Influencia de las propiedades opto-electrónicas de nanopartículas de plata sobre la fluorescencia de un derivado de la fluoresceína

LBI
Laboratorio de Bioinorgánica Facultad de Química Universidad de la Habana
TRABAJO DE DIPLOMA
Influencia de las propiedades opto-electrónicas de

nanopartículas de plata sobre la fluorescencia de un
derivado de la fluoresceína
Autor: Greter Amelia Ortega Rodríguez

Tutor: Dr. Roberto Cao Milán
2012
A mis padres
Agradecimientos
Agradecimientos:
Aunque abatidos por el cansancio, los diplomantes gustosos escriben de último la

primera y más importante página de la tesis: los agradecimientos. No importa la
redacción, coherencia, posición de las comas; lo más importante es expresar la enorme y
sincera gratitud hacia todo aquel que nos ayuda.
Gracias a los profesores de la Facultad de Química de la Universidad de la Habana por

compartir sus conocimientos. A mi grupo, q 2007, de todos y cada uno me llevo una
enseñanza.
Es mi deber y además agradecer a todos los que me auxiliaron en mi trabajo científico:

al grupo LSO, Biomat (Nancy), a la profesora Margarita Suárez, por su dedicación; a
Mayra Granda; al personal de LUCES, que sin ellos hubiera sido imposible; a Anita,
por recibirme tan generosamente en el CIM, al proyecto MAEC (proyecto
A/031093/10) con el país Vasco, en especial a Maite.
Gracias a la familia del LBI que me acogió desde primer año y no me botó cuando
rompí el polalógrafo (solo fue un pequeño baño con agua….). Al profesor Cao por
exigirnos ser cada día mejor; a la profe Alicia, que como una madre educa a sus hijos
con paciencia y dulzura, a Darío, Rudy, mis compañeros, Jason. A la familia Cao Milán
por su hospitalidad y a Adiley por su gran apoyo.
A mis grandes amigos (no hay orden): Gabriela, Ana Margarita, Marcos y Carlos.
También, al piquete del LQCT, incluyendo Sandra y Alfredo.
En el plano muy personal a dos hombres que me encaminaron en la carrera de la

química y me entrenaron para la vida: Luis Guerra e Isidro Martínez, muchas gracias.
A María del Carmen y Miguel, gracias por su ayuda y cariño.
A toda mi familia (abuelos, primos, tíos), gracias por su apoyo. "A mi abuelito querido,
siempre estará conmigo."
A mi ángel de la guarda, contrincante de pesos pesados, amigo, hermano y papá,

Robertico y a mi tutor y colega Dr. Roberto Cao Milán.
A Julio, por ser mi mano derecha y mi corazón izquierdo.
Sería imposible expresar con palabras o magnitudes el agradecimiento hacia los mejores
padres del mundo, los míos. A ellos va dedicada mi tesis, mi carrera científica y mi
vida.
Índice
Índice
Resumen 1
Abstract 2
Capítulo 1 Introducción 3
Capítulo 2 Revisión bibliográfica

2.1 Nanopartículas. Definición y propiedades. 5
2.2 Nanopartículas de plata. 5
2.3 Nanopartículas de plata. Propiedades químicas. 6
2.4 Síntesis de nanopartículas de plata. 7
2.5 Métodos de obtención con citrato. 8
2.5.1 Mecanismo de formación de las AgNP a través de la reducción y
estabilización con citrato de sodio. 9
2.6 Resonancia plasmónica superficial de nanopartículas metálicas. 11
2.7 Bandas de Plasmones Superficiales. 12
2.8 Bandas de Plasmones Superficiales. Modelo de Mie. 12
2.9 Factores que afectan la SPB de las nanopartículas metálicas
esféricas. 14
2.10 Campos electromagnéticos asociados a las SPR de nanopartículas
metálicas. 15
2.11 Influencia de las nanopartículas metálicas sobre la fluorescencia de
especies asociadas a su superficie. 16
2.11.1 Fluorescencia. 16
2.11.2 Atenuación de la fluorescencia de fluorósforos ubicados a distancias
menores de 5 nm respecto a la superficie de una nanopartícula. 17
2.11.3 Incremento de fluorescencia de fluorósforos ubicados a distancias de
5-25 nm respecto a la superficie de una nanopartícula. 18
2.12 Ciclodextrinas (CDs). 20
2.13 Complejos de inclusión. 21
Capítulo 3 Parte experimental

Reactivos 22
Equipos utilizados 22
Síntesis de los compuestos utilizados:
3.1 Síntesis de fluoresceína funcionalizada con un grupo adamantano
(Fluo-Ada). 23
3.2 Síntesis de la cisteamina (cis). 23
3.3 Síntesis de la βCD funcionalizada con cisteamina (cis-βCD). 23
Índice
3.4 Síntesis de nanopartículas de plata con citrato de sodio (AgNP-Cit). 24

3.4.1 Estudio cinético de la reacción de formación de AgNP-Cit. 24
3.5 Síntesis de las AgNP recubiertas con cis-βCD. 25
3.6 Síntesis de las AgNP recubiertas con polímeros de polietilenimina
(PEI). 25
3.7 Estudio de la influencia de las propiedades opto – electrónicas de las
AgNP sintetizadas sobre la fluorescencia del Fluo-Ada. 25
3.8 Metodología para detectar HSA a partir del sistema (AgNP-cis-
βCD)@(Fluo-Ada). 26
Capítulo 4 Resultados y Discusión.

4.1 Síntesis de los compuestos utilizados o sus precursores. 28
4.1.1 Funcionalización de la fluoresceína con un grupo adamantano (Fluo-
Ada). 27
4.1.2 Síntesis de la cisteamina (cis) 30
4.1.3 Síntesis de la βCD funcionalizada con cisteamina (cis-βCD). 31
4.1.4 Síntesis de nanopartículas de plata con citrato de sodio AgNP-Cit. 31
4.1.5 Estudio cinético de la reacción de formación de AgNP-Cit. 33
4.1.6 Modificación de la superficie de las AgNP con las distintas cubiertas
orgánicas de derivados de βCD. 35
4.2 Estudio de la influencia de las nanopartículas de plata sintetizadas
sobre la fluorescencia de la Fluo-Ada. 38
4.3 Detección por fluorescencia de albúmina serum humana (HSA) a
través del sistema (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada). 43
5 Conclusiones 48
6 Recomendaciones 49
Bibliografía 50
Anexos 53
Resumen 1
Resumen
La convergencia entre las novedosas propiedades de las nanopartículas con las tradicionales de
moléculas asociadas a su superficie permite un gran número de nuevas aplicaciones. En este
sentido, se ha estudiado cómo las propiedades opto-electrónicas de nanopartículas de plata
(AgNP) modulan la intensidad de luz por fluorescencia, emitida por fluorósforos asociados a su
superficie. A distancias entre el fluorósforo y la superficie metálica de las AgNP entre 1 y 5 nm,
la fluorescencia del primero disminuye. Sin embargo, para separaciones entre 5 y 25 nm, las
AgNP inducen un incremento de la fluorescencia del fluorósforo asociado.
En este trabajo se reportan las síntesis de AgNP funcionalizadas con diferentes cubiertas
orgánicas con grosores de 1, 5 y 10 nm y provistas con residuos de β-ciclodextrina (βCD).
Posteriormente se asociaron supramolecularmente sobre su superficie, un derivado de la
fluoresceína con un grupo adamantano (Fluo-Ada). Los compuestos sintetizados fueron
caracterizados por espectrometría de Masa, TEM, y espectroscopías: FT-IR, UV-Vis, RMN-1H,
RMN-13C y de fluorescencia, de acuerdo con el caso.
El proceso de inclusión del Fluo-Ada en la cavidad de la βCD fue estudiado por espectroscopía
de fluorescencia.
La AgNP modula la fluorescencia del Fluo-Ada asociado supramolecularmente, según las

distancias relativas entre ambas especies. Cuando el Fluo-Ada interacciona con los receptores de
βCD localizados a 1 nm de la superficie de AgNP, la fluorescencia disminuye en un 27% debido
a los procesos de transferencia electrónica (ET). A distancias mayores entre AgNP y Fluo-Ada
este fenómeno es menos favorable y las propiedades ópticas de las nanopartículas provocan un
incremento de la luz emitida del Fluo-Ada, distanciado a 5 y 10 nm, en un 19 % y 30 %
respectivamente.
También fue demostrado que si se adiciona albúmina humana al sistema supramolecular en el

cual el Fluo-Ada está asociado a 1 nm de la AgNP, el derivado de fluoresceína se desplaza de su
posición, a distancias en las cuales se favorece el incremento de la fluorescencia. Este resultado
tiene gran importancia en el desarrollo de nuevos tipos de nanobiosensores ópticos.
Abstract 2
Abstract
The singularity of nanoparticles converges with the known properties of molecules associated to
them permitting a wide variety of new applications. In this sense, it has been observed that the
novel opto-electronic properties of silver nanoparticles (AgNP) can modulate the fluorescence of
dyes capping their surfaces. AgNP can quench the fluorescence of dyes located at a distances of
1-5 nm from the surface. On the other hand, if the fluorescent specie is situated at a distance of
5-25 nm, the effect of the nanoparticle induces an enhancement of fluorescence.
Here we report the synthesis of AgNP capped with different organic shells with thickness of 1, 5
or 10 nm, and provided of β-cyclodextrin (βCD) residues. A fluorescein derivative with an
adamantane (Fluo-Ada) moiety was associated to these nanoparticles by supramolecular
interactions. Every compound was characterized by Mass spectrometry, TEM, FT-IR, UV-Vis,
1
H-NMR, 13C-NMR, fluorescence spectroscopy according the case.
The supramolecular inclusion of Fluo-Ada in the cavity of β-cyclodextrin was followed

fluorospectrometrically.
The presence of the AgNP rules the fluorescence of Fluo-Ada supramoleculary attached to the
former according the distance between them two. When Fluo-Ada interacts with a βCD receptor
located at 1 nm from the surface of AgNP its fluorescence is quenched in a 27% due to an
electron transfer process (ET). For bigger distances between AgNP and Fluo-Ada the ET tends to
be less favored and the optic properties of the former enhances the fluorescence of the latter in
19% and 30% for distance of 5 and 10 nm respectively.
It was also demonstrated that if the supramolecular asociation among AgNP, with thickness of 1
nm and Fluo-Ada is set to interact with human serum albumin, the fluorescein derivative is
displaced from the nanoparticle surface up to distances at which of enhance of the fluorescence
process takes place. These results have great importance in the development of new kinds of
optic nanobiosensors.
Capítulo 1 3
Introducción
1. Introducción
Uno de los principales exponentes del desarrollo de las nanociencias son las nanopartículas
metálicas, que producto de sus novedosas propiedades físico-químicas, actualmente están
siendo utilizadas en el desarrollo de nuevos materiales, dispositivos y metodologías de
trabajo con impacto en numerosas ramas de la ciencia y la tecnología.
Por otro lado, en los últimos 15 años el desarrollo de metodologías basadas en procesos
relacionados con el fenómeno de fluorescencia, presente en algunos compuestos orgánicos,
ha sido fundamental en el campo de desarrollo de sistemas de diagnósticos para la medicina
y la biotecnología. Por ejemplo, en Cuba se utilizan ensayos ELISA con fluorescencia para
el diagnóstico de enfermedades como dengue, VIH, hepatitis, tumores cancerígenos,
padecimientos neonatales, etc.
Sin embargo, el empleo de estos métodos es usualmente limitado por procesos de auto-
atenuación de la fluorescencia, bajo rendimiento cuántico de las fluorósforos, etc., que
afectan la sensibilidad de los métodos de diagnóstico.
Entre los objetivos de estudio de las nanociencias se encuentra la combinación sinérgica de

las propiedades físico-químicas de las nanopartículas, con aquellas de las especies
moleculares ya reportadas. En este sentido, vale destacar que las nanopartículas metálicas
poseen propiedades opto-electrónicas, que pueden provocar tanto una disminución de la luz
emitida por fluorescencia de aquellos fluorósforos que se encuentren ubicados a distancias
de 0-5 nm, como un incremento de la fluorescencia, si estos fluorósforos se encuentran a
distancias de 5-25 nm de su superficie. Ambas propiedades han sido utilizadas por separado
en los últimos años para desarrollar nuevos sistemas de detección de biomoléculas.
Expuesto lo anterior nos hemos planteado como problema científico:
La utilización simultánea de los efectos, atenuantes y de incremento, que ejercen las

nanopartículas metálicas sobre la fluorescencia de fluorósforos asociados a distintas
distancias de su superficie, como fundamento para el desarrollo de nuevos tipos de bio-
sensores ópticos de alto contraste.
Para resolver el problema científico anteriormente descrito nos formulamos desarrollar una
prueba de concepto basado en la hipótesis siguiente:
Si se hace interactuar una biomolécula con un sistema, compuesto por una nanopartícula de
plata y un derivado de la fluoresceína asociado supramolecularmente, se generará un re-
arreglo estructural, del mencionado sistema, que provocará un incremento abrupto de su
fluorescencia y que por tanto, servirá como señal de detección de la presencia de dicha
biomolécula.
Capítulo 1 4
Introducción
Para demostrar nuestra hipótesis nos trazamos el objetivo principal siguiente:
Diseñar y sintetizar un sistema supramolecular compuesto por nanopartículas de plata y un

derivado de fluoresceína, que al interactuar con biomoléculas brinde altos contraste en la
variación de la intensidad de luz emitida por fluorescencia.
Para cumplimentar nuestro objetivo principal nos trazamos objetivos más específicos
como:
1. Sintetizar nanopartículas de plata (AgNP) recubiertas con derivados de β-ciclodextrina

enlazados a espaciadores de longitudes de 1, 5 y 10 nm.
2. Obtener un derivado de fluoresceína con un grupo adamantano asociado (Fluo-Ada) de
alta afinidad por la cavidad de la ciclodextrina.
3. Caracterizar los compuestos obtenidos por espectrometría de Masa, microscopía de
transmisión electrónica y espectroscopías: FT-IR, UV-Vis, RMN-1H, RMN-13C y de
fluorescencia, de acuerdo con el caso.
4. Determinar mediante espectroscopía de fluorescencia, los cambios de fluorescencia del
Fluo-Ada al hacerlo interaccionar supramolecularmente con las AgNP obtenidas en el
objetivo 1.
5. Determinar mediante espectroscopía de fluorescencia, los cambios que se generan al
hacer interactuar el sistema compuesto por las AgNP, que poseen el derivado de
ciclodextrina ubicado a 1 nm de su superficie y Fluo-Ada, con la albúmina humana.
6. Valorar si estos resultados son adecuados para la elaboración de un sistema de
detección de biomoléculas de alto contraste.
Capítulo 2 5
Revisión bibliográfica
2. Revisión bibliográfica.
2.1 Nanopartículas. Definición y propiedades.
Las nanopartículas se definen como partículas con dimensiones entre 1 y 100 nm. Las
mismas presentan novedosas propiedades físicas, químicas y biológicas, diferentes a las de
la materia en escala masiva y que han recibido considerable atención para un gran número
de aplicaciones.1,2
Las notorias diferencias entre las propiedades químico-físicas de la materia en la escala

