Visualización de Inmunoglobulinas

mediante la técnica de Western Blot

Sebastián Gómez, Marianela Mariño, Miguel Criollo
Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura, Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE
Sangolquí, Ecuador

Resumen
El Western Blot es una técnica analítica usada en biología celular y molecular para
identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, tal como la que se
presenta en extractos celulares o de tejidos. La técnica utiliza tres etapas para lograr esto:
separación por tamaño, transferencia a un soporte sólido y, finalmente, visualización
mediante la marcación de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios
apropiados. Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología,
como la biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. En esta
práctica se realizó la cuantificación de proteínas mediante el método de BCA a partir del
suero de muestras de estudiantes, luego por Western Blot se determinó el peso molecular
de las Inmunoglobulinas.
Palabras clave: Western Blot, Ig, Ac

Key words: Western Blot, Ig, Ac

Introducción
El Western Blot es una técnica analítica
usada para detectar una proteína
especifica en un extracto crudo,
mediante el uso de anticuerpos. Los
anticuerpos son proteínas producidas por
el sistema inmune de un animal
(inmunoglobulinas) que son capaces de
detectar proteínas ajenas (antígenos) y
unirse específicamente a ellas (Arguelles
& Assandri, 2016). En la actualidad el
Western Blot es el estudio confirmatorio
más empleado para el diagnóstico del
SIDA (Calderon, 2016).
En el Western Blot las proteínas son
separadas en primer lugar mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida
en condiciones y posteriormente se
transfieren a una membrana, mediante la
aplicación de un campo eléctrico
perpendicular al gel (electroblotting).
Una vez completada esta operación las
proteínas de interés son reveladas por el
agregado de un anticuerpo específico
(Universidad Nacional de Quilmes,
2016).
Los colorantes que permiten teñir las
proteínas en los geles de poliacrilamida
no son utilizables en las membranas pues
se unen irreversiblemente a éstas. Para
teñir las proteínas en las membranas se
emplean: Rojo Ponceau, Tinta china o
Negro Amido (Universidad Nacional de
Quilmes, 2016). El Rojo Ponceau se
emplea en forma de solución acuosa. La
tinción es rápida pero no es permanente
y puede desaparecer en el procesamiento
posterior. Como la tinción desaparece es
compatible con casi todos los
procedimientos de detección con
anticuerpos (Calderon, 2016).

