
retención cual el analito pasa
a través del sistema
cromatográfico en Dependiendo de la naturaleza de la
ciertas condiciones. fase estática y de la fase móvil se
Fase Sustancia que se pueden distinguir distintos tipos
estacionaria fija a la columna o de cromatografía:
en el panel, sobre

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a) Cromatografía sólido-líquido: La thin-layer chromatography) es un
fase estática o estacionaria es un ejemplo especial de cromatografía de
sólido y la móvil un líquido. adsorción donde la fase estacionaria
es un plano en la forma de un sólido
soportado sobre una placa inerte, y la
b) Cromatografía líquido-líquido: La fase móvil es un líquido.
fase estática o estacionaria es un
líquido anclado a un soporte sólido.
b) Cromatografía de partición:
La separación se basa en las
c) Cromatografía líquido-gas: La fase
diferencias de solubilidad de los
estática o estacionaria es un líquido
componentes de la mezcla en las
no volátil impregnado en un sólido y
fases estacionaria y móvil, que son
la fase móvil es un gas.
ambas líquidas.
La fase estacionaria en la
d) Cromatografía sólido-gas: La fase cromatografía de partición es un
estacionaria es un sólido y la móvil un líquido soportado en un sólido inerte.
gas. Aquí la fase móvil también puede ser
un líquido (cromatografía de partición
Según el tipo de interacción que se líquido-líquido) o un gas
establece entre los componentes (cromatografía gas-líquido, GLC). En
de la mezcla y la fase móvil y el modo normal de operaciones de la
estacionaria podemos distinguir partición líquido-líquido se usa una
entre: fase estacionaria polar (como
metanol sobre sílice) con una fase
móvil no polar (como hexano). Esto
a) Cromatografía de adsorción: favorece la retención de compuestos
La fase estacionaria es un sólido polares y la elución de compuestos
polar capaz de adsorber a los no polares, y se denomina
componentes de la mezcla mediante cromatografía de fase normal. Si se
interacciones de tipo polar. usa una fase estacionaria no polar y
una fase móvil polar, entonces se
La fase estacionaria es un sólido retienen más los solutos no polares y
sobre el que se adsorben los los solutos polares se eluyen con
componentes de la muestra. La fase mayor facilidad. A esto se le llama
móvil puede ser un líquido cromatografía de fase inversa o
(cromatografía líquido-sólido) o un reversa, y en realidad es la más
gas (cromatografía gas-sólido); los común.
componentes se distribuyen entre las
dos fases por una combinación de En la cromatografía de fase normal
procesos de sorción y desorción. La se separan los componentes polares
cromatografía en capa delgada (TLC, estacionaria polar. En la
cromatografía de fase inversa, los
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compuestos no polares se separan disolvente. Se agrega la fase móvil de
en una fase estacionaria no polar. disolvente a la columna y se deja que
¡Esta última es más común! salga lentamente por su parte inferior.
Un soluto está en equilibrio entre una
fase móvil y una estacionaria. Cuanto
c) Cromatografía de intercambio
más interactúe con la fase
iónico:
estacionaria, más lentamente se
La fase estacionaria es un sólido que moverá a través de una columna.
lleva anclados grupos funcionales
ionizables cuya carga se puede
intercambiar por aquellos iones Cromatografía líquida:
presentes en la fase móvil.
En la cromatografía de intercambio La fase móvil es un disolvente o
iónico se usa una resina de mezcla de disolventes y la fase
intercambio iónico como fase estacionaria un sólido que interactúa
estacionaria. El mecanismo de con las sustancias que se desea
separación se basa en equilibrios de separar (cromatografía líquido-
intercambio iónico. En la sólido), o bien un líquido inmiscible
cromatografía de exclusión de con la fase móvil, depositado en la
tamaño se separan moléculas superficie de un sólido (cromatografía
solvatadas de acuerdo con su tamaño líquido-líquido). Esta forma de
gracias a su facilidad de penetrar en cromatografía puede realizarse con
una estructura como la de una criba diferentes arreglos experimentales:
(la fase estacionaria). en columna, en capa delgada o en
papel. En el primer caso, la fase
Cromatografía en columna: estacionaria se encuentra rellenando
un tubo; en el segundo, se dispersa
En la cromatografía en columna, la sobre una lámina de vidrio o aluminio
columna puede empacarse con formando un lecho de espesor
partículas pequeñas que constituyen uniforme; en la cromatografía en
la fase estacionaria (cromatografía de papel, la fase estacionaria es la
adsorción), o recubierta con una capa solución acuosa contenida en el
delgada de fase líquida interior de las celdas formadas por las
(cromatografía de partición). fibras de la celulosa, y es por tanto
una forma de cromatografía líquido-
líquido.
La separación de esos componentes
en una columna cromatográfica. Se
coloca un pequeño volumen de la Cromatografía de gases:
muestra en la parte superior de la
columna, llena con partículas En este caso la fase móvil es un gas
cromatográficas (fase estacionaria) y inerte (helio o nitrógeno) y la fase

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estacionaria es un sólido el control de calidad de los productos
(cromatografía gas-sólido) o un químicos y farmacéuticos
líquido “sostenido” por un sólido manufacturados; en fin, la lista de
inerte (cromatografía gas-líquido). ejemplos es interminable.
Este tipo de cromatografía siempre es
en columna, ya que es la única
manera de que la fase móvil gaseosa
Cromatografía en Papel:
se mantenga fluyendo, confinada
dentro del sistema. La columna La cromatografía en papel es un
puede estar rellena con la fase proceso muy utilizado en los
estacionaria, en forma semejante a la laboratorios para realizar análisis
cromatografía líquida, o bien la fase cualitativos ya que pese a no ser una
estacionaria puede depositarse sobre técnica potente no requiere de ningún
las paredes de un tubo muy delgado tipo de equipamiento. La fase
(0.25mm de diámetro) y largo (hasta estacionaria está constituida
100m). Este tipo de columnas se simplemente por una tira de papel de
conocen como columnas capilares y filtro. La muestra se deposita en un
proporcionan la mayor capacidad de extremo colocando pequeñas gotas
separación. De acuerdo con el de la disolución y evaporando el
mecanismo de retención, la disolvente. Luego el disolvente
cromatografía se puede clasificar en empleado como fase móvil se hace
los siguientes tipos: ascender por capilaridad. La
 Adsorción (normal, de fase separación se realiza en función de la
reversa) afinidad de los solutos con las dos
fases, las más solubles en agua se
 Partición líquido-líquido quedarán cerca del punto donde se
aplicó la muestra, y las menos
 Intercambio iónico
solubles en agua y más solubles en el
 De afinidad disolvente llegarán más lejos.

