Universidad Autónoma del Estado de Morelos

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS E INGENIERÍA

López Cabrales Enrique Abisai

20144012916 8° semestre

Química Analítica 4

“Métodos cromatográficos convencionales”

19-abril-2018
 2.1 Cromatografía de gases

INTRODUCCION:
La cromatografía es una técnica de separación, se ha utilizado por su capacidad de
resolver muestras complejas, su utilización ha generado la necesidad de desarrollar
instrumentación cada vez más fina, el principio utilizado es la separación por elución
obteniendo un mayor control de las condiciones cromatográficas para incrementar la
reproductibilidad de los resultados.
De entre todos los métodos cromatográficos disponibles, la cromatografía de gases
es probablemente la técnica más utilizada, su capacidad de separación y sensibilidad
al analizar compuestos volátiles no se compara con ninguna otra.
Para realizar una cromatografía de gases se inyecta una pequeña cantidad de la
muestra a separar en una corriente de gas inerte a elevada temperatura, ésta
corriente de gas atraviesa una columna cromatográfica que separa los componentes
de la mezcla por medio de un mecanismo de partición, de adsorción o una mezcla de
ambos. Los componentes separados emergen de la columna a intervalos y pasaran a
por un sistema de detección o directamente a un dispositivo para recoger la muestra.

INSTRUMENTACION:
Un cromatógrafo de gases es utilizado para la separación, este complejo equipo de
compone de las siguientes partes: Fuente de gas, sistema de inyección, horno y
columna cromatográfica, sistema de detección y sistema de registro:
 el horno de un cromatógrafo de gases tienen el propósito de mantener la columna
termostatizada a una temperatura fijada con gran precisión, de modo que es necesario
que el control del horno permita incrementar la temperatura de éste a una velocidad
fijada y constante.

INYECCION: los dispositivos de inyección de muestras tienen la misión de vaporizar

la muestra a analizar e incorporarla a la corriente de gas portador que se dirige a la
columna. La vaporización de la muestra en el sistema debe cumplir los siguientes
requisitos:
1.- La vaporización de la muestra debe ser lo más rápida posible.
2.- La vaporización debe realizarse sin discriminar ningún componente de la muestra.
3.- La muestra debe llegar a la columna como una banda lo más fina posible.

Inyectores de columnas empaquetadas: Este tipo de columnas admiten cantidades

de muestra relativamente elevadas, y la inyección de unos cuantos microlitros de
muestra no conduce a una merma apreciable de la eficacia de la columna

Un inyector está formado por un bloque metálico conductor de calor, provisto de un

sistema de calentamiento, un termostato para mantener la temperatura constante y un
aislamiento térmico adecuado, dentro del horno está el sistema de inyección (imagen
de arriba). En éste, el gas portador, previamente calentado pasa de forma continua
por el sistema, la muestra es inyectada en el interior de la cámara, por medio de una
microjeringa de precisión, a través de un diafragma perforable con capacidad de
autosellado al retirar la aguja, al inyectar la muestra ésta se evapora al instante
mezclándose con el gas portador en una cámara de mezcla fabricada con el material
más inerte posible, la muestra una vez vaporizada es arrastrada rápidamente por la
corriente del gas portador en dirección a la columna.

Inyectores para columnas capilares: su principio es similar al sistema de inyección

de columnas empaquetadas.
La diferencia más importante es la cantidad de muestra admitida por el segundo
sistema, la cantidad de muestra utilizable es mucho menor, además las columnas
capilares se ven afectadas por los disolventes, de forma que los volúmenes que se
pueden inyectar en ellas son extremadamente bajos.

Existen otros sistemas de inyección de muestras:

 Válvulas de inyección de gases. Es muy utilizada para el muestre automático
de gases en sistemas dinámicos. Las válvulas muestreadoras utilizadas en
cromatografía de gases son del tipo de seis vías y pueden estar provistas de
bucles de carga de capacidad
variable.
 Desorción térmica: el equipo consta de un horno donde la muestra es desorbida
de los tubos de muestreo a elevada temperatura bajo una corriente de gas
portador, una vez desorbidos los vapores de la muestra, estos son retenidos en
una trampa criogénica hasta la finalización del proceso de desorción,
efectuándose la inyección en este momento por medio de un calentamiento muy
rápido de la trampa fría.

 Inyección de espacio de cabeza: es aplicable a l análisis directo de

contaminantes volátiles en muestras sólidas o liquidas. El fundamento consiste
en analizar una alícuota de la atmósfera que se encuentra en contacto con la
muestra con el fin de determinar en ella la fracción vaporizada de los
componentes que se encuentran en equilibrio con la muestra sólida o líquida.
Para realizar un análisis, la muestra se introduce en un vial herméticamente
cerrado y se somete a una temperatura previamente fijada durante un tiempo
suficiente para que las distintas fases de los compuestos a analizar alcancen el
equilibrio.
DETECCIÓN: Cuando los componentes han sido separados por la columna es
necesario un sistema detector al salir la muestra, que sea capaz de señalar la elución
de un componente de la muestra y ofrecer una señal proporcional a la cantidad de
substancia que pasa a través de él.
Los detectores utilizados en cromatografía de gases son de tipo diferencial, no ofrecen
señal cuando pasa por ellos solamente le gas portador y responden ante alguna
propiedad que pueda variar cuando éste se encuentra mezclado con alguna
substancia eluida en la columna.
Tipos de detectores: se dividen en detectores universales y detectores específicos, los
primeros ofrecen responder prácticamente ante cualquier compuesto que pueda eluir
de la columna excepto si se trata de un compuesto detector específico el cual es mas
ventajoso porque responde únicamente a un grupo limitado de compuestos.

