INTRODUCCION

La detección y cuantificación específica de material genético

en una muestra biológica ha mostrado un significativo impacto
en todas las áreas de la salud, sobre todo en las áreas de las
enfermedades infecciosas y el cáncer. El desarrollo de nuevas
tecnologías, más rápidas y precisas, ha transformado a las
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes en una
herramienta clave para el equipo clínico en directo beneficio
del paciente.

Esta revisión se enfoca en analizar la diversidad y complejidad

de cada tipo de cáncer, enfocadas hacia el diagnóstico
molecular de tumores, adecuando la terapia a cada paciente y
contribuyendo a la identificación de genes relevantes en
cáncer esporádico y familiar.

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INDICE

TÉCNICAS DE ANÁLISIS MASIVO DE LA EXPRESIÓN DE GENES ...................................... 3

SISTEMAS DE ANÁLISIS MOLECULAR MASIVO ...................................................................... 3
I.MATRICES TISULARES ................................................................................................................. 3
a.MATRICES DE CDNA (ONCOCHIP) U OLIGONUCLEÓTIDOS ............................................ 3
b.ANÁLISIS DE RESULTADOS DE MICROARRAYS ................................................................. 4
c.DETECCIÓN DE PROTEÍNAS COMO MARCADORES SÉRICOSError! Bookmark not
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d.APLICACIONES EN FARMACOGENÓMICA ............................................................................. 5
e.FUTURO EN LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE GENÓMICA Y PROTEÓMICA ............ 5

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 TÉCNICAS DE ANÁLISIS MASIVO DE LA EXPRESIÓN DE
GENES

Los conocimientos sobre el genoma humano hacen posible la utilización de tecnologías

en Genómica y Proteómica, capaces de analizar la diversidad y complejidad de cada tipo
de cáncer, enfocadas hacia el diagnóstico molecular de tumores, adecuando la terapia
a cada paciente y contribuyendo a la identificación de genes relevantes en cáncer
esporádico y familiar.
De interés particular es la aplicación de los sistemas de análisis molecular masivo a la
predicción de respuesta a tratamientos individuales.
Numerosos estudios han demostrado la capacidad de generar estos modelos predictivos
aplicados a supervivencia, metástasis, respuesta a tratamientos concretos. Todos ellos,
en mayor o menor grado, adolecen del mismo defecto, la insuficiente reproducibilidad de
los resultados generados, cuando son aplicados en un contexto distinto; es decir, en
otros centros, por otros especialistas, o usando una tecnología diferente.

SISTEMAS DE ANÁLISIS MOLECULAR MASIVO

I. MATRICES TISULARES
Permiten utilizar en bloques parafinados sistemas de análisis masivo. Para ello crean
un nuevo bloque de parafina en el que se insertan en posiciones predefinidas hasta
800 cilindros de 600 a 1000μ, procedentes de biopsias de aguja efectuadas sobre
bloques de parafina preexistentes.

Es un sistema adaptado para investigar un marcador o un panel de marcadores

relacionados en una serie amplia de muestras, útil en IHQ, FISH, HIS,
complementario a microarrays de cDNA. Indicaciones típicas de esta técnica son
control de calidad, análisis de nuevos anticuerpos, estudio molecular de cánceres de
pequeño tamaño, establecimiento de modelos predictivos basados en expresión de
proteínas.

La posibilidad de digitalizar el resultado de las inmunotinciones, así como de

cuantificar la expresión de un marcador preciso, abre el camino de un uso más
ambicioso de las matrices tisulares (MTA).

a. MATRICES DE CDNA (ONCOCHIP) U

OLIGONUCLEÓTIDOS

Es miniaturizado en el que fragmentos de DNA se inmovilizan en soportes sólidos.

Desde un punto de vista de longitud de la sonda usada, hay 2 tipos de microarrays
de DNA: un sistema

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  Microarrays de cDNA que presenta sondas de cientos de bases
 Arrays de oligonucleótidos con sondas de 20-25 bases o 50-80.

Estos chip o microarrays consisten en un soporte sólido, por ejemplo un

portaobjetos, sobre el que un robot ha impreso de manera ordenada miles de cDNAs
específicos (u oligonucleótidos) representantes de otros tantos genes.

Por analogía con el término chip micro-electrónico (dispositivo con una alta densidad
de circuitos electrónicos), en biología molecular también se ha utilizado el término
de biochip de expresión para denominar a los arrays de DNA, ya que son dispositivos
de pequeño tamaño (chip) en los que se alcanza una gran densidad de material
biológico (bio) inmovilizado sobre una superficie sólida. Un chip puede ser hibridado
simultáneamente con dos sondas de cDNA marcadas diferencialmente (por ejemplo
con los fluorocromos Cy3 y Cy5) generadas a partir del RNA mensajero de las
muestras a comparar (por ejemplo, tejido normal versus tejido tumoral), o bien ser
marcado con un único fluorocromo.