1
La membrana posee gran afinidad por las
proteínas, lo que es una ventaja al
momento de transferir las proteínas de
interés en el protocolo de Western Blot.
Sin embargo, los pasos posteriores de
detección involucran la incubación de la
misma con anticuerpos (que también son
proteínas) que deberían unirse
específicamente con las proteínas a
detectar. Una etapa común a todos los
procedimientos de inmunodetección es
el bloqueo, para prevenir la unión no
específica del sistema de detección a la
membrana. El paso de bloqueo evita que
los anticuerpos y otras proteínas
involucradas en la detección se peguen
inespecíficamente a la membrana, con el
riesgo asociado de tener un elevado
background o falsos positivos (Arguelles
& Assandri, 2016).
Materiales y métodos
Muestras
Se utilizaron cuatro tubos de proteína en
total, dos con inmunoglobulinas y dos
con albúmina, las cuales habían sido
extraídas de la sangre periférica de una
mujer saludable de 21 años. Las
proteínas se encontraban solubilizadas
en PBS 1X y refrigerados a 4ºC.
Cuantificación de proteínas
Se realizó la medición de la
concentración de proteínas en las
muestras utilizando el método de BCA.
Para esto primero, en una placa de
microtiter, se utilizaron dos filas de
pocillos para realizar la curva de
calibración, colocando concentraciones
descendientes de BSA con BCA como se
muestra en la tabla 1. En los primeros
cuatro pocillos de la tercera y cuarta fila
se colocaron 100 µL de las muestras de
inmunoglobulinas y de albúmina, sin
dilución, junto con BCA. En cambio,
para los cuatro siguientes pocillos se
utilizaron 100 µL de muestra con PBS
1X en una proporción 1:1. Se dejó
incubar a 60ºC por una hora y
posteriormente se leyeron las
absorbancias a 562 nm. Se construyó una
curva de calibración con los estándares y
se encontró la concentración de proteína
en las muestras.
Tabla 1. Concentración de proteína para la
curva de calibración.
Pocillo Concentración de
proteína (ug/ml)
1 50
2 25
3 12.5
4 6.25
5 3.125
6 1.5625
7 0.78125
8 0
Western blot
Primero se colocó en un tubo de
centrífuga 20 µL de buffer de carga 5X
(3.55 mL de H2Odd, 1.25 mL de Tris-
HCl 0.5 M a pH de 6.8, 2.5 mL de
glicerol al 87% y 2 mL de SDS al 10%)
y otros 20 µL de muestra de proteína.
Posteriormente, se incubó en un
termobloque a 100ºC por 10 min para
luego mantenerlas a 4ºC hasta su uso.
Mientras las muestras se incubaban en el
termobloque, se polimerizó un gel de
separación al 4% al combinar 3.2 mL de
H2O, 0.5 mL de acrilamida bisacrilamida
5:1 al 40%, 1.25 mL de tampón Tris-HCl
1.5 M y 0.4% SDS a un pH 8.8, 25 µL de
APS al 10% y 5 µL de TEMED.
Inmediatamente después de mezclar los
componentes, se colocaron entre las
placas de vidrio de la cámara de
electroforesis previamente limpiadas con
etanol y secadas con papel toalla.
Una vez que el gel de separación estaba
polimerizado, se preparó el gel de
2
concentración al 8% colocando 2.7 mL
de H20, 1 mL de acrilamida
bisacrilamida 5:1 al 40%, 1.25 mL de
tampón Tris-HCl 0.5 M y 0.4% de SDS
a un pH de 6.8, 25 µL de APS al 10% y
5 µL de TEMED. La mezcla se colocó
sobre el gel de separación, se colocaron
los peines y se dejó polimerizar. Los
geles formados no fueron utilizados para
la electroforesis.
Un gel preparado con anterioridad se
armó en la cámara de electroforesis, se
añadió buffer de electroforesis junto con
hielo para evitar la degradación de las
muestras y se procedió a cargar las
muestras. En el primer pocillo se colocó
el marcador de peso molecular y en los
demás las inmunoglobulinas y membrana y agitar continuamente.
albúminas. Una vez cargadas, se dejó
correr a 100 V durante 1.5 h. Después, se
desarmó la cámara, se rescató el gel
despegándolo del vidrio, se descartó el
gel de concentración y se tiñó el de
separación con solución de tinción (0.5 g
Tabla 2. Absorbancias de las muestras proteicas de todos los grupos de trabajo incluidos los estándares medidas a
570 nm.
de azul de Coomasie R-250, 225 mL de
metanol, 50 mL de ácido acético y 225
mL de agua destilada) durante 10 min.
Posteriormente, se destiñó con solución
de metanol, ácido acético y agua
destilada en una proporción 1:1:8 por 1 h
hasta que las bandas eran visibles. No se
transfirieron las proteínas a una
membrana de nitrocelulosa en este
ensayo.
Finalmente, a una membrana de
nitrocelulosa a la que previamente se le
habían transferido proteínas, se tiñó con
rojo Ponceau (0.5 g de rojo de Ponceau
con 1 mL de ácido acético aforado a 100
mL con agua destilada) al colocar
directamente el colorante sobre la
Después de 5 min se retiró el tinte y se
eliminó el exceso utilizando una
solución de destinción hasta que las
bandas se veían claramente.
Resultados
3
 Figura 1. Curva de calibración.

Tabla 3. Concentraciones de las muestras de proteínas de todos los grupos de trabajo.

