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EXTRACCIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LA PROTEÍNA DE LA LECHE 1

EXTRACCION Y RECONOCIMIENTO DE LA PROTEINA DE LA LECHE

Lucia Sosa Viera

Instituto La Mennais

6to Físico - Matemático

Química

Profesor Alejandro Cagiao

Miércoles 3 de Abril del 2018


EXTRACCIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LA PROTEÍNA DE LA LECHE 2

Índice

Introducción ........................................................................................................................... 3
Marco Teórico ........................................................................................................................ 4
Objetivo.................................................................................................................................. 9
EXTRACCIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LA PROTEÍNA DE LA LECHE 3

Introducción

En este informe tenemos la intención de inducirnos en las proteínas, principalmente en los

distintas ensayos cualitativos que conforman a las variadas formas de reconocer la presencia

de las proteínas en una sustancia dada y en particular con el objetivo de identificar los

aminoácidos presentes en la leche. Para ello no solo introduciremos conceptos claves de gran

relevancia para el tema en cuestión, si no que veremos y explicaremos tras la

experimentación en el ámbito del laboratorio estos mismos.


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EXTRACCION Y RECONOCIMIENTO DE LA PROTEINA DE LA LECHE

Marco Teórico

Las proteínas son macromoléculas presentes en todas las células vivas.

Aproximadamente constituyen el 50% de la masa de peso seco de las células. Son

biopolímeros (macromoléculas orgánicas), de elevado peso molecular, constituidas

básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno; aunque pueden contener también

azufre y fósforo, y en menor proporción otros elementos. Todas las proteínas son similares en

el sentido de que todas están compuestas por moléculas pequeñas llamadas aminoácidos.

Un aminoácido es una molécula que contiene un grupo amino –NH2 y un ácido

carboxílico –COOH. Las unidades básicas de todas las proteínas son los α-aminoácidos,

donde α (alfa) indica que el grupo amino se localiza en el átomo de carbono inmediatamente

adyacente al grupo acido carboxílico. Así siempre hay un átomo de carbono entre el grupo

amino y el grupo acido carboxílico.

La fórmula general para un α-aminoácido está representada por:

R R
+ -
H2N – C – COOH o H3N – C – COO

H H

La fórmula doblemente ionizada, denominada zwitteron, generalmente predomina en

valores casi neutros de pH. Esta forma es resultante de la transferencia de un protón del grupo

acido carboxílico hacia el grupo amino.

Los aminoácidos se distinguen por su diferencia en los grupos R, habiendo

identificados en la naturaleza 22 tipos distintos.

Los aminoácidos se enlazan entre sí mediante grupos amida:

R–C–N–R

H
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Cada grupo amida se conoce como enlace peptídico cuando está formado por

aminoácidos. Un enlace peptídico se forma por una reacción de condensación entre el grupo

carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro.

Los polipéptidos se forman cuando un gran número de aminoácidos se unen por

medio de enlaces peptídicos. Las proteínas son moléculas de Pol peptídicos lineales.

Estructura de las proteínas

La secuencia de los aminoácidos a lo largo de la cadena proteica se conoce como

estructura primaria y da a la proteína su identidad única. Cualquier cambio, aunque mínimo,

altera sus características bioquímicas.

La estructura secundaria de una proteína hace referencia a como se orientan los

segmentos de la cadena proteínica en un patrón regular. Es embobinada o torcida.

La estructura terciaria es la forma global de una gran proteína, particularmente, la

forma en la cual las secciones de la proteína se pliegan o se entrelazan.

La estructura cuaternaria es resultante del acumulamiento de varias cadenas

proteínicas individuales en una forma final específica. (Véase Ilustración 1)

El proceso por el cual la proteína adopta su forma biológicamente activa se conoce

como plegamiento.

Desnaturalización de la proteína

Esta es una desnaturalización bioquímica, con esto se refiere al cambio estructural de

proteínas o ácidos nucleicos que produce la perdida de la estructura nativa de la molécula de

estas sustancias. Este cambio estructural conlleva a un cambio en el funcionamiento óptimo

de las proteínas o ácidos nucleicos pudiendo llegar a la pérdida total de su función biológica.
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En algunos casos va seguido de cambios en las propiedades físico-químicas siendo lo más

frecuente la pérdida de solubilidad.

Una proteína adopta una estructura en el espacio concreta que es esencial para el

desarrollo de su función biológica. Esta estructura tridimensional es conocida con el nombre

de conformación espacial y se caracteriza por un plegamiento determinado de su estructura.

La desnaturalización de las proteínas ocurre cuándo se pierde esta conformación espacial

específica. (Véase Ilustración 2)

La desnaturalización de proteínas es derivada de algún factor externo como acidez del

medio, temperatura, etc. Es significativo saber que la desnaturalización de una proteína no

perturba a lo que se conoce cómo estructura primaria.

Hay casos extraordinariamente anómalos en los que una proteína desnaturalizada no

pierde su función biológica.