Detector de conductividad térmica: llamado también de hilo caliente, responde a la

diferencia de conductividad térmica existente entre el gas portador puro y el gas
portador mezclado con alguna otra sustancia.
Detector de ionización de llama: es selectivo hacia los compuestos que presentan
enlaces C-H por lo que son muy pocos los compuestos que no dan señal en él.
En este detector el gas procedente de la columna se mezcla con hidrógeno y esta
mezcla se quema en una cámara con exceso de aire:

Detector de captura electrónica: se utiliza una fuente de radiación beta para bombear
el gas portador que pasa a través de una cámara de ionización, generándose de esta
forma un plasma de iones positivos, radicales libres y electrones térmicos.
Detector de nitrógeno- fosforo: está basado en el hecho de que la adición de una sal
de metales alcalinos a la llama de un detector de ionización aumente la respuesta de
éste hacia determinados elementos, la selectividad de este tipo de detectores es muy
dependiente de parámetros tales como la temperatura. La forma y tamaño de la llama,
la composición de la sal alcalina, geometría del detector, etc. Por esto el manejo
puede ser difícil.

Detector fotométrico de llama: utiliza una llama de hidrógeno para excitar a un estado
electrónico elevado fragmentos de moléculas que contengan átomos de azufre o
fósforo. En este detector el gas portador procede de la columna de mezclado con aire
y quemado en una atmósfera de hidrógeno, la emisión de los átomos de fósforo o
azufre se da en la zona superior por lo que en ocasiones se utiliza un diseño de doble
quemador con una segunda llama para producir la excitación.
Detector de fotoionización: están basados en la utilización de los fotones generados
en una lámpara de descarga para ionizar los compuestos orgánicos que emergen,
junto con el gas portador, de una columna cromatográfica. Estos detectores utilizan la
radiación de un tubo de descarga que contiene una mezcla de gases a baja presión,
éstos son excitados por medio de una diferencia de potencial elevada que se
mantiene en dos electrodos. La variación en las proporciones de la mezcla de gases
de la lámpara, permite obtener radiación ultravioleta de diferentes energías.

COLUMNA CROMATOGRÁFICA:
La columna es el elemento de separación de los componentes de la muestra, esta
formada por un tubo que debe ser fabricado con materiales inertes, dentro del cual se
encuentra la fase estacionaria. Esta puede ser un sólido activo o un liquido depositado
sobre las partículas de un sólido portador.

Columnas empaquetas: las columnas empaquetadas consisten en un tubo con un

diámetro interno entre 2 y 5mm y de una longitud entre 1 y 15 m enrollado para
poderse introducir en el interior del horno cromatográfico:
Columnas tubulares abiertas: está formada por un tubo normalmente de vidrio de un
diámetro entre 0.2 y 0.8 mm en cuya pared interna se dispone la fase estacionaria.

La permeabilidad de las columnas tubulares es 100 veces mayor que las columnas
empaquetadas

LA FASE ESTACIONARIA: la fase móvil es cromatográficamente inerte y las

separaciones son debidas exclusivamente a las interacciones específicas que se dan
entre los componentes de la muestra y la fase estacionaria.
Propiedades que una fase estacionaria debe cumplir:
1. Debe tener un rango de temperaturas de utilización entre -60 y 400°C
2. Debe tener una presión de vapor lo más baja posible.
3. Debe ser térmicamente estable.
4. Debe ser químicamente inerte
5. Debe tener baja viscosidad en las condiciones de trabajo.
6. Debe mojar bien el soporte, presentando además una adherencia suficiente
como para que no sea arrastrada por la fase móvil.
La fase estacionaria debe ser selectiva frente a los compuestos a separar.

Caracterización de las fases estacionarias: la temperatura más baja de utilización de

una fase estacionaria corresponde a su temperatura de fusión, el límite superior de
una fase estacionaria es la temperatura más elevada a la que puede mantenerse sin
que se produzcan descomposiciones.

En cromatografía de gases pueden llevarse a cabo la mayoría de las separaciones

utilizando unos cuantos tipos de fases estacionarias de uso frecuente, sintetizadas
específicamente para este uso:
1. Hidrocarburos: se han utilizado como fases estacionarias apolares hidrocarburos
de elevado peso molecular, las únicas fuerzas de interacción que se tienen con
este tipo de fases son las de dispersión, por lo que los compuestos
cromatografiados eluirán de las columnas que utilicen este tipo de fases en
orden de volatilidad.
 2. Polisiloxanos: o siliconas son como mucho el grupo de fases estacionarias de
más amplia utilización debido a su elevada estabilidad térmica y a la posibilidad
de modificar químicamente la estructura de base para obtener fases con
diferentes polaridades y selectividades.

3. Polifeniléteres: son fases estacionarias moderadamente polares, químicamente

caracterizadas y de utilidad para realizar muchas separaciones.

4. Poliésteres: son polímeros resinosos formados por policondensación de un ácido

polibásico con un polialcohol. Las columnas preparadas con este tipo de fases
presentan el problema de su escasa estabilidad ya que los poliésteres son
fácilmente hidrolizables, pueden reaccionar con algunos componentes de las
muestras y son muy sensibles a la oxidación, pr estas razones su uso se ha
disminuido bastante.

5. Polietilenglicoles: son muy útiles para la separación de compuestos polares y

con posibilidades de formación de enlaces de hidrógeno, se preparan por
polimerización del oxido de etileno.