Las áreas de aplicación son muy La cromatografía en papel es una


diversas y abarcan prácticamente técnica utilizada para análisis
todas las actividades en las que inorgánico cualitativo, permite llevar a
interviene la química, por ejemplo: se cabo la separación e identificación de
emplea en: El análisis de drogas y iones, trabajando con cantidades
fármacos en fluidos biológicos como mínimas de sustancia. Pertenece al
la saliva, la sangre, la orina; Seguir la tipo de “Cromatografía de partición”
transformación de las sustancias se fundamenta en que las sustancias
responsables de la transmisión problema, pueden tener diferentes
neurológica; Determinar la presencia coeficientes de reparto en dos
de contaminantes en el medio disolventes de inmiscibilidad limitada,
ambiente; Descifrar la composición uno permanece fijo en la superficie
de los combustibles fósiles; Realizar del papel “fase estacionaria”

13
generalmente en agua, la fase móvil componentes orgánicos (con tonos
constituida generalmente por una amarillo-marrón), pero las manchas
mezcla de disolventes parcialmente desaparecen con el tiempo con lo que
miscibles en ella. Hay varios tipos de es conveniente señalar las manchas
cromatografía, la ascendente (papel aparecidas. Otro reactivo revelador
hacia arriba), descendente (papel bastante utilizado es el ácido
invertido), radial y de separación de sulfúrico, que reacciona con los
zonas y sectores. componentes orgánicos produciendo
manchas negras. Sin embargo debe
tenerse en cuenta que el tamaño de
las manchas no está relacionado con
Cromatografía en capa fina:
la cantidad de componente separado
Se basa en la preparación de una
capa, uniforme, de un adsorbente
mantenido sobre una placa de vidrio Cromatografía en intercambio
u otro soporte. Los requisitos iónico:
esenciales son, pues, un adsorbente,
placas de vidrio, un dispositivo que La cromatografía de intercambio
mantenga las placas durante la iónico se lleva a cabo con empaques
extensión, otro para aplicar la capa de columna que tiene grupos
de adsorbente, y una cámara en la funcionales cargados unidos a una
que se desarrollen las placas matriz polimérica. Los grupos
cubiertas. Es preciso también poder funcionales enlazados
guardar con facilidad las placas permanentemente y asociados con
preparadas y una estufa para contra iones de carga opuesta. El
activarlas. La fase móvil es líquida y mecanismo de retención más común
la fase estacionaria consiste en un es el intercambio simple de los iones
sólido. La fase estacionaria será un de la muestra y de la fase móvil con
componente polar y el eluyente será el grupo cargado de la fase
por lo general menos polar que la estacionaria. En el caso de
fase estacionaria, de forma que los empaques cargados negativamente
componentes que se desplacen con sirven para intercambiar especies
mayor velocidad serán los menos catiónicas.
polares. Polaridad de los compuestos
Aplicaciones de intercambio
orgánicos en orden creciente.
catiónico: Los cationes inorgánicos
Hidrocarburos < olefinas < flúor < se pueden determinar en alimentos,
cloro < nitro < aldehído aldehído < tales como los alimentos dietéticos
ester < alcohol < cetonas < aminas < bajos en sodio, y en muestras de
ácidos < amidas orina.

Generalmente se utiliza como Aplicaciones de intercambio


reactivo revelador yodo, el cual forma aniónico: Se pueden separar los
complejos coloreados con los ácidos HCN, carbónico, silícico y

14
bórico de los ácidos fosfórico, preciso de la temperatura de la fase
sulfúrico y clorhídrico. Los metales móvil; (2) un restrictor o un dispositivo
que forman complejos cloruro y de contrapresión, que se utiliza para
floruro mantener la presión en la columna en
el nivel deseado y para convertir el
fluyente, de fluido supercrítico en un
gas, y arrastrarlo al detector.
Cromatografía de fluidos
supercríticos: La cromatografía de fluidos
supercríticos se ha aplicado a la
La temperatura crítica de una separación de un amplio conjunto de
sustancia es la temperatura por sustancias, entre los que se cuentan
encima de la cual no puede existir en productos naturales, fármacos,
la fase líquida independientemente de alimentos, pesticidas y herbicidas,
la presión. La presión crítica es la tensoactivos, polímeros, aditivos de
presión de vapor de una sustancia a polímeros, combustibles fósiles y
su temperatura crítica. Una sustancia explosivos y propelentes.
a temperaturas y presiones por
encima de su temperatura y de su
presión crítica (punto crítico) se
denomina fluido supercrítico. Los Cromatografía de afinidad:
fluidos supercríticos tienen
densidades, viscosidades y otras La cromatografía de afinidad separa
propiedades que son intermedias las proteínas (analitos) en función de
entre las características de esa su especificidad de fijación de
sustancia en estado gaseoso y en ligandos. Los ligandos de afinidad
estado líquido. son moléculas poliméricas que sirven
de soporte porque están unidas
La ventaja de los fluidos supercríticos covalentemente sobre la columna
es que son baratos, inocuos y no son cromatográfica o matriz inerte que
sustancias tóxicas, por lo que se debe de tener una estructura de poro
pueden dejar evaporar libremente en abierta y estabilidad en condiciones
la atmósfera sin efectos ambientales de cambio de pH, detergentes y
dañinos. agentes disociantes, para así, retener
y adsorber específicamente a las
Los equipos instrumentales para la
proteínas, la fase estacionaria es
cromatografía de fluidos supercríticos
sólida.
son bastante parecidos en lo
referente a los componentes La cromatografía de afinidad tiene la
instrumentales a los equipos de ventaja de ser altamente selectiva
HPLC. Existen, sin embargo, dos para la retención de proteínas afines
diferencias importantes: (1) Es a la columna, para ello, emplea
necesario un horno, similar para sistemas de baja presión, columnas
mantener la columna termostatizada cortas y un campo restringido para la
y además proporcionar un control separación.

