La contaminación marina y costera se ha convertido en una preocupación mundial en los últimos

años debido al aumento de la intensidad de los contaminantes en el medio marino. La liberación

de petróleo crudo en el medio marino durante su explotación y transporte causa una grave
contaminación ambiental, debido a la presencia de compuestos orgánicos tóxicos. El petróleo
crudo, que es el recurso energético más predominante en todo el mundo, es la mezcla compleja
de hidrocarburos que incluye más del 70% de alcanos junto con compuestos aromáticos, naftenos
y resinas. Los alcanos de cadena larga presentes en el petróleo crudo siguen siendo persistentes
debido a su naturaleza no volátil y representan una gran amenaza para los ecosistemas terrestres
y marinos. La biodegradación se ha convertido en una tecnología potencial y económica para la
restauración del medio ambiente derramado de petróleo.

La degradación microbiana de los hidrocarburos ha llamado la atención debido a su

naturaleza no carcinogénica, no combustible, de amplia difusión y respetuosa con el medio
ambiente en comparación con otros métodos convencionales. La biodegradación elimina
los hidrocarburos del petróleo del medio ambiente marino y restaura el ecosistema
contaminado con petróleo.

En general, el petróleo crudo es una mezcla compleja de hidrocarburos, alcanos,

aromáticos, asfalteno y resinas. Varias bacterias tienen la capacidad de utilizar estos
hidrocarburos como fuente de energía y carbono y oxidar los hidrocarburos del petróleo.

El potencial de Bacillus subtilis para la remediación del derrame de petróleo se muestra a

partir del análisis de propiedades, tales como, el crecimiento de las bacterias en el petróleo,
interacción de bacterias y petróleo crudo, producción de biofluorescencia, tensión
superficial, actividad de emulsificación, degradación y reducción de la viscosidad de
petróleo.

2. Materiales y métodos

2.1. Petróleo Crudo Ceroso

El petróleo céreo fue obtenido del activo del campo petrolífero Mehsana, Gujarat,
India. En la Tabla 1 se dan fracciones masivas de compuestos saturados, aromáticos,
resinas y asfáltenos (SARA) en el petróleo céreo bruto utilizado en los experimentos.

Tabla 1. Distribución de SARA en petróleo crudo.

2.3. Análisis de crecimiento

La tasa de crecimiento de los microorganismos se midió usando biomasa en peso

seco y unidades formadoras de colonias (UFC).

2.4. Extracción de biosurfactante

El sobrenadante del cultivo después de descartar la biomasa se precipitó usando 6 N

HCl, y el Biosurfactante se extrajo usando diclorometano. La fase inferior se recogió, se
concentró utilizando un evaporador de vacío rotativo (Buchi rota vapor, Suiza), y se pesó
después del secado.

2.5. Reducción de la tensión superficial

Las células bacterianas se eliminaron del cultivo mediante centrifugación durante

10 min, y el sobrenadante del cultivo libre de biomasa se usó para la medición de la tensión
superficial utilizando un tensiómetro.

2.6. Actividad de emulsificación

Emulsión: es una mezcla de dos líquidos inmiscibles de manera más o menos

homogénea.

La actividad de emulsificación se da como una relación de la altura de la capa de

emulsión y la altura total de la mezcla. Se tomó 2ml de queroseno y 2ml de muestra de
cultivo. La mezcla se agitó a alta velocidad en un tubo de ensayo, se dejó sin perturbar
durante 24 horas. Finalmente se observó la capa de emulsión y la mezcla total.

2.8. Medición de la viscosidad

Sobrenadante: Disolución que permanece tras la formación de un precipitado.

La viscosidad del petróleo crudo durante todo el período de degradación se midió

con un reómetro. Las células bacterianas se centrifugaron a temperatura ambiente durante
10 min a 10000 x g y el sobrenadante del cultivo libre de bacterias se ensayó para la
reducción de la viscosidad.
3. Resultados y discusiones

3.1. Crecimiento bacterial

El crecimiento de la bacteria es el requisito principal para llevar a cabo la

biodegradación. La población microbiana considera directamente la producción de
biosurfactante responsable de ayudar a la degradación de hidrocarburos. La Figura 2
muestra el crecimiento de Bacillus subtilis en petróleo céreo bruto a temperatura ambiente.

