Rapid and Accurate Molecular Identification of the Emerging Multidrug-Resistant Pathogen

Candida auris

Identificación molecular rápida y precisa del patógeno emergente multidrogo resistente

Candida auris

ABSTRACT
Candida auris is an emerging multidrug-resistant fungal pathogen causing
nosocomial and invasive infections associated with high mortality. C. auris is
commonly misidentified as several different yeast species by commercially
available phenotypic identification platforms. Thus, there is an urgent need for
a reliable diagnostic method. In this paper, we present fast, robust, easy-to-
perform and interpret PCR and real-time PCR assays to identify C. auris and
related species: Candida duobushaemulonii, Candida haemulonii, and Candida
lusitaniae. Targeting rDNA region nucleotide sequences, primers specific
for C. auris only or C. auris and related species were designed. A panel of 140
clinical fungal isolates was used in both PCR and real-time PCR assays
followed by electrophoresis or melting temperature analysis, respectively. The
identification results from the assays were 100% concordant with DNA
sequencing results. These molecular assays overcome the deficiencies of
existing phenotypic tests to identify C. aurisand related species.
ABSTRACTO
Candida auris es un patógeno fúngico emergente resistente a múltiples fármacos que causa infecciones
nosocomiales e invasivas asociadas con una alta mortalidad. C. auris comúnmente se identifica
erróneamente como varias especies de levadura diferentes mediante plataformas de identificación
fenotípicas disponibles comercialmente. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de un método de
diagnóstico confiable. En este documento, presentamos rápidos, robustos, fáciles de realizar e interpretar
PCR y ensayos de PCR en tiempo real para identificar C. auris y especies relacionadas: Candida
duobushaemulonii, Candida haemulonii y Candida lusitaniae. Se diseñaron las secuencias de nucleótidos
de la región rDNA, cebadores específicos para C. auris solo o C. auris y especies relacionadas. Se utilizó
un panel de 140 aislados fúngicos clínicos tanto en PCR como en ensayos de PCR en tiempo real
seguidos de electroforesis o análisis de temperatura de fusión, respectivamente. Los resultados de
identificación de los ensayos fueron 100% concordantes con los resultados de secuenciación de ADN.
Estos ensayos moleculares superan las deficiencias de las pruebas fenotípicas existentes para identificar
C. auris y especies relacionadas.

KEYWORDS

Candida duobushaemulonii

Candida haemulonii

Candida lusitaniae

Candida auris

PCR
diagnostics

identification

real-time PCR

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PALABRAS CLAVE Candida duobushaemulonii Candida haemulonii Candida

lusitaniae Candida auris PCR diagnóstico identificación PCR en tiempo real Sección
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INTRODUCTION
Candida auris is an emerging multidrug-resistant yeast that can cause invasive
infections and is associated with high mortality. It was first described in 2009 after
being isolated from the external ear discharge of a patient in Japan (1). Since then, C.
auris infections have been reported from South Korea (2, 3), India (4–6), Pakistan (5),
Kuwait (7), Israel (8), South Africa (5, 9), the United Kingdom (10–12), Spain (13), the
United States (14, 15), Colombia (16), and Venezuela (5, 17). The Centers for Disease
Control and Prevention (CDC) and other research groups reported that almost all C.
auris isolates are highly resistant to fluconazole, with the other azoles showing variable
antifungal activity and isavuconazole and posaconazole being the most active ones.
Moreover, up to one-third were resistant to amphotericin B, and a few were resistant to
echinocandins. Some isolates demonstrated elevated MICs to all three major antifungal
classes (azoles, echinocandins, and polyenes), indicating that treatment options
against these multidrug-resistant isolates would be limited (18–20). C. auris is of great
concern to public health agencies, due to the possibility that biologic and epidemiologic
factors could trigger an even more extensive worldwide emergence of C. auris
infections (21). Therefore, it is important for clinical microbiology and public health
laboratories to rapidly and accurately identify this organism to help prevent health care-
associated outbreaks and improve survival among infected patients by enabling
appropriate early antifungal therapy implementation (22, 23).

Candida auris es una levadura emergente resistente a múltiples fármacos que puede
causar infecciones invasivas y se asocia con una alta mortalidad. Fue descrito por
primera vez en 2009 después de ser aislado de la descarga del oído externo de un
paciente en Japón (1). Desde entonces, se han notificado infecciones por C. auris en
Corea del Sur (2, 3), India (4-6), Pakistán (5), Kuwait (7), Israel (8), Sudáfrica (5, 9), la
Reino Unido (10-12), España (13), Estados Unidos (14, 15), Colombia (16) y
Venezuela (5, 17). Los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC)
y otros grupos de investigación informaron que casi todos los aislamientos de C. auris
son altamente resistentes al fluconazol, mientras que los otros azoles muestran
actividad antifúngica variable y el isavuconazol y el posaconazol son los más activos.
Además, hasta un tercio eran resistentes a la anfotericina B y algunos eran resistentes
a las equinocandinas. Algunos aislados demostraron elevadas CIM a las tres
principales clases de antifúngicos (azoles, equinocandinas y polienos), lo que indica
que las opciones de tratamiento contra estos aislados resistentes a múltiples fármacos
serían limitadas (18-20). C. auris es una gran preocupación para las agencias de salud
pública, debido a la posibilidad de que factores biológicos y epidemiológicos puedan
desencadenar una aparición mundial aún más extensa de infecciones por C. auris
(21). Por lo tanto, es importante para la microbiología clínica y los laboratorios de salud
pública identificar este organismo de manera rápida y precisa para ayudar a prevenir
brotes asociados a la atención médica y mejorar la supervivencia entre pacientes
infectados al permitir la implementación apropiada de terapia antifúngica temprana (22,
23).