15
Esquema de cromatografía de antibióticos, esteroides, especies
afinidad: En el primer vaso, se organometálicas y gran variedad de
encuentra una mezcla de proteínas sustancias inorgánicas. La fase móvil
que se añaden a la columna, la cual es un líquido y la fase estacionaria es
contiene un ligando específico ligado una columna que puede ser de acero
al polímero, para la proteína de inoxidable.
interés. En el segundo matraz se
encuentra una solución de ligando, el Aplicaciones de la cromatografía
cual se añade a una probeta para que en la vida diaria:
eluya a la proteína de interés. La
bureta de en medio indica que las - Se suele usar para tomar pruebas
proteínas deseadas se lavan a través de la escena de un crimen (el análisis
de la columna. Los puntos rojos de muestras de sangre o de telas).
representan la proteína de interés, los - Verificación de incendios
negros, el ligando y las bolas beige provocados (identificación de las
unidas a los puntos negros, sustancias químicas responsables de
representan el ligando acoplado con un fuego).
el polímero.
- Análisis de sangre después de la
Cromatografía de líquidos de alta muerte o en vida para determinar los
resolución: niveles de alcohol, drogas o
sustancias venenosas en el cuerpo.
La cromatografía de líquidos de alta
eficacia es la técnica analítica de - También se utiliza para determinar
la composición de los alimentos.
separación más ampliamente
utilizada. Las razones son la - Para mirar los niveles de
sensibilidad, su fácil adaptación a las contaminación, por ejemplo, del agua
determinaciones cuantitativas o del aire.
exactas, es ideal para la separación
de especies no volátiles o - Para el estudio de mezclas
termolábiles y por su gran complejas en cosas tales como
aplicabilidad a sustancias que son de alimentos, perfumes, petroquímica, y
interés en la industria. Algunos producción farmacéutica.
ejemplos son: aminoácidos,
proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos,
fármacos, terpenoides, plaguicidas,
estas en un campo eléctrico a través
de una matriz porosa, la cual las
ELECTROFORESIS
separa por tamaños moleculares y
1. ¿QUÉ ES? carga positiva.

Técnica para la separación de 2. APLICACIONES


moléculas según la movilidad de

16
 Determinación de la masa 4.2 Vertical.
muscular.
 Casi exclusivamente con gel
 Determinación del punto
de poliacrilamida para
isoeléctrico.
proteínas y ácidos nucleicos
 Isoenzimas. de pequeño tamaño.
 Mapas de restricción.  Gel: electroforesis continua (un
 Secuenciación de ácidos solo tipo de gel) y
nucleicos. electroforesis discontinua (2
 3. CONCEPTOS BÁSICOS tramos de gel de composición
ligeramente diferente.
3.1 Electroforesis capilar
Técnica de separación que se ha
desarrollado gracias a los avances de
la cromatografía líquida de alta
eficacia. 5. TÉCNICAS
ELECTROFORÉTICAS
Permite separa biomoléculas, donde
la cromatografía liquida se muestra 5.1 Electroforesis capilar en zona o
menos eficaz, y compuestos de en disolución libre (CZE)
pequeña masa molecular. Procedimiento de electroforesis más
habitual, en el cual el capilar es
recorrido por el electrolito a través de
3.2 Métodos de Detección. un medio buffer que puede ser ácido
Se mide intensidad de la luz que pasa (fosfato o citrato), básico (borato), o
a través del capilar en una pequeña anfótero (carácter ácido y básico). El
zona en la que se ha eliminado el flujo electroosmótico crece con el pH
revestimiento opaco. del medio electroforético.

Detección por fluorescencia resulta


mas sensible si se emplea una fuente 5.2 Electroforesis capilar
laser muy intensa. electrocinética micelar (MEKC)
En esta variante del procedimiento
4. MODOS DE DISPOSICIÓN DE anterior se añade a la fase móvil un
SOPORTE compuesto catiónico o aniónico para
formar micelas cargadas. Estas
4.1 Horizontal. pequeñas gotas inmiscibles con la
 En papel para aminoácidos u disolución retienen a los compuestos
neutros de un modo más o menos
otras moléculas pequeñas.
eficaz, por afinidad hidrófilahidrófoba.
 En gel de almidón o agarosa
Se puede utilizar este tipo de
para proteínas y ácidos electroforesis para moléculas que
nucleicos. tienen tendencia a migrar sin
17
separación, como es el caso de 5.4 Isoelectroenfoque capilar
algunos enantiomeros. (CIEF)
Esta técnica, también conocida como
electroforesis en soporte, consiste
5.3 Electroforesis capilar en gel
en crear un gradiente de pH lineal en
(CGE)
un capilar con pared tratada que
Esta es la transposición de la contiene un anfótero. Cada
electroforesis en gel de poliacrilamida compuesto migra y se enfoca al pH
o de agarosa. El capilar está relleno que tenga igual valor que su punto
con un electrolito que contiene al gel. isoeléctrico (al pI su carga neta es
Se produce un efecto de filtración que nula). Seguidamente, bajo el efecto
ralentiza a las grandes moléculas y de una presión hidrostática y
que minimiza los fenómenos de manteniendo el campo eléctrico, se
convección o de difusión. Los desplazan las especies separadas
oligonucleótidos, poco frágiles, se hacia el detector. Las altas eficiencias
pueden separar de este modo. obtenidas con este procedimiento
permiten separar péptidos con pI que
apenas difieren entre sí 0.02
unidades de Ph
atómica y para
espectroscopia de masa
Sistemas para la introducción de
atómica. Existen dos
muestras.
opciones: plasmas
 ATOMIZADORES acoplados
CONTINUOS: inductivamente o
1. Fuentes de plasma: corriente directa (cd).
disponibles en el 2. Atomizadores de
mercado desde 1970, flama: consiste en un
es una mescla gaseosa nebulizador neumático,
conductora que el cual convierte la
contiene una disolución de la muestra
concentración en una neblina, o
significativa de iones y aerosol, que es
electrones. Ha sido introducido en un
utilizada para emisión incinerador. El
atómica, fluorescencia nebulizador concéntrico

