Efecto del período luz-oscuridad sobre la estabilidad de membrana del eritrocito

bovino
Cerutti, R. D.; Scaglione, M. C.; Gennaro, A. M.

INTRODUCCIÓN

Las múltiples actividades biológicas de los seres vivos no se manifiestan de

manera constante. Por el contrario varían de forma periódica, regular y predecible.
Actualmente se admite que la ritmicidad es una propiedad fundamental de todos los
organismos, desde los unicelulares hasta los pluricelulares más complejos en todos
los niveles de organización, desde el subcelular hasta el sistema orgánico en su
totalidad (Reinberg, 1979).

La cronobiología (Reinberg, 1982) se refiere al estudio sistemático de las

características temporales de la materia viva, incluye el estudio de ritmos biológicos
como, por ejemplo, las oscilaciones periódicas en variables biológicas y los cambios
asociados al desarrollo.

Las alteraciones cíclicas de membranas celulares en términos estructurales y

fisiológicos (Chedid y Nair, 1972; Rensing y Goedeke, 1976), en la fosforilación de las
proteínas estructurales, funcionales y reguladoras (Letnansk y Rensinger, 1972; Potter
et al., 1966;Vilchez y Saffe de Vilches, 1971; Watanabe et al., 1968) y también en el
metabolismo del RNA y DNA (Barnum et al., 1957; Barnum et al., 1958; Eling, 1967;
Hardeland et al., 1973; Letnansk, 1977), pueden ser consecuencias de ritmos de
fosfolípidos de membranas celulares. Esta hipótesis ha sido desarrollada durante los
últimos cuarenta años, de forma indirecta, a partir de estudios dedicados a la
marcación de estos fosfolípidos (Halberg et al., 1956; Barnum et al., 1957; Halberg et
al., 1959).

Las oscilaciones en la producción, cantidad y mecanismos de acción de

hormonas deben contribuir en los eventos rítmicos que se producen en las
membranas, en los mecanismos de transcripción y traducción y en otras muchas
funciones celulares. Esas variaciones rítmicas funcionales coinciden (o estarían en su
génesis) con reorganizaciones profundas y precisas de las estructuras celulares, tales
como el núcleo, las organelas celulares y otros constituyentes citoplasmáticos y de
membrana. Por ejemplo, es conocido el papel ejercido por hormonas peptídicas y
esteroides en los sistemas biológicos y particularmente en los ritmos biológicos (Clegg
y Clegg, 1969; Frieden y Just, 1970; Heddlund et al., 1973; O´Malley et al., 1969,
Pascualini, 1976). Ellos interactúan con proteínas receptoras específicas, encontradas
en las membranas celulares (peptídicas) o sino, en el citoplasma (esteroides) (Szego,
1976; Yamamoto y Albert, 1975) llevando a la activación /desactivación enzimática y
alteraciones de las síntesis de RNA y proteínas, respectivamente (Barnack y Coffey,
1983; Jensen y De Sombre , 1972; O´Malley et al., 1969; Spelsberg y Halberg, 1981;
Valentine y Hollemberg, 1984). También se demostró la periodicidad de receptores de
membranas para varias hormonas (Boyd y Splesberg, 1979; halberg et al., 1978;
Hrusheskiy et al., 1979; Hughes et al., 1976; Labrosse et al., 1978; Lemmer et al.,
1985; Splesberg y Halbert, 1980) así como también para factores epidémicos
(Scheving et al., 1979 y 1980).
Se encontraron resultados semejantes en estudios dedicados a las enzimas
relacionadas con el transporte a través de membrana, con la fosforilación y con
mecanismos de transducción de energía, tales como adenilato ciclasa (Dikstein, 1971;
Gerich, 1980;Perlow et al., 1977; Wagner y Frosch, 1974; Wagner et al.; 1974)
guanilato ciclasa (Guillemant et al., 1978 y 1979), 5-nucleotidasa (Klaushofer et al.,
1979; Von Mayersbach y klaushofer et al., 1979) glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Frosch y Wagner, 1973; Frost et al., 1973;
Deitzner et al., 1974). También fue encontrada periocidad circadiana de permeabilidad
para las membranas nucleares (Kittlck, 1970).