Los agentes desnaturalizantes son aquellos factores químicos o físicos que causan la

desnaturalización de las proteínas. Entre los más habituales podemos nombrar: la

temperatura, el pH, la polaridad del disolvente y la fuerza iónica.

Composición de la leche

La leche es una mezcla de agua, proteínas, grasas, vitaminas, hidratos de carbono y

minerales. Cada tipo de leche tiene diferentes propiedades, dependiendo de las sustancias que

aparezcan en la mezcla.

La cantidad de proteínas que contiene la leche es desigual según la especie de que se

trate. (Véase Tabla 1)

Las proteínas encontradas en la leche son:


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Caseína

La caseína comprende varios tipos de moléculas que son el alfa-caseína, la beta-

caseína, la kappa-caseína y la gamma-caseína. Son partículas sólidas que permanecen en

suspensión. En la leche de vaca es la proteína más abundante, constituyendo el 80% del total

de sus proteínas. En la leche humana constituyen el 40%, y no hay ni alfa ni gamma caseína.

Cuando esta proteína se encuentra en un medio ácido o alcalino se produce su

desnaturalización, tiene lugar una reacción química que altera su estructura, y deja de ser

soluble en agua, lo que provoca que precipite en forma de grumos.

Beta-lactoglobulina

La beta-lactoglobulina es una proteína que no se encuentra en la leche humana, pero

sí en la leche de vaca. Cuando se hierve la leche, esta proteína forma parte de la capa de nata

que aparece en la superficie. Puede pasar a la leche humana a través de la leche de vaca

ingerida en la dieta de la madre.

Alfa-lactoalbúmina

La alfa-lactoalbúmina es una proteína que favorece la unión de la glucosa con la

galactosa para la síntesis la lactosa. Se encuentra tanto en la leche de vaca como en la

humana. Forma parte de la capa de nata que aparece en la superficie de la leche hervida.

Lactoferrina

La lactoferrina es una proteína de color rojo debido al hierro al que está unida. Tiene

una importante función defensiva antibacteriana y antifúngica, ya que altera la pared de los

microorganismos causando su muerte y además fija el hierro del medio quitándoselo a éstos,

que ya carecen de él para su proliferación.

Lactoperoxidasa

La lactoperoxidasa es una proteína casi inexistente en la leche humana, pero muy

abundante en la saliva. También es muy abundante en la leche de vaca. Es una enzima con
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función defensiva que en presencia de agua oxigenada, procedente de los microorganismos o

producida por otros enzimas, cataliza la formación de una serie de sustancias con gran poder

antimicrobiano.

Inmunoglobulinas

Las inmunoglobulinas son proteínas que reconocen las estructuras extrañas al

organismo, como las membranas de los microorganismos, y se unen a ellas permitiendo que

sean destruidas por el sistema inmune. Son muy abundantes en el calostro y menos en la

leche.

Lisozima

La lisozima es una proteína presente en la leche humana pero ausente de la leche de

vaca. Su función es disolver la pared de los microorganismos patógenos. Actúa además

potenciando la acción de los leucocitos. La lisozima y la lactoferrina se potencian

mutuamente en su acción contra los agentes infecciosos. La lisozima se encuentra también en

la clara del huevo.

Extracción de proteínas de forma experimental

Reacción de Biuret

Es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con

dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. Está hecho de

hidróxido potásico (KOH y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio

(KNaC4H4O64H2O) El reactivo de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y

vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El hidróxido de potasio no

participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

Se usa normalmente en el ensayo de Biuret; un método colorimétrico que permite determinar


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la concentración de proteínas de una muestra mediante espectrosdopia ultravioleta visible a

una longitud de onda de 560 nm (para detectar el ion Cu2+)

Reacción xantoproteica

Es un método que se puede utilizar para determinar la presencia de proteínas solubles

en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en

aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en

presencia de tirosina Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali. Se torna color

amarillo oscuro. La reacción xantoproteica se puede considerar como una situación

electrofilia aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico dando un

compuesto coloreado amarillo a pH acido. Según las guías químicas es una reacción

cualitativa más no cuantitativa, por ende determina la presencia o no de proteínas.

Reacción para compuestos azufrados

Son compuestos que presentan azufre como es el caso de la metionina y de la cisteína

los dos aminoácidos azufrados son esenciales, la metionina estrictamente mientras que la

cisteína puede formarse a partir de la metionina (no al revés). Las dietas basadas en

leguminosas pueden ser deficientes en estos aminoácidos. Además, ambos son bastante

inestables frente a condiciones de oxidación. La cisteína es muy importante en el

mantenimiento de la estructura terciaria y cuaternaria de la mayoría de las proteínas mediante

la formación de puentes disulfuro, en dímeros de la cisteína formados por oxidación. Junto a

la cisteína. La metionina es uno de los dos aminoácidos proteinogénicos que contienen

azufre. Este deriva de la s-Adenosil metionina (SAM) sirviendo como donante de metiles. La

metionina es un intermediario en la biosíntesis de la cisteína, la carnitina, la aurina. La

lecitina, la fosfatidilcolina y otros fosfolípidos. Fallos en la conversión de metionina pueden

desembocar en ateroesclerosis. Este aminoácido es usado también por las plantas en la


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síntesis del etileno. Este proceso es conocido como el ciclo de Yang o el ciclo de la

metionina.