nanométrica están basadas fundamentalmente, en: i) la alta relación superficie/volumen de
estos compuestos,3 ii) en los efectos de confinamiento cuántico4 y iii) en los fenómenos
físicos asociados a su interacción con la luz. 5 Estas características anteriormente
mencionadas dependen en la mayoría de los casos de factores como la forma, tamaño y
naturaleza de las nanopartículas. 6-8
2.2 Nanopartículas de plata.
Entre las nanopartículas metálicas que tienen una interesante combinación de sus
propiedades físicas y químicas se encuentran las de plata.
Figura 2.1. Lustre que data de 1525 del maestro Giorgio Andreoli en
Gubbio que representa Hércules y el centauro Nessus.
La plata coloidal o nanopartículas de plata (AgNP) se conocen desde los tiempos del
imperio romano y han sido utilizadas para colorear cristales con matices de amarillos
intensos. En el siglo XV, artesanos italianos en Gubbio y Deruta preparaban porcelanas
llamadas lustres que contenían nanopartículas de plata y cobre (fig. 2.1).
Las nanopartículas de plata han recibido gran atención en los últimos años debido a sus
interesantes propiedades opto-electrónicas. En la actualidad, las AgNP presentan
potenciales aplicaciones en electroquímica,9 catálisis10-12 y desarrollo de sensores.13
Recientemente, se ha comenzado una nueva estrategia para el desarrollo de biosensores

mediante el empleo de AgNP. Estas nuevas metodologías están basadas fundamentalmente,
en la combinación del fenómeno de la resonancia plasmónica (se origina al interactuar las
nanopartículas metálicas con la luz, ver más abajo) de las AgNP y procesos de
reconocimiento molecular.14
Capítulo 2 6
2.3 Nanopartículas de plata. Propiedades químicas.
Las nanopartículas de plata son generalmente estables bajo condiciones ordinarias, aunque
son considerablemente más reactivas que las de oro. Dada su naturaleza de ácido blando
(teoría de Pearson), las AgNP son capaces de quimisorber fuertemente todos los
compuestos sulfurados, en los que el átomo de azufre sea blando.15 Dicha interacción
ocurre solamente en la superficie de la nanopartícula, lo cual origina una estructura en
forma de monocapa molecular del compuesto sulfurado. La fuerte interacción con esta
clase de compuestos se debe, en gran medida, al solapamiento orbitálico entre el HOMO
del tiol con los “orbitales cristalinos” vacíos de la nanopartícula.16 Otros ligandos afines a
las nanopartículas de plata son las alquilaminas,17 silanos18 y fosfinas,19 que se quimisorben
mediante interacciones parecidas a las de los tioles.
Otra clase de ligandos como sales de ácidos grasos, el ácido cítrico y distintos tipos de
polímeros suelen asociarse a las AgNP por procesos de fisisorción.20 La naturaleza de esta
interacción es mayoritariamente electrostática entre el grupo carboxilato, por ejemplo, e
iones Ag+ quimisorbidos en la superficie de la nanopartícula metálica. (Téngase en cuenta
que la plata es un elemento lo suficientemente blando como para formar aductos tales
como el Ag2+, Ag42+, etc.21 Por tal razón, no debe resultar difícil concebir una
nanopartícula de plata con iones Ag+ adsorbidos). Como en estos casos, la interacción
ocurre entre un ligando duro y un metal blando, la misma es mucho más débil que para el
caso de la interacción con tioles, alquilaminas, silanos, etc.
Las propiedades químicas mencionadas se emplean en el diseño de metodologías para la

síntesis de AgNP funcionalizadas con moléculas relativamente caras o complicadas de
obtener.22 En un primer paso se suele sintetizar las AgNP recubiertas con el ión citrato (ver
más abajo) y luego, este ligando se intercambia por una molécula de interés que contenga
un residuo tiolado (para asociarse a la superficie). Normalmente, la síntesis de AgNP con
una forma y diámetro determinado, dependen en gran medida de la concentración y del tipo
de ligando que las recubre (ver más abajo). Por tal razón, resulta conveniente hacer la
síntesis de las AgNP protegidas con un ligando barato, en concentración relativamente alta
(1 – 0.1 mol/L), y luego este ligando se sustituye por el compuesto de interés en
concentraciones mucho más bajas (0.01-10-6 mol/L). Este tipo de reacciones se llaman
reacciones de intercambio de ligando como para el caso de compuestos de coordinación.
Capítulo 2 7
2.4 Síntesis de nanopartículas de plata.
Durante las dos últimas décadas han sido reportados numerosos métodos de síntesis de
nanopartículas de plata, con riguroso control de sus formas y tamaños que, a su vez,
condicionan las propiedades ópticas y/o electrónicas que se desean. Los métodos de síntesis
de AgNP pueden ser variados,23-30 aunque de manera general, la estrategia que se sigue es
reducir un compuesto fuente de Ag, como el AgNO3, en presencia de agentes protectores
como tioles, alquil-aminas, silanos, citrato de sodio, etc.
Los reductores pueden ser borohidruro de sodio (NaBH4), hidracina, el propio citrato de
sodio o disolventes, como etanol, dimetilformaamida, etc.31
La función del agente protector es recubrir la nanopartícula e inhibir el proceso de

crecimiento y aglomeración del cristal.
Para el caso de las AgNP recubiertas con compuestos tiolados (alquilaminas, fosfinas, etc),
como el enlace Ag-SR es tan estable, la monocapa impide la colisión entre dos (o más)
nanopartículas de plata, con la formación de un enlace metálico y la generación de una
estructura de mayor tamaño. La naturaleza de estos ligandos protectores pueden conferirle,
a su vez, solubilidad a las partículas en determinados medios: aquellos ligandos que posean
grupos hidrofóbicos tienden a formar AgNP solubles en disolventes orgánicos. Por el
contrario los que, como el ácido 11-mercaptoundecanoico presenten grupos hidrofílicos son
solubles en agua, metanol, DMSO, otros (fig. 2.2).
Figura 2.2: Representación de AgNP

recubiertas por monocapas protectoras que
impiden la coalescencia de las
nanopartículas.
La forma en que los compuestos como el citrato de sodio estabilizan a las AgNP se debe,
fundamentalmente, a interacciones del tipo electrostática. El citrato de sodio, fisisorbido
sobre las AgNP, forma una doble capa eléctrica en la que existe un exceso de carga
negativa en la superficie de la nanopartícula, que repele a las otras vecinas (fig 2.3).
Capítulo 2 8
Figura 2.3: a) Esquema que representa la doble capa eléctrica de las AgNP recubiertas con
el ion citrato, según el modelo de Gouy-Chapman-Stern. b) Estabilización electrostática
para AgNP recubiertas con el ion citrato, gracias a la doble capa eléctrica.32
Como en este trabajo se utilizó, para la síntesis de AgNP, el método de reducción y

estabilización con Na3Cit, se brindarán más detalles de los procesos químicos involucrados
en esta reacción.
2.5 Métodos de obtención con citrato.
Una de las rutas sintéticas más estudiadas y utilizadas para la obtención de AgNP es el
método de Turkevich.33 En el procedimiento se emplea al citrato de sodio con doble
función, como reductor y como estabilizante.
Típicamente, se obtienen nanopartículas de plata estables cuando una solución acuosa de

AgNO3 a concentraciones de 10-4-10-3 mol/L es calentada a ebullición en presencia de
citrato de sodio a 5*10-4-0.01 mol/L. Cuando se utilizan menores concentraciones del
citrato, las cargas negativas sobre las superficies de las nanopartículas solo son suficientes
para neutralizar la carga positiva de la esfera metálica (iones Ag + adsorbidos sobre la
AgNP) y no para repeler a partículas vecinas. En estas condiciones existen altas
probabilidades que las nanopartículas colisionen para formar estructuras de mayor tamaño.
Por tal razón, a bajas concentraciones de citrato de sodio se obtienen AgNP con muchas
imperfecciones y gran dispersión de tamaños (fig. 2.4).
A concentraciones mayores se obtiene un resultado similar, pero por una causa distinta: un
incremento de la concentración de iones citrato eleva la fuerza iónica del medio por lo cual,
la doble capa eléctrica que mantiene dispersas las AgNP, tiende a estrecharse (fig 2.3). El
estrechamiento de la doble capa eléctrica provoca que las nanopartículas se agreguen y en
un segundo paso, coalescan (fig. 2.4).34
Capítulo 2 9
El tiempo de reacción de los iones Ag+ con citrato de sodio, en un sistema a reflujo es un
factor importante para lograr la total reducción de la plata. Algunos reportes evidencian
que únicamente con altas concentraciones de citrato ocurre la total reducción de los iones
Ag+.35
Figura 2.4: Microscopías de

transmisión electrónica (TEM)
de AgNP con diferentes
concentraciones de citrato de
sodio y 1*10-3 mol/L de AgNO3.
Las AgNP sintetizadas por este método suelen ser relativamente grandes (10 a 100 nm) y
con estructuras facetadas, cuyas caras están compuestas por planos tipo 111 bien definidos.
2.5.1 Mecanismo de formación de las AgNP a través de la reducción y estabilización

con citrato de sodio.
Para dilucidar el mecanismo de formación de AgNP por este método se han hecho
experimentos especiales a partir de la radiólisis del isopropanol en agua. Para ello, partieron
de soluciones acuosas de Ag+ (1*10-3 mol/L) y de citrato de sodio como estabilizante a
varias concentraciones. El reductor de los iones Ag+ empleado en estos estudios fue el
isopropanol sometido a procesos de radiólisis (genera radicales de marcado carácter
reductor).34
Los resultados arrojaron que en un primer paso la especie reducida Ag0, ácido blando,
interacciona con un ion Ag+ para formar la especie (Ag)2+. Luego, este aducto puede
interaccionar con otros para generar cúmulos o clústeres de plata de mayor tamaño, pero
menores que 1 nm y casi siempre con carga positiva (Ag42+, Ag9+…Agx+). Dichos clústeres
interaccionan con el anión citrato para formar especies más complejas (Agx-Cit) y donde el
citrato se encuentra en un equilibrio citrato adsorbido con citrato en disolución (ecuación
a).
Capítulo 2 10
A bajas concentraciones (5*10-5 mol/L), ocurre que la cantidad de citrato adsorbido sólo
alcanza para neutralizar las cargas positivas de los clústeres. Esta neutralización favorece el
crecimiento de los clústeres por condensación. Estos procesos se denominan de
condensación en semejanza a pequeñas gotas dispersas que forman otras más grandes. La
condensación se distingue de la coalescencia porque en ella se plantea una liberación del
exceso de iones Ag+ al formar partículas más grandes21 (ecuación b).
Es decir, los clusters de Agx+ son las semillas de formación de partículas más grandes por
condensación y este proceso se designa como mecanismo de crecimiento tipo I. Los iones
Ag+ liberados tienden a reducirse en solución y a formar los aductos mencionados, que
luego interactúan con otros clústeres o nanopartículas haciéndolas crecer por condensación.
Si la concentración de citrato llegara a ser muy baja, entonces las nanopartículas formadas
podrán crecer, en un segundo paso, por procesos de coalescencia. (En estos casos la
colisión no implica pérdida de iones Ag+. Las partículas se unen a través de enlaces
metálicos y generan estructuras de mayor tamaño).
Para concentraciones entre 1*10-3-0.01 mol/L de citrato, ocurren los pasos a y b, pero
durante el proceso de condensación se forma un clúster Agm-Cit con un tamaño crítico (≈ 1
nm), el cual es extremadamente estable. En estas condiciones los clústeres de plata se
encuentran recubiertos con cantidades apreciables de citrato en forma de doble capa
eléctrica (fig 2.3). Esta capa de iones citrato impide por repulsiones electrostáticas, la
colisión entre distintos Agm-Cit, como ya se explicó anteriormente y por tanto, anula el
crecimiento de las partículas por el mecanismo tipo I. Por tal razón, el efecto de esta doble
capa eléctrica hace que, el aumento de tamaño de las partículas ocurra únicamente por la
adsorción y reducción sucesiva de iones Ag+ en la superficie del clúster Agm-Cit. Téngase
en cuenta además, que las Agm-Cit tendrán un exceso de carga negativa en su superficie
que favorece la migración de iones Ag+ hacia la misma. Este mecanismo de reacción es
conocido como mecanismo de crecimiento tipo II o mecanismo de Ostwald (fig 2.5).36
Figura 2.5:
Mecanismos de
formación de
las AgNP con
citrato de sodio
como reductor
y estabilizador.
Capítulo 2 11
2.6 Resonancia de plasmones superficiales de nanopartículas metálicas.
Entre las propiedades más interesantes que muestran en general las nanopartículas de
metales nobles, se encuentran las ópticas. Las nanopartículas de los metales acuñables y
representativos, al interactuar con la luz, pueden presentar un fenómeno denominado
resonancia de plasmones superficiales (surface plasmon resonance, SPR de las siglas en
inglés).
Al irradiarse una nanopartícula metálica de dimensiones comparables a las longitudes de

onda de la radiación incidente, puede ocurrir la polarización colectiva de sus electrones de
conducción. Los modelos asumen para nanopartículas esféricas, que las cagas positivas en
la superficie se encuentran estáticas y los electrones libres se desplazan según el campo
externo aplicado.37 De esta forma se crea una diferencia de potencial entre los límites de la
red cristalográfica de la nanopartícula, que a su vez, genera fuerzas restauradoras. Como
consecuencia de este fenómeno puede ocurrir que los electrones oscilen con una frecuencia
determinada. Si la frecuencia del movimiento de los electrones se acopla a la de la
radiación incidente se origina el fenómeno de resonancia u oscilación de plasmones
superficiales,38 el cual es descrito por modelos de dipolos y multipolos.
Cuando las partículas irradiadas presentan dimensiones considerablemente más pequeñas

que la radiación incidente, el movimiento de los electrones se puede representar como un
dipolo eléctrico oscilante (fig. 2.6 a).
Por otra parte, si las dimensiones de las nanopartículas son comparables con la longitud de
onda de la radiación incidente, puede ocurrir que varias porciones de la partícula se
encuentren con la componente del campo eléctrico en sentidos contrarios. En este caso, la
oscilación electrónica en la nanopartícula tiene que ser descrita por un modelo de
multipolos (más comúnmente por cuadrupolos) en lugar de dipolos (fig. 2.6 b).39
Experimentalmente se ha observado que este tipo de efectos ocurre fundamentalmente
cuando las partículas tienen tamaños mayores de 40 nm.
Figura 2.6. Esquema de la resonancia u oscilación plasmónica superficial descrita por un modelo de
dipolos (a) y cuadrupolos (b).
Capítulo 2 12
El movimiento de los electrones producido por la interacción de la luz con la nanopartícula

ocasiona siempre dos procesos: la absorción y dispersión de la radiación incidente. Cuando
las AgNP son pequeñas (menores que 40 nm) predominan los procesos de absorción de la
luz, mientras que para partículas más grandes prevalece la dispersión.
2.7 Bandas de Plasmones Superficiales.
Como estos procesos de resonancia plasmónica tienen elevadísimas probabilidades, las