18
es el más popular. En la 2.4.3 ESPECTROMETRÍA DE
mayoría de los ABSORCIÓN ATÓMICA.
atomizadores, el
2.4.3.1 PRINCIPIOS.
oxidante es un gas de
alta presión, con el
La solución de la muestra se aspira y
aerosol que contiene el
se introducen en una flama, como en
oxidante siendo
la espectrometría de emisión de
mezclado
flama; el elemento en la muestra se
posteriormente con el
convierte en vapor atómico. De esta
combustible. Los
manera, la flama contiene átomos del
incineradores utilizados
elemento; algunos son excitados
en espectroscopia de
térmicamente por la temperatura de
flama suelen ser los
la flama, pero casi todos permanecen
incineradores de flujo
en estado fundamental.
laminar previamente
mezclado. Estos átomos en estado fundamental
pueden absorber radiación de
 ATOMIZADORES
determinada longitud de onda
DISCRETOS:
producida en una fuente especial que
3. Atomizador electro
contenga ese mismo elemento. Las
térmico: disponibles
longitudes de onda de la radiación
desde 1970, ofrecen
emitida por la fuente son las mismas
una mayor sensibilidad
que absorben los átomos en la flama.
debido a que toda la
muestra es atomizada La absorción obedece la ley de Beer.
en un periodo corto y Esto es, la absorbencia es
porque el tiempo directamente proporcional a la
promedio de residencia longitud de trayectoria en la flama y a
de los átomos en la concentración de vapor atómico en
trayectoria óptica es de ella. Ambas variables son difíciles de
un segundo o más. determinar, pero se puede mantener
constante la longitud de trayectoria y

19
entonces la concentración del vapor detector se ajusta para sólo recibir
atómico será directamente radiación modulada a la frecuencia
proporcional a la concentración del del espejo de sector y entonces se
analito en la solución que se aspira. discrimina contra la emisión emitida
por la flama.
El procedimiento se puede utilizar
para preparar una curva de
calibración --de concentración en la
2.4.3.3 INSTRUMENTACIÓN.
solución-- en función de la
absorbencia. La desventaja principal
Se requieren instrumentos de doble
de hacer mediciones por absorción
haz para la corrección de fondo si se
atómica es que para cada elemento
usan lámparas continuas de deuterio.
se requiere una fuente diferente.
No obstante, el divisor de haz para
obtener el haz doble reduce la
2.4.3.2 DESCRIPCIÓN DE LA
energía radiante y causa mayores
TÉCNICA.
niveles de ruido (disminuye las
Como en la espectrometría normal de relaciones de señal a ruido). Se
absorción, las necesidades para la encuentran disponibles instrumentos
espectrometría de absorción atómica de un solo haz de fuente de alta
son una fuente luminosa, una celda energía que usan correcciones de
(la flama), un monocromador y un fondo basados en una línea (miden la
detector. La flama se sitúa entre la absorción del fondo con una línea
fuente y el monocromador. cercana a la línea del analito); estos
equipos proporcionan buenas
Se trata de un instrumento de Haz
relaciones de señal a ruido y son más
doble. El haz de la fuente se envía de
pequeños e incluso más portátiles.
manera alternada a través de la flama
y en otra trayectoria que no pasa por 1.Fuentes. Se requiere una fuente de
ella mediante un espejo de sector que líneas nítidas en absorción atómica
lo divide. El detector mide esta porque el ancho de la línea de
alternancia y despliega el logaritmo absorción es muy estrecho --de unas
de la relación. El amplificador del milésimas a una centésima de

20
nanómetro, cuando mucho--. Por ser se desprenda y se evapore. El metal
una línea de absorción tan angosta, vaporizado se excita a niveles
sólo se absorbe una pequeña electrónicos más altos debido a las
fracción de la radiación producida en continuas colisiones con los iones
una fuente continua que pasa por la gaseosos de alta energía; cuando los
rendija y llega al detector. electrones regresan al estado
fundamental emiten las líneas
La fuente que se usa casi
características de ese elemento
exclusivamente es una lámpara de
metálico. También se emiten las
cátodo hueco (HCL, hollow-cathode
líneas del gas de relleno, pero en lo
lamp). Se trata de una fuente de
general no están lo suficientemente
líneas definidas que emite longitudes
cerca de las del elemento como para
de onda específicas (en esencia,
interferir.
monocromáticas).
Estas líneas emitidas por la lámpara
Consiste en un cátodo cilíndrico
de cátodo hueco atraviesan la flama y
hueco hecho del elemento que se va
pueden ser absorbidas por el
a determinar o alguna aleación del
elemento que se analiza debido a que
mismo y un ánodo de tungsteno.
poseen exactamente la energía
Ambos están encerrados en un tubo
necesaria (la longitud de onda
de vidrio que suele tener una ventana
adecuada) para producir transiciones
de cuarzo, porque con frecuencia las
electrónicas discretas. Con frecuencia
líneas de interés están en la región
la línea que se absorbe más
ultravioleta. El tubo se encuentra a
intensamente es la que corresponde
presión reducida relleno con un gas
a la transición electrónica más
inerte como argón o neón.
probable en general del estado
Entre los electrodos se aplica un alto fundamental al estado excitado más
voltaje que causa la ionización de los bajo. Ésta se denomina línea de
átomos del gas en el ánodo. Estos resonancia.
iones positivos son acelerados hacia
Las líneas de una lámpara de cátodo
el cátodo negativo, y cuando lo
hueco son más estrechas que las de
bombardean hace que algo del metal