2.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas CG/EM

La cromatografía de gases es una técnica separativa que tiene la cualidad de

conseguir la separación de mezclas muy complejas.
Pero una vez separados, detectados, e incluso cuantificados todos los componentes
individuales de una muestra problema, el único dato de que disponemos para la
identificación de cada uno de ellos es el tiempo de retención de los correspondientes
picos cromatográficos.
Este dato no es suficiente para una identificación inequívoca, sobre todo cuando
analizamos muestras con un número elevado de componentes, como es frecuente en
cromatografía de gases capilar.
Por otra parte, la espectrometría de masas puede identificar de manera casi
inequívoca cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz de identificar los
componentes individuales de una mezcla sin separar previamente sus componentes,
debido a la extrema complejidad del espectro obtenido por superposición de los
espectros particulares de cada componente. Por lo tanto, la asociación de las dos
técnicas, GC (“Gas Chromatography”) y MS (“Mass Spectrometry”) da lugar a una
técnica combinada GC-MS que permite la separación e identificación de mezclas
complejas.
La utilización de la cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masas
requiere sistemas especiales de conexión.
En principio, se trata de dos técnicas que trabajan en fase gaseosa y necesitan una
muy pequeña cantidad de muestra para su análisis, por lo que son muy compatibles.
El único obstáculo serio a la hora de realizar su acoplamiento es que el efluente que
emerge de la columna cromatográfica sale a presión atmosférica y debe introducirse
en el interior del espectrómetro de masas que trabaja a alto vacío.
Actualmente, el acoplamiento directo resulta fácil cuando se utiliza la cromatografía
de gases capilar, que es el caso más habitual.
La espectrometría de masas (MS) utiliza el movimiento de iones en campos
eléctricos y magnéticos para clasificarlos de acuerdo a su relación masa - carga.
De esta manera la espectrometría de masas es una técnica analítica por medio de la
cual las sustancias químicas se identifican separando los iones gaseosos en campos
eléctricos y magnéticos.
La MS brinda información cualitativa y cuantitativa acerca de la composición atómica y
molecular de materiales inorgánicos y orgánicos.
Condiciones de los solventes:
Los solventes que se utilizan en este método deben ser de la máxima calidad que se
puedan adquirir para evitar incertidumbres en el resultado. También deben ser
comprobados por GC/MS antes de utilizarse para identificar impurezas. En dado caso
que contengan impurezas será necesario concentrar los solventes bajo una corriente
de nitrógeno a temperatura ambiente con el fin de desplazarlas.
Condiciones del equipo de vidrio y metal:
Todo equipo de vidrio y metal debe estar completa 48 Las muestras serán
congeladas en un refrigerador a – 20 ◦ C donde serán almacenadas hasta el día de su
análisis.
Mediciones adicionales para el control de contaminación:
La muestra debe de ser tomada sin ningún instrumento de plástico (como Vacutainer,
torniquete, etc.) se deben utilizar instrumentos fabricados con materiales alternos
como el vidrio. Se recomienda utilizar guantes de nitrilo para la recolección debido a
que contienen una cantidad insignificante de ftalatos. Las muestras deben ser
acidificadas con ácido fosfórico (1M; 125µL/mL) cerca de una hora después de su
obtención con el fin de evitar la hidrólisis enzimática de los ésteres de ftalato.
Análisis en GC/MS Las muestras de sangre serán descongeladas y diluidas con
agua ultra pura, despues la muestra será extraída dos veces con hexano: MTBE (1:1;
5mL) por 30 min. Una extracción final se realizará con hexano por 15 min. El extracto
debe ser limpiado en una columna de amino propileno. El extracto será analizado por
un CG 6990N marca Agilent acoplado a un detector de masas 5973 marca Agilent. La
inyección será por medio de pulsaciones por medio de un inyector Split-Splitless a
250 ◦C. se debe utilizar una columna capilar de silica fundido (VF-5MS 30 m x 0.25
mm i.d. x 0.25 µm film thickness, Varian) la cual será calentada 45 °C por 2 minutos.,
aumentará 35 °C por minuto hasta llegar a 100°C, y por ultimo 10 °C por minuto hasta
llegar a 295 °C una vez ahí mantener por 10 minutos. Debe utilizarse helio como gas
acarreador (1 mL/min; 36 cm/s), la línea de transferencia de temperatura del
espectrómetro de masas será de 290 ◦ C. el detector debe ser utilizado en el modo de
monitoreo selecto de ion con ionización del electrón con una energía de 70 eV. Los
analitos serán identificados por sus características de tiempo de retención y por una
cuantificación ion. Cada muestra debe analizarse por lo menos 2 veces para tener
mayor número de datos y así aumentar la especificidad. La cuantificación será basada
en los estándares internos de la metodología. Los resultados deben de ser corregidos
de acuerdo a su estándar. Para la calibración del estándar es recomendable utilizar un
estándar con una mezcla que contenga los principales ftalatos. DEHP, DBP, BBzP,
DOP, DIDP.36 Cada ftalato incluido en el estándar se mostrara según su tiempo de
retención.
Limite de detección:
El límite de detección puede ser establecido de diferentes maneras dependiendo del
tipo del método. En el caso de métodos establecidos como oficiales casi nunc a es
necesario determinar el límite actual de cuantificació 50.
Existen diferentes formas de determinar el límite de detección cualquiera que sea el
método utilizado, requiere del análisis de un número adecuado de muestras conocidas
que deben estar cercanas o preparadas a la concentración del límite de detección
requerido para el tipo de ensayo a analizar.
El límite de detección para los ftalatos están en un rango de 0.1ng/mL a 3.0 ng/mL,
estos se muestran en la tabla 9.36 Control de calidad Muchas sustancias al inyectarse
en GC/MS sufren varios procesos (fragmentación, filtración) lo que ocasiona que
tengan cambios estructurales, otro problema que se puede presentar es que los
analitos queden retenidos o atrapados en los filtros del mismo GC/MS. Y debido a
estos problemas podremos obtener falsos resultados. Por lo tanto es necesario
corregir estos resultados mediante un índice de recuperación. El cual puede obtenerse
al analizar una muestra, con una cantidad conocida de cierto analito y si el resultado
es menor a la cantidad real, es necesario realizar un ajuste.37 El rango de
recuperación para el estándar de 5 ftalatos marca Ultra Scientific es de 58%. Los picos
obtenidos de la muestra control serán analizados paralelamente con los picos
corregidos de la muestra desconocida determinando mediante el área de cada pico la
concentración del ftalato que se desea analizar. El Cromatograma incluido en la figura
3 es el correspondiente del análisis del estándar de 5 ftalatos marca Ultra Scientific
 2.3 Cromatografía de líquidos de alta resolución

La cromatografía liquida de alta eficacia consiste en que un liquido circula en contacto

con un sólido u otro liquido inmiscible; al introducir una mezcla de sustancias en la
corriente de fase móvil, cada analito avanzara a lo largo del sistema con una velocidad
diferente que dependerá de su afinidad por cada una de las fases. Esto supone que
después de terminado el recorrido de la muestra por la columna, cada una de las
substancias introducidas en el sistema eluirá con un tiempo diferente, es decir, estarán
separadas.