AgNP presentarán bandas intensas en los espectros UV-Vis (para partículas bien grandes
puede llegar a ser Vis-NIR). Estas bandas se denominan bandas de plasmones superficiales
(surface plasmon band, SPB de las siglas en inglés)4 y presentan coeficientes de extinción
aproximadamente 105 veces mayores que los cromóforos orgánicos convencionales. 40 La
posición y forma de las SPB dependen de varios factores como: son naturaleza, tamaño,
geometría y recubrimientos de las nanopartículas.41
2.8 Bandas de Plasmones Superficiales. Modelo de Mie.
En 1908 Mie presentó la solución de las ecuaciones de Maxwell para el caso de partículas
esféricas durante su interacción con la luz.42 Con esta teoría, Mie pudo describir los
coeficientes de extinción, así como su componente absortiva ( ) y dispersiva ( ), en
los espectros UV-Vis de partículas esféricas de tamaño arbitrario. En realidad, las
soluciones exactas de las ecuaciones de Maxwell son posibles para 11 geometrías de alta
simetría. Para partículas de baja simetría se utilizan métodos numéricos para su
descripción.43
La principal suposición de la teoría de Mie era que la partícula y el medio que la rodea eran
homogéneos y por tanto, podían ser descritos en términos de las funciones dieléctricas de
su forma masiva.
Cuando la luz interacciona con una nanopartícula esférica, de radio R, se producen en su

superficie multipolos eléctricos que, para su descripción matemática, deben ser clasificadas
según las condiciones siguientes: i) Cuando 2R λ ( : es la longitud de onda de la
radiación incidente) se dice, que la nanopartícula se encuentra en régimen cuasiestático. En
estas condiciones el campo eléctrico de la radiación incidente puede ser considerado
constante y por tanto, se genera una polarización plasmónica homogénea de los electrones
de la partícula y que puede ser descrita por dipolos. ii) Cuando 2R λ, la nanopartícula se
encuentra en régimen dinámico con un desplazamiento multipolar de sus electrones
(cuadrupolos).38 En la práctica, las AgNP con diámetros menores que 40 nm se pueden
considerar francamente en régimen cuasiestático y a mayores tamaños en régimen
dinámico.44
Capítulo 2 13
En nuestro caso, las AgNP sintetizadas fueron más pequeñas que las longitudes de onda de
la radiación a la cual resuenan. Por tal razón, se entendió necesario abordar algunos
aspectos de los modelos matemáticos reportados en la literatura, para describir sus
propiedades ópticas en régimen cuasiestático. Estas expresiones se utilizarán más adelante
para la explicación de algunas propiedades ópticas de interés.
A partir de las consideraciones del régimen cuasiestático y de las representaciones del

campo eléctrico y magnético por las ecuaciones de Mawell, Mie pudo describir el
coeficiente de extinción (σext) y la función dieléctrica de la partícula esférica ( ), de
radio R, según las expresiones siguientes (ecuación 1 y 2):45
Donde V es el volumen de la esfera, c es la constante de velocidad de la luz, es la

constante dieléctrica real del medio y y son los componentes real e
imaginario de la función dieléctrica de la esfera :
Es importante notar que la función dieléctrica de la partícula depende no solo de la

frecuencia de la luz incidente (ω), sino del tamaño de la partícula. Dicha dependencia se
hace aún más notable para nanopartículas metálicas mayores de 40 nm. En estos casos, en
el proceso de resonancia plasmónica los fenómenos de dispersión de la luz suelen ser
dominantes frente a los de absorción ( .46
En la expresión 1, si es débilmente independiente de ω, el valor de se hace máximo,

y por tanto la intensidad de la SPB también, cuando la condición de resonancia es
satisfecha (expresión 3).
El espectro de extinción UV-Vis para N partículas metálicas idénticas por unidad de

volumen es determinada a través de la expresión 4, donde “d” es el paso óptico.
Cuando las nanopartículas son polidispersas, con una distribución de tamaños

descrita en histogramas), la función se remplaza por la integral:
Capítulo 2 14
2.9 Factores que afectan la SPB de las nanopartículas metálicas esféricas.
De las expresiones 1, 3 y 5 se puede inferir que: la posición, intensidad y ancho de las SPB
dependen de la función dieléctrica de las nanopartículas y del entorno que las rodea, así
como de su distribución de tamaños.
La función dieléctrica de un metal está fundamentalmente gobernada por la estructura

electrónica del mismo. Por ejemplo, para estimar el valor de las componentes y
de la función dieléctrica de la nanopartícula, se determinan las posibles
transiciones de los electrones ubicados en niveles de la banda d y s hacia niveles vacíos, por
encima del nivel de Fermi (banda s o p) (fig 2.7). 46-48
Figura 2.7. Representación esquemática de los

procesos de excitación electrónica de los
electrones s y d de la banda de conducción.
Como la constante dieléctrica del metal depende de la estructura electrónica del mismo,
esta magnitud puede ser modificada cuando las nanopartículas presentan adsorbatos como
tioles, aminas, fosfinas, etc.40 Como se explicó anteriormente, las AgNP pueden
quimisorber compuestos sulfurados mediante interacciones que incluyen solapamiento
orbitálico entre el HOMO del tiol con los orbitales de la banda SP de la nanopartícula. Esta
nueva combinación genera una nueva banda híbrida sp(metal)-HOMO(compuesto
sulfurado) y por tanto, una función dieléctrica distinta de la partícula desnuda. Por tal
razón, la formación de monocapas de tioles sobre las AgNP produce corrimientos
batocrómicos de la SPB. 41, 49,50
De la expresión 3 puede verse que la posición del máximo de las SPB de las nanopartículas
metálicas está determinada además, por la función dieléctrica del medio que la rodea. Así,
las nanopartículas metálicas dispersas en agua tendrán una SPB ubicada en posiciones
distintas a si se encuentran disueltas en un disolvente orgánico. De forma parecida, si se
recubren las partículas con distintos dieléctricos (Ej, polímeros, SiO 2, TiO2, etc), con el
resto de los parámetros constantes, se observará que sus SPB estarán ubicadas en
posiciones distintas.
Cabe destacar que este efecto, aunque tiene una consecuencia parecida al recubrimiento con
tioles la causa es totalmente distinta. Para el caso de las partículas recubiertas con tioles, se
afecta considerablemente la función dieléctrica del centro metálico.
Capítulo 2 15
Para el caso del recubrimiento de las nanopartículas con polímeros, SiO2, etc., apenas hay
solapamiento orbitálico entre los niveles electrónicos del centro metálico con los de la
cubierta. Por tal razón, la posición de la SPB está determinada por la constante dieléctrica
del dieléctrico y por el espesor de la cubierta.
Como ya se explicó en el sub-epígrafe 2.8, la intensidad de las bandas de resonancia

dependen de la condición de resonancia y por tanto, de la función dieléctrica de la
nanopartícula y del entorno que la rodea.
Según la expresión 5, el ancho de la banda de resonancia plasmónica será mayor mientras

mayor sea la dispersión en la distribución de tamaños de las nanopartículas. Como la
constante dieléctrica de la partícula metálica es función del radio de la partícula, la
condición de la expresión 3 se verá satisfecha para distintos valores de R y la SPB se hará
más ancha.
2.10 Campos electromagnéticos asociados a las SPR de nanopartículas metálicas.
La polarización de los electrones durante la resonancia plasmónica induce un campo

electromagnético sumamente intenso sobre o cerca de las nanopartículas metálicas. El
campo asociado al movimiento electrónico en la superficie de las nanopartículas se describe
en términos de oscilación de dipolos (aproximación cuasiestática) o cuadrupolos
(aproximación dinámica) (fig. 2.8).51, 52
Figura 2.8: Se presenta el contorno

del campo eléctrico de
nanopartículas de plata esféricas con
radios de 30 (A) y 60 nm (B), donde
se incluyen en la resolución de
ecuaciones, dipolos (30 nm) y
cuadrupolos (60 nm).5
Como se puede observar en la figura 2.9 (A), para AgNP descritas por el régimen
cuasiestático, el campo electromagnético es muy intenso en la superficie de la
nanopartícula y su intensidad disminuye en la medida que nos alejamos a una distancia x
de su superficie. El campo electromagnético es perceptible hasta casi 30 nm de la superficie
metálica.
La figura 2.9 (B) solo se mostró en aras de visualizar las oscilaciones electrónicas en forma
de multipolos (régimen dinámico) cuando la luz interactúa con partículas mayores que 40
nm. (No se harán posteriores análisis ni comentarios)
Capítulo 2 16
2.11 Influencia de las nanopartículas metálicas sobre la fluorescencia de especies

asociadas a su superficie.
Los campos electromagnéticos generados en la superficie de las nanopartículas, durante la

resonancia plasmónica, tienen notable influencia sobre las propiedades ópticas de las
moléculas que se encuentren asociadas a las mismas.
Los fluorósforos asociados a la superficie de nanopartículas metálicas pueden aumentar o

disminuir su fluorescencia. La influencia de las nanopartículas sobre el fluorósforo
depende, en gran medida, de cómo afecta los procesos de excitación y emisión de la
molécula.52
2.11.1 Fluorescencia.
Recordando, una molécula excitada por absorción de un fotón puede retornar al estado base
por diferentes vías. Se denomina fluorescencia al mecanismo de de-excitación a través del
cual la molécula pasa del primer nivel singlete excitado “e”, al singlete base “g” con
emisión de fotones.
El parámetro que caracteriza la emisión de fluorescencia es el rendimiento cuántico de

fluorescencia (Φ). Este parámetro se define como la fracción de moléculas excitadas que
retornan al estado base con emisión de luz por fluorescencia. Por tanto, se denominan
fluorósforos de elevado rendimiento cuántico a las especies (fluoresceína, rodaminas, etc.)
en las que el proceso de relajación radiativa ocurre con mayores probabilidades que por
otros mecanismos de de-excitación.
De esta forma el rendimiento cuántico de fluorescencia se obtiene a través de la siguiente

relación:53
, donde γ es la constante de velocidad de los procesos de relajación radiativos de

la molécula libre y K es la sumatoria de las constantes de velocidad de todos los procesos
de desactivación.
Las constantes de transición radiativas son determinadas a partir de la conocida regla de oro
de Fermi ,
donde es el momento de dipolo de la transición del estado electrónico excitado “e” al

base “g”, y es la densidad de fotones emitidos durante la relajación al estado base g. 41
Por otra parte, las constantes totales de velocidad K están determinadas por la expresión
siguiente:
.
Capítulo 2 17
Donde kint es la constante de conversión interna y knr son las constantes de relajación vía no
radiativa (colisional, térmicas, vibracionales, etc.).
Los procesos y términos expuestos anteriormente pueden ser fácilmente visualizados en el

diagrama simplificado de Jablonski (fig. 2.9).
. Figura 2.9: Diagrama de Jablonski para una

molécula libre.
En este diagrama solo falta señalar que σ representa la excitación transversal de la molécula
(según establece el principio de Franck-Condon).
2.11.2 Atenuación de la fluorescencia de fluorósforos ubicados a distancias menores de

5 nm respecto a la superficie de una nanopartícula.
Cuando los fluorósforos se encuentran ubicados en las vecindades de nanopartículas

metálicas y a distancias r, menores de 5 nm, se observa una disminución pronunciada de su
fluorescencia. En este caso, se plantea que ocurre una transferencia electrónica desde el
último nivel semi-ocupado del fluorósforo en el estado excitado, hacia niveles vacíos de la
partícula (k1).54 Igualmente, puede ocurrir una transferencia electrónica desde los niveles
poblados de la partícula al hueco generado en el fluorósforo excitado (k2) (fig. 2.10).
Figura 2.10 Esquema de la transferencia electrónica

entre los orbitales del estado excitado del fluorósforo
(Fl*) y la banda metálica de la nanopartícula metálica
(NP) (Fl* → NP).
De esta forma, se crea una vía nueva de de-excitación no radiativa para el fluorósforo. Este
nuevo mecanismo de relajación, matemáticamente, es tomado en cuenta mediante la
adición de una nueva constante kM a la K (expresión 8). Por tal razón, puede verse
fácilmente que disminuye el rendimiento cuántico del fluorósforo ubicado a r < 5 nm de la
superficie de la partícula.41
Este intervalo de distancias fluorósforo-nanopartícula a las que ocurre la transferencia

electrónica Fl* → NP, se debe al hecho de que dicho proceso transita por un mecanismo de
saltos (efecto túnel) y la probabilidad de kM es dependiente de 1/r4.55
En determinados casos puede observarse una disminución de la constante radiativa del

fluorósforo (γ), asociado a la nanopartícula, debido a una transferencia de energía no
Capítulo 2 18
radiativa entre la molécula fluorescente y la partícula. Esta transferencia ocurre al acoplarse

el momento dipolo de la relajación radiativa del fluorósforo en el estado excitado
(recuérdese la regla de oro de Fermi, ecuación7), con los dipolos oscilantes generados en la
superficie de la nanopartícula.55 Para que dicha transferencia de energía sea efectiva, el
espectro de emisión del fluorósforo debe solaparse a la SPB de la nanopartícula. 56
Esta forma de transferir energía puede interpretarse como si la luz que el fluorósforo
emitiera fuera absorbida por la nanopartícula al hacer oscilar sus electrones en el proceso de
SPR. En esta forma de visualizar el fenómeno hay que acotar que en realidad el fluorósforo
nunca llega a emitir el fotón. El movimiento de los electrones al pasar del estado activado
al estado base del fluorósforo, induce una oscilación de los electrones en la partícula. Estos
movimientos electrónicos pueden describirse con los momentos dipolos enunciados arriba.
Figura 2.11: Esquema de la transferencia de energía

fluorósforo-nanopartícula por acoplamiento
2.11.3 Incremento de fluorescencia de fluorósforos ubicados a distancias de 5-25 nm

respecto a la superficie de una nanopartícula.
Para el caso de fluorósforos que se encuentren asociados a una nanopartícula a distancias de