21
absorción del elemento en la flama; a la volatilización selectiva
este ensanchamiento de la línea de (“destilación”) de uno de los
absorción es consecuencia de la elementos del cátodo, el cual se
mayor temperatura y presión de la condensa en las paredes de la
flama. De esta manera, se absorbe lámpara.
todo el ancho de la línea de la fuente.
2.Quemadores. El quemador qué se
La mayor especificidad también se usa en la mayor parte de los
debe a que, mientras en una fuente instrumentos comerciales es el
continua un elemento que tuviera una quemador con cámara de
línea de absorción en cualquier lugar premezcla, que a veces se llama
del ancho de la rendija absorbería quemador de flujo laminar. El
sólo parte de toda la radiación de esa combustible y los gases de soporte
fuente, las emisiones de una fuente se mezclan en una cámara antes de
de líneas no se absorberán a menos entrar a la cabeza del quemador (a
que las líneas de absorción del través de una rendija), donde se
elemento coincidan con ellas. Hay queman.
muy pocos casos en los que sí hay
La solución de la muestra se aspira a
traslape de líneas de diferentes
través de un capilar gracias a un
elementos
efecto Venturi creado con el gas de
A veces es posible usar una aleación soporte para la aspiración, que suele
de varios elementos para fabricar el ser aire. El aire crea un vacío parcial
cátodo hueco y con esas lámparas se al final del capilar y succiona la
emiten las líneas de todos los muestra por este. La muestra se
elementos; se trata de las divide y forma una aspersión fina en
denominadas lámparas la punta o proceso normal de
multielementos de cátodo hueco, y nebulización.
pueden usarse normalmente como
Las gotas más grandes del aerosol
fuente para dos o tres elementos.
que se produce se condensan y
Tienen menor vida útil que las
drenan de la cámara. Las restantes
lámparas de un solo elemento debido
se mezclan con los gases de

22
combustión y entran a la flama. Hasta muestran en la siguiente tabla, con
90% de las gotitas se condensan y sus temperaturas máximas de
salen, y sólo 10% entra a la flama. combustión:

En general los quemadores de


premezcla se limitan a flamas con
Las flamas que más se usan para
rapidez de quemado relativamente
absorción atómica son la flama de
baja. Aunque una gran parte de la
aire-acetileno y la de óxido nitroso-
muestra aspirada se pierde en la
acetileno. Esta última, de alta
cámara, la “eficencia de atomización”,
temperatura, no se requiere e incluso
qué es la eficencia de producción de
puede ser perjudicial para muchos
vapor atómico de la parte de la
casos en absorción atómica debido a
muestra que llega la flama, es alta
que causa la ionización de los átomos
porque las gotitas son más finas.
gaseosos. Sin embargo, es útil para
También la longitud de la trayectoria elementos que tienden a formar
es grande. La combustión con óxidos termoestables en la flama de
quemadores de premezcla es muy aire-acetileno (los “elementos
relajada. Una versión popular de los refractarios”).
quemadores de premezcla es el
La Flama de aire acetileno y de otros
quemador Boling. Se trata de un
hidrocarburos absorbe una gran
quemador de cabeza con 3 ranuras
fracción de la radiación a longitudes
que produce una flama más amplia y
de onda menores a 200 nm, y para
causa menor distorsión de la
esa región del espectro se prefiere
radiación cuando atraviesa las orillas
una flama de argón-hidrógeno con
de esta. Sin embargo, este quemador
admisión de aire para tener la
se deforma con mayor facilidad que
máxima capacidad de detección. Se
otros y se debe tener cuidado para no
trata de una flama incolora, y el gas
sobrecalentarlo.
oxidante real es el aire. Se usa para
3.Flamas. Las principales flamas que elementos como el arsénico
se usan en espectrometría de (193.5nm) y el selenio (197.0nm)
absorción y emisión atómica se cuando se separan de sus soluciones

23
por volatilización en forma de hidruros se prefiere una flama “fría” de aire-
(AsH3, H2Se, etc.) y van a la lama propano o similar debido a la menor
como tales. ionización de estos elementos.

Lo anterior es necesario porque esta 2.4.3.4 APLICACIONES.


flama fría es más propensa a tener
más interferencias químicas que otras  Se utiliza para analizar
flamas. Una flama de óxido nitroso- muestras de aleaciones: fierro
acetileno ofrece una ventaja en esta (Fe), plomo (Pb), níquel (Ni),
región del espectro cuándo existe el cromo (Cr), manganeso (Mn),
peligro de interferencia molecular; la cobalto (Co), antimonio (Sb),
absorción de la flama es etc.
relativamente pequeña a longitudes  Estimación de contaminantes
de onda corta. por oligoelementos.
 Determinación de composición
En espectrometría de emisión de
cárnica de embutidos y
flama se requiere una flama caliente
conservas.
para analizar una gran cantidad de
elementos, y por ello se recurre a la  Estudios de citotoxicidad de

de óxido nitroso-acetileno. La flama conservantes y aditivos.

de oxiacetileno tiene gran rapidez del  Análisis de elementos

quemado y no se puede usar con un químicos en vinos y aceites.

quemador de premezcla  Discriminación Ca/Sr en los

convencional. Sin embargo, la de mecanismos de absorción

óxido nitroso-acetileno si se puede intestinal.

usar con quemadores de premezcla.  Los efectos del plomo (Pb) en


biosíntesis del grupo Hemo.
Debido a sus altas temperaturas debe
 Elementos en el fluido
usarse una cabeza de quemador de
cerebroespinal (fisiopatología).
acero inoxidable especial y gruesa.
 Determinación de sustancias
En el caso de la espectrometría de
contaminantes a nivel de
emisión de flama de los elementos
trazas, en particular de
sodio y potasio, fácilmente excitables,
metales pesados.
24
 Análisis de muestras de suelo. correspondiente señal
 Análisis forense, presencia de eléctrica.
radicales, nitratos, nitritos,
plomo, cobre, antimonio, y A.Ionización de la muestra (Oriol,
bario provenientes de pólvora, 1998, 312-313): La ionización de la
muestra se consigue por bombardeo
proyectil y fulminante. mediante electrones (e-) según el
proceso:
2.4.4 ESPECTROMETRÍA DE
MASAS M + e- à M+ + 2e-

