Informe de laboratorio:

Cuantificación Espectrofotométrica de Proteínas.

Bioquimica General

BIO-003
 17 de abril del 2018

Introducción.

Los aminoácidos son la base de todo proceso vital necesaria para los procesos
metabólicos. Además, son elementos constructores, algunos esenciales y deben ser
consumidos en la dieta, mientras que otros pueden ser sintetizados directamente por
nuestro cuerpo mediante reacciones químicas. Los aminoácidos son la unidad estructural
de las proteínas, los cuales se encuentran unidos por medio de uniones peptídicas,
asimismo las proteínas desempeñan un papel fundamental en el organismo, son capaces
de producir enzimas y hormonas que necesitamos, provee resistencia y energía, también
son importantes para la síntesis y mantenimiento de tejidos.(1)

Las proteínas también se pueden reconocer y cuantificar, el principio fundamental para la

determinación de concentración proteica se basa en establecer una relación entre la
cantidad de un producto formado con la reacción o interacción entre un reactivo y una
función química proteica. Existen diversos métodos para la cuantificación de las proteínas,
esto se debe a la propiedad intrínseca para absorber la luz en el espectro ultravioleta, las
proteínas también presentan máximos de absorción, por lo que se eligen las cadenas
laterales más reactivas, capaces de generar productos coloreados.

La reacción de biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de un

complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen más de un enlace
peptídico, como las proteínas.

Objetivos

 Aprender el manejo de espectrofotómetro y su aplicación en los métodos

colorímetros
 Determinar la concentración de proteínas de una muestra de leche.

Procedimiento experimental.

Actividad 1: Reconocimiento y cuantificación de Aminoácidos y Proteínas por absorbancia

a 280 nm.

Se dispuso de 4 tubos de hemólisis y se preparo una micropipeta de p1000 con una

punta especial, la cual se cambio cada vez que se utilizó otra sustancia. Con esta pipeta
se agregó 3 mL de suero fisiológico al tubo n°1; 3 mL de Glicina al tubo n°2; 3 mL de
Triptófano al tubo n°3 y 3 mL de Seroalbúmina de Bovino (SAB) al tubo n°4. Se preparo el
Espectrofotómetro, se ajustó en 280 nm (A280), utilizando cubetas de cuarzo se depositó el
contenido de los tubos de hemólisis para medir la absorbancia. Se tomo el Suero
Fisiológico como muestra Blanco, se calibro para que este quedara en 0; posteriormente
se midió la absorbancia de los líquidos de los tubos n°2; n°3 y n°4. Posteriormente se
midió la concentración de cada muestra según la ecuación de Lambert- Beer y se
analizaron las concentraciones de cada muestra.

Actividad 2: Cuantificación de Proteínas por el método Biuret.

Se dispuso de 8 tubos de ensayo y de una micropipeta p1000 la cual se equipó con una
aguja especial para el aparato y se cambio cada vez que se uso una sustancia distinta;
con esta pipeta se agregó a estos tubos suero fisiológico al 0,9 p/v en diferentes
cantidades; 2,0 mL al tubo n°1; 1,8 mL al tubo n°2, 1,5 mL al tubo n°3, 1,0 mL al tubo n°4
y 0,5 mL al tubo n°5. Posteriormente con la micropipeta se agregó SAB 5 mg/ mL a los
siguientes tubos; 0,2 mL al tubo n°2; 0,5 mL al tubo n°3; 1,0 mL al tubo n°4; 1,5 mL al tubo
n°5 y 2,0 mL al tubo n°6. Se dispuso 2 muestras problemas (1: Leche descremada 1:8 v/v;
2: leche de soja 1:10 v/v) en un tubo se agregó la muestra problema 1 y en otro tubo
muestra problema 2, ambo en una cantidad de 2 mL medido con la micropipeta. A los 8
tubos de ensayo se les agregó 2 mL de Reactivo de Biuret y se mezclo suavemente. Se
dispuso de 4 cubetas plásticas, se preparo el Espectrofotómetro en 540 nm (A540), se
utilizo en tubo n°1 como blanco, y se midió la absorbancia de cada sustancia y se
determinó la concentración de proteínas utilizando la fórmula de diluciones.

Resultados.

Actividad 2:

La mayor concentración de proteínas que se presentó en los tubos fue la del tubo n°6, la
cual estaba compuesta netamente por SAB. Se concluyo que ambas muestras problema
contenían proteínas, luego de los cálculos se dedujo que la Leche descremada contienen
una mayor concentración de proteínas (ver anexo 2)

Muestra problema 1: 2,0625 mg/mL

Muestra problema 2: 1,5 mg/mL

Discusión.