5-25 nm, se ha observado que la fluorescencia se incrementa notablemente. Este fenómeno
se ha denominado como surface enhance fluorescence (SEF) y fue observado por Drexhage
et al por primera vez, hace cuatro décadas, al trabajar con complejos de Eu 3+ asociados a
superficies planas de metales nobles. 57
Los procesos SEF se atribuyen fundamentalmente al incremento en las probabilidades de

excitación de los fluorósforos asociados a las nanopartículas. Como se puede apreciar en la
figura 2.8, durante el proceso de resonancia plasmónica, el campo electromagnético
oscilante es muy intenso en la superficie de la nanopartícula metálica y su intensidad es
dependiente de 1/x3.58 Por tal razón, al estar un fluorósforo en las cercanías de las
nanopartículas y con bandas de excitación en las mismas longitudes de onda de la SPB de
la partícula, tendrá mayores probabilidades de excitarse que si estuviera libre en disolución.
Más aún, si se tiene en cuenta que los procesos de resonancia tienen altísimas
probabilidades de ocurrir durante la interacción fotón- nanopartícula (SPB con coeficientes
de extinción de 108-109 L* mol -1* cm-1), entonces puede considerarse que los fluorósforos
en las vecindades de dichas nanopartículas se excitarán fundamentalmente, por el campo
eléctrico asociado a la SPR de esta última. 59
Como este proceso de excitación es más eficiente que la absorción directa de un fotón, 60 el
resultado final será un aumento de la concentración de especies en el estado excitado y por
tanto, un aumento de la intensidad de luz emitida por fluorescencia (fig. 2.12).
Capítulo 2 19
Figura 2.12: Esquema de la interacción entre una

nanopartícula metálica con fluorósforos asociados
a distancias mayores de 5 nm.
Según Garoff et al., el efecto del campo eléctrico asociado al proceso de resonancia
plasmónica de la nanopartícula, se puede describir matemáticamente mediante la
incorporación de un factor de incremento sobre y (|E( ,R)|2 y |E( `,R)|2
respectivamente).61 De esta forma, la expresión de la constante de velocidad total de los
procesos de desactivación quedaría de la forma siguiente:
Donde kM tiene concebido los dos procesos atenuantes que puede ejercer la partícula sobre
el fluorósforo (ver sub-epígrafe 2.11.2).
Si se sustituyen en la ecuación 6 el nuevo valor de la constante radiativa γ y el

valor de K (expresión 9) entonces, se puede inferir que el rendimiento cuántico del
fluorósforo asociado a la partícula deberá aumentar respecto al fluorósforo en disolución.
Para ello, deberán cumplirse 3 condiciones importantes:
1. La distancia fluorósforo-nanopartícula deberá ser > 5nm.
2. Debe haber poco solapamiento entre el espectro de emisión del fluorósforo y la SPB
de la partícula.
3. Debe haber buen solapamiento entre el espectro de excitación del fluorósforo y la
SPB de la partícula.
Las dos primeras condiciones aseguran un pequeño valor de k M, mientras que la tercera
asegura un buen efecto de los factores |E( ,R)|2 y |E( `,R)|2.
El diagrama simplificado de Jablonski para el fluorósforo en las cercanías de la

nanopartícula quedaría como se muestra en la figura 2.13. 41
Figura 2.13: Diagrama de Jablonski para una

molécula asociada a una nanopartícula metálica. Los
términos y representan el
incremento del campo eléctrico debido al metal, a
una radiación de incidencia con una frecuencia ω y
con una emisión a frecuencia .
Algunos autores interpretan este fenómeno de incremento de la fluorescencia, como un

proceso de transferencia de energía de la partícula hacia los fluorósforos asociados. Para
Capítulo 2 20
ello se ha planteado que ocurre un acoplamiento del momento dipolo de los electrones
oscilantes con el momento dipolo de la excitación del fluorósforo. Esta interpretación del
fenómeno la suelen denominar como transferencia de energía por resonancia de plasmones
(PRET).62
El efecto de las nanopartículas sobre la fluorescencia de moléculas, asociadas a ellas, ha

sido utilizado en los últimos años para modular convenientemente la señal óptica de
sensores de biomoléculas.63-65 Por tanto, resulta muy importante el estudio de sistemas
análogos a los descritos para su implementación en la biotecnología y medicina.
2.12 Ciclodextrinas (CDs).
Las ciclodextrinas (CDs) son oligosacáridos cíclicos formadas por varias unidades de D-
glucopiranosas. Existen 3 tipos de estos oligosacáridos y se denominan α, β, o γ-
ciclodextrinas para los compuestos con 6, 7 u 8 unidades de D-glucopiranosa
respectivamente.
Las primeras referencias sobre las CDs se remontan a 1891, cuando Villiers aisló una
sustancia cristalina que denominó celulosita, a partir de un cultivo de Basillus macerans en
almidón.66
Las CDs presentan forma similar a un cono anular truncado. Los OH secundarios se
encuentran orientados hacia el borde más ancho y los primarios hacia el más estrecho (fig.
2.14). Presenta una cavidad con diferentes diámetros según el tipo de CD (fig. 2.14 tabla).
Los átomos de carbono de la posiciones 3 y 5 y los pares de electrones de los oxígenos de
los enlaces glicosídicos, orientados hacia el interior de la cavidad, provocan que esta tenga
una alta densidad electrónica y un carácter hidrófobo elevado. Por otro lado, los OH de las
caras le confieren propiedades hidrofílicas a estas moléculas.67
α β γ
Unidades de glucosa 6 7 8
Solubilidad en agua (g/100ml) 14.5 1.85 23.2
Diámetro de la cavidad (nm) 0.47-0.53 0.6-0.65 0.75-0.83
Figura 2.14: Estructura y propiedades de las CDs.

Capítulo 2 21
2.13 Complejos de inclusión.
Las ciclodextrinas han recibido hasta el momento una gran atención por la comunidad
científica, debido a su propiedad de formar complejos de inclusión con compuestos que
puedan introducirse dentro de su cavidad. En este tipo de compuestos se dice que la CD
actúa como hospedero y la especie que se incluye dentro de su cavidad actúa como
huésped.
Figura 2.15. Propiedad de la CD de

formar complejos de inclusión.
hospedero.
Las interacciones que permiten la formación de estos compuestos son de naturaleza no

covalente como las de tipo van der Waals, puentes de hidrógeno, etc. En los últimos 25
años este tipo de interacciones han sido denominadas como interacciones
supramoleculares.68
Debido a la naturaleza de la cavidad de la CD es posible que en ella pueda ser incluida una
determinada molécula que posea dimensiones adecuadas y naturaleza hidrofóbica. Mientras
mayor sea la semejanza entre el volumen del huésped respecto a la cavidad de la CD, tanto
mayor será la estabilidad del compuesto de inclusión generado. Así, los complejos de
inclusión más estables que se conocen son con compuestos aromáticos y con especies
cíclicas como el adamantano donde la Kinclusión llega al valor de 3*105. 69,70En muchos casos
la presencia de grupos polares en la molécula huésped, brinda una estabilización adicional,
por la formación de puentes de hidrógeno con los grupos OH de las caras de las CDs. 71
La capacidad de las CD de formar complejos de inclusión con especies hidrofóbicas y la

presencia de grupos hidroxilos en las caras primaria y secundaria, permite la solubilización
en agua de especies de interés como fármacos de naturaleza hidrófoba, etc.
Capítulo 3 22
Parte experimental
3. Parte experimental.
Reactivos:
El AgNO3 fue adquirido de la casa productora Panreac. El resto de los reactivos fueron
adquiridos de la Aldrich. Todos los reactivos utilizados fueron de calidad analítica. Los
únicos disolventes con tratamiento previo fueron el acetonitrilo y la piridina. Ambos fueron
sometidos a un proceso de anhidración con CaH2 seguido de una destilación.
La Albúmina humana liofilizada (HSA), Mw = 69 000 Da, se adquirió de la Cohn fraction

V Koch-Light Laboratories Ltd, Inglaterra. Lote con código: 9077-01.
Equipos utilizados:
Las determinaciones espectrofotométricas se registraron en un equipo Ultrospec 2100 pro

(AmershamBioSci.).
Los espectros de fluorescencia se realizaron en un espectrofluorímetro modelo Shimadzu-

rf-5301pc, con las especificaciones técnicas siguientes: fuente de luz: lámpara de Xenón,
150 W; exactitud espectral 1.5 nm; velocidad de barrido entre 5500 nm/min y 3000
nm/min; temperatura operacional de 15 a 35°C e intervalo de medición de longitud de onda
entre 220 y 750 nm.
La espectrometría de masa se realizó con un instrumento Apex-Qe con ionización por

electronebulización (ESI), con potencial eléctrico del capilar de salida de 300 V y
analizador de tiempo de vuelo.
Los espectros de resonancia magnética nuclear fueron registrados en un espectrómetro

Topspin 400, versión 1.3, BrukerBioSpinGmbH en DMSO-d5 (100 MHz para 13C en
CDCl3).
Los espectros infrarrojos se registraron en un espectrofotómetro Rayleigh WQF-510 FT-IR.

Para cada espectro se acumularon los datos de 32 barridos a una resolución de 2 cm-1. Se
utilizaron pastillas de KBr con aproximadamente un 2 % de las muestras.
Las mediciones de microscopía de transmisión electrónica (TEM) se realizaron en un JEOL

modelo 2000FX con 200 kV de voltaje de aceleración. El microscopio está provisto con
porta muestra doble (con un ángulo de rotación máximo de +/- 45º) con 0,5 mm de
desplazamiento en el eje Z y resolución de 3,1*10-10 m.
Las determinaciones electroquímicas fueron hechas en un polarógrafo Yanaco P-900,

acoplado a un registrador Graphted WX1000 X-Y. La celda electroquímica utilizada fue
una estándar de tres huecos.
Capítulo 3 23
Parte experimental
Síntesis de los compuestos utilizados:
3.1 Síntesis de fluoresceína funcionalizada con un grupo adamantano (Fluo-Ada).
Se disolvió 0.15 g (0.48mmol) de fluoresceína en piridina seca. A esta mezcla se adicionó

20 ml de CH3CN para homogenizar. Se agregó 0.1 g (0.5 mmol) de cloruro de acilo de
adamantano (Ada-COCl). La mezcla se dejó reaccionar por 24 h a temperatura ambiente y
agitación constante. La solución resultante se lavó con HCl (0.5 mol/L) tres veces 10 mL,
para extraer la piridina en exceso y precipitar la fluoresceína, con el grupo adamantano
condensado (Fluo-Ada). El ácido carboxílico de adamantano que se obtuvo como
subproducto se eliminó del precipitado anterior, mediante 3 lavados de 5mL con éter
etílico.
Para separar el producto obtenido de la fluoresceína que no reaccionó, se hizo una

cromatografía de adsorción, con una matriz de sílica gel en una columna Pharmacia XK-
16/70 y se utilizó DCM/metanol al 2% como fase móvil. Rendimiento 55%.
En RMN-1H (400 MHz, DMSO-d5) aparecen las siguientes señales δ (ppm): 8.0 (d, 1H),
7.84 (t, 1H), 7.76 (t, 1H), 7.28 (d, 1H), 6.72 (m, 3H), 6.55 (m, 3H), 1.98-1.74 (m, 15H), 4.0
(1H activo) y en RMN-13C (100MHz, CDCl3) los δ (ppm) aparecen en: 179, 169, 159, 152,
38.4, 35.9, 27.3. Picos en espectrometría de masa (ESI): 333.08 (FluoH+), 413.27, 495.18
(FluoH+-Ada), 555.11, 752.24, 827.25, 989.36 (dímero de Fluo-Ada (Fluo-Ada)2H+). El
espectro de fluorescencia del Fluo-Ada mostró una longitud de onda de excitación del
fluorósforo en los 497 nm y de emisión en los 514 nm.
3.2 Síntesis de la cisteamina (cis).
Se disolvió en 5 mL de dioxano 0.0168 g (0.07 mmol) de cistamina dihidroclorada y 0.0134

g (0.3 mmol) de NaBH4. Se dejó la reacción toda la noche. Se adicionó 1 mL de agua para
eliminar el NaBH4 en exceso y sobre esta solución se adicionó NaOH (s) hasta que se
produjera el efecto salting out. La fase orgánica fue decantada, secada con Na2SO4 anhidro,
filtrada con papel, sometida a rotoevaporación y el líquido obtenido (cisteamina) guardado
en el congelador.
3.3 Síntesis de la βCD funcionalizada con cisteamina (cis-βCD).
Se partió del derivado 6-mono-O-tosil-β-ciclodextrina (βCD-OTs) previamente sintetizado

en nuestro laboratorio y cuya técnica se reporta en la tesis de doctorado del Dr. Héctor L.
Ramírez.72 Entonces, 0.004 g (0.05mmol) de cisteamina se hizo reaccionar con 0.06 g (0.04
mmol) de βCD-OTs, en una mezcla DMSO/H2O 30 ml (50:1), por 24 horas a temperatura
ambiente. Posteriormente se adicionó 100 ml de acetonitrilo y se obtuvo un sólido blanco,
el cual fue lavado con abundante etanol.
Capítulo 3 24
Parte experimental
El sólido obtenido se disolvió en agua y se purificó mediante cromatografía de exclusión

con Sephadex G-25 como fase estacionaria y agua como fase móvil, en una columna
Pharmacia XK-16/70. Se colectaron las muestras eludidas positivas a deshidratación de
azúcares con H2SO4 (10 %) y presencia de tioles con nitrato de plata. Rendimiento 70,5%.
En el espectro FT-IR aparecen las bandas νas Csp3-H (2932 cm-1), νs Csp3-H (2905cm-1).
Picos en espectrometría de masa (ESI) (m/z): 1194.40 (M+.), 803.25, etc.
3.4 Síntesis de nanopartículas de plata con citrato de sodio (AgNP-Cit).
La síntesis de nanopartículas de plata con citrato de sodio (Cit-3) como reductor y

estabilizante fue objeto de un proceso previo de optimización de las condiciones de
reacción como: relación AgNO3/ Cit -3 en la mezcla reaccionante, tiempo de reacción,
concentraciones de reactivos, temperatura, condiciones del proceso de adición, etc. Los
mejores resultados se alcanzaron con el procedimiento siguiente:
En baño de agua hirviente con cloruro de sodio se hizo reflujar 173,6 ml de agua destilada.
Luego se adicionó AgNO3 para una concentración final de 4.7*10-4 mol/L y citrato de sodio
para una concentración final de 3.3*10-3 mol/L (relación molar Ag+: Cit -3 1:7). El sistema
se dejó agitar a reflujo por 15 minutos hasta la aparición de un color amarillo y luego se
detuvo la reacción por enfriamiento. La presencia de AgNP se verificó mediante
espectroscopía UV-Vis, donde se observó el máximo de la banda de plasmones
superficiales en los 405 nm.
3.4.1 Estudio cinético de la reacción de formación de AgNP-Cit.
Con el objetivo de optimizar las condiciones de formación de AgNP-Cit, descritas en 3.4,

se hizo un estudio en aras de establecer el comportamiento cinético durante el transcurso de
la reacción. En este sentido, se determinó cómo se consumían los iones Ag+ durante el
avance de la reacción. Para ello se realizó la técnica de voltametría cíclica, altamente
sensible.
La técnica empleada fue la siguiente:

Durante el avance de la reacción descrita en 3.4 se tomaron muestras (deteniendo la
reacción por enfriamiento) a los 0, 2.5, 5, 7.5, 10 y 12.5 minutos de iniciada. A 5 ml de las
mencionadas muestras se le adicionó 0.2525 g de KNO3, para un concentración final de 0.5
mol/L. A cada una de estas soluciones se les determinó la concentración de iones Ag + libre
en una celda de 3 electrodos: uno de referencia de Ag/AgCl/KCl (sat) y dos electrodos de
platino (uno de trabajo y otro auxiliar).
Ambos electrodos de platino se sometieron a una limpieza previa con agua regia por 5
minutos, luego con HNO3 (1 mol/L) por 5 minutos y por último se lavaron con agua
bidestilada.
Los parámentros de los barridos de la voltametría cíclica fueron:
Capítulo 3 25
Parte experimental
Sensibilidad en el eje y (corriente, I) = 10 μA/cm

Potencial inicial (IP) = 0.60 V
Potencial final (FP) = 0.10 V
Sensibilidad en el eje x (potencial, V) = 200 mV/cm
Por otra parte, la formación de nanopartículas de plata durante el tiempo se comprobó

mediante espectroscopía UV-Vis para las mismas muestras estudiadas por voltametría.
3.5 Síntesis de las AgNP recubiertas con cis-βCD.
A 50 ml de AgNP-Cit se le adicionaron 0.001g de cis-βCD y la solución resultante se dejó

incubar toda la noche.
Se verificó la formación de las nuevas nanopartículas (AgNP-cis-βCD), por el
desplazamiento batocrómico de la banda de resonancia plasmónica en el espectro UV-Vis.
3.6 Síntesis de las AgNP recubiertas con polímeros de polietilenimina (PEI).
En una primera etapa se hizo reaccionar por 24 horas 100 ml de AgNP-Cit, previamente
sintetizadas con 0.001 g (0.005 mmol) de ácido 1-undecanotiol (MUA). A dos fracciones,
cada una de 50 ml, de AgNP-MUA se le adicionaron, con fuerte agitación, 0.025 ml (0.1 %
en masa) y 0.075 ml (0.1 % en masa) de soluciones de polietilenimina de 2000 y 75 000
Da, respectivamente. Posteriormente, a cada porción de AgNP recubiertas con PEI de 2000
(AgNP-P2) y 75 000 Da (AgNP-P7) respectivamente, se le añadió 6 mg (0.004 mmol) de
βCD-OTs. De este modo, se obtuvieron AgNP recubiertas con polímeros de PEI de
distintos tamaños moleculares, provistas con residuos de βCD (AgNP-P2-βCD y AgNP-P7-
βCD respectivamente). Cada etapa de reacción se siguió por espectroscopía UV-Vis.
3.7 Estudio de la influencia de las propiedades opto – electrónicas de las AgNP

sintetizadas sobre la fluorescencia del Fluo-Ada.
Volúmenes de 0.1 ml (aproximadamente 1*10-8 mol/L) de AgNP-cis-βCD, AgNP-P2-βCD

y AgNP-P7-βCD se diluyeron hasta 5 ml con agua, para una concentración final muy
aproximada de 2*10-10 mol/L. Luego se adicionó Fluo-Ada para una concentración final de
10-6 mol/L. Como la interacción entre las AgNP sintetizadas y la Fluo-Ada es a través de
un equilibrio supramolecular, se nombrará los sistemas correspondientes a las condiciones
descritas anteriormente como: (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada), (AgNP-P2-βCD)@(Fluo-
Ada) y (AgNP-P7-βCD)@(Fluo-Ada) respectivamente. Luego, se determinaron los
espectros de fluorescencia de los diferentes sistemas vs patrones de Fluo-Ada 10-6 mol/L.
Para determinar los espectros de fluorescencia de los tres sistemas y los patrones de Fluo-
Ada se fijaron las condiciones de trabajo siguientes: λexcitación= 497 nm y λemisión= 514 nm;
ancho de la rendija de excitación (1.5) y emisión (1.5); velocidad de barrido media y
temperatura 24 °C.
Capítulo 3 26
Parte experimental
3.8 Metodología para detectar HSA a partir del sistema (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-

Ada).
Los experimentos para la detección de HSA por cambios en la fluorescencia del sistema
(AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) se realizaron mediante el procedimiento siguiente:
1. Se fijaron en el espectrofluorímetro los parámetros siguientes: λexcitación = 497 nm y

λemisión = 514 nm; ancho de la rendija de excitación (1.5) y emisión (1.5) y tiempo de
acumulación de 2 s. Todos estos parámetros fueron establecidos mediante un patrón
Fluo-Ada 10-6 mol/L.
2. Se preparó una solución de 2*10-10 mol/L de AgNP-cis-βCD y 10-6 mol/L de Fluo-
Ada en un volumen total de muestra de 5 ml. Una alícuota de 2.2 ml de esta muestra
se añadió sobre una cubeta marcada como “2”. La solución patrón (2.2 ml de Fluo-
Ada 10-6 mol/L) se adicionó en otra cubeta marcada como “1”.
3. Se prepararon distintas soluciones madre de HSA con concentraciones de 10 -9, 10-7 ,
10-5 y 5.82*10-4 mol/L.
4. A las cubetas 1 y 2 se le adicionaron distintas alícuotas de HSA en solución con las
concentraciones establecidas en el paso 3 y lo suficientemente pequeñas para no
afectar el volumen final de las muestras en las cubetas. (Ver esquema de la figura
3.1 y la tabla 3.1).
5. La medición de cada valor de fluorescencia se hizo en el mismo orden en que se
añadió la alícuota de HSA sobre la cubeta. (si la alícuota de HSA fue añadida
primero en 1 y luego en 2, la cubeta 1 se mide primero que la 2).
Capítulo 3 27
Parte experimental
Figura 3.1: Diseño experimental para la detección de HSA por variación en la fluorescencia
del sistema con (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada).
Tabla 3.1: Concentraciones de trabajo de HSA.
Concentración de HSA Alícuotas adicionadas a las Concentración final de la

inicialmente preparada cubetas 1 y 2. HSA en las cubetas 1 y 2.
en el (paso 3) (μl) (mol/L)
(mol/L)
10-9 2.2 10-12
10-9 22 10-11
10-7 1.98 10-10
10-7 19.8 10-9
10-5 1.98 10-8
10-5 19.8 10-7
5.82*10-4 3.4 10-6
5.82*10-4 34 10-5
Capítulo 4 28
Resultados y Discusión
4. Resultados y Discusión.
Para cumplimentar los objetivos planteados en nuestro trabajo fue necesaria la síntesis y
caracterización de AgNP recubiertas con distintas corazas orgánicas y que poseyeran
residuos de ciclodextrinas. Separadamente se sintetizó un derivado de fluoresceína con
un grupo adamantano (Fluo-Ada), para que se asociase a las anteriores nanopartículas.
Luego se estudió la influencia de las propiedades opto-electrónicas de las distintas AgNP
sintetizadas sobre la fluorescencia del Fluo-Ada asociado. Por último, las experiencias
obtenidas en dicho estudio de fluorescencia permitieron elaborar una nueva prueba de
concepto para la fabricación de sensores de biomoléculas. Para demostrar dicha prueba de
concepto se utilizó el sistema (AgNP-cis- CD)@(Fluo-Ada) en su interacción con la
albúmina humana.
A continuación se presentan y analizan los principales resultados obtenidos:
4.1 Síntesis de los compuestos utilizados o sus precursores.
4.1.1 Funcionalización de la fluoresceína con un grupo adamantano (Fluo-Ada).
La fluoresceína, cuya estructura pertenece al grupo de los xantenos, es un fluorósforo que

posee uno de los mayores rendimientos cuánticos que se conoce. Esta especie posee
además, un equilibrio tautomérico en dependencia del disolvente en que se encuentre, así
como otros equilibrios de ganancia y pérdida de protones en función del pH del medio (fig.
4.1).
Figura 4.1: Distintas formas estructurales de la fluoresceína según el pH y disolventes

empleados.
Algunos reportes han demostrado que la fluoresceína se encuentra en forma de lactona al

estar disuelta en disolventes polares apróticos. Por tal razón, el uso de cantidades
Capítulo 4 29
estequiométricas para los reactivos, así como el empleo de acetonitrilo seco como
disolvente permitió, que se obtuviera el éster deseado (Fluo-Ada) (fig. 4.2 Izq).
Figura 4.2: Equilibrios propuestos para el producto Fluo-Ada. No se tuvo en cuenta las
condiciones extremas de pH debido a que el éster fenólico se puede hidrolizar y por tanto,
la fluoresceína transitaría por equilibrio planteado en la figura 4.1.
El mecanismo por el cual la reacción transita es a través de un ataque nucleofílico del grupo
fenólico de la fluoresceína, al carbono trigonal del cloruro de ácido del adamantano. Según
la literatura, se plantea que el proceso transcurre con una cinética de orden 2 y con la
formación de un intermediario tetraédrico.73
El medio de la reacción se procuró bien seco debido a la fácil hidrólisis del cloruro de acilo
del adamantano. La piridina se utilizó como base para neutralizar el HCl que se produce y
así, desplazar el equilibrio hacia la formación del producto.
La purificación del producto se realizó a través de una columna cromatográfica de

adsorción. El derivado esterificado de la fluoresceína es mucho más apolar que su
precursor, lo que permite una adecuada separación de fases.
El producto obtenido fue caracterizado por espectroscopía de resonancia magnética

protónica y de carbono 13, espectrometría de masa y espectroscopía de fluorescencia.
En el espectro RMN-1H (400 MHz, DMSO-d5) se pudo distinguir dos grupos de señales:
las correspondientes a los protones aromáticos de la fluoresceína y los alifáticos del grupo
adamantano. Debido a la complejidad del espectro no se pudo asignar individualmente los
desplazamientos químicos de cada protón diferente, pero si se obtuvo una correcta
integración de H según su naturaleza, alifática o aromática (ver anexo 1).
En el espectro RMN-13C (100MHz, CDCl3) se pudo asignar las señales correspondientes a

los carbonos del grupo éster (179 ppm), de la lactona (169 ppm, 152 ppm), del grupo
fenólico (159 ppm) y de los carbonos alifáticos del grupo adamantano (38 ppm, 36 ppm, 27
ppm) (ver anexo 2). Por tanto, se comprobó que la estructura propuesta para la Fluo-Ada en
disolventes apróticos era la correcta (fig 4.2 Izq).
En espectrometría de masas se obtuvieron las señales m/z correspondientes a los

fragmentos moleculares (MH+) siguientes (ver anexo 3):
Capítulo 4 30
El pico base en m/z 333.08 es el correspondiente a la fluoresceína protonada (FluoH +)

obtenida por fragmentación del producto Fluo-Ada, a través de un posible reordenamiento
McLafferty.
El pico en m/z 495.18 corresponde al ion molecular monocargado del compuesto

sintetizado (FluoH+-Ada).
La señal asociada en m/z 989.36 se le asignó a un fragmento tipo dímero del Fluo-Ada
((Fluo-Ada)2H+) generado por puentes de hidrógeno. La formación de dicho ion dímero
puede tener lugar debido a que la técnica de ionización empleada es muy suave y no
fragmenta considerablemente los iones.
El espectro de fluorescencia mostró una intensidad máxima de emisión en los 514 nm para
una excitación en los 497 nm, muy semejante a la fluoresceína sin funcionalizar.
4.1.2 Síntesis de la cisteamina (cis)
La obtención de la cisteamina se realizó a partir de la reducción de la cistamina

dihidroclorada con borohidruro de sodio (fig 4.3), según el método que aparece en el sub-
epígrafe 3.2.
Figura 4.3. Ecuación de reacción para la obtención del 2-aminomercaptoetano (cis).
Como se expresa en la ecuación de la reacción, el puente disulfuro en presencia de un

reductor enérgico como el borohidruro de sodio, puede reducirse al tiol correspondiente.
Entre los productos que se generan a partir de la oxidación del borohidruro pueden
encontrarse el borano, fundamentalmente en disolventes no acuosos, como boratos u otros
en agua.
La separación de la cisteamina del resto de los reaccionantes y productos, se realizó

mediante una extracción líquido-líquido con dioxano y una solución concentrada de
hidróxido de sodio. Las disoluciones acuosas con elevada fuerza iónica, pueden llegar a ser
inmiscibles con disolventes orgánicos de alta polaridad como el dioxano, THF, acetonitrilo
y hasta DMF (efecto “saltingout”). A través de esta metodología se extrajo la cisteamina en
la fase orgánica del resto de los reaccionantes y productos que quedaron en la fase acuosa.
Para que este método de extracción sea efectivo el electrolito que debe adicionarse debe ser
NaOH, de manera que la amina se mantenga desprotonada y pase a la fase orgánica. Luego,
la fase orgánica se sometió a los procesos de anhidración y rotoevaporación.
Al producto obtenido, en forma de líquido amarillo claro viscoso, se le comprobó la

presencia de grupos tioles a través del ensayo con nitrato de plata (los grupos disulfuro no
Capítulo 4 31
reaccionan con los iones Ag+). El grupo amino se comprobó a través del ensayo con cloruro
de cobre con la aparición del color azul característico.
4.1.3 Síntesis de la βCD funcionalizada con cisteamina (cis-βCD).
Uno de los métodos más utilizados para obtener derivados monosustituídos en la cara
primaria de la βCD es la monotosilación74, 75 y la ulterior sustitución del grupo tosilo con
alguna otra especie nucleofílica. Debido a que el tosilo es buen grupo saliente, puede ser
fácilmente sustituído por nucleófilos como aminas primarias y secundarias, azidas, tioles,
etc.
En nuestro caso, partimos del derivado 6-mono-O-tosil-β-ciclodextrina (βCD-OTs)

obtenido previamente en nuestro laboratorio.72
En la síntesis del derivado tiolado de la βCD (cis-βCD) el procedimiento utilizado fue la

reacción de la cisteamina (cis) con la βCD-OTs en defecto (fig 4.4).76
Figura 4.4. Esquema de síntesis del cis-βCD.
El producto obtenido se caracterizó por FT-IR y espectrometría de masas. Por