2.4.4.1 DESCRIPCIÓN DE LA B.Aceleración de los iones por un


TÉCNICA. campo eléctrico (Oriol, 1998, 313):
Convertimos una fracción significativa
Hoy en día, esta técnica continúa de los átomos formados en la etapa 1
teniendo los mismos fundamentos en un flujo de iones, generalmente
que en su origen, aunque el positivos y de carga única. La
espectrómetro de hoy en día poco velocidad que adquieren viene regida
tenga que ver con su predecesor. La por la fórmula:
espectrometría de masas se
fundamenta en la separación de v = [2eV/m] ½
partículas moleculares o atómicas por
Donde V es el potencial aplicado, “e”
su diferente masa. El proceso de la la carga del electrón y “m” la masa.
espectrometría de masas comprende Cuando las partículas aceleradas se
someten a la acción de un campo
básicamente cuatro etapas: magnético (H) describen una
trayectoria circular de radio r
 Ionización de la muestra. alrededor de este campo,
 Aceleración de los iones por desarrollando una fuerza centrífuga
mv2/r, la cual es igual a la fuerza de
un campo eléctrico.
atracción del campo Hev.
 Dispersión de los iones según De esto deducimos que el radio es
su masa/carga. igual a:

 Detección de los iones y r = (2Vm/H2e) ½


producción de la

25
C.Dispersión de los iones según su Básicamente un espectrómetro de
relación masa/carga (Oriol, 1998, masas costa esencialmente de las
315): Basándonos en la ecuación siguientes partes:
anterior podemos calcular la relación
1. Sistema de entrada de
m/e que es:
muestras.

m/e = H2.r2/2V 2. Cámara de ionización.


3. Acelerador.
Dado que la mayoría de los iones
4. Analizadores.
formados en la segunda etapa tienen
5. Detector.
una sola carga y que el resto de
parámetros se mantienen constantes, 1.Sistema de entrada de muestras.
la relación m/e suele ser la masa del En el sistema de entrada de
ión. muestras, un micromol o menos de
La utilidad analítica de un muestra se convierte al estado
espectrómetro de masas depende de gaseoso por calentamiento a unos
la resolución del instrumento, o 400ºC y se introduce lentamente en la
capacidad del mismo para separar cámara de ionización.
dos partículas de diferente masa. La finalidad del sistema de entrada es
permitir la introducción de una
D.Detección de los iones y
muestra representativa en la fuente
producción de la correspondiente
de iones con la mínima perdida de
señal eléctrica (Oriol, 1998, 317): El
vacío. En los espectrómetros de
ordenador al que está conectado el
masas más modernos encontramos
aparato recoge las distintas señales y
diferentes tipos de sistemas de
las reproduce en forma de
entrada:
espectrograma, formato de fácil
interpretación.  Sistemas indirectos de
entrada: es el sistema más
clásico y el más simple, en el
cual la muestra se volatiliza
externamente y se introduce
2.4.4.2 INSTRUMENTACION. en la región de ionización que
26
está a baja presión. El sistema capilar que permiten la
de entrada es normalmente de separación y determinación de
vidrio para evitar posibles los componentes de mezclas
pérdidas por adsorción. complejas.
 Entrada por sonda
2.Cámara de ionización.
indirecta: los líquidos y los
sólidos no volátiles se pueden Las fuentes de iones de los

introducir en la región de espectrómetros de masas, tienen

ionización mediante un soporte todas unas características comunes,

para muestra o sonda, el cual pese a la variabilidad de tipos

se inserta a través de un cierre existente y es que todas transforman

de vacío. El sistema de cierre los componentes de una muestra en

se utiliza para controlar la iones.

cantidad de aire que entra En muchos casos el sistema de


después de la inserción de la entrada y la fuente de iones están
sonda en la región de combinados en un único componente.
ionización. Las sondas En todos los casos, se obtiene un haz
también se usan cuando la de iones positivos o negativos
cantidad de muestra es (normalmente positivos) que
limitada ya que se pierde posteriormente se acelera hacia el
mucha menos cantidad. interior del analizador de masas o
 Sistemas de entrada sistema separador a través del
cromatrográficos y de acelerador.
electroforesis capilar : es un
La formación de iones del analito es
tipo de sistema de entrada
el punto de arranque de arranque de
especial, está indicado su uso
un análisis por espectrometría de
cuando al espectrómetro de
masas. El aspecto de los espectros
masa va acoplado un sistema
de masas para distintas especies
de cromatografía de gases o
moleculares, depende en gran
de líquidos de alta eficacia o a
medida del método utilizado para la
columnas de electroforesis
formación de los iones. Estos
27
métodos los podemos dividir en dos masa. Además, los analizadores
categorías: deberían de permitir el paso del
número suficiente para producir
 Fuentes de fase gaseosa: en
corrientes iónicas fáciles de medir.
estas primero se volatiliza la
muestra y luego se ioniza. Al igual que sucede con los
 Fuentes de desorción: es estas monocromadores ópticos, a los que
la muestra en estado sólido o los analizadores son análogos, estas
líquido, se transforman dos propiedades no son compatibles
directamente en iones y se debe de llegar a un equilibrio que
gaseosos. está regido por la resolución del
espectrómetro de masa. Existen
3.Sistema acelerador.
diferentes tipos de analizadores de
En el sistema acelerador las masas:
partículas ionizadas producidas por el
 Analizadores de sector
impacto de los electrones son
magnético.
obligados a atravesar una primera
 Espectrómetros de doble
ranura aceleradora por una pequeña
enfoque.
diferencia de potencial. Entre esta
 Espectrómetro de masa
primera y una segunda ranura existe
cuadrupolar.
una diferencia de potencial muy
 Analizadores de masas de
elevada que imprime a las partículas
tiempo de vuelo (TOF).
su velocidad final. Una tercera ranura
 Analizadores de trampa de
actúa como colimador del haz de
iones.
partículas.
 Transformada de Fourier (FT)
4.Analizadores de masa.
5. Detectores.
Para la separación de iones con
diferente relación m/e se dispone de Los iones procedentes del sistema

varios dispositivos. Lo ideal es que el acelerador llegan al detector el cual

analizador fuera capaz de distinguir generalmente está constituido por un

entre diferencias muy pequeñas de cátodo emisor que al recibir el

28
impacto producido por las partículas  Determinación del peso
cargadas emite electrones. Estos molecular de péptidos,
electrones son acelerados hacia un proteínas y oligonucleicos.
dínodo el cual emite varios electrones  Determinación de secuencias
más al recibir el impacto de cada de aminoácidos en muestras
electrón. de polipéptidos y proteínas.