El reactivo de Biuret está compuesto de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico

(CuSO4) y es un método utilizado para detectar presencia de proteínas en una solución,
pueden ser péptidos cortos o con más de dos enlaces peptídicos en sustancias
desconocidas. Este reactivo en soluciones alcalinas, el Cu+2 se une a enlaces peptídicos,
dando el color morado, es decir, positivo. La cantidad de color producido es proporcional a
la concentración de proteínas.(2)

El tubo Nº1 solo contenía NaCl (suero fisiologico) al 0.9% con 200 mL de solución, esta
solución presento un color azul, es decir, dio un resultado negativo en base al reactivo de
Biuret, ya que la disolución no contenía proteínas en su composición, dando como
resultado una tonalidad azul.
En los tubos Nº2, Nº3, Nº4, Nº5 y Nº6 es posible observar tonalidades de color violeta, es
decir, un resultado positivo, ya que en su composición propiamente tal contenía SAB
(Seroalbúmina de bovino), esta se trata de una proteína del plasma de la sangre
encargado de transportar sustancias de naturaleza química muy diversa, como ácidos
grasos, aminoácidos, esteroides, etc, facilitando la transferencia de muchas de ellas
desde la circulación sanguínea a órganos como el hígado, el riñón, el intestino y
el cerebro(3). En las soluciones de cada tubos, se observó un complejo coloreado,
racionando los grupos amino con el Cu+2 dado que se ocupó CuSO4 en un medio básico
donde se ioniza el Cu como Cu+2, lo que produce que se forme un complejo de
coordinación del cobre con los nitrógenos de los enlaces peptídicos, logrando observarse
el color violeta. La tonalidad de morado es mas fuerte dependiendo la cantidad de SAB
agragada a la solucion.

La Ley de Lambert-Beer nos indica que la luz incidente es paralela y monocromática (de
una sola longitud de onda) y que las moléculas de disolvente y de soluto están orientas al
azar (4), esto quiere decir que cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el
cual es una curva que muestra la cantidad de energía radiante absorbida Absorbancia,
por la sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a una
determinada longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia absorbe una
cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto.

Cuando se calculó la absorbancia de las ocho cubetas de plástico a 540 nm, se deduce
que a mayor concentración de aminoácidos (enlaces peptidicos) mayor será la
absorbancia de la muestra. De acuerdo a los datos obtenidos se realizó el grafico de
calibración, el cual sirve para la determinación de la concentración de una sustancia en
una muestra desconocida, por ejemplo, en este caso la solución estándar de
seroalbúmina de Bovino, que se implementa para determinar la cantidad de esta
compuesto (proteínas) presentes en una muestra incógnita.

Conclucion.

Gracias a la espectrofotometría y su relación con la ley de Lambert-Beer, se establecieron

las concentraciones y la absorbancia de las distintas soluciones del práctico. Además, con
el reactivo de Biuret se determinó si la muestra era positiva (color morado) en el caso de
poseer enlaces peptídicos o negativa (azul) en caso de no tener este enlace.

Referencias.

(1) Nelson, David L. Cox, Michael M. Lehninger : principios de bioquímica /Barcelona

Omega, 2015.xxviii, 1196 p, [103] : Edición ; 6a.
(2) Lima, G. Práctico Química. 13 de enero del 2017. Disponible en:
http://limapecoy.blogspot.cl/p/practico-1.html
(3) CCM. Albúmina sérica. 07 de septiembre del 2017. Disponible en:
http://salud.ccm.net/faq/22680-albumina-serica-definicion
(4) Lehninger. Principios de Bioquímica. David L. Neison, Michael M. Cox. 5° Edición,
2009.
Anexos.
Anexo 1: Tabla de concentraciones de muestra

Concentracion Concentracion
teorica Experimental
Muestra A280
(mg/ml) (mg/ml)

Suuero Fisiologico 0 0 0
Glicina 000,4 1,5089X10-3 2,01005x10-3
Triptofano 0,557 0,023 0,09789103691

Seroalbumina de 0,424 0,649 9,675063892x10-3

bovino (SAB) (mL)

Descripcion: Tabla comparativa entre concentracion teorica y concentracion

experimental, en base a resultados dados por ecuación de LambertBeer y la absorbancia
a 280nm (A280) de cada muestra problema

Anexo 2: Grafico de Absorbancia v/s concentración.

Grafico de calibracion
y = 0.2247x - 0.0038
R² = 0.9968
0.6

0.5

0.4
Proteinas (mg/mL)

0.3

0.2

0.1

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
-0.1
Absorvancia a 540 nm (A540)
Descripción: En el grafico resiente se muestra la relación directa que hay entre la
absorbancia y la concentración de cada muestra, obteniendo como conclusión que
mientras mas proteínas haya en la muestra mayor es la absorbancia.

Anexo 3: Cálculo de Concentración de Proteínas en muestra problema: (C1 x V1= C2 x V2)

𝑚𝑔 𝑚𝑔
Muestra problema 1: leche descremada 1 litro C= 33 𝑚𝐿
1:8= 4,125 𝑚𝐿

𝑚𝑔
4,125 𝑚𝐿
x 2 mL = 2,0625 mg/ml

4 mL
𝑚𝑔 𝑚𝑔
Muestra problema 2: leche de soja 1 litro C= 30 1:10 = 3
𝑚𝐿 𝑚𝐿

𝑚𝑔
3 𝑚𝐿
x 2 mL = 1,5 mg/ mL

4 mL