Facultad de ciencias agroindustriales

Programa de Ingeniería de alimentos

Microbiología de los alimentos – Procesos Lácteos

Determinación del Tiempo de Destrucción Térmica (TDT) y del Punto de

Muerte Térmica (PMT) en la flora mesófila y en los coliformes totales en
leche fresca

Objetivo
Que el alumno aplique un método que le permita conocer la relación entre el tiempo
y la temperatura para eliminar a los microorganismos presentes en leche cruda
mediante pasteurización a diferentes temperaturas y tiempos de retención.

Introducción
La destrucción de microorganismos mediante tratamiento térmico es una de las
principales formas de conservación de la leche fresca. De estos tratamientos
encontramos diferentes adaptaciones tecnológicas como la pasterización y la
ultrapasterización.

Cinética de destrucción térmica (Ibarz y Barbosa. 2005 pg 506): Esta permite

modelar el efecto de los tratamiento térmicos que para el caso de los microorganismos
se consideran de primer orden. En las cuales a una temperatura constante la variación
de microorganismos (N) con respecto al tiempo (t) se puede expresar de la siguiente
manera:
𝑑𝑁
= −𝐾𝑁
𝑑𝑡
Donde K es la constante de inactivación térmica. Integrando esta ecuación entre un
tiempo inicial (cero) con un recuento de microorganismo No y un tiempo t tenemos:

𝑁 = 𝑁0 𝑒 −𝑘𝑡 (Ecuación 1)

Siendo N el numero de microorganismos presente en el tiempo t a una temperatura

definida de pasteurización. Las formas vegetativas o esporuladas de los
microorganismos tienen diferentes constantes de inactivación térmica siendo mucho
mas altas las de las formas esporuladas.

Tiempo de reducción decimal (D): Se define como el tiempo de tratamiento térmico

a una temperatura, para que el número de microorganismos se reduzca a la decima
parte y se representa con (DT). Este tiempo se considera independiente de la
concentración inicial de microorganismos y depende de la temperatura de tratamiento
y el tipo de bacteria o alimento en el que se encuentre presente. Derivado de esto se
determina el tiempo de tratamiento mediante la siguiente expresión: 𝑡 =
𝑁
𝐷𝑇 𝑙𝑜𝑔10 ( 0)
𝑁

Curvas de destrucción térmica: Linealizando la ecuación 1 tenemos:

𝑁
𝑙𝑛 ( ) = −𝑘𝑡
𝑁0

log N
Si evaluamos la destrucción térmica a
diferentes temperaturas y
representando en coordenadas
semilogaritmicas N/N0 obtendremos T3
T2
una recta con pendiente –k como se T1
muestra en el siguiente ejemplo de una
t
curva de inactivación térmica
para formas vegetativas de microorganismos don T1>T2>T3.
A continuación se presenta una grafica con las curvas de inactivación para la leche:

El tiempo de destrucción térmica (TDT) o DT es el tiempo necesario para destruir un

número dado de microorganismos
a una temperatura determinada. Mediante este método, la temperatura se mantiene
constante y se determina el tiempo necesario para destruir todas las células
microbianas. El punto de muerte térmica (PMT), es la temperatura necesaria para
destruir un número dado de microorganismos en un tiempo determinado.

Grafica 2. Obtención del tiempo de reducción decimal.

Constante de tiempo de muerte térmica (Z): Los tratamientos térmicos se realizan

a diferentes temperaturas, dependiendo de el tipo de alimento o proceso que se realice.
Por lo tanto se deben tener datos de destrucción térmica para diferentes temperaturas,
por lo que se tiene una relación entre el tiempo de destrucción térmica y la temperatura
, esto se logra graficando los Tiempos de destrucción térmica (TDT), contra la
temperatura y mediante la pendiente de esta recta se obtiene el valor Z . si se tiene el
calor de TDT a una temperatura de referencia DR y se conoce la valor Z podemos
calculad el nuevo valor D1 a la temperatura T1 mediante la siguiente expresión:
𝑇𝑅 −𝑇1
𝐷1 = 𝐷𝑅 10 𝑧

Grafica 2.Curvas de inactivación térmica para leche (Ibarts y Barbosa. Pg 508)

Termoresistencia (Barragan y Rodriguez 2013): En general, la termorresistencia de

los microorganismos está relacionada con su temperatura óptima de crecimiento. Los
microrganismos psicrófilos son los más termosensibles. Las bacterias esporógenas
son las más termorresistentes. Respecto a la reacción de Gram, las bacterias gram (+)
tienden a ser más resistentes, especialmente los cocos. Las levaduras y los mohos
tienden a ser medianamente sensibles al calor. Existen diversos factores que influyen
en la termorresistencia de los microorganismos:

• Agua. La termorresistencia de las células microbianas aumenta al disminuir el

contenido de agua o la humedad de un alimento.
• Grasa. En presencia de grasa hay un aumento general de la termorresistencia
de algunos microorganismos.
• Sales. La influencia de las sales en la termorresistencia de los microorganismos
es variable y depende de la clase de sal así como de la concentración empleada,
 entre otros factores.
• Carbohidratos. La presencia de azúcares en el alimento con el que se realiza la
suspensión origina un aumento en la termorresistencia de los microorganismos.
• pH. Los microorganismos son más resistentes al calor a su pH óptimo de
crecimiento.
• Proteínas y otras sustancias. Durante el calentamiento del alimento las
proteínas del mismo tienen un efecto protector de los microorganismos.
• Número de microorganismos. A mayor es el número de microorganismos,
mayor es el grado de termorresistencia.
• Edad de los microorganismos. Las células bacterianas tienden a ser más
resistentes al calor mientras se encuentran en la fase estacionaria de
crecimiento y menos resistentes durante la fase logarítmica.
• Sustancias inhibidoras. Cuando el calentamiento tiene lugar en presencia de
antibióticos, de SO2 y de otros inhibidores microbianos, la termorresistencia de
la mayoría de los microorganismos disminuye.