Clasificación de la cromatografía liquida:

 Cromatografía de adsorción (liquido-solido): la fase estacionaria es un

adsorbente y la separación se basa en repetidas etapas de adsorción –
desorción.
 Cromatografía de reparto/adsorción (fases ligadas químicamente): la separación
en este caso se basa en un reparto del soluto entre la fase móvil y la fase
estacionaria.
 Cromatografía de intercambio iónico: se da cuando la fase estacionaria presenta
en su superficie grupos ionizados capaces de retener selectivamente a iones de
signo contrario que circulan en la fase móvil.
 Cromatografía de exclusión molecular: la fase estacionaria es un material poroso
de tamaño de poro controlado, que permite la entrada de ciertas moléculas de
manera selectiva, dejando de fuera otras de mayor tamaño.
 Cromatografía de fase normal: la fase estacionaria presenta puntos activos de
alta polaridad y las interacciones que se producen con el soluto son específicas
del grupo activo.
 Cromatografía de fase reversa: la fase estacionaria tiene una naturaleza apolar y
las interacciones que se producen son inespecíficas.

INSTRUMENTACION:

Componentes del cromatógrafo:

- Dispositivo de suministro de eluyentes.
- Dispositivo de inyección.
- Conducciones y conexiones.
- Detector y registrador.
- Columna
BOMBEO:
La misión de la bomba es suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la fase
móvil a través de la columna, sin que el flujo sea influido por la presión en cabeza de
la columna,
Un sistema de bombeo debe cumplir con las siguientes características:
- Estar construido con materiales químicamente inertes frente a la fase móvil.
- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
- Proporcionar un flujo libre de pulsaciones ya que disminuyen la sensibilidad.
- Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas.
- El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que de él
depende la reproductibilidad de los tiempos de retención.
Tipos de bombas:
COLUMNAS: Las más utilizadas en cromatografía de
líquidos son las de relleno; estas columnas consisten en
un tubo relleno de una fase estacionaria adecuada al tipo
de separación que se pretende llevar a cabo. El diámetro
interno varía entre 2 y 60 mm y su longitud varia entre 5 y
30 cm.
Las características de la columna que influyen sobre su
capacidad de separación son:
- Diámetro interno
- Longitud
- Conexiones
- Relleno
- Tamaño de partícula del relleno

Elección de la columna y fase móvil:

La elección del sistema cromatográfico debe realizarse en
función de la naturaleza de las substancias a separar.

Mecanismos de separación más generales utilizados en

cromatografía liquida:

1. Adsorción: Cromatografía liquido – sólido (CFL)

2. Adsorción / reparto: Cromatografía con fases ligadas (CFL)
Cromatografía de fase normal (CFL)
Cromatografía de fase reversa (CFR)
3. Intercambio iónico: Cromatografía de intercambio iónico (CII)
Cromatografía de cambio catiónico.
Cromatografía de cambio aniónico.
4. Tamaño molecular: Cromatografía de exclusión molecular (CEM)
Cromatografía de filtración en gel (CFG)
 2.4 Cromatografía de fluidos supercríticos
La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) se utiliza para el análisis y
purificación de moléculas de bajo a moderado peso molecular. Los principios son
similares a los de HPLC sin embargo SFC típicamente utiliza CO2 como la fase móvil.
Fundamento:
La temperatura critica Tc de una sustancia, es aquella temperatura por encima de la
cual no puede existir en fase liquida independientemente de la presión.
La presión de vapor de una sustancia cuando alcanza la Tc es su presión crítica Pc.
Una sustancia a temperatura y presión por encima de su Tc y su Pc “punto crítico”
se denomina fluido supercrítico.
Este fluido tiene las propiedades de expansión e un gas y la densidad de un liquido
lo que le proporciona una notable capacidad para disolrver moléculas grandes no
volátiles.

Es una técnica híbrida entre la cromatografía de gases (GC) y la HPLC, que combina
lo mejor de ambas técnicas. Esta técnica es importante porque permite la separación
de mezclas en las que no es adecuada la aplicación de la GC ni de la HPLC. En
concreto, se aplica a compuestos no volátiles o térmicamente inestables que no
pueden separarse mediante GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que
imposibilitan su detección en la HPLC.
INSTRUMENTACIÓN:

Debido a las características de la fase móvil (alta presión y temperatura), se emplean

equipos parecidos a los de HPLC, con varias diferencias

 El empleo de un horno termostático para poder controlar con precisión la

temperatura de la fase móvil.

 El uso de un restrictor, empleado para poder mantener por una parte la presión
en el interior de la columna, y -por otra parte- permitir la bajada de la presión a la
salida para que el fluido supercrítico (SF en adelante) pase al estado gaseoso y
pueda detectarse adecuadamente el analito.