Este proceso se repite varias veces  Identificación de drogas de

hasta obtenerse una cascada de abuso y sus metabolitos en

electrones que llega al colector sangre, orina y saliva.

lográndose una corriente fuertemente  Monitoreo de gases en el

amplificada, por un procedimiento aliento de un paciente durante

muy similar al que se utiliza en los una cirugía.

tubos fotomultiplicadores. La corriente  Pruebas para confirmar la

obtenida puede amplificarse de nuevo presencia de drogas en sangre

por procedimientos electrónicos y se de caballos de carreras y en

lleva a un sistema registrador. atletas olímpicos.


 Calculo de la antigüedad de
2.4.4.3 APLICACIONES. piezas arqueológicas.
 Análisis de partículas de
Las aplicaciones son tan numerosas
aerosoles.
y abarcan tantos campos que resulta
 Determinación de residuos de
complicado citarlas todas, a
pesticidas en alimentos.
continuación veremos las más
 Control de compuestos
características:
orgánicos volátiles en
 Elucidación de la estructura de suministros de agua.
moléculas orgánicas y
biológicas.

29
PROTEINAS cabo miles de funciones. Las
Las proteínas son biomoléculas proteínas están codificadas en el
formadas básicamente por carbono, material genético de cada organismo,
hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. donde se especifica su secuencia de
Pueden además contener azufre y en aminoácidos, y luego son sintetizadas
algunos tipos de proteínas, fósforo, por los ribosomas.
hierro, magnesio y cobre entre otros las proteínas desempeñan un papel
elementos. fundamental en los seres vivos y son
las biomoléculas más versátiles y
Por tanto, las proteínas son cadenas
más diversas. Realizan una enorme
de aminoácidos que se pliegan
cantidad de funciones diferentes,
adquiriendo una estructura
tridimensional que les permite llevar a

1
entre ellas funciones estructurales, en la sangre en los organismos
enzimáticas, transportadora. vertebrados y en los músculos
respectivamente.

Funciones y ejemplos de proteínas Enzimática


Estructural Las proteínas cuya función es
enzimática son las más
La función de resistencia o función
especializadas y numerosas. Actúan
estructural de las proteínas también
como biocatalizadores acelerando las
es de gran importancia ya que las
reacciones químicas del
proteínas forman tejidos de sostén y
metabolismo.
relleno que confieren elasticidad y
resistencia a órganos y tejidos. Hormonal
Ejemplo de ello es el colágeno del
Algunas hormonas son de naturaleza
tejido conjuntivo fibroso, reticulina y
proteica, como la insulina y el
elastina del tejido conjuntivo elástico.
glucagón que regulan los niveles de
Con este tipo de proteínas se forma
glucosa en sangre
la estructura del organismo.
defensa Reserva

Las proteínas crean anticuerpos y Si fuera necesario, las proteínas


regulan factores contra agentes cumplen también una función
extraños o infecciones. Toxinas energética para el organismo
bacterianas, como venenos de pudiendo aportar hasta 4 Kcal. de
serpientes o la del botulismo son energía por gramo. Ejemplos de la
proteínas generadas con funciones función de reserva de las proteínas
defensivas. son la lactoalbúmina de la leche o a
ovoalbúmina de la clara de huevo.

transporte Reguladoras

Las proteínas realizan funciones de Las proteínas tienen otras funciones


transporte. Ejemplos de ello son la reguladoras puesto que de ellas
hemoglobina y la mioglobina, están formados los siguientes
proteínas transportadoras del oxígeno compuestos: Hemoglobina, proteínas
1
plasmáticas, hormonas, jugos color pardo y que, al encontrarse en
digestivos, enzimas y vitaminas que el entorno hidrofóbico del interior de
son causantes de las reacciones una proteína, origina un color azul
químicas que suceden en el intenso que se puede medir
organismo. fácilmente. Este método depende,
pues de la interacción relativamente
Cuantificación de proteínas.
inespecífica entre un colorante
• Para el estudio de la estructura hidrofóbico y las proteínas.
de una proteína, de la METODO DE KJELDAHL
actividad de una enzima o el
• Método más usado en la
contenido proteico de un
actualidad
alimento.
• PREPARACIÓN DE LA
• Es necesario conocer
MUESTRA (Ej. Carne)
cuantitativamente la
concentración de las proteínas. • 1. Trituración y
homogenización

• 2. Pesar 1-5 g de la muestra

DIGESTIÓN
Cuantificación directa de
proteínas. 1. Añade 10-15 ml de Ácido Sulfúrico
96-98% y una Tableta (8mg) de
• Método de Bradford
catalizador (Sulfato de cobre
Ensayo colorimétrico para la medición pentahidratado)
de proteínas totales en una solución
2. Montar un sistema scrubber con
dada.
Carbonato de Sodio
La lectura se debe hacer en la
DILUCIÓN
primera hora.
1.Sacar los tubos muestra del bloque
se emplea un colorante hidrofóbico
digestor y dejar enfriar a Tª ambiente.
cuyas disoluciones acuosas en
presencia de ac. fosfórico tienen un

2
2. Añadir unos 25ml de agua Aminoácidos en harinas
destilada en cada tubo.
• Dejar a reflujo la muestra con
3. Para evitar pérdidas de nitrógeno y
HCl 6N durante 24 horas.
reacciones violentas no introducir el
Evaporar a sequedad en
tubo todavía caliente al destilador.
evaporador rotatorio.
DESTILACIÓN
• Realizar el examen
1. Situar un Erlenmeyer de 250ml a
cromatográfico de una solución
la salida del refrigerante con 50ml de
problema al 10% de la muestra
ácido Bórico y unas gotas de
tratada en solución - acuosa
indicador.
de isopropanol a 10%.
2. Programar una dosificación de 50
a 75 ml de NaOH. • Soporte papel Whatman nº1.

3. Introducir el tubo con la muestra • Longitud del papel 50 cm.


en el destilador.
4. Destilar hasta recoger 250ml en el
Erlenmeyer (50ml Bórico + 200ml de LIPIDOS
destilado).