Tabla 4. Concentraciones de las muestras de proteínas del grupo 1

4
Resultados de la corrida electroforética de las muestras proteicas en geles de
poliacrilamida al 12 %:

 Gel 1:

Bandas de proteínas

Figura 2. Gel 1. M: marcador; 1:Ig1-4; 2:Alb1-4; 3:Alb2-3; 4:Ig1-3; 5: Ig2-3; 6:Alb1-3; 7:Alb1-1; 8:Alb2-1

 Gel 2:

Figura 3 Gel 2 1: DAN; 2: DAN; 3:Ig1-1; 4:A205; 5: A205; 6:Alb1-3; 7:Alb2-2; 8:Alb2-2; M: marcador

5
Tinción de la membrana de nitrocelulosa

Bandas de proteínas

Figura 4. Membrana de nitrocelulosa teñida con rojo de Ponceau. A la derecha se pueden ver bandas de
proteínas.

Discusión
La técnica de Western blot es una técnica anticuerpo específico (Universidad
analítica usada para detectar una proteína Nacional de Quilmes, 2016).
especifica en un extracto crudo,
Sin embargo, en este ensayo no se
mediante el uso de anticuerpos. Los
pudieron observar las bandas debido a
anticuerpos son proteínas producidas por
que los geles no se destiñeron
el sistema inmune de un animal
apropiadamente (figuras 2 y 3). Si se
(inmunoglobulinas) que son capaces de
hubiera mantenido más tiempo en la
detectar proteínas ajenas (antígenos) y
solución de destinción, las bandas serían
unirse específicamente a ellas (Arguelles
más claras (Calderon, 2016). Gracias a
& Assandri, 2016). En esta técnica las
esto, tampoco se puede distinguir, a
proteínas son separadas en primer lugar
partir de los geles, qué muestra posee
mediante electroforesis en geles de
más cantidad de IgG. Por otro lado, a
poliacrilamida en condiciones y
pesar de que estas últimas solo se
posteriormente se transfieren a una
deberían tener proteínas de
membrana, mediante la aplicación de un
aproximadamente el mismo tamaño, se
campo eléctrico perpendicular al gel
ve una línea continua de proteína. Esto
(electroblotting). Una vez completada
puede deberse a que las muestras no se
esta operación las proteínas de interés
almacenaron apropiadamente y se
son reveladas por el agregado de un
degradaron los polipéptidos o no se

6
realizó una adecuada purificación Arguelles , R., & Assandri, M. (2016).
(Calderon, 2016).
Western Blot. Recuperado el 11
En cambio, en la tinción de la membrana
de nitrocelulosa, sí se pudieron observar de 08 de 2017, de
bandas definidas de proteína (figura 4) a
diferencia de los geles (figuras 2 y 3). El http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-
procedimiento de destinción de rojo de
Ponceau mostró ser menos tedioso que el Virtual/BQblog/Electroforesis-
de azul de Coomasie, por lo que los
resultados se obtienen más fácilmente. western-blot-Elisa.pdf
Sin embargo, no se contaba con el
Calderon, R. (2016). Tecnicas
marcador de peso molecular de las
membranas por lo que no se podía
Inmunoquimicas. Recuperado el
determinar el número en kDa de las
proteínas. 11 de 08 de 2017, de
Conclusiones y recomendaciones
http://www.ibt.unam.mx/comput
Se realizó un Western Blot para
determinar y cuantificar las proteínas, o/pdfs/met/inmunoquimica.pdf
inmunoglobulinas y albuminas obtenidas
de suero sanguíneo. En la cuantificación Portillo, J. D., Barrio, M. T., & Salido, F.
proteica se obtuvo un rango de 30 a 300
ng/uL de proteínas. Se realizaron dos P. (1996). Aspectos básicos de
geles de poliacrilamida al 12% cada uno,
bioquímica clínica. Madrid: Díaz
en los cuales fueron corridas las muestras
proteicas para confirmar su tamaño. No de Santos.
se obtuvieron bandas definidas de las
muestras de proteínas. Esto puede Universidad Nacional de Quilmes.
deberse a que no se realizó una adecuada
purificación, a degradación de las (2016). Western Blot. Obtenido
muestras tras su almacenaje o una mala
tinción del gel con azul de Coomassie. de

Referencias https://ibcmunq.files.wordpress.

com/2010/03/tp6.pdf