Básicamente, un restrictor es un tubo capilar de unos 2 a 10 cm de longitud y un

diámetro interno menor al de la columna (típicamente 1/10 del diámetro), donde a la
salida el SF expande y pasa al estado gaseoso y se puede mantener simultáneamente
la presión en el interior de la columna.
A diferencia de la cromatografía de gases, en la SFC no se aumenta la velocidad de
elución modificando la temperatura, sino la presión del SF. El aumento de presión, al
aumentar la densidad, permite una mayor interacción analito-fase móvil y disminuye
los tiempos de elución. Se suele emplear en las eluciones una primera
etapa isobárica para luego aumentar la presión lineal o asintóticamente hasta el final
de la elución.

Fases estacionarias:
Se pueden emplear, al igual que en la GC, las columnas capilares o de relleno,
prefiriéndose las primeras. Las dimensiones son parecidas en longitud, de 10 a 20 m,
y el diámetro interno es bastante menor, de 0,05 a 0,10 mm. La película interna es
de siloxano entrelazado y polimerizado. Si se emplean columnas de relleno, su
diámetro interno varía entre 0,5 y 4,6 mm, y el grosor de la partícula de relleno es de 3
a 10 μm. En este caso, el recubrimiento es parecido al empleado en HPLC de reparto.

Fases móviles:

La fase móvil estrella en la SFC es el dióxido de carbono, por sus excelentes

propiedades:

 Apolar, disuelve una gran variedad de moléculas orgánicas.

 Transparente a la radiación ultravioleta
 Inodoro
 No tóxico
 Fácil de obtener
 Barato
 No inflamable
El CO2 tiene la ventaja de que se puede obtener fácilmente como fluido supercrítico.
Su temperatura crítica es de 31ºC y la presión crítica de 72,9 atm, condiciones
realmente asequibles y por debajo del rango de condiciones usuales en la HPLC.
Otras fases móviles también probadas y empleadas son
el etano, pentano, dietiléter, amoníaco, tetrahidrofurano, diclorofluorometano y óxido
nitroso.
Detectores:
Se puede emplear el detector de ionización de llama (también usado en GC), por sus
características de universalidad (permite detectar casi cualquier compuesto orgánico),
alta sensibilidad y bajo mantenimiento. El espectrómetro de masas también tiene
utilidad, al tener una salida en fase gas, y detectores espectrofotométricos como el
de infrarrojos, ultravioleta, el de emisión por fluorescencia, el termoiónico y el
fotométrico de llama.
Aplicaciones:
La SFC se aplica a una gran variedad de compuestos, entre los que podemos citar
drogas, alimentos, herbicidas, tensioactivos, polímeros y aditivos para éstos,
impelentes, explosivos o combustibles fósiles.

REFERENCIAS:
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/cromatogr
afia_de_gases.pdf
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/cromatogr
afia_liquida_de_alta_eficacia.pdf
http://www.chem.agilent.com/en-S/Products/Instruments/lc/analytical/systems/sfc
http://intranet.chem.agilent.com/Library/brochures/1260-Infinity%20a-SFC-
Brochure.pdf
Muneo Saito (2008), [1.pdf Supercritical Fluid Chromatography: A New Technology?], Packed Column SFC
2008, Switzerland
 Validación de un método por Cromatografía de Gases para la
determinación de los ácidos grasos que componen el D-004
ingrediente activo

El D-004 es un nuevo ingrediente activo obtenido a partir de los frutos de la palma real
cubana (Roystonea regia), el cual ha demostrado su efectividad en modelos experimentales
de hiperplasia prostática.
Esta sustancia está compuesta principalmente por una mezcla de ácidos grasos (AG)
saturados e insaturados libres, entre 8 y 18 átomos de carbono. Se desarrolló y validó un
método por cromatografía gaseosa para la determinación de los AG en el D-004. Los AG
fueron analizados como ésteres metílicos, obtenidos por reacción con cloruro de acetilo al 10
% en metanol y separados en una columna capilar widebore BPX-5 utilizando ácido
tridecanoico como patrón interno.
En el estudio de especificidad se demostró que no hubo interferencias en la determinación
de esta mezcla, una vez que las muestras fueron sometidas a condiciones de estrés. La
determinación del contenido de AG totales fue lineal
(r > 0,999; CVs de los factores de respuesta y la pendiente menores que 5 y 2 %,
respectivamente) y sin sesgo en todo el intervalo estudiado, desde 50 a 150 % de la masa
nominal. Se obtuvieron recobrados elevados en el estudio de exactitud (100,4 a 100,8 %),
realizado en un intervalo de 80 a 120 % de la concentración nominal.
Se obtuvieron buenos resultados en los estudios de repetibilidad y precisión intermedia (CV
< 2 %), lo que probó que el método es preciso. Conforme a estos resultados, el
procedimiento validado es apropiado para el control de calidad y los estudios de estabilidad
de este ingrediente activo.