Determinación total de INTRODUCCIÓN


aminoácidos.
La palabra lípido originalmente se
definía como ¨sustancia insoluble en
• Los aminoácidos son ácidos
agua, pero soluble en disolventes
carboxílicos que poseen un orgánicos como cloroformo, hexano y
grupo amino. éter de petróleo¨. Esa acepción
abarca las grasas, los aceites, los
• Se clasifican en alfa, beta, terpenos, las vitaminas A, D, E y K y
pigmentos como los carotenoides.
gama, etc, según la posición
del grupo amino En la actualidad se considera que los
lípidos forman un grupo muy amplio
• Las proteínas son polipéptidos de compuestos constituidos por
carbono, hidrogeno y oxigeno que
naturales que contienen mas integran cadenas hidrocarbonadas
de 50 unidades de alifáticas o aromáticas, que también
contienen fosforo y nitrógeno. Así
aminoácidos.
pues, la concepción de lípidos implica

3
una gran variedad de sustancias que reacción de esterificación entre
se encuentran ampliamente el glicerol y una, dos o tres
distribuidas en la naturaleza y que moléculas de ácidos grasos en
cumplen diferentes funciones. las posiciones 1,2 y 3 del
Por ser los más abundantes, las glicerol. Su nomenclatura,
grasas y los aceites participan llamada numeración
directamente en la textura y estereoespecifica, se basa en
lubricación de los alimentos; otros que los sustituyentes de la
lípidos son pigmentos, hormonas o molécula se designan 1, 2 y 3,
vitaminas, algunos forman parte de y el 2 se representa a la
las membranas celulares y de los izquierda del plano de átomos
sistemas de transporte de de carbono.
nutrimentos, etc. o Fosfogliceridos o
fosfolípidos: Son
CLASIFICACIÓN:
diacilgliceridos cuyo glicerol
o Ácidos grasos: Están esta esterificado a una
constituidos exclusivamente molécula de ácido fosfórico
por triacilgliceridos, que, a su vez, se enlaza a una
comúnmente llamados basa nitrogenada, a la serina o
triglicéridos, que a su vez a un alcohol, como el inositol.
esteres de ácidos grasos con Por tener un átomo de carbono
glicerol, esos ácidos asimétrico son ópticamente
representan un gran activos, aunque la mayoría
porcentaje de la composición pertenece al enantiometro de
de los triacilgliceridos y en la serie a.
consecuencia de las grasas y o Ceras: Son esteres de un
aceites. Las grasas y los alcohol monohidroxilado en
aceites poseen diferencias de cadena larga con un ácido
estabilidad a la oxidación, de graso. Son muy resistentes al
plasticidad, de estado físico, hidrolisis, funcionan como
de patrón de cristalización, de agentes protectores en la
índice de yodo, de superficie de las hojas, los
temperaturas de solidificación tallos y los frutos, al igual que
y de fusión etc., que se deben en el pelo, la lana, las plumas
principalmente a sus ácidos de los animales y en los peces;
grasos. son sólidas con frio, pero
o Acilgliceridos: Son lípidos liquidas y moldeables en
simples, neutros o sin carga, caliente y su temperatura de
los más comunes en la fusión varia de 40 a 100C.
naturaleza, derivados de la Cubren la epidermis de las
frutas, regulan su
4
transpiración, actúan como solida cambia a liquida, reflejo
barrera para gases de la fuerza de unión entre los
atmosféricos indeseables, son ácidos grasos de un cristal.
repelentes al agua y las  Temperatura de formación
protegen contra los insectos. de humos o punto de
o Esteroides: Son sustancias humeo: Es la temperatura la
integradas por el grupo que se le producen compuesto
perhidrociclopentanofanantren de descomposición visibles,
o, una cadena hidrocarbonada que depende de los ácidos
y un grupo alcohol y están grasos y de los mono y
presentes tanto en el reino diacilgliceridos libres de la
vegetal como en el animal. grasa.
Reciben el nombre genérico de  Prueba de frio: Sirve para
fitoesteroles, entre los que determinar la eficiencia de la
destaca el sitoesterol, seguido hibernación. El aceite se
del estigmasterol del mantiene a 0C y se mide el
campesterol, del resvaterol y tiempo que permanece
de otros, en apariencia transparente; los
funcionan de la misma manera triacilgliceridos de alto punto
que el colesterol en el tejido de fusión lo enturbian a bajas
animal, es decir, estabilizan la temperaturas. Se considera de
membrana y controlan su buena calidad si el aceite se
permeabilidad. conserva transparente durante
cinco horas y media para
usarse, por ejemplo, en
mayonesas.
ANALISIS FISICO Y QUIMICOS  Plasticidad: El punto de fusión
En la producción de grasas y aceites mide la dureza de una grasa,
usados para fabricar mantecas, pero no su plasticidad o perfil
aderezos, mayonesas, margarinas, de solidos a distintas
etc., se emplean los siguientes temperaturas; las grasas son
análisis: semisólidos de triacilgliceridos
que forman una matriz
 Índices: EL más común es el
cristalina en la que queda
de acidez, que mide la
atrapado el aceite líquido,
cantidad de ácidos grasos
como el agua en una esponja y
libres de un aceite como
su plasticidad depende de su
resultado de un hidrolisis de
relación solido/líquido a
los triacilgliceridos.
diferentes temperaturas.
 Punto de fusión: Es la
temperatura a la que la fase

5
 Índice de solidos grasos
(ISG): Una grasa a -30C se
solidifica y a medida que se
calienta se induce la formación
de una mezcla de lípidos que
se encuentra en estado líquido
y solido en una relación que
depende de la temperatura.
Los componentes solidos se
dilatan de manera diferente a
como lo hacen los líquidos y la
máxima expansión de alcanza
cuando la grasa solida se
vuelve liquida.
 Resonancia Magnética
Nuclear: Se basa en la
absorción de ondas por parte
de los núcleos de moléculas
orgánicas, cuando estos se
ubican en un fuerte campo
magnético. La energía
administrada a los núcleos
cambia su orientación y las
señales generadas por el
hidrogeno en una grasa solida
son distintas a las producidas
por una grasa liquida, esta
diferencia se usa para medir el
porcentaje de grasa solida a
una determinada temperatura
y el resultado se reporta como
´´valores N´´