Después de la hibridación, y utilizando un scanner, puede medirse para cada spot

de cDNA la intensidad de cada uno de los fluoróforos, siendo el nivel de señal
detectado proporcional al número de copias de mRNA en la muestra; de modo que
el cociente de la intensidad de fluorescencia (Cy3/Cy5) constituye una medida de la
expresión génica diferencial relativa al cDNA representado en el chip ("ratios" de
expresión).
El alto grado de integración del array permite, en un solo ensayo, obtener multitud
de valores de expresión génica relativa para distintas condiciones biológicas, lo que
convierte a esta técnica en una herramienta de alto rendimiento para trabajos en el
área de la genómica funcional. El gran volumen de datos generados debe ser tratado
con herramientas y métodos bioinformáticas.

b. ANÁLISIS DE RESULTADOS DE MICROARRAYS

Los datos generados en estos experimentos precisan de análisis bioinformático, que
esencialmente pretenden:
 Agrupar muestras o genes expresados de forma sincronizada.
 Identificar genes cuya expresión se asocia a eventos específicos.
 Asignar función biológica a los genes resultados del experimento.
 Identificar cambios tiempo-dependientes, ordenados a lo largo del tiempo.
 Simplificar series de genes al mínimo número de datos posible.
 Asignar riesgos específicos derivados de la expresión de genes concretos.

La idea no necesita apenas justificación, el análisis de suero es una técnica

mínimamente invasiva, que permite monitorizar con frecuencia cambios previos al
diagnóstico clínico o a lo largo de la enfermedad. Resultados iniciales obtenidos en
cáncer de ovario, páncreas o próstata alentaron esta línea de trabajo, usando SELDI-
TOF-MS.

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 Sin embargo, estos estudios han demostrado una baja reproducibilidad y una
elevada tasa de falsos positivos, lo que prejuzga su uso como técnica de análisis
rutinario en análisis de poblaciones a riesgo de contraer enfermedades específicas.

c. APLICACIONES EN FARMACOGENÓMICA
Las matrices de cDNA permiten también establecer el llamado perfil genómico de un
fármaco, o firma molecular del mismo, además de establecer firmas moleculares
predictivas de sensibilidad/resistencia. Aunque desde un punto de vista clínico tiene
mayor interés identificar marcadores iniciales, al diagnóstico, de sensibilidad a
drogas precisas, alcanzar este objetivo tropieza con los mecanismos de acción
múltiples de la mayoría de las drogas en uso, así como con la existencia de múltiples
sistemas redundantes de promoción de la supervivencia de las células neoplásicas.
En la práctica, se ha demostrado que los cambios inducidos por drogas son más
informativos que alteraciones moleculares al diagnóstico. Estos cambios pueden ser
analizados in vitro -células tumorales expuestas a la acción de drogas precisas- o in
vivo - cambios en el tiempo en células leucémicas tras tratamiento-.

De hecho, el tratamiento con un fármaco concreto de una línea celular específica

permite identificar el conjunto de genes inducidos en respuesta a ese fármaco. Estos
genes muestran variabilidad en función de la droga, estirpe celular, alteraciones
génicas precisas e intervalo de tiempo transcurrido hasta el análisis. Su
conocimiento permite proponer mecanismos de acción de una droga precisa.

Uno de los objetivos en análisis farmacogenómico es la identificación de pacientes

sensibles o resistentes a drogas concretas. La resistencia a una droga depende de
múltiples factores, incluyendo sobreexpresión de genes de resistencia a drogas,
incremento en la reparación de DNA, o alteraciones en la sensibilidad celular a
quimioterapia, afectando a múltiples rutas.

Marcadores de resistencia o sensibilidad identificados en modelos experimentales

en el laboratorio o en pacientes aislados pueden perder interés cuando se estudian
sobre series largas de pacientes. Consecuentemente, es preciso analizar la
relevancia clínica de los genes así identificados en series de pacientes tratados de
forma randomizada.

Una aplicación extremadamente relevante de estos estudios es la identificación de

dianas terapéuticas y el análisis de rutas. Esencialmente, la información derivada de
estos estudios brinda la oportunidad de proponer nuevas dianas que, después de
validación experimental, permitan el desarrollo de drogas racionalmente dirigidas.

d. FUTURO EN LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE GENÓMICA Y

PROTEÓMICA

El alto potencial aplicado a investigación y diagnóstico de estas técnicas aún precisa

de numerosos estudios adicionales, previamente a su aplicación clínica masiva. Este
carácter novedoso y el alto nivel de complejidad de estos experimentos que da
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subrayado por el hecho de que aún se publican muchas más revisiones o comentarios
editoriales sobre técnicas de genómica y proteómica que resultados originales.

No obstante, cabe esperar que la aplicación clínica de estas técnicas siga en

incremento, cubriendo primero una etapa de identificación de marcadores
diagnósticos y, posteriormente, propuesta y validación de dianas terapéuticas. El
desarrollo de estas técnicas de análisis molecular masivo, al mismo tiempo, está
ofreciendo un reto para el desarrollo de sistemas de análisis estadístico de múltiples
variables y validación de datos.