MATERIALES Y MÉTODOS:
Reactivos y disoluciones D-004 ingrediente activo (lote 020205) obtenido en el
Departamento Química del Centro de Productos Naturales, Centro Nacional de
Investigaciones Científicas (Ciudad de La Habana).
Patrones de los ácidos decanoico (cáprico, C10:0), dodecanoico (láurico, C12:0),
tetradecanoico (mirístico, C14:0), hexadecanoico (palmítico, C16:0), 9-octadecenoico (oleico,
C18:1), octadecanoico (esteárico, C18:0), tridecanoico (C13:0) y ésteres metílicos de los
ácidos octanoico (caprílico, C8:0), 9-hexadecenoico (palmitoléico, C16:1) y 9-octadecenoico
(oleico, C18:1).
Disolución metilante (DME) de cloruro de acetilo 10 % en metanol.
Disolución de hidróxido de sodio en agua (NaOH-H2 O) 2 mol/L.
Disolución acuosa de peróxido de hidrógeno (H2 O2) 30 %.
Disolución matriz de referencia (DMR). Se pesaron con exactitud de 0,1 mg, alrededor de
10 mg de cada uno de los ácidos siguientes: C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 y C18:0 en un tubo
de ensayos y se aplicó la metodología analítica.
Disolución de Referencia de ácidos (DRA). Se pesaron 15,37; 452,61; 188,10; 247,12;
53,38 y 829,00 mg de los ácidos C10:0, C12:0, C14:0, C16:0, C18:0 y C18:1 y se disolvieron
en 100 mL de n-hexano.
Disolución de patrón interno (DPI). Se pesó con exactitud de 0,1 mg, alrededor de 1 g de
C13:0, y se disolvió en 100 mL de metanol. En el estudio se emplearon patrones de SIGMA
(St. Louis, MO, USA); reactivos y disolventes (MERCK, Darmstadt, Alemania) y agua
destilada.
Equipos:
Cromatógrafo de gases GC 14A (Shimadzu, Japón)
Con detector de ionización por llama (DILL), acoplado a sistema de cómputo (Konixbert,
Barcelona, España),
Con columna capilar wide-bore con fase enlazada BPX-5 (30 m x 0,53 mm d.i. y 1,5 µm de
espesor de película, SGE, Australia).
Programación: de 120 (2 min) a 320 ºC, a 10 ºC /min.
Flujo del gas portador (H2): 8 mL/min.
Temperatura del detector y el inyector: 320 ºC y volumen de inyección: 1 µL en modo
splitless.
La especificidad del método se comprobó por CG– Espectrometría de Masas (CG-EM). Se
utilizó un cromatógrafo de gases 6890N con detector selectivo de masas 5975 B Inert
acoplado a un sistema de cómputo y con columna capilar HP-5MS (30 m x 0,25 mm d.i., 0,25
µm de espesor de película, Agilent Technologies, CA, USA).
Programación: de 70 °C (1 min) a 180 a 20 °C/min, de 180 a 230 °C a 2 °C/min, y de 230 a
320 °C a 20 °C/min.
Temperatura del inyector: 300 ºC, y volumen de inyección: 0,5 µL en modo splitless. Flujo
del gas portador (He): 1 mL /min.
Temperaturas de la fuente, la interfase y el cuadrupolo fueron 250, 300 y 150 oC,
respectivamente.
La energía de ionización fue 70 eV. El espectro de masas fue adquirido continuamente de
40 a 800 m/z en modo scan.
Preparación de la muestra:
En un tubo de ensayos se pesaron, con exactitud de 0,1 mg, alrededor de 100 mg de D-004.
Se agregó 1 mL de la DPI, 3 mL de DME, 5 mL de n-hexano y se cerró herméticamente.
Se colocó en un termostato seco a 85 ºC durante 30 min con agitación vigorosa ocasional.
Se sacó del termostato y se dejó enfriar a temperatura ambiente.
Se adicionaron 3 mL de la disolución de NaOH. Se agitó en la zaranda durante 15min.
Se dejó reposar durante 2 min para separar las fases y se extrajo una alícuota de 1 mL de la
fase orgánica (superior) hacia un vial,
Se reconstituyó con 1 mL de hexano, se cerró y se agitó manualmente durante 30 s.
Finalmente se tomó 1 µL por la técnica de solvent-flush para el análisis por CG.6

Método de análisis cualitativo:

Como criterio de identificación por CG-DILL se determinó la retención relativa de cada uno de
los ácidos siguientes: C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C16:1, C16:0, C18:1 y C18:0, para lo cual
se tomó como referencia al patrón interno C13:0. La retención relativa determinada fue
comparada con la obtenida del análisis de sus patrones comerciales como ésteres metílicos.
La identificación fue corroborada por CG-EM a través de la comparación de los espectros de
cada AG con los de los patrones comerciales y los que aparecen en la biblioteca Wiley.
Los fragmentos característicos (principalmente, m/z 74, 87, 143) e iones moleculares (M+)
de los ésteres metílicos de los AG fueron examinados e interpretados.
Método de análisis cuantitativo:
La determinación cuantitativa se realizó por el método del patrón interno, previo cálculo de
los fi m a partir de la DMR y utilizando como referencia al patrón interno C13:0. Los ácidos
linoleico (C18:2) y linolénico (C18:3) se cuantificaron como ácido oleico (C18:1), para el ácido
C8:0 se utilizó el fi m calculado para el ácido C10:0 y para el ácido palmitoleico (C16:1) se
utilizó el fi m calculado para el ácido C16:0. El contenido de cada compuesto (Ci) en el D-004
se determinó por el método del patrón interno, 12 mediante la ecuación siguiente:

Validación Aplicabilidad del sistema:

Se realizaron seis réplicas de inyección de una muestra de D-004 siguiendo la preparación
descrita anteriormente. A partir de los cromatogramas obtenidos se determinó: la resolución
cromatográfica entre los ácidos C16:0-C16:1 (n = 3), la cual debía ser mayor o igual a 1; la
retención relativa de cada ácido (n = 3), la que debía coincidir con la calculada con cada
patrón y la repetibilidad de la inyección, para la cual el CV % de la cuantificación total (n = 6)
debía ser menor que 0,8 %.

Especificidad:
La especificidad del método fue determinada al comparar los cromatogramas del D-004, el
estándar interno y las muestras de D-004 sometidas a condiciones propicias a la ocurrencia
de degradación. Estas condiciones fueron: termólisis (103 ºC, 7 d), oxidación (1 g de D-004
en 1,5 mL de H2 O2 al 30 % a 25 ºC, 7 d), y fotolisis (254 nm a 25 ºC, 7 d); y se llevaron a
cabo en ampolletas de vidrio neutro, a las cuales se les insufló nitrógeno y se sellaron (n =
3). La pureza cromatográfica de las señales fue comprobada por CG-EM.

