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10 Resumen:
15 resultados de las lecturas se elaboró una curva de calibración, la cual permitió obtener la
18 logró determinar que el mejor método de extracción fue mediante ultrasonido y el mejor
19 solvente fue el C.
21
*
Autor para la correspondencia. E-mail:gladysprado94@gmail.com
Tel. 695-109-9811
23 The determination of a calibration curve using the Bradford method was carried out using
24 the Biomodel platform. Through the use of a UV-visible spectrophotometer at 595 nm, the
25 concentration of various protein dilutions was determined, using the Bradford reagent as
26 target. From the results of the readings a calibration curve was elaborated, which allowed to
27 obtain the equation for the determination of protein content obtained from two extraction
28 methods (orbital agitation and ultrasound) by using 3 different solvents. It was determined
29 that the best extraction method was by ultrasound and the best solvent was C.
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32 1. Introducción
33 Los granos de las leguminosas son nutricionalmente importantes, como la principal fuente
34 de proteínas en la dieta del hombre que no puede comprar proteína animal, por su alto
36 humana. (Gosttschalk, 1983). Sin embrago, todas las leguminosas contienen ciertos factores
38 existe una gran demanda de materias primas ricas en proteínas y carbohidratos para
39 alimentación humana y animal que además de presentar un alto valor nutricio, puedan
42
45 Estudios realizados por Dickey et al. (1998); encontraron que cuando las partículas de maíz
46 obtenidos por molienda seca fueron sometidas a una extracción de las proteínas de los
48 relación de masa 4:1 (alcohol al 70% para una de maíz) por un periodo de 1-6 horas a
49 temperatura ambiente, la solución del extracto fue filtrada y centrifugada para remover
51 precipitar extractos solubles, las medidas de las partículas de masa suspendidas separadas
52 por centrifugación indican que la mezcla de partículas de maíz con etanol disuelve y
53 debilita la proteína entre las celdas y entre los gránulos de almidón próximas a la superficie
54 de las partículas. Bajo las condiciones de este estudio partículas de maíz liberan gránulos de
55 almidón más rápidamente que la disolución de cuerpos proteicos, como el indicado por el
57 la proteína indica, que a un tamaño de partícula de 2mm presenta más masa convectiva
58 transferida de a 20.
59 Los surfactantes pueden ser usados en la purificación de almidón. Paulis (1981) reportó que
64 disminuyó a 0.08%, una reducción del 50% en el contenido de proteína residual comparado
67 almidón de arroz sin el uso de químicos como el método tradicional de remojo alcalino. Los
68 surfactantes (SDS, SSL y Tween 80; a 0.1, 0.03 y 0.05%) combinados con una alta
70 arroz. La harina de arroz fue sometida a sonicación por 15, 30, y 60 minutos con
73 sonificación; el contenido de proteína y almidón dañado después del aislamiento fue de 0.9-
74 1.7% y 3.3-3.5% (en base seca), respectivamente. La combinación de 0.5% de SDS y alta
76 proteína residual, sin embargo, poco mejoramiento fue observado con SSL o Tween 80
77 (Wang, 2004)
78 2.2 Ultrasonido
82 las interfases, fricción, rotura mecánica, efectos químicos, etc. Estos mecanismos son
83 empleados para producir o mejorar una amplia gama de procesos tales como soldadura de
88 para trabajar de manera que actúan en sinergia con otras formas de energía estimulando,
97 de Sedmark y Grossberg, Biuret y Bradford, con este ultimo método las proteínas tienen
98 una capacidad de absorción máxima de 465 nm, eso cambia a 595 nm cuando el colorante
99 esta unido a las proteínas, este es el principio básico del azul de Comasie para la
102 compara contra diferentes cantidades de una proteína estándar, usualmente albumina de
105 Uno de los procedimientos analíticos más usados para poder cuantificar una cantidad de
107 representación grafica se mide en función de la concentración del analito y los resultados
109 compuesto (muestra), este se compara con estándares de muestras conocidas del mismo
110 compuesto y para poder realizar la curva se requiere de métodos y equipos apropiados,
112 espectro se ha utilizado ampliamente desde hace mucho tiempo para el análisis cuantitativo,
113 las medidas se basan en la Ley de Lambert-Beer (ecuación 1) una de las ecuaciones más
114 usadas en química analítica, esta relaciona la absorción de la radiación con la concentración
120 3. Justificación
121 Los cereales son las plantas más estudiadas por su importancia agroeconómica (Kellogg,
122 2001). El maíz es la base para la elaboración de un buen número de alimentos tanto para el
123 ser humano como para los animales de cría, así como variedad de productos para las
125 regiones naturales del país, debido a su adaptación especial a diversas condiciones
127 Las proteínas de almacenamiento de las semillas de maíz, han sido investigadas
128 ampliamente en cuatro áreas principales: 1) análisis de la diversidad genética dentro y entre
131 una herramienta en la mejora de los cultivos (Ghafoor et al. 2002). Sin embargo, las
132 técnicas de extracción de proteínas siguen siendo un desafío para el análisis preciso de estas
134 et al. 2012). Asimismo, existen muchos métodos para la determinación de proteínas, cada
135 uno de estos procedimientos tiene su particularidad, y el mejor solo podrá ser determinado
136 dependiendo de las concentraciones de las proteínas en las muestras (García y Vásquez,
137 1998).
