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01-03-2018 Práctica 3.

Determinación de la constante de inhibición (KI) de


una reacción enzimática para inhibición
competitiva, no-competitiva o mixta

Dr. Sergio Huerta Ochoa.


Laboratorio Virtual de Ingeniería enzimática

NIETO DIAZ MARINA BELEN


MORALES OLVERA LUIS ARMANDO
HERNANDEZ MARTINEZ NOHEMI LIZBETH
MONTES DE OCA MARTINEZ AIDEE CITLALLI
TORRES ROBLES EDGAR

0
INTRODUCCIÓN.
Un inhibidor enzimático es algún compuesto que impide que alguna o algunas enzimas catalicen. Estos
compuestos en varias ocasiones son específicos, es decir, inhiben algún grupo en especial de enzimas y
como se acaba de mencionar su principal función es evitar la actividad de la enzima ya sea por
impedimento estérico o por que ocupe el sitio que debería ocupar el sustrato.
Este fenómeno también se pude dar por el propio sustrato, es decir, que el propio sustrato inhiba a la
enzima. Existen dos tipos de inhibidores, los reversibles y los irreversibles, los irreversibles son
aquellos que no se pueden deshacer.
La inhibición reversible es aquella que después de un tiempo o tratamiento se puede deshacer. También
podemos clasificar a los inhibidores reversibles como competitivos, no competitivos que depende de si
“compiten” por el sitio activo o no.
La forma cuantitativa de medir la actividad de estos inhibidores es mediante el cálculo de las constantes
enzimáticas, las cuales nos dan un valor sobre que tanto está afectando el inhibidor a la velocidad de
reacción de la enzima, en otras palabras nos dice que tan rápida es la enzima en producir un
determinado producto.
Estos valores también ayudan en la caracterización del tipo de inhibición, en especial el valor de Ki o
constante de inhibición. Además de hacer la comparación entre otros valores como Km o constante de
Michaelis- Menten y la velocidad máxima de esa reacción enzimática.
En la presente práctica virtual se escogió una fosfatasa; las fosfatasas son un grupo de enzimas
hidrolíticas capaces de desfosforilar compuestos orgánicos, realizan la ruptura de enlaces ésteres
fosfóricos y fosfoanhidridros, en general son enzimas de baja especificidad aunque hay algunas con
elevada especificidad principalmente las que actúan sobre azúcares fosforilados. Las fosfatasas se
clasifican de acuerdo a sus propiedades fisicoquímicas tal como el pH óptimo, de tal modo que existen
fosfatasas ácidas, alcalinas o neutras. [1]
Una de las fosfatasas más estudiadas es la fosfatasa alcalina (FA) en organismos de origen terrestre
debido a su importancia bioquímica y clínica, como por ejemplo: fosfatasa de placenta humana,
fosfatasa del intestino de ratas y fosfatasa de gusanos aplanados.

La fosfatasa alcalina (AP; E.C. 3.1.3.1) es una enzima hidrolasa, considerada metaloenzima
homodimérica, que cataliza la hidrólisis en la presencia de aceptores de fosfato, así también, cataliza la
transfosforilación de una amplia variedad de mono ésteres de fosfato (R-OPO3) para la producción de
fosfato inorgánico y alcohol o agua. El producto fosfato inorgánico, es también un inhibidor para la
enzima. La función biológica de la FA es la hidrólisis de monoésteres de fosfato, la cual se considera
una reacción importante ligada al metabolismo energético, regulación metabólica y a una variedad de
rutas de transducción de señales. [2]

En la práctica médica la determinación de los niveles plasmáticos de esta enzima es útil para la
detección de colestasis. El término colestasis hace referencia a los cuadros clínicos determinados por la
presencia de un obstáculo, mecánico o funcional, que impide la llegada de la bilis al duodeno. [2,3]

1
OBJETIVO.
Determinar los parámetros cinéticos (KM y Vmax) en presencia y ausencia de un inhibidor, y
posteriormente identificar el tipo de inhibición que se presenta y su constante de inhibición (KI).
PROCEDIMIENTO (DIAGRAMA DE BLOQUES).