espectroscopía de IR no se observaron cambios apreciables entre el espectro de vibración
de la βCD y de la cis-βCD. Ambos compuestos tienen bandas intensas y anchas en los
3300-3600 cm- correspondientes a las vibraciones de valencia de los hidroxilos de las
glucopiranosas. Esta banda ancha pudiera solapar a la banda νNH del cis-βCD y por eso no
se aprecia en el espectro. Sin embargo, en el espectro de la cis-βCD aparecen nuevas
bandas tipo νCH2as y νCH2 s en 2934 y 2895 cm-, distintas de la banda en los 2925 cm-
característica de la βCD. Estas nuevas bandas pudieran corresponder a los nuevos grupos
metilenos de la cisteamina insertada. La débil señal del grupo tiol no se observa en el
espectro de la cis-βCD.
En el espectro de masas del compuesto obtenido se observó claramente un pico

correspondiente al ion molecular monocargado cisH+-βCD en m/z 1194.40. Las demás
señales no se pudieron asignar debido a la complejidad de la estructura analizada y la
cantidad de fragmentaciones posibles (ver anexo 4).
Capítulo 4 32
4.1.4 Síntesis de nanopartículas de plata con citrato de sodio AgNP-Cit.
Como ya se describió anteriormente las nanopartículas de plata se obtuvieron por el método

de Turkevich. Para la implementación de este método fue necesario optimizarlo
previamente. Este proceso de optimización de la técnica operatoria se realizó monitoreando
el ancho de la banda de resonancia plasmónica como medida del grado de dispersión en
tamaños de las partículas (ver sub-epígrafe 2.9).
Las mejores condiciones de síntesis fueron las siguientes: concentración de AgNO3 de 0.47
mmol/L, la relación molar óptima Ag+:Cit3- fue de 1:7 y el tiempo de reacción de 15 min.
Así, se lograron sintetizar AgNP-Cit con una SPB intensa en los 405nm y un semiancho de
banda de 74 nm (fig 4.5).
Figura 4.5: SPB característica de las AgNP-Cit sintetizadas.
Una demostración que el origen de la SPB es el resultado de procesos de dispersión y

absorción de la luz, puede obtenerse mediante la observación de las AgNP por microscopía
de campo oscuro. Al incidir una radiación monocromática, con longitud de onda cercana a
la de resonancia plasmónica sobre las AgNP sintetizadas, estas podrán comportarse como
pequeños focos de luz (azul en este caso).
En esta micrografía los puntos más grandes no significa que se observen partículas más
grandes (partículas más grandes dispersarían luz de otra longitud de onda), sino que son
aquellas que están más cercas del foco de observación.
Figura 4.6: Microscopía de campo oscuro de

una gota de AgNP-Cit. La radiación incidente
se monocromatizó (364 nm) con un filtro
DAPI, Alexa 350. La luz dispersada se
observó a través de un filtro de emisión CP-
400 nm.
Capítulo 4 33
Las AgNP-Cit se caracterizaron mediante microscopía de transmisión electrónica (TEM).

Por esta técnica se observó que las AgNP presentaron formas aproximadamente esféricas y
diámetros de 13.7 ± 3.0nm (fig 4.7). La pequeña desviación estándar del tamaño de las
partículas puede justificar la aparición de una SPB estrecha como en la figura 4.5 (ver sub-
epígrafe 2.9).
Figura 4.7: Micrografías (izquierda) e histograma de frecuencia (derecha) de las AgNP-Cit.
4.1.5 Estudio cinético de la reacción de formación de AgNP-Cit.
Adicionalmente, en aras de optimizar las condiciones de síntesis de las AgNP-Cit se realizó

un estudio cinético sobre los mecanismos de formación de las nanopartículas, a través de
voltametría cíclica y espectroscopía UV-Vis (ver anexo 5).
Dicho estudio se realizó mediante el análisis de la variación de la concentración de iones

plata en el tiempo. La técnica operatoria se describió en el sub-epígrafe 3.4.1. Solamente
puntualizaremos que el KNO3 (0.5 mol/L), adicionado a las diferentes muestras, cumple
una doble función: primero, esta sal actúa como electrolito soporte (evita los fenómenos de
migración de la especie electroactiva y la generación de corrientes capacitivas). Segundo la
alta concentración de KNO3 incrementa la fuerza iónica del medio y en consecuencia, las
AgNP-Cit precipitan (ver sub-epígrafe 2.5). De este modo, solo queda en solución los iones
Ag+ que no han reaccionado y cuyas concentraciones en el tiempo se determinaron por
voltametría cíclica (ver anexo 6). El nitrato de potasio se escogió como electrolito soporte
debido a que no hace precipitar a los iones Ag+.
Posteriormente, se procedió a determinar el orden de reacción para la formación de AgNP-

Cit. Con este objetivo, se sustituyeron los valores experimentales de la variación de
concentración de iones Ag+ en las ecuaciones cinéticas integradas de orden 1, 2 y 0.
Capítulo 4 34
Las determinaciones realizadas demostraron que, para un intervalo de tiempo de 0 a 10

min, la reacción en estudio se ajusta a un proceso con cinética de orden 0 (fig 4.8 Izq) y que
a partir de los 12.5 min no había presencia de iones Ag+.
Figura 4.8 Izquierda: Gráfico de correlación entre la concentración de iones Ag + y el

tiempo de reacción, lo cual corresponde a un cinética de orden 0. Derecha: Espectros UV-
Vis de las AgNP-Cit para varios tiempos de reacción.
El orden 0 calculado indica que la reducción de Ag+ ocurrió únicamente en la superficie de

las semillas de plata (AgNP), haciéndolas crecer por un mecanismo de tipo II de Ostwald.
Estas observaciones están en total correspondencia con los mecanismos de formación de
AgNP por el método de Turkevich reportados para la concentración de citrato utilizada
(Ver sub-epígrafe 2.5.1).
El crecimiento de las nanopartículas se comprobó además, por los incrementos en la

intensidad de las SPB durante el tiempo de reacción (fig 4.8 Der). A medida que aumenta el
volumen de las AgNP-Cit, aumenta el valor de su coeficiente de extinción, lo que explica el
aumento de intensidad de las bandas (ver sub-epígrafe 2.8, expresión 1).
Sin embargo, pasado los 12.5 min, y manteniendo el sistema a reflujo, se continuaron con
las mediciones de los espectros UV-Vis de las AgNP-Cit. En dichos espectros se observó
un incremento notable de la intensidad y del ancho de las SPB (ver anexo 5). Nótese que
para estos valores de tiempo los iones Ag+ se habían consumido. Por tal razón, dicho
resultado sugiere que el crecimiento de las AgNP-Cit, pasado 12.5 min, ocurre por
colisiones y coalescencia de las AgNP-Cit más pequeñas. Las partículas obtenidas de esta
manera suelen ser en realidad bastante poco homogéneas en cuanto a distribución de
tamaños y formas.
Capítulo 4 35
Por tal razón, para los propósitos de este trabajo se decidió ajustar el tiempo de reacción a
15 min. El exceso de 2.5 min se utilizó para asegurar la total reducción de los iones plata,
sin comprometer mucho la homogeneidad de tamaños y formas de las AgNP).
A modo de resumen se puede decir que durante la formación de AgNP-Cit hay dos etapas
de reacción. En la primera etapa, el crecimiento de las AgNP-Cit está dado por la reducción
de los iones Ag+ en la superficie de las nanopartículas (mecanismo tipo II). En la segunda
etapa, ocurre un crecimiento de las partículas por procesos de coalescencia (proceso
indeseado).
4.1.6. Modificación de la superficie de las AgNP con las distintas cubiertas orgánicas
de derivados de βCD.
Una vez sintetizadas las AgNP-Cit se procedió a funcionalizarlas con diferentes

compuestos orgánicos, de modo que poseyeran unidades de βCD ubicadas a distancias de 1,
5 o 10 nm de la superficie de la nanopartícula. Dichos recubrimientos se diseñaron con el
objetivo de realizar los estudios de fluorescencia correspondientes (ver más abajo).
AgNP-cis-βCD
Las AgNP-Cit obtenidas anteriormente se recubrieron con cis-βCD, que como posee un
grupo tiol de alta afinidad por la superficie de plata, puede formar una monocapa de alta
estabilidad (ver sub-epígrafe 2.3). Este tipo de interacción, genera una nueva estructura
electrónica (banda híbrida), producto de la combinación entre el HOMO del tiol y los
orbitales de la banda SP de la nanopartícula. Por tal razón, como se trató en el subepígrafe
2.9, la función dieléctrica de la AgNP-cis-βCD es diferente a la AgNP-Cit. Así, el
recubrimiento provoca un corrimiento batocrómico de las SPB de la nanopartícula y por
tanto, se pudo comprobar la presencia de cis-βCD sobre las AgNP por espectroscopía UV-
Vis (fig. 4.9). Las intensidades entre las SPB de la AgNP-Cit y AgNP-cis-βCD varían
debido al cambio de la condición de resonancia, producto de la formación de la nueva
monocapa y por tanto, la variación de la constante dieléctrica de la AgNP (ver sub-epígrafe
2.9).
Figura 4.9: Esquema de síntesis de las AgNP-cis-βCD con las bandas de plasmones
superficiales correspondientes.
Capítulo 4 36
El espesor de cis-βCD fue determinado a través de un programa de modelación molecular

(ChemBio3D Ultra 12.0). Así, las unidades de βCD quedaron ancladas a la superficie
metálica de las AgNP con una separación aproximada de 1 nm de longitud.
AgNP-P2-βCD y AgNP-P7-βCD
En una primera etapa AgNP-Cit previamente sintetizadas se dejaron incubar por 24 horas con el
ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA). Esta especie se asocia a la superficie de plata a
través de su grupo tiol y por tanto, su grupo carboxilato (o en su forma ácida) queda
orientado hacia el exterior.
Una vez obtenidas las AgNP-MUA se separó en dos porciones diferentes de iguales
volúmenes. A una se le añadió un polímero de polietilenimina (PEI), con masa molecular
promedio de 2000 Da y a la otra el mismo tipo de polímero, pero con masa molecular de 75
000 Da. Las concentraciones de polímeros trabajadas fueron ajustadas a la mínima
concentración de manera tal que provocara cambios en las SPB de las AgNP-MUA
modificadas.
Resultó interesante que al añadir excesos de polímero se observó la aglomeración y

precipitación de las nanopartículas. Dichos aglomerados no ofrecieron ninguna posibilidad
de redisolución. En este sentido, consideramos que, al aumentar las cantidades de polímero
en disolución existen más probabilidades que estas moléculas se asocien a través de
múltiples puentes de hidrógeno. Estas interacciones multivalentes pueden inducir que las
nanopartículas floculen junto a los agregados del polímero y producto de su alta masa,
pueden precipitar por la acción de la gravedad. Este resultado demuestra la importancia del
control de la cantidad de polímero adicionado (tanto del de 2000 Da como el de 75 000 Da)
durante el recubrimiento de las AgNP-MUA, así como la velocidad de agitación (ver parte
experimental).
Para realizar el recubrimiento de las AgNP-MUA con los PEI mencionados (espaciadores)
y que se obtuviera una asociación estable, no fue necesaria una modificación a través de
enlaces covalentes. Dichos polímeros presentan una cantidad considerable de grupos
aminos primarios, secundarios y terciarios que, a través de atracciones electrostáticas,
pueden interactuar con los carboxilatos de la AgNP-MUA. Como la asociación es
multivalente el recubrimiento es muy resistente a futuros tratamientos.
Por último, en analogía con la reacción descrita en el epígrafe 4.1.3, se hizo interactuar el
derivado βCD-OTs con las AgNP-P2 y AgNP-P7. De esta forma, la βCD puede quedar
anclada a la superficie de las AgNP-P2 y AgNP-P7, a través de una sustitución nucleofílica
del grupo tosilo por los grupos aminos externos del PEI. La distancia entre la βCD y la
superficie metálica de AgNP está condicionada fundamentalmente, por el diámetro de los
PEI utilizados.
Capítulo 4 37
Figura 4.10: Esquemas de síntesis de AgNP-P2-βCD y AgNP-P7-βCD
Cada etapa de reacción descrita (fig 4.10) fue monitoreada por espectroscopia UV-Vis (fig.
4.11). Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
El proceso de recubrimiento de las AgNP-Cit con MUA provocó fundamentalmente un

corrimiento batocrómico de 13 nm de la SPB (fig 4.11). La asociación de los PEI 2000 y 75
000 Da sobre las AgNP produjeron otros corrimientos batocrómicos de 12 y 14 nm
respectivamente. La reacción de CD-OTs con las AgNP-P2 y AgNP-P7 no produjo
cambios considerables en las posiciones de las SPB correspondientes.
Los corrimientos batocrómicos y cambios en las intensidades de las bandas de la AgNP-

MUA, respecto a la AgNP-Cit, se pueden explicar cómo mismo se hizo para el caso de las
AgNP-cis- CD.
Los desplazamientos y cambios en las intensidades de las SPB observados durante la

obtención de AgNP-P2 y AgNP-P7, a partir de AgNP-MUA, pueden explicarse por un
cambio considerable del entorno dieléctrico de la nanopartícula. Este cambio del entorno,
ocasiona una variación en la condición de resonancia (los coeficientes de extinción de las
nanopartículas serán máximos para nuevos valores de longitud de onda (ver sub-epígrafe
2.9).
Para el caso de la asociación de βCD-OTs a las AgNP-P2 y AgNP-P7, no deben esperarse

diferencias significativas en los máximos de las SPB. La anterior hipótesis puede
formularse dado que el recubrimiento de las AgNP apenas sufre variaciones en cuanto a
espesor (cambios del entorno dieléctrico del medio).
Capítulo 4 38
Figura 4.11: Espectros de extinción de los intermediarios y productos de la síntesis del AgNP-P2-
CD (a) y AgNP-P7-βCD (b).
Mediante mediciones hechas por microscopías de transmisión electrónica y de fuerza

atómica se pudo determinar que los polímeros comerciales PEI de 2000 y 75 000 Da tenían
un diámetro aproximado de 4 y 9 nm respectivamente. (Estos resultados no se mostraron).
Por tanto, se llegó a la conclusión que las AgNP-P2-βCD y AgNP-P7-βCD tenían las
unidades de βCD espaciadas aproximadamente a 5 y 10 nm de la superficie de plata.
4.2 Estudio de la influencia de las nanopartículas de plata sintetizadas sobre la

fluorescencia de la Fluo-Ada.
Una vez sintetizadas AgNP-cis-βCD, AgNP-P2-βCD y AgNP-P7-βCD se procedió a evaluar

su influencia sobre la fluorescencia del Fluo-Ada asociado a cada una de ellas.
En el sub-epígrafe 3.7 se mencionó que las muestras de nanopartículas de plata fueron