138 4. Hipótesis
139 Ho: Debido a las comparaciones que realizó Wang en 2004 sobre el rendimiento de un
140 método que emplea solventes con agitación contra otro de ultrasonicación, se puede
147 ̶ Obtener una curva de calibración adecuada a partir del método de Bradford
149 métodos.
150 ̶ Definir la mejor combinación de método-solvente para una extracción más eficiente
152
153
156 Todos los reactivos químicos utilizados fueron Sharlau grado analítico, y las semillas de
157 maíz (Zea mays L.) empleadas fueron variedad Amarillo ICA V-305 tipo comercial de
158 tamaño grande, producidas por Semillas del Pacífico. Se seleccionaron semillas sin daños
161 Las semillas de maíz previamente seleccionadas se sembraron en cajas Petri (100 x 15)
162 mm, con papel absorbente como soporte. A cada caja se le adicionaron 12.0 mL de agua
163 destilada y se colocaron en una incubadora Incucell de 222 L sin luz, a una temperatura de
164 30.1 °C ± 0.1 °C. La humedad del sistema fue de 59.00 % ± 3.39 %. Después de 48 horas,
165 las semillas se sacaron de la incubadora, se les retiró la radícula y fueron trituradas con
166 ayuda de un molino eléctrico hasta obtener un polvillo muy fino que se guardó en una bolsa
169 Las proteínas totales fueron extraídas mediante el uso de tres solventes diferentes: solvente
170 A, TCA: ácido tricloroacético 10% (Natarajan et al. 2005); solvente B, Tris-HCl: Tris-HCl
171 0,05 M; urea 5 M; SDS (Dodecil-sulfato sódico) 0,02% y glicerol 1% (Ranjan et al. 2012);
173 hidrocloruro de cisteína 0,1%; ácido ascórbico 0,1% y glicerol 1% (Ranjan et al. 2012), y
177 de extracción (TCA (A), Tris-HCl (B) o Tris-Base (C)) y se colocaron en un agitador
178 orbital durante una hora. Al cabo de este tiempo el material se decantó obteniéndose un
180 adicionó una nueva porción del respectivo solvente fresco y se reextrajo dos veces más. Los
184 500 mg del polvo de la semilla se depositaron en un tubo de ensayo con 3 mL del solvente
186 durante 20 minutos a 35 °C. Al cabo de este tiempo el material se decantó obteniéndose un
188 adicionó una nueva porción del respectivo solvente fresco y se reextrajo dos veces más. Los
195 Se utilizó el reactivo de Bradford, que contiene azul de Coomassie, metanol o isopropanol,
196 ácido fosfórico y proteínas disueltas en el reactivo, y se comparo con una proteína estándar
199 Este paso se realizo en un laboratorio virtual de espectrofotómetro UV- VIS. Se calculó la
200 concentración de proteínas en la mezcla final de cada celda, sabiendo que la concentración
201 en la botella es de 800 mg/L. Se preparo una cubeta sólo con reactivo de Bradford (celda 1;
204 volumen total de 3 mL en cada una (volumen de la celda). Se introdujo la primera cubeta
207 "blanco de reactivos" y sirvió para que el color propio del reactivo no se considere en la
209 Se realizó el mismo procedimiento para las celdas 2 (2 mL del reactivo de Bradford + 1 mL
212 promedios de las absorbancias para cada cubeta y se registraron en una tabla así como
213 también se realizo la resta de las absorbancias promedio de cada una de las muestras menos
214 el blanco de reactivos, una vez obtenidos los datos se procedió a su análisis estadístico.