C. auris is phenotypically close to Candida haemulonii (1). It was reported that

laboratories worldwide, relying on commercially available phenotypic platforms for
yeast identification, commonly misidentify C. auris as C. haemulonii but also as several
other yeast species (C. famata, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C. sake,
Rhodotorula glutinis, and Saccharomyces cerevisiae) (18, 22, 24, 25). Moreover, some
clinical laboratories do not identify all Candida to the species level, placing C. auris
isolates in the “other Candida spp.” category (18). Thus, the prevalence of C. auris is
probably significantly underestimated due to unreliable identifications (4, 18, 25).
C. auris es fenotípicamente cercano a Candida haemulonii (1). Se informó que los laboratorios de todo el
mundo, que dependen de plataformas fenotípicas disponibles comercialmente para la identificación de
levaduras, comúnmente identifican erróneamente C. auris como C. haemulonii, pero también como varias
otras especies de levadura (C. famata, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C. sake,
Rhodotorula glutinis y Saccharomyces cerevisiae) (18, 22, 24, 25). Además, algunos laboratorios clínicos
no identifican a todas las Candida a nivel de especie, colocando cepas de C. auris en la categoría "otras
Candida spp." (18). Por lo tanto, la prevalencia de C. auris probablemente se subestime significativamente
debido a identificaciones poco confiables (4, 18, 25).

Given the current diagnostic urgency surrounding this pathogen, the aim of this work
was to develop molecular-based methods that can quickly and accurately identify C.
auris and related species (C. duobushaemulonii, C. haemulonii, and C. lusitaniae). The
performance of the proposed methodology was evaluated using a comprehensive
panel of clinical isolates with a wide spectrum of variable fungal species.
Dada la urgencia diagnóstica actual que rodea a este patógeno, el objetivo de este trabajo fue desarrollar
métodos moleculares que puedan identificar de forma rápida y precisa C. auris y especies relacionadas (C.
duobushaemulonii, C. haemulonii y C. lusitaniae). El rendimiento de la metodología propuesta se evaluó
mediante un panel completo de aislados clínicos con un amplio espectro de especies fúngicas variables.

RESULTS
RESULTADOS

Primer design.The specific primers enabling the identification of C. auris and related
species, C. duobushaemulonii, C. haemulonii, and C. lusitaniae are listed in Table 1.
The designed amplicons cover a fragment of 5.8S, all of ITS2, and a fragment of 28S.
CauF and CauR primers were designed to selectively amplify a 163-bp-long PCR
product specific for C. auris only. CauRelF and CauRelR primers were designed to
selectively amplify PCR products from either C. auris, C. duobushaemulonii, C.
haemulonii, or C. lusitaniae. Amplified fragments differ in length (215 bp, 208 bp, 197
bp, and 203 bp, respectively) and composition and can be easily distinguished upon
melting curve analysis
Diseño de cebador. Los cebadores específicos que permiten la identificación de C. auris y especies
relacionadas, C. duobushaemulonii, C. haemulonii y C. lusitaniae se enumeran en la Tabla 1. Los
amplicones diseñados cubren un fragmento de 5,8 S, todos de ITS2, y un fragmento de 28S. Los
cebadores CauF y CauR se diseñaron para amplificar selectivamente un producto de PCR de 163 pb
específico para C. auris únicamente. Los cebadores CauRelF y CauRelR se diseñaron para amplificar
selectivamente productos de PCR de C. auris, C. duobushaemulonii, C. haemulonii o C. lusitaniae. Los
fragmentos amplificados difieren en la longitud (215 pb, 208 pb, 197 pb y 203 pb, respectivamente) y la
composición, y se pueden distinguir fácilmente tras el análisis de la curva de fusión

iew this table:

Mira esta tabla:

Rapid and Accurate Molecular Identification of the Emerging Multidrug-Resistant

Pathogen Candida auris
Identificación molecular rápida y precisa del patógeno emergente multidrogo resistente Candida auris

Traducion de la tabla:
Primers utilizados en el estudio; Sequence …Secuencia
Specificity….Especificidad

TABLE 1
TABLA 1

Primers used in the study

Candida auris-specific PCR and real-time PCR assays.A 163-bp PCR product specific for Candida auris
was observed for all 44 C. auris DNA samples. No PCR products were detected for other yeast and mold
isolates or human DNA (100% sensitivity and 100% specificity). Moreover, robust and reproducible
amplicons were observed for all isolates when DNA extracts were replaced with a direct single-colony
pick in the established assay (Fig. 1).

Primers utilizados en el estudio

PCR específica de Candida auris y ensayos de PCR en tiempo real. Se observó un producto de PCR de
163 pb específico para Candida auris para las 44 muestras de ADN de C. auris. No se detectaron
productos de PCR para otros aislamientos de levadura y moho o ADN humano (100% de sensibilidad y
100% de especificidad). Además, se observaron amplicones robustos y reproducibles para todos los
aislamientos cuando los extractos de ADN se reemplazaron por un pico directo de una sola colonia en el
ensayo establecido (figura 1).