Material y equipo:

• Montaje de pasteurización con temperatura variable.

• Leche cruda
• Cronómetro
• Probeta 500 mL
• Cajas de petri de 90 mm con Agar RVB
• Cajas de petri de 90 mm con Agar Plate Count
• Agua peptonada estéril
• Asas bacteriológicas redondas
• Bolsas de stomacher
• Homogenizador peristáltico
• Frascos de vidrio estériles con tapa

Procedimientos:

1. Punto de Muerte Térmica (PMT):

• Filtrar 5L de leche cruda y realizar recuento inicial por duplicado en placa

-3
de mesófilos totales y coliformes totales realizando dilución 10 .
• Someter una muestra de la leche cruda a esterilización en autoclave a 121
lb/in2 durante 15 min para su análisis microbiológico.
• Pasteurizar la muestra de leche a temperaturas de 55°, 60°,65°,70°, 75°, C.
Y utilizando dos tiempos de retención.
• Una vez transcurrido el tiempo de cada tratamiento tomar una muestra de 250
mL de leche es un recipiente estéril con tapa, realizar recuento de mesófilos
 totales en agar Plate Count y coliformes totales en RVB.

Determinación de resistencia térmica:

Incubar las placas invertidas a 37°C por 24 h y determinar el número UFC/mL para
cada caso.

Transcurrido el tiempo de incubación, examinar las placas y comparar los recuentos

con la con la leche cruda y la esterilizada.

Observar y anotar cuidadosamente los resultados para poder establecer el nivel de

reducción de los dos grupos de microorganismos estudiados.

2. Tiempo de Destrucción Térmica (TDT):

Pasteurizar la leche a las diferentes temperaturas y calcular los dos tiempos de

residencia definidos para el sistema de pasteurización, acorde al caudal en el sistema
de pasteurización que se estandarice para lograr cada temperatura de pasteurización.

Tabla 1. Resultados de los recuentos del experimento de muerte térmica

Recuento Leche cruda 55 °C 60 °C 65 °C 70°C 75°C Leche estéril

Mesófilos totales
Colofirmes totales
Calculo del tiempo de residencia.

1. Determine la longitud y el diámetro de las secciones de tubería a través de las

cuales fluye la leche posterior a la sección de calentamiento.
2. Calcule el volumen de la sección de retención.
3. Con el grifo que se encuentra a la salida del intercambiador de placas regule el
caudal a lograr la temperatura deseada a posterior a la zona de retención.
4. Una vez lograda la temperatura deseada determine el caudal a la salida del grifo
usando la probeta de 500 mL y el cronómetro.
5. Con el volumen de la zona de retención y el caudal del sistema calcule el
tiempo de retención de los dos tratamientos térmicos a temperatura constante.

Calculo de las características fisicoquímicas de leche

1. Determinar densidad por método lactedensimétrico a la leche cruda y leche

pasteurizada

L(15/15°C) = l + 0,24 (T – 15°C)

 Densidad (15/15°C) = 1 + (L(15/15°C)/1000)

2. Determinar acidez titulable a la leche cruda y leche pasteurizada

% ácido láctico = ml NaoH gastados * N NaoH * meq ac. láctico * 100

ml de muestra

3. Determinar pH a la leche cruda y leche pasteurizada

4. Analizar resultados y comparar con el decreto 616 de 2006

Una vez transcurrido cada uno de los tiempos de pasteurización, tomar la muestra de
leche y guardar en hielo o a temperatura inferior a cero grados antes de su preparación
para siembra (con hielo).

Cuantificar las bacterias sobrevivientes al proceso de pasteurización a una

temperatura determinada al cultivar las muestras de leche sobre placas de agar
estándar plate count para determinar mesófilos totales y rojo vilis brillante para
determinar coliformes totales.


Control no expuesto. Observar cuidadosamente los resultados para poder establecer

en qué tiempo se ubica el TDT para cada uno de los grupos de microorganismos
probados.

Recuento Leche cruda Tiempo 1 Tiempo 2

Mesófilos totales
Colofirmes totales
. Tabla 2. Resultados de los recuentos del experimento de muerte
térmica.

Preguntas:

1 ¿Por qué son más sensibles las bacterias psicrófilas al tratamiento térmico?
2 ¿Explique por qué las bacterias Gram (+) son más resistentes al tratamiento
térmico?
3 ¿Cuál es el componente de los microorganismos que se ve mayormente afectado
por el tratamiento térmico?
4 ¿Qué grupo de microorganismos son mas resistentes al tratamiento térmico
realizado y argumente por que?
5 ¿A qué tiempo se encontró el TDT de cada uno de los grupos de bacterias y
explique a qué se debe este resultado?
6 ¿Cómo se define el tiempo de reducción decimal?
7 En una curva de la tasa de crecimiento de un microorganismo en función de la
temperatura, se distinguen tres puntos importantes conocidos como temperaturas
cardinales, ¿a qué se refieren estas temperaturas? .

Bibliografía:

Albert Ibarz. Gustavo Barbosa Cánovas. Operaciones Unitarias en la ingeniería de

alimentos. Ediciones Mundi Prensas. Madrid 2005.

Prado Barragán A., Rodríguez Serrano G. Y otros, Manual de practicas de laboratorio de

Microbiología de Alimentos. Universidad autónoma metropolitana. México. 2013.