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216
217
218
Volúmenes 595 nm
Prot.
Celda Reactivo estándar [Proteína] Lectura 1 Lectura 2 Lectura 3 Promedio Corrección
1 3 0 0 0.002 0.003 0.007 0.004 0.004
2 2 1 266.666667 0.183 0.167 0.181 0.177 0.173
3 1 2 533.333333 0.351 0.363 0.358 0.357333333 0.353333333
4 0 3 800 0.542 0.543 0.537 0.5425 0.5385
221
0.6
0.5
y = 0.0007x - 0.0004 (ecuación 2)
R² = 0.9996
0.4
Absorbancia (nm)
0.3
0.2
0.1
0
0 200 400 600 800 1000
-0.1
224 Conc. De Proteina (mg/L)
225
226
227
228
229
230
SOLVENTE
MÉTODO
A B C
781.0476 ± 813.9047619 828.6666667
Orbital 17.16268694 a ±18.64454471 a,b ±13.72717648 b,c
865.8095238 888.6666667 881.047619
Ultrasonido ±12.14985793 d ±5.408484139 e ±18.08897135 d,e,f
235
236 Tabla 4. Concentración general por método de proteína en germinados de semilla de maíz
Método de extracción
Orbital 807.873016 ±24.37580551
Ultrasonido 878.507937 ±11.63828748
237
239 solventes
Método de extracción
Solvente Orbital Ultrasonido
A 781.047619 865.8095238
B 813.9047619 888.6666667
C 828.6666667 881.047619
240
241 En la tabla 1 se puede se pueden apreciar los datos obtenidos mediante el método de
242 Bradford, de la cual se tomaron los datos de la concentración de proteína calculada y los
243 valores corregidos (con ayuda de las lecturas del blanco) de absorbancia para ser graficados
244 (gráfica 1). Se trazó una línea de tendencia con un valor de R2= 0.9996, lo cual indica que
245 la línea trazada para la regresión lineal es aceptable, al tender tendencia bastante cercana a
246 1, esta se puede aceptar como valor de referencia. Posteriormente a partir de la línea de
247 tendencia se obtuvo la ecuación requerida (ecuación 2) para el posterior cálculo de los
249 absorbancias obtenidas por los métodos y tratamientos de orbital y ultrasonicación, valores
251 En la tabla 3 se presentan los resultados de las extracciones por métodos y solventes
252 empleados, con sus respectivas desviaciones estándar y a su vez se puede apreciar que
253 existen diferencias significativas entre métodos y solventes. Los valores más elevados de
254 extracción fueron obtenidos a partir de la ultrasonicación y con el empleo del solvente C,
255 sin embargo, se puede apreciar que sin importar el uso de cualquier solvente, el método de
256 ultrasonido genera mejores resultados comparados con el método de orbital, tal y como
257 reporta Wang (2004) en sus estudios de extracción de arroz y como se puede reflejar
259 capacidad para trabajar actuando en sinergia con otras formas de energía estimulando,
260 acelerando, o mejorando muchos procesos, por ello hoy en día es particularmente
264 proteínas con los tres diferentes solventes, para ambos casos, tanto el método de orbital
267 extracción porque la solución Tris además de precipitar las proteínas funcionan como
269 sirve para desestabilizar la membrana aún más y dejar expuestas las proteínas (Tan, 2018),
270 mientras que el TCA (solvente A) no posee la función amortiguadora que proteja a las
271 proteínas.
272 9. Conclusiones
274 obtenida por diversos métodos fue efectiva, ya que la línea de regresión obtuvo un valor de
275 R2 = 0.9996, el cual representa la eficiencia del modelo en donde los valores mas cercanos
277 Por otra parte se logró determinar cuál de los métodos empleados para la extracción fue el
278 más eficiente, así como el solvente que brinda mayor rendimiento en la extracción. Este
279 trabajo demuestra o confirma lo que investigaciones anteriores ya han determinado, que la
284 Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of
288 coding and optimum colour information transmission in the retina. In Proc. R. Soc.
289 Lond. B (Vol. 220, No. 1218, pp. 89-113). The Royal Society.
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306 Mason, T. J., Paniwnyk, L., & Lorimer, J. P. (1996). The uses of ultrasound
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312 magnetic resonance guided high intensity focused ultrasound and temperature
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316 Overstreet-Wadiche, L. S., ... & Maletic-Savatic, M. (2010). Microglia shape adult
319 Tan, Alex (2018): ¿Cuál es la función de una solución buffer Tris en la
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