preparadas por dilución de una alícuota de 0.1 ml (10-8 mol/L) (tomada directamente del
balón de reacción) de AgNP-cis-βCD, AgNP-P2-βCD o AgNP-P7-βCD en 5 ml de agua. La
concentración molar de AgNP de la alícuota fue calculada de forma aproximada. Para ello,
se determinó el número de átomos de plata en las nanopartículas sintetizadas. El cálculo del
número de átomos en cada partícula se realizó asumiendo a las AgNP como esferas
concéntricas de “n” capas de átomos (como si fuera una cebolla). La cantidad de capas en
la esfera se determinó dividiendo el radio medio de las partículas entre el diámetro del
átomo de plata (0.29 nm). La cantidad de átomos en cada capa “n” se determinó por la
formula 10n2+2 átomos.4 Si se suma la cantidad de átomos de plata por cada capa, entonces
se puede determinar la cantidad de átomos en la partícula. Aunque el cálculo parezca
fatigoso utilizando un programa adecuado de procesamiento de datos, como el Microsoft
Excel, se puede resolver en pocos minutos.
Una vez calculados el número de átomos en cada AgNP sintetizada se puede determinar la
concentración molar aproximada en las soluciones en estudio. Esta determinación se realizó
Capítulo 4 39
a partir de la división de la concentración inicial de iones Ag+ (4.7*10-4 mol/L en todos los
casos) entre el número de átomos por partícula.
Basado en los resultados obtenidos, se determinó que la concentración de la solución madre

de las AgNP sintetizadas (AgNP-cis-βCD, AgNP-P2-βCD y AgNP-P7-βCD) fue de 1*10-8
mol/L aproximadamente. A partir de estas soluciones se prepararon muestras más diluidas,
con concentraciones finales de 2*10 -10 mol/L aproximadamente.
Las AgNP sintetizadas no se pudieron someter a ningún proceso de purificación debido a

que si se precipitaban eran imposibles de re-dispersar correctamente. Un proceso de
precipitación, lavado y re-dispersión inducía un cambio drástico de sus propiedades ópticas
producto de la formación de agregados. Por tanto, debido a la presencia de impurezas en las
soluciones madres de las nanopartículas obtenidas, fue necesario la preparación de
soluciones patrones para el estudio de fluorescencia. En este sentido, se prestó especial
cuidado en la preparación de dichos patrones con las cantidades exactas de los reactivos
empleados, el mismo orden de adición y tiempo de reacción que se usaron durante las
síntesis de las distintas AgNP.
Una vez preparadas las muestras diluidas de AgNP-cis-βCD, AgNP-P2-βCD y AgNP-P7-

βCD (2*10-10 mol/L) y sus respectivos patrones, se les adicionó Fluo-Ada con una
concentración final de 1*10 -6 mol/L. Los sistemas obtenidos se tomaron como modelo para
estudiar la influencia de las propiedades opto-electrónicas de las AgNP sobre la
fluorescencia del fluorósforo (Fluo-Ada), localizado a diferentes distancias de la superficie
de las nanopartículas.
Es importante destacar que tanto las AgNP como el fluorósforo fueron modificados
especialmente para que interaccionasen a través de la formación de un complejo de
inclusión (en equilibrio con las especies disociadas (ver sub-epígrafe 2.13). Este tipo de
asociación supramolecular nanopartícula-fluorósforo la representaremos en lo adelante
mediante la nomenclatura siguiente: i) Las especies interactuantes se colocarán entre
paréntesis separados por el signo @. ii) La especie interna se coloca a la izquierda y la que
la recubre a la derecha (fig 4.12).
Capítulo 4 40
Figura 4.12: Interacción

supramolecular entre las
AgNP y el Fluo-Ada.
En la figura 4.13 se pueden observar el espectro fluorescencia de los tres sistemas

representados en la figura 4.12 y el de sus correspondientes patrones.
a 20 b c
400 15
In de fluorescencia
In de fluorescencia
15
Int de fluorescencia
300
10
10
200
5
100 5
0 0 0
400 450 500 550 600 400 450 500 550 600 400 450 500 550 600
longitud de onda (nm) longitud de onda (nm) longitud de onda (nm)
Δ fluorescencia = -27% Δ fluorescencia = +19% Δ fluorescencia = +30%
Figura 4.13: Espectros de excitación y emisión de los sistemas a. (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-

Ada), b. (AgNP-P2- βCD)@(Fluo-Ada) y c. (AgNP-P7-βCD)@(Fluo-Ada) (líneas azules)
vs patrones de Fluo-Ada, 1*10-6 mol/L (líneas negras).
En la figura 4.13 puede observarse que cuando el Fluo-Ada se encuentra asociado

supramolecularmente a 1 nm aproximadamente de la superficie de la nanopartícula,
((AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada)) la intensidad de fluorescencia disminuye en un 27%
respecto a su patrón. De forma contraria, cuando el Fluo-Ada se encuentra a 5 nm de la
superficie metálica en (AgNP-P2-βCD)@(Fluo-Ada), la fluorescencia se incrementa en un
Capítulo 4 41
19 % y, cuando dicha distancia es de 10 nm ((AgNP-P7- βCD)@(Fluo-Ada)) , entonces la

intensidad de luz emitida aumenta hasta un 30 %.
Para explicar las variaciones de fluorescencia de los sistemas en estudios ((AgNP-cis-

βCD)@(Fluo-Ada), (AgNP-P2-βCD)@(Fluo-Ada) y (AgNP-P7-βCD)@(Fluo-Ada)), se
debe analizar, primeramente, las longitudes de onda de las SPB correspondientes y los
espectros de excitación y emisión de Fluo-Ada. Para realizar este análisis se superpusieron
todos los espectros mencionados en un mismo gráfico. Estos espectros no fueron
normalizados para ajustarlos en la escala de las ordenadas. Los análisis propuestos son solo
sobre la base de las posiciones de los máximos de las bandas.
Figura 4.14: Espectro de excitación (λemisión=514 nm) de Fluo-Ada 1*10-6 mol/L (línea
roja), espectro de emisión (λexcitación= 497 nm) de Fluo-Ada 1*10-6 mol/L (línea negra) y
SPB de las AgNP (líneas azules) a. AgNP-cis-βCD, b. AgNP-P2-βCD y c. AgNP-P7-βCD.
Como se aprecia en la figura 4.14, en todos los casos la posición de las SPB de las
nanopartículas de plata se encuentran próximas al espectro de excitación del Fluo-Ada y
absorben poco en la zona de emisión. Según lo discutido en el sub-epígrafe 2.11.2, en el
caso de fluorósforos asociados a la superficie de nanopartículas metálicas, hasta distancias
de 5 nm, puede ocurrir una disminución de la fluorescencia por dos procesos
fundamentales: transferencia electrónica y/o transferencia de energía no radiativa por
acoplamiento de dipolos. Para que esta última causa de disminución de la fluorescencia sea
efectiva, el espectro de emisión del fluorósforo debe solaparse a la SPB de la nanopartícula.
En nuestros sistemas, debido al débil solapamiento de las SPB de todas las nanopartículas
mencionadas con los espectros de emisión de Fluo-Ada, puede decirse que la mencionada
transferencia de energía es poco probable (fig. 2.11).
De acuerdo con el análisis anterior, y los datos de la figura 4.14a, se puede decir que la
disminución de fluorescencia en el sistema (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) se debe
básicamente, a una transferencia electrónica desde del fluorósforo en su estado excitado, a
los niveles vacíos de la banda metálica de la nanopartícula (Fluo-Ada*→AgNP) (fig. 2.10).
Capítulo 4 42
Por otra parte, a separaciones mayores que 1 nm entre la nanopartícula y el fluorósforo la

probabilidad de transferencia electrónica disminuye exponencialmente (kM~1/r4, ver sub-
epígrafe 2.11.2).. Por tal razón, en el sistema (AgNP-P2-βCD)@(Fluo-Ada) la posibilidad
que ocurran estos procesos será relativamente baja y casi nula para (AgNP-P7-
βCD)@(Fluo-Ada).
En estos dos últimos casos, el aumento de fluorescencia de Fluo-Ada asociado a la AgNP

se puede atribuir a: un incremento en la eficiencia del proceso de excitación del
mencionado fluorósforo debido a la dispersión de la luz por las nanopartículas (fig. 4.6).
Este análisis se basó en el hecho de que los espectros de extinción de las AgNP-P2-βCD y
AgNP-P7-βCD se superponen poco con el de emisión de Fluo-Ada (ver sub-epígrafe
2.11.3). Debido a los procesos SEF (fig. 2.12), la concentración de Fluo-Ada en el estado
excitado es mucho mayor al estar asociada a AgNP-P2-βCD y AgNP-P7-βCD que si se
encuentra libre en disolución. Según lo anterior, la emisión de luz por fluorescencia de
(AgNP-P2-βCD)@(Fluo-Ada) y (AgNP-P7-βCD)@(Fluo-Ada) será mayor que la de Fluo-
Ada libre.
Expuesto todo lo anterior se puede hacer un análisis completo respecto a las variaciones en
los espectros de fluorescencia de Fluo-Ada en cada uno de los sistemas: (AgNP-cis-
βCD)@(Fluo-Ada), (AgNP-P2-βCD)@(Fluo-Ada) y (AgNP-P7-βCD)@(Fluo-Ada). O lo
que es lo mismo, la variación de la fluorescencia de Fluo-Ada asociado a distintas
distancias de la superficie de AgNP.
En todos los casos coexisten 2 tipos de fenómenos: transferencia electrónica (Fluo-Ada*→

AgNP) o los procesos SEF. Ambos procesos modulan antagónicamente la fluorescencia de
Fluo-Ada asociada a la AgNP. La prevalescencia de uno sobre el otro estará determinada
por la distancia fluorósforo-nanopartícula.
Para el compuesto (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada), dada la corta distancia entre AgNP y el

Fluo-Ada, la probabilidad de que ocurra la transferencia electrónica (ET) es alta y los
fluorósforos regresan a su estado base sin emisión de fotones (elevado valor de kM, ver
expresión 9 sub- epigrafe 2.11.3)
Para el caso de (AgNP-P7-βCD)@(Fluo-Ada) los procesos ET se vuelven muy poco

probables (pequeño valor de kM). Por tal razón, debido a los procesos SEF, se obtiene un
aumento de la concentración de fluorósforos en el estado excitado y que se de-excitan
emitiendo luz.
Para el caso de (AgNP-P2-CD)@(Fluo-Ada) la separación fluorósforo-nanopartícula se

encuentra en un valor intermedio, donde los dos procesos mencionados coexisten a la vez y
se contrarestan uno al otro. En este caso se puede decir que, los procesos de SEF aumentan
más rápido la concentración de especies excitadas, de lo que la transferencia electrónica
Capítulo 4 43
Fluo-Ada*AgNP la disminuye. El resultado global es un aumento ligero de la

fluorescencia de Fluo-Ada.
4.3 Detección por fluorescencia de albúmina serum humana (HSA) a través del
sistema (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada).
En los últimos tiempos, uno de los objetivos trazado de las nanociencias ha sido la
construcción de nuevos tipos de bio-sensores para detectar patógenos de una manera eficaz
y simple. Entre los métodos más utilizados se encuentran aquellos que se basan en
fenómenos de fluorescencia. En este sentido, el aporte de las nanociencias ha sido
fundamentalmente el diseño de sistemas novedosos, que permitan disminuir los límites de
detección de los bio-sensores, así como una constucción más barata de estos. 77
Con este objetivo y con los resultados anteriores, se hipotetizó que los sistemas estudiados
(fig. 4.12) podían ser utilizados en la fabricación de nuevos bio-sensores de alto contraste.
En este sentido, se pensó que al hacer interactuar la (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada), cuya
fluorescencia estaba inicialmente atenuada, con una proteína como la albúmina serum
humana (HSA), ocurriría un cambio notable en la fluorescencia de Fluo-Ada.
Como la asociación entre el Fluo-Ada y la AgNP-cis-βCD es regida por interacciones

supramoleculares, presumimos que la adición de una proteína al sistema podría desplazar
de la superficie de la nanopartícula al fluorósforo. Debido al tamaño nanométrico de la
HSA (alrededor de 11 nm), si esta interactúa con la AgNP-cis-βCD78 interponiéndose entre
la nanopartícula y el fluorósforo entonces, se debe esperar un espectro de fluorescencia
similar al del sistema (AgNP-P7-βCD)@(Fluo-Ada). Como resultado final se esperaría que
la adición de HSA induciría un incremento brusco en la fluorescencia (SEF). Es decir, en
un inicio se debería obtener un espectro atenuado, como el de (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-
Ada), y luego, con la adición de la HSA se obtendrían valores de intensidad de
fluorescencia parecidos al (AgNP-P7-βCD)@(Fluo-Ada). De esta forma, si se toma como
señal de detección las variaciones de luz emitida por fluorescencia entonces, se podría
diseñar un sistema que inicialmente estuviese apagado y que ante la presencia de HSA
pasase a muy encendido, logrando un alto contraste.
Para demostrar la anterior hipótesis se realizó el siguiente ensayo preliminar: a una solución
de (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) se le adicionó HSA y la muestra se observó bajo un
lámpara de luz violeta-azul ( =380-400 nm) (fig. 4.15). En la figura 4.15 se puede observar
un incremento ligero de la fluorescencia de (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) luego de añadir
la HSA.
Capítulo 4 44
Figura 4.15: Interacción entre la HSA y el sistema

(AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) que ocasiona un
ligero incremento de la fluorescencia. La
intensidad media de luz emitida se determinó
mediante un procesamiento de imagen con el
programa Photoshop 7.0.
Como los aumentos de fluorescencia observados en estos estudios preliminares fueron

considerablemente más bajos que los esperados ( ~60%) se replantearon nuevas
interrogantes, con nuevos experimentos.
La principal interrogante que se planteó fue si la HSA en realidad se interponía entre la

AgNP-cis- CD y Fluo-Ada ((AgNP-cis-βCD-HSA)@(Fluo-Ada)) o si, simplemente,
producto de interacciones HSA-(Fluo-Ada), la proteína estuviese extrayendo al fluorósforo
de la superficie de la partícula (fig. 4.16).
Figura 4.16: Posibles interacciones entre la HSA y el equilibrio supramolecular del sistema
(AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada).
Para responder la interrogante anterior se diseñó el experimento control siguiente:
Se prepararon dos soluciones de Fluo-Ada 1*10-6 mol/L, una de ellas fue tomada como
patrón y a la otra se le adicionó HSA para estudiar el efecto de la interacción HSA-(Fluo-
Ada) sobre la fluorescencia del último. Bajo una lámpara de UV se pudo observar a simple
vista, que la HSA posee un efecto atenuante sobre la fluorescencia de Fluo-Ada (fig 4.17).
Capítulo 4 45
Figura 4.17: Interacción entre la HSA y la Fluo-Ada que

ocasiona una disminución notable de la fluorescencia.
El efecto atenuante de la HSA sobre la fluorescencia de Fluo-Ada nos permite afirmar que
al interactuar el sistema (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) con dicha proteína, esta se interpone
entre la partícula y el fluorósforo (fig. 4.16 a). De forma contraria, si el fenómeno que
tomara lugar fuese la mera asociación entre el fluorósforo y la proteína (fig 4.16 b), nunca
se hubiese observado un aumento de la luz emitida por fluorescencia.
Posteriormente, para cuantificar las variaciones de intensidad de luz emitida en el equilibrio

(AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) al interaccionar con HSA se procedió a cumplimentar el
diseño de experimentos explicado en el sub-epígrafe 3.8.
Recordando brevemente, a dos soluciones contenidas en dos cubetas diferentes, una con
(AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) (cubeta 2) y otra con el patrón de Fluo-Ada (cubeta 1), se les
adicionó distintas alícuotas de HSA para una concentración de 10-12- 10-5 mol/L. Luego de
cada adición se determinó el valor de intensidad emitida por fluorescencia, con las
condiciones de medición previamente optimizadas.
Así, se realizó un gráfico de variación porcentual de intensidadde fluorescencia, de las

cubetas 1 y 2, para cada concentración de proteína añadida (fig. 4.18). Como valores de
referencia (puntos iniciales o el cero) se tomaron las intensidades de fluorescencia de las
muestras sin añadir HSA.
Capítulo 4 46
Figura 4.18: Gráfico de la variación de intensidad de luz emitida en el sistema (AgNP-cis-

βCD)@(Fluo-Ada) (puntos rojos), con respecto a un patrón de Fluo-Ada (puntos negros) a
distintas concentraciones de HSA.
En este gráfico se puede observar que la interacción del tipo HSA-(Fluo-Ada) siempre
tiende a provocar una disminución de la fluorescencia (cubeta 1). Esta disminución toma
valores notables a concentraciones mayores de 10-8 mol/L de HSA. En cambio, para el caso
de (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) se observa que, una vez que se añade la proteína, se
obtiene un incremento de la fluorescencia de ~13% que permanece casi constante hasta una
concentración de HSA de 10-8 mol/L. A concentraciones mayores de esta proteína la
fluorescencia del sistema (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) + HSA se atenúa.
La diferencia de intensidades de luz emitida por fluorescencia entre las cubetas 1 y 2, al

interactuar con HSA, a una concentración de 10 -8 mol/L, nos permite pensar que hay dos
posibles efectos sobre la fluorescencia de Fluo-Ada (fig. 4.16). Por una parte, como se
mencionó anteriormente, el sistema descrito en la cubeta 2 evoluciona hacia la formación
de (AgNP-cis-βCD-HSA)@(Fluo-Ada) y, a esta nueva separación los procesos SEF
dominarían sobre los procesos de transferencia electrónica. Sin embargo, paralelamente,
aparece el efecto atenuante de la HSA sobre la fluorescencia del Fluo-Ada (HSA-(Fluo-
Ada)) que contrarresta la esperada ganancia de fluorescencia por los procesos SEF. Por tal
motivo, no se presentan los incrementos de fluorescencia observados para (AgNP-P7-
βCD)@(Fluo-Ada). En este intervalo de concentraciones de proteína, 10-12-10-8 mol/L,
puede decirse que el proceso dominante es el incremento de la fluorescencia de Fluo-Ada
ocasionado por los procesos SEF de la AgNP.
Capítulo 4 47
Para concentraciones mayores de albúmina (de 10-8 a 10-5 mol/L), el efecto atenuante de la
HSA, sobre Fluo-Ada, domina sobre el aumento de la fluorescencia que provoca la AgNP.
Las propiedades fluorescentes del derivado de la fluoresceína son fuertemente dependientes

del pH y del entorno químico en que se encuentre. En este sentido, se puede decir que la
HSA posee numerosos aminoácidos que pueden interactuar a través de equilibrios ácido-
base o interacciones electrostáticas, con la Fluo-Ada y de esta manera afectar su
fluorescencia. De hecho, en la literatura se reporta que la fluoresceína puede asociarse al
centro activo I de la HSA e interaccionar, electrostáticamente, con los aminoácidos lisina
(195, 199), treonina (125, 243), ácido glutámico (167, 244), glutamina (196), serina (202) y
arginina (197). Dicha interacción está reportada que produce una disminución de su
fluorescencia.79
Con estos datos podemos concluir que la HSA, al interaccionar con un sistema
supramolecular y reversible como el (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada), se interpone entre la
partícula y el fluorósforo en función de espaciador. Producto de esta reorganización, se
puede observar, en determinados intervalos de concentración de HSA, que el sistema
incrementa discretamente la luz emitida por fluorescencia.
Aunque en este estudio no se obtuvieron porcientos elevados en la variación de

fluorescencia, es de esperar que la forma en que se asocian la nanopartícula, la proteína y el
fluorósforo pueda inducir cambios contrastantes en la luz emitida. Para demostrar lo
planteado, actualmente se realiza un estudio similar con un fluorósforo, cuya fluroescencia
es independiente del pH, como la rodamina B. En este caso, como el espectro de excitación
de este fluorósforo presenta un máximo sobre los 540 nm, fue necesario utilizar
nanopartículas de oro que poseen su SPB en esta zona del espectro visible. Los resultados
obtenidos fueron los esperados y se mostrarán en futuros documentos de tesis.
Con los datos expuestos anteriormente nosotros consideramos que esta prueba de concepto
puede ser útil en el diseño de nuevos bio-sensores ópticos. Para ello, una ruta pudiera ser la
funcionalización de la nanopartícula con moléculas de alta afinidad y especifidad por la
biomolécula de interés. El fluorósforo deberá, igualmente, ser modificado para interactuar
con la nanopartícula y con la biomolécula de manera tal que se logren elevados contrastes
apagado/encendido de la señal óptica. En este sentido se dirigirán las futuras
investigaciones de nuestro grupo.
Conclusiones 48
5. Conclusiones
1. Se sintetizó y caracterizó un derivado de fluoresceína con un grupo adamantano, de

alta afinidad por la cavidad de la βCD.
2. Se estudiaron, por voltametría cíclica y espectroscopía UV-Vis, las condiciones
óptimas para la síntesis AgNP-Cit con diámetros alrededor de 13.7 ± 3 nm,
necesaria para ulteriores transformaciones. Debido a los mecanismos de formación
de estas nanopartículas se determinó, que la síntesis de estas partículas debía tener
un tiempo óptimo de 15 min y una concentración de AgNO3 de 0.47 mmol/L y
relación molar Ag+: Cit-31:7.
3. Se sintetizaron las nanopartículas de plata recubiertas con derivados de β-
ciclodextrina enlazados a espaciadores de longitudes de 1, 5 y 10 nm (AgNP-cis-
βCD, AgNP-P2-βCD y AgNP-P7-βCD respectivamente). Cada paso en el proceso de
recubrimiento se verificó por cambios en la posición de la banda de resonancia
plasmónica.
4. Se observó que cuando el Fluo-Ada se encontraba asociado supramolecularmente a
la nanopartícula AgNP-cis-βCD, a 1 nm aproximadamente de la superficie de la
partícula, debido a procesos de transerencia electrónica, su fluorescencia disminuía
en un 27% con respecto a su patrón. Por otra parte, cuando el Fluo-Ada se
encontraba asociado a AgNP-P2- βCD, a 5 nm de la superficie de la nanopartícula,
la fluorescencia se incrementó en un 19 %. Cuando la separación relativa entre el
fluorósforo y la AgNP era de 10 nm, como en el caso de (AgNP-P7- βCD)@(Fluo-
Ada) entonces, la intensidad de luz emitida aumentó hasta un 30 %. Los
incrementos de fluorescencia en los dos últimos casos se atribuyó a los procesos
SEF.
5. Se observó que al hacer interactuar el sistema (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada)
inicialmente atenuado, con la HSA, no se obtuvo el esperado aumento abrupto en la
intensidad de luz emitida por fluorescencia. Se constató que la causa de este
resultado era debido a un efecto atenuante de la HSA sobre la fluorescencia de Fluo-
Ada.
6. Se comprobó gracias al efecto atenuante de la HSA, que al interactuar esta
biomolécula con (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) se produce un rearreglo en su
estructura donde la HSA se interpone entre la partícula y el fluorósoforo. Este tipo
de rearreglos puede ser el fundamento para la elaboración de nuevos tipos de
biosensores que utilicen simultáneamente los efectos, atenuantes y de incremento,
que ejercen las nanopartículas metálicas sobre la fluorescencia de fluorósforos
asociados a distintas distancias de su superficie.
Recomendaciones 49
6. Recomendaciones.
• Construir un sistema semejante al (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada) pero utilizando

nanopartículas de oro y un fluorósforo cuya fluorescencia sea independiente del pH,
como la Rodamina B, para evitar los procesos de atenuación causados durante su
interacción con biomoléculas como la HSA.
• Determinar por técnicas de termogravimetría el proceso de asociación de la βCD-

OTs a las nanopartículas recubiertas con MUA y PEI.
• Estudiar por la técnica Dynamical Light Scattering, la interacción de la HSA con el
sistema (AgNP-cis-βCD)@(Fluo-Ada).
• Determinar la constante de asociación supramolecular entre el fluorósforo y las
nanopartículas así como la constante de la asociación HSA- AgNP-cis-βCD.
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Anexos 53
Anexo 1. RMN-1H del Fluo-Ada.
Anexo 2. RMN-13C del Fluo-Ada.

Anexos 54
Anexo 3. Espectrometría de masa del Fluo-Ada.

Anexos 55
Anexo 4. Espectrometría de masa del cis-βCD
Anexo 5. Izquierda. Voltamogramas de la formación de AgNP-Cit. Derecha. Espectros de

extinción de las AgNP-Cit para diferentes tiempos de reacción.
Anexos 56
Anexo 6.
La ecuación de Randles-Sevcik describe cómo la intensidad de ip es proporcional a la

concentración de la especie electroactiva, en este caso Ag +, si se mantienen los demás
parámetros constantes.
Concentración de iones Ag+ para varios tiempos de reacción obtenidos por voltametría
cíclica.
t(min) 0 2.5 5.0 7.5 10 12.5
[Ag+](mol/l)10-4 4,7 3,71 3,0 1,96 0.72 -

Influencia de las propiedades opto-electrónicas de nanopartículas de plata sobre la fluorescencia de un derivado de la fluoresceína

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LBI

Laboratorio de Bioinorgánica Facultad de Química Universidad de la Habana

Influencia de las propiedades opto-electrónicas de

Autor: Greter Amelia Ortega Rodríguez

Aunque abatidos por el cansancio, los diplomantes gustosos escriben de último la

Gracias a los profesores de la Facultad de Química de la Universidad de la Habana por

Es mi deber y además agradecer a todos los que me auxiliaron en mi trabajo científico:

En el plano muy personal a dos hombres que me encaminaron en la carrera de la

A María del Carmen y Miguel, gracias por su ayuda y cariño.

A mi ángel de la guarda, contrincante de pesos pesados, amigo, hermano y papá,

A Julio, por ser mi mano derecha y mi corazón izquierdo.

Capítulo 2 Revisión bibliográfica

Capítulo 3 Parte experimental

3.4 Síntesis de nanopartículas de plata con citrato de sodio (AgNP-Cit). 24

Capítulo 4 Resultados y Discusión.

La AgNP modula la fluorescencia del Fluo-Ada asociado supramolecularmente, según las

También fue demostrado que si se adiciona albúmina humana al sistema supramolecular en el

The supramolecular inclusion of Fluo-Ada in the cavity of β-cyclodextrin was followed

Entre los objetivos de estudio de las nanociencias se encuentra la combinación sinérgica de

Expuesto lo anterior nos hemos planteado como problema científico:

La utilización simultánea de los efectos, atenuantes y de incremento, que ejercen las

Para demostrar nuestra hipótesis nos trazamos el objetivo principal siguiente:

Diseñar y sintetizar un sistema supramolecular compuesto por nanopartículas de plata y un

1. Sintetizar nanopartículas de plata (AgNP) recubiertas con derivados de β-ciclodextrina

2.1 Nanopartículas. Definición y propiedades.

Las notorias diferencias entre las propiedades químico-físicas de la materia en la escala

2.2 Nanopartículas de plata.

Recientemente, se ha comenzado una nueva estrategia para el desarrollo de biosensores

2.3 Nanopartículas de plata. Propiedades químicas.

Las propiedades químicas mencionadas se emplean en el diseño de metodologías para la

2.4 Síntesis de nanopartículas de plata.

La función del agente protector es recubrir la nanopartícula e inhibir el proceso de

Figura 2.2: Representación de AgNP

Como en este trabajo se utilizó, para la síntesis de AgNP, el método de reducción y

2.5 Métodos de obtención con citrato.

Típicamente, se obtienen nanopartículas de plata estables cuando una solución acuosa de

Figura 2.4: Microscopías de

2.5.1 Mecanismo de formación de las AgNP a través de la reducción y estabilización

2.6 Resonancia de plasmones superficiales de nanopartículas metálicas.

Al irradiarse una nanopartícula metálica de dimensiones comparables a las longitudes de

Cuando las partículas irradiadas presentan dimensiones considerablemente más pequeñas

El movimiento de los electrones producido por la interacción de la luz con la nanopartícula

2.7 Bandas de Plasmones Superficiales.

Como estos procesos de resonancia plasmónica tienen elevadísimas probabilidades, las

2.8 Bandas de Plasmones Superficiales. Modelo de Mie.

Cuando la luz interacciona con una nanopartícula esférica, de radio R, se producen en su

A partir de las consideraciones del régimen cuasiestático y de las representaciones del

Donde V es el volumen de la esfera, c es la constante de velocidad de la luz, es la

Es importante notar que la función dieléctrica de la partícula depende no solo de la

En la expresión 1, si es débilmente independiente de ω, el valor de se hace máximo,

El espectro de extinción UV-Vis para N partículas metálicas idénticas por unidad de

Cuando las nanopartículas son polidispersas, con una distribución de tamaños

2.9 Factores que afectan la SPB de las nanopartículas metálicas esféricas.

La función dieléctrica de un metal está fundamentalmente gobernada por la estructura

Figura 2.7. Representación esquemática de los

Como ya se explicó en el sub-epígrafe 2.8, la intensidad de las bandas de resonancia

Según la expresión 5, el ancho de la banda de resonancia plasmónica será mayor mientras

2.10 Campos electromagnéticos asociados a las SPR de nanopartículas metálicas.

La polarización de los electrones durante la resonancia plasmónica induce un campo

Figura 2.8: Se presenta el contorno

2.11 Influencia de las nanopartículas metálicas sobre la fluorescencia de especies

Los campos electromagnéticos generados en la superficie de las nanopartículas, durante la

Los fluorósforos asociados a la superficie de nanopartículas metálicas pueden aumentar o