La medición de la duración de las fases de luz oscuridad es fundamental para

el desencadenamiento de la respuesta fotoperiódica y también para la regulación de
los ritmos diarios.

La pineal es la principal interface entre el ciclo luz-oscuridad ambiental y el

sistema nervioso central y el endocrino La extensión de la noche se evalúa a partir de
una señal humoral dada por la hormona de la pineal, melatonina (Arendt, 1995).

A pesar de no conocerse completamente la función de la pineal en distintos

procesos fisiológicos, se puede afirmar que es el principal mediador de la respuesta
fisiológica en los ritmos circanuales y un poderoso modulador de los ritmos circadianos
(Cardinali, 1981).

Las actividades biosintética y secretora de la glándula pineal responde

primariamente a estímulos luminosos (regulación del tipo neural) y secundariamente a
estímulos hormonales provenientes de los tejidos periféricos (regulación del tipo
hormonal (Cardinali, 1981b; Cardinali et al., 1985, 1991 y 1994; Cardinali y Vacas,
1987; Vollrath, 1981).

La secreción de melatonina es resultado de la situación de iluminación

ambiental (Pevet, 1987). El pico de secreción se produce entre las 2 y 6 horas de la
mañana, sin relación con la fase de sueño (Arendt, 1988 y 1995).

La melatonina está implicada en muchos procesos fisiológicos vía mecanismo

de control hipotalámicos, además es muy lipófila y penetra fácilmente dentro de los
tejidos y células, donde puede actuar eliminando radicales libres; esta acción de la
melatonina no requiere receptores.

Ochoa et al., 2003, han demostrado in vitro que la melatonina protege a la

membrana eritrocitaria de la lipoperoxidación inducida, aumentando la fluidez y
disminuyendo la rigidez de membrana.

En mamíferos, la fosfatidilcolina (PC) es el fosfolípido de membrana mas

abundante (1,12,13). Sin embargo, en rumiantes, existe una notable desviación. Las
membranas de los eritrocitos de los rumiantes son particularmente deficientes en PC,
los cuales pueden estar completamente ausente en algunas especies de rumiantes.
En cambio, contienen niveles altos de esfingomielina (SM)(13). Un segundo aspecto
que es único de las membranas de los eritrocitos de rumiantes es la presencia de N-
acetilados aminofosfolípidos, incluyendo N-acil-PE (NAPE) (14). En contraste, las
células madre de la médula, de las cuales los eritrocitos provienen, poseen una
composición lipídica típica de los mamíferos con relativamente altos niveles de PC
(13).

Por ello, el objetivo de este estudio será establecer en neonatos bovinos,

sometidos a diferentes períodos de ciclo luz oscuridad, diferencias en la composición
de la membrana eritrocitaria que le confieran mayor rigidez y por lo tanto mayor
fragilidad..