Linealidad:
El estudio constó de cinco puntos, con tres réplicas cada uno. Estos puntos representaron
el 50, 80, 100, 120 y 150 % de la masa de D-004 que se emplea en el análisis de las
muestras, por lo que se pesaron alrededor de 50, 80, 100, 120 y 150 mg de D-004 y
posteriormente, se procedió con la preparación descrita anteriormente. A partir de las masas
analizadas y las áreas obtenidas, se calculó la ecuación de regresión: y = b x + a, por el
método de los mínimos cuadrados. Para ello, se graficaron las relaciones de áreas obtenidas
(y = Ai /Api) en función de las relaciones de masas añadidas (y = mi /mpi), donde Ai y mi son
el área y la masa del total de AG y Api y mpi son el área y la masa del patrón interno. Se
realizaron pruebas estadísticas (p = 0,05) para comprobar la linealidad y proporcionalidad,
para lo cual se debían cumplir los criterios siguientes: coeficiente de correlación (r) ≥ 0,990,
coeficientes de variación de los factores de respuesta (CVf) y de la pendiente (CVb) ≤ 5 % y
≤ 2 %, respectivamente. Además, los límites de confianza del intercepto (a) debían incluir el
cero.

Exactitud:
La exactitud se evaluó por un estudio de recobrado en un intervalo de 80 a 120 % de la
concentración nominal de AG.
Se aplicó el método de Adición de Patrón, para lo cual se utilizó la DRA, la cual simula la
proporción en que se presentan estos AG en el D-004.
De esta disolución, se tomaron 1, 2 y 3 mL y se añadieron a tubos de ensayos (n = 3). Luego
se llevaron a sequedad a 40 °C con un flujo suave de N2 y se adicionaron 60 mg
aproximadamente de D-004. Se analizaron en paralelo las muestras de D-004 sin y con
adición de la mezcla patrón de AG. La diferencia de resultado de “muestra + patrón” menos
“muestra” se comparó con la cantidad añadida. Con el objetivo de comprobar si la
concentración afectaba los resultados se realizó una prueba de Cochran para p = 0,05. Los
recobrados fueron calculados [(cantidad encontrada/cantidad añadida) x 100 %] y se les
realizó una prueba t de Student (p = 0,05) para comprobar si existían diferencias
significativas con el 100 %, según la ecuación siguiente:

Precisión:
Este parámetro se determinó mediante ensayos de repetibilidad y de precisión intermedia
(dos analistas analizaron tres muestras independientes con cuatro réplicas en tres días
diferentes, en el mismo equipo).
Se calcularon los CV (%) de la determinación de cada ácido y del contenido total, y se halló
además, el límite de confianza (LC = media ± t x DE/n1/2) de la determinación del contenido
total de ácidos para p = 0,05.
Para determinar si hubo diferencias significativas, se realizó una prueba ANOVA de dos vías
(p = 0,05). Además, se consideró como criterio que los CV deberían ser ≤ 2 %.8-11

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
El procedimiento analítico permitió una determinación rápida, confiable y reproducible de
los AG que componen el D-004 ingrediente activo. Debido a que los fi m de los AG
individuales estuvieron alrededor de la unidad, por lo que se asumió que el fi m = 1 para el
cálculo cuantitativo de cada AG, lo cual coincide con lo descrito para el análisis de AG por
CG con DILL6, 7 y demuestra que en el proceso de inyección no ocurren efectos
discriminatorios. Al estudiar la aplicabilidad del sistema, se comprobó que la resolución
cromatográfica entre los ácidos C16:1 y C16:0 en las tres determinaciones fue mayor que el
límite de aceptación (1,0); lo cual garantizó una separación adecuada de las señales de
interés. La determinación del contenido total de AG en las seis réplicas de inyección presentó
un CV de 0,5 %, inferior al límite de aceptación (0,8 %). También, las retenciones relativas
calculadas (n = 3) coincidieron con las obtenidas para los patrones de referencia, todo lo cual
permitió comprobar que el sistema analítico cumplía con los criterios de aplicabilidad para ser
utilizado en la validación del método.

CONCLUSIONES:
El método analítico propuesto para la determinación del contenido de los AG en el D-004
ingrediente activo, cumplió con los requerimientos para considerarse validado, demostrando
ser específico, lineal, exacto y preciso.
De esta manera el método puede ser utilizado en el proceso de control de calidad y
estudios de estabilidad de este ingrediente activo.
Determinación de L-canavanina por cromatografía líquida de alta
resolución en fase reversa y por colorimetría.

La canavanina (ácido 2-amino-4-(guanidinooxy) butanoico) es el principal

aminoácido libre presente en el grano de canavalia (Canavalia ensiformis) y algunas
otras leguminosas.
Es un aminoácido no proteico análogo a la arginina. Sus propiedades tóxicas se
deben a esta similaridad estructural, ya que interfiere con el metabolismo de la
arginina, inhibe la síntesis de proteínas, bloquea las síntesis de RNA y DNA, afecta el
sistema inmune y es un potente antimetabolito que resulta tóxico a diferentes tipos de
organismos.
A pesar del efecto tóxico de la canavanina contenida en la canavalia, este frijol es
una fuente potencial de proteína y energía para los animales, por lo que se ha
intentado eliminar o reducir la cantidad de este componente por medio de tratamientos
tanto físicos como químicos, a niveles que permitan su inclusión en dietas
comerciales.
Cualquier intento de estudiar la eficacia de los tratamientos para detoxificación y el
efecto metabólico de la canavanina en animales o plantas depende de la
disponibilidad de métodos sensibles, específicos y rápidos de análisis, de ahí la
importancia de esta determinación.
El método más común de análisis de la canavanina está basado en la formación de
un compuesto cromóforo por reacción con pentacianoaminoferrato y su posterior
detección por espectofotometría.
Este método ha sido criticado por carecer de una especificidad absoluta y un umbral
elevado de sensibilidad. Como alternativa a los métodos colorimétricos, se ha
recurrido a técnicas más precisas y costosas, como la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) buscando aumentar la confiabilidad en la determinación de la
canavanina . Los métodos por HPLC para la determinación de aminoácidos y
compuestos aminados se han vuelto de uso rutinario en los laboratorios de nutrición
animal y con esto algunos métodos para la determinación de canavanina han sido
desarrollados, utilizando derivatización pre-columna con reactivos como Cloruro de
Dansilo (4) y OPA (o-ftaldialdehído) (5, 6), realizando la separación de los compuestos
en una columna de fase reversa para su posterior detección fluorimétrica.
El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método para la determinación de
canavanina por HPLC utilizando como agente derivatizante al DABSCl y comparar los
resultados con los obtenidos de manera simultánea por el método calorimétrico
descrito por Rosenthal.