Etanol

El compuesto químico etanol, conocido como alcohol etílico, es un alcohol que se

presenta en condiciones normales de presión y temperatura como un líquido incoloro e

inflamable con un punto de ebullición de 78,4 °.

Los alcoholes son disolventes versátiles. Debido a su naturaleza ligeramente polar,

son en general buenos disolventes multiuso para los hidrocarburos no polares, los compuestos

orgánicos polares e incluso para compuestos iónicos. Los alcoholes etílicos e isopropilo son

comúnmente utilizados en agentes de limpieza, soluciones antisépticas y jabones líquidos, así

como para la limpieza de manchas y para aplicaciones de retoque. Los alcoholes etílicos e

isopropilo son plenamente miscibles en agua.

Ácido acético

También llamado ácido etanoico o ácido metilencarboxílico, es un ácido orgánico de

dos átomos de carbono, se puede encontrar en forma de ion acetato. Su fórmula es CH3-

COOH (C2H4O2), siendo el grupo carboxilo es el que le confiere las propiedades ácidas a la

molécula. Este es un ácido que se encuentra en el vinagre, siendo el principal responsable de

su sabor y olor agrios.

Objetivo

 Aplicar métodos de separación y obtención de proteínas

 Identificar las proteínas mediante reacciones químicas

Materiales

 Probetas graduadas  Leche descremada


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 Vasos de bohemia  Tubos de ensayo

 Termómetro  Etanol

 Varilla de vidrio  Papel de filtro

 Ácido acético 2,0mol/L  Mechero

 Hidróxido de sodio 10%  Pinza

 Sulfato de Cobre (II) 1%  Embudo

 Ácido nítrico concentrado  Trípode

 Reactivo de millón

Técnica

Reacción de Biuret:

Reacción xantoproteica:
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Reacción de millón:

Procedimiento

Extracción de la caseína

1) Medir en probeta graduada aproximadamente 25 mL de leche descremada.

2) Transferir los 25mL de leche a un vaso de bohemia.

3) Calentar la leche hasta los 40ºC agitando con varilla para homogenizar. Tratar con

cuidado el termómetro ya que es frágil.

4) Adicionar gota a gota, agitando en forma continua, el ácido acético 2,0 mol/L,

hasta que no se observe más precipitación (aproximadamente 60 gotas).

5) Con papel filtro y en otro recipiente, se filtra la caseína de la leche y de las grasas.

6) Se filtra nuevamente con etanol esta vez, la caseína de las grasas.

7) Se desecha el líquido sobrante y se traslada la caseína a tubos de ensayo

dividiéndolo previamente en tres partes iguales.

Reacciones de caracterización:

En los distintos tubos de ensayo A, B y C se realizan las tres reacciones por separado

A. Reacción con reactivo de Biuret:

1) Agregar 20 gotas de NaOH 10% y agitar

2) Agregar 2 gotas de solución de sulfato de cobre (II) al 1%.


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3) Anotar las observaciones

B. Reacción Xantoproteica:

1) Agregar 10 gotas de HNO3 y agitar

2) Anotar observaciones

C. Reacción de millón

1) Agregar 5 gotas de reactivo de millón (Hg2(NO3)2)

2) Calentar con suavidad cuidando de no evaporar el líquido no carbonizar la

proteína.

3) Anotar observaciones.

Observaciones

Reacción Coloración Precipitado


Ración de Biuret Violeta NaOH (10%) + CuSo4(ac)
Reacción xantoprotieca Amarilla HNO3(ac)
Reacción de millón Solido rojo Millón y calor

Conclusiones

Todas las reacciones dieron positivo, por lo tanto podes podemos concluir:

 Hay presencia de dos o más enlaces peptídicos

 Existe en la sustancia, aminoácidos con anillo bencénico

 Existen aminoácidos con anillo fenólico


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Tablas

Tabla 1

Composición de la leche en distintos animales

EspecieProteína Caseína Seroproteína Grasa Carbohidratos Cenizas


total (%) (%) (%) (%) (%) (%)
Humana 1,2 0,5 0,7 3,8 7,0 0,2

Caballo 2,2 1,3 0,9 1,7 6,2 0,5

Vaca 3,5 2,8 0,7 3,7 4,8 0,7

Búfalo 4,0 3,5 0,5 7,5 4,8 0,7

Cabra 3,6 2,7 0,9 4,1 4,7 0,8

Oveja 5,8 4,9 0,9 7,9 4,5 0,8


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Ilustraciones

Ilustración 1. Estructura de la proteína

Ilustración 2. Desnaturalización de una proteína