MATERIALES Y MÉTODO
El trabajo se llevó a cabo en un establecimiento agropecuario de la localidad de
Villa Trinidad, paralelo 19, meridiano 26, provincia de Santa Fe durante agosto 2004.
Se utilizaron 6 terneros, de la especie bovina raza Holstein, de la misma edad,
de peso similares, bajo sistema de crianza artificial, los cuales se dividieron al azar en
dos grupos de tres animales cada uno. Los animales del Grupo A estaban mediante
collar y cadena atados a una estaca a la intemperie, sujetos a la variación natural del
ciclo luz-oscuridad (LO 12:12), los del grupo B se encontraban en una habitación con
condiciones ambientales constantes (LO 24:00), 19 + 0,5 ºC , 50 + 10 humedad
relativa. A todos se les suministraba 2 L de leche cada 12 horas, y ad-libitum, maíz y
heno de alfalfa. A cada animal, a los 30 días de vida, se le extrajo a las 20 horas por
punción yugular 5 ml de sangre . Las muestras fueron divididas en dos alícuotas, una
centrifugada y el suero almacenado a 5 ºC hasta el momento que se cuantificó los
niveles séricos de glucosa, colesterol, triglicéridos, albúmina y proteínas totales. La
determinación se realizó con un autoanalizador (Metrolab Mod. 2100, Argentina)
utilizando Kits comerciales (Wiener lab., Argentina), la otra se sometió a proceso de
lavado de eritrocitos para observar la composición de membrana.
Fluidez de membrana eritrocitaria: Se utilizaron los marcadores de espín
liposolubles 5, 12 y 16-doxil ácido esteárico (5, 12 y 16 SASL, Sigma), en los que un
radical nitróxido sustituye al carbono n de la cadena del ácido esteárico. Estos
marcadores se incorporan a la membrana eritrocitaria en forma aproximadamente
paralela a las cadenas acílicas de los fosfolípidos, y sus espectros de resonancia
paramagnética electrónica (EPR) dan información sobre el grado de desorden de la
bicapa lipídica al nivel donde se encuentra el radical nitróxido. En la marcación se
mantiene una relación molar marcador/lípido menor al 1%. La marcación se realizó
depositando el volumen adecuado de solución stock de cada marcador en etanol
(usualmente 1.2 l, que se evaporan casi instantaneamente) en un tubo de PVC.
Posteriormente se adicionaron 720 l de buffer fosfato salino y 80 l de eritrocitos
lavados y empaquetados. La solución se homogeneizó por agitación suave y se incubó
durante 30 min a temperatura ambiente con posterior centrifugado a 1500  g,
descartando el sobrenadante. Para el experimento, alícuotas del pellet de eritrocitos
marcados (aprox. 20 l) se transfirieron a capilares de vidrio posteriormente sellados.
Los experimentos de EPR se realizaron a una temperatura de (25  1)°C y a la
frecuencia de 9.7 GHz (banda X) en un espectrómetro Bruker ER 200. A partir de los
espectros de EPR de cada marcador puede evaluarse el parámetro hiperfino A max,
proporcional al parámetro de orden de las cadenas acílicas, que está en relación
inversa a la fluidez de membrana (mayor Amax---menor fluidez a esa profundidad de la
bicapa).

Se utilizó test estadístico de Kruskal-Wallis para observar la diferencias entre

los grupos.

RESULTADOS ALCANZADOS
La tabla1 resume las medias y su desvio standard para los dos grupos en las
concentraciones séricas de glucosa, colesterol, triglicéridos, albúmina y proteínas
totales.

Tabla 1: Media y Desvio Standard por grupo de los niveles séricos de glucosa,
colesterol, triglicéridos, albúmina y proteínas totales en terneros Holstein
 parámetro condición X DS

glucosa natural 5.545 0.913

controlada 5.046 0.290

colesterol natural 151.113 7.447

a

controlada 172.867 19.424

b

triglicérido natural 8.022 3.482

controlada 16.366 6.711

albúmina natural 0.601 0.211

controlada 0.581 0.200

proteína natural 5.271 0.594

controlada 6.456 0.940

a,b: Diferentes subíndices para una columna del mismo componente indican
diferencias significativas a p<0,05.
Tabla 2: Media y Desvío Standard por grupo de los valores del parámetro hiperfino
Amax obtenido a partir de espectros de resonancia paramagnética electrónica de
marcadores de espín a distintas profundidades en la membrana de eritrocitos de
terneros Holstein. El aumento de Amax indica menor fluidez de membrana.

naturales controladas

Amax (gauss) DS (gauss) X Amax (gauss) DS (gauss)

Carbono

5 29.72 0.03 29.64 0.09

12 28.00a 0.13 28.32b 0.13

16 18.74a 0.07 18.86b 0.01

a,b: Diferentes subíndices para una fila del mismo componente indican
diferencias significativas a p<0,05.
DISCUSIÓN
Los experimentos de EPR muestran que la región central de la bicapa lipídica de la
membrana eritrocitaria está más rigidizada en animales sometidos a condiciones
controladas.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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gobiernan la vida. Ed. La ciencia /188 para todos.México. pp.197.
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Cronobiología:principios y aplicaciones. Ed.Universidad de Bs. Aires. Pp.56-97.
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S.A. de C.V. México, D.F.pp 571.