MATERIALES Y MÉTODOS:
Cinco muestras diferentes de canavalia fueron tomadas para realizar este estudio.
Cuatro de ellas provenientes de procesos de ensilaje y una del grano crudo. Todas las
muestras se corrieron por cuatriplicado.

Preparación de la muestra:
Extracción:
Se pesó 1 g de muestra molida finamente y se le agregó 10 mL de agua destilada,
se agitó durante 10 min al cabo de los cuales se centrifugó por 10 min a 2000 g.
El sobrenadante fue extraído con un volumen igual de cloroformo y centrifugado por
10 min a 2000 g. La extracción con cloroformo fue repetida 2 veces más recuperando
la fase acuosa en todos los casos. El extracto obtenido fue utilizado en cada ocasión
para la determinación de canavanina por ambos métodos, realizando los análisis de
manera simultánea.

Análisis por HPLC:

Instrumentación:
El equipo consistió en un cromatógrafo de líquidos Beckman Modelo System Gold
con dos bombas para formación de gradiente y detector UV/VIS Modelo 166 con
lámpara de haló- geno, filtros de segundo orden y software para programación y
captura de los datos.
Las lecturas se hicieron a 436nm. La columna utilizada fue Ultrasphere ODS 4.6 mm
x 25 cm, Beckman.

Reactivos:
a) Acetonitrilo (grado HPLC)
b) Agua (grado HPLC)
c) Acetato de sodio 25 mM pH 6.5 con 4% de Dimetilformamida.
d) Bicarbonato de sodio 500 mM pH 8.1
e) Buffer de fosfatos 50 mM /etanol (1:1) pH 7
f) Dabs-Cl (Sigma St. Louis) 4 nmol/µL
g) L-Norleucina (Sigma St. Louis) 2.5 nmol/µL
h) L-Canavanina base libre (Sigma St. Louis) 2.5 nmol/µL
i) Etanol absoluto
 Procedimiento:
Una alicuota de 200 µl de cada extracto de canavalia y 500 µL de Norleucina se
colocaron en viales de 10 mL perfectamente limpios y secos
Se llevó a estufa a 50o C hasta sequedad y después se les agregó 400 µL de
bicarbonato de sodio 500 mM pH 8.1 y 400 µL de DABS-Cl 4 nmol/µL.
Se colocó en estufa a 70o C por 30 min, posteriormente se aforó el volumen a 5
mL con buffer de fosfatos/etanol 1:1 pH 7.0.
De esta solución 20 µL fueron inyectados al cromatógrafo.
Para la cuantificación de la canavanina se utilizó el método del estándar interno
(norleucina), integrando los picos de acuerdo a sus áreas.
Las lecturas se hicieron a 436 nm.
Las condiciones cromatográficas fueron las descritas en el siguiente cuadro:

Análisis colorimétrico

Reactivos:

a) Buffer de fosfatos pH 7.0

b) Persulfato de Amonio al 1%
c) Pentacianoaminoferrato (PCAF) al 1%
d) Canavanina 10 ìmol/ml Procedimiento.

Se utilizó 1 mL del extracto y 4 mL de agua destilada, añadiéndole 5 mL de buffer, 1

mL de persulfato y 0.5 mL de pentacianoaminoferrato.
La curva de calibración se construyó de acuerdo al cuadro siguiente.
Se dejó reposar por 60 min y se leyó en un espectofotómetro Beckman DU650 con
detector UV/VIS a 550 nm.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El cuadro siguiente muestra los resultados promedios obtenidos para las 5

muestras analizadas y las desviaciones estándar correspondientes a cada uno de los
métodos utilizados.

Existe cierta controversia para la cuantificación de L-canavanina mediante análisis

colorimétrico, dado el argumento de baja especificidad y sensibilidad, sin embargo en
este estudio, no se encontraron diferencias significativas entre este tipo de análisis y el
de separación cromatográfica utilizando cloruro de dabsilo como reactivo derivatizante
y detección UV/Vis.

El análisis de regresión no mostró diferencias significativas

Una de las ventajas del análisis de regresión empleado es que genera constantes que
son invariantes al cambiar ejes (simétricas sobre la unidad) y permite evitar el sesgo
que crea el utilizar regresión lineal clásica donde el error es asociado sobre el eje y.

La relación entre las determinaciones por ambos métodos fue descrita por la ecuación:

y = 0.0396 + 0.956x (Intervalo de confianza 0.782 - 1.168)

Aún cuando el método HPLC aquí descrito resultó en una buena separación de la
canavanina, este análisis al ser comparado con el método colorimétrico resulta más
laborioso, implica mayores tiempos de análisis y costo de reactivos y equipo
empleados.

Si consideramos que, de acuerdo a los resultados obtenidos no existen diferencias

significativas entre ambos métodos, el análisis colorimétrico de canavanina brinda una
buena alternativa rápida para la cuantificación de L-canavanina en etapas iniciales de
valoración de procesos físicos, químicos y fisiológicos que involucren este aminoácido.

El análisis por HPLC deberá ser utilizado cuando exista evidencia probada sobre
problemas de específidad por interferencia de algún compuesto y/o metabolito.