Se observa que el peso en seco de la biomasa es de 2.11 g/L cuando las unidades
formadoras de colonias (UFC) alcanzan su valor máximo igual a 28 × 106 / mL del cultivo
bacteriano. Por lo tanto podemos ver en la gráfica que el crecimiento de la bacteria aumentó
hasta el día 12 y luego se mantuvo hasta el día 15.

3.2. Producción y propiedades de biosurfactante

Figura 3. (a) Producción y propiedades del biosurfactante; (b) Adherencia bacteriana al
petróleo crudo céreo.

Se ha observado que el uso de biosurfactantes mejora la degradación del petróleo crudo .

Los biosurfactantes emulsionan los hidrocarburos presentes en el petróleo crudo y
aumentan la solubilidad en agua, disminuyen la tensión superficial y aumentan el
desplazamiento de sustancias oleosas del medio poroso. La Figura 3(a) muestra la
producción de biosurfactante como una función del tiempo. La producción de
biosurfactante fue de 0.98 g / L en 1 día y máxima de 4.1 g / L en 10 días. La producción de
biosurfactantes también se confirmó por la reducción observada en la tensión superficial y
el aumento de la emulsificación en el cultivo de petróleo crudo céreo. La tensión superficial
se reduce a 25 mN / m en 10 días y 21 mN / m en 20 días y no hubo más cambios (Figura
3a).

Se realizó una actividad de emulsificación para verificar la interacción del biosurfactante

con petróleo crudo y otros hidrocarburos. Típicamente, la degradación microbiana aumenta
con el aumento de la actividad de emulsificación ya que esta última proporciona un mejor
contacto con la interfaz de petróleo crudo y agua. En 1 día, se observó el 60% de la
emulsificación, mientras que el máximo del 82% se logró en 15 días (Figura 3a). La
variación de hidrofobicidad de la superficie celular (CSH) con período de incubación de
la bacteria se muestra en la Figura 3b. Se observó que la CSH era del 82% en un día y
posteriormente se hizo constante. La Hidrofobicidad de la superficie celular (CSH) es un
indicativo del potencial de las bacterias para crecer en sustancias hidrofobicas.

Los resultados experimentales revelan que el biosurfactante producido en presencia de

petróleo crudo ceroso puede mejorar la interacción entre las células bacterianas y el
petróleo crudo, acelerando así la degradación.
Análisis de reducción de la viscosidad y degradación del petróleo crudo céreo

En el grafico se muestra la reducción de la viscosidad del petróleo crudo durante el proceso

de degradación debido a la bacteria “Bacillus subtilis” a una temperatura ambiente. Se
observa que el tratamiento del petróleo crudo con la bacteria aumentó la fluidez del
petróleo crudo.

La reducción de la viscosidad se encuentra alrededor del 25% en un día y alcanza

aproximadamente el 60% en 8 días (luego permanece constante). La mayor reducción de la
viscosidad se observó entre los días 4 a 8. Esto se debe a que durante este periodo de
tiempo la bacteria alcanzó su crecimiento máximo.

Figura 4. Reducción de la viscosidad del crudo céreo durante la degradación.

La Figura 5 muestra la degradación del petróleo crudo y el conteo bacteriano en función del
tiempo. Se observa que la tasa de degradación del petróleo crudo aumentó junto con el
aumento en el tiempo de incubación de la bacteria. Se observó que la degradación del
petróleo crudo era del 62% en 1 día y del 80% después de 10 días. La tasa de degradación
creció rápidamente entre el día 1 y 10. Sin embargo, la tasa de degradación no aumentó
después del día 10. En el día 10, el recuento bacteriano alcanzó el máximo de 28 × 106
CFU / mL, y el mismo se mantuvo durante una semana y disminuyó después de eso. La
degradación del petróleo crudo sigue la misma tendencia que el crecimiento microbiano.
De acuerdo con Bordenave et al. (2007) las bacterias individuales podrían metabolizar el
petróleo crudo solo a hidrocarburos limitados y la biodegradación completa requiere una
mezcla de diferentes grupos bacterianos. En contraste con esto, los resultados revelan que
la bacteria Bacillus subtilis podría degradar el amplio rango de hidrocarburos
presentes en el petróleo crudo.