En el primer día de trabajo se


Se escogió la determinó la cinética tipo Michaelis-
enzima fosfatasa Menten en ausencia del inhibidor
obteniendo valores para Km y Vmax.

El segundo día se hizo lo


El tercer día se hizo lo mismo pero
mismo solo que en presencia
ahora con 0.0005 mM de inhibidor. El
de 0.001 mM de inhibidor.
cuarto día lo mismo solo que la
Nuevamente se tomaron los
concentración de inhibidor fe de
valores de Km y Vmax.
0.00075 mM

En todos los días se Se compararon los valores


Se calculó KI con todos los
utilizó una con inhibidor y sin
parámetros anteriores
concentración de inhibidor para determinar
sustrato de 50000 µM qué tipo de inhibición.

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RESULTADOS.
Enzima elegida en el programa: Fosfatasa
No. De Referencia: PH/94-324-012
Concentración: 1.09mg/mL
Actividad específica: 0.2mmol [P]/min*mg [E]
pH: 7
Concentración del sustrato inicial [S]: 20mM
Velocidad de reacción: 0.2-10µMol producto/min
Número de muestras trabajadas: 1 Volumen de la muestra descongelada: 500µL
Fracción de la muestra a utilizar por corrida: 20µL
Vmáx INTERVALO
MÉTODO KS (mM) (µM/min) INTERVALO [KS] [Vmáx]
SIN REGRESIÓN
INHIBIDOR NO LINEAL 0.001167 4.4861 [0.0010526-0.0012814] [4.1984-4.7738]
REGRESIÓN
[I]=0.001mM NO LINEAL 0.001869 2.5656 [0.0016862-0.0020518] [2.4289-2.7023]
REGRESIÓN
[I]=0.0005mM NO LINEAL 0.001556 3.2356 [0.0013983-0.0017137] [3.0668-3.4044]
REGRESIÓN
[I]=0.00075mM NO LINEAL 0.001765 2.9119 [0.0000310-0.0034990] [2.7581-3.0657]

De acuerdo a la tabla anterior que muestra los resultados dados por el software se observa que el tipo
de inhibición es no competitiva. Así se procedió a linealizar los datos sacando el recíproco de la
velocidad de reacción y de la concentración de sustrato mostrados en el anexo 1. Con lo anterior se
realizó la siguiente gráfica corroborando que el tipo de inhibición es no competitiva.

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NOTA: Para la concentración [I]=0mM no se tomaron todos los datos mostrados en la tabla del anexo1
al realizar la gráfica para poder visualizar mejor el gráfico.
De acuerdo a lo anterior se elaboró la siguiente tabla y se calculó la velocidad máxima aparente y Ks

[I] mM [I]µM PENDIENTE (Ks/Vmáx app) ORDENADA (1/Vmáx app) Vmáx app (µM/min) Ks (µM)
0.0005 500 468.3801 0.3167 3.1575 1478.9282
0.00075 750 618.8903 0.3325 3.0073 1861.1707
0.001 1000 736.7999 0.3812 2.6230 1932.6280
A partir de la definición de velocidad por inhibición no competitiva.

Se calcularon las dobles reciprocas como se mencionó antes.

Por definición de velocidad máxima aparente:

La linealización quedó como:

Luego para calcular la constante de inhibición de toma la definición de velocidad máxima aparente se
linealiza como sigue:

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Así como se muestra en la siguiente tabla se observa que la constante de inhibición tiene un valor de
2740µM.
Gráfica 2. Inhibición no competitiva
[I]µM Vmáx app(µM/min)
500 3.1575
750 3.0073
1000 2.6230
PENDIENTE 2 (-Vmáx app/KI) -0.0011
ORDENADA 2 (Vmáx) [µM/min] 3.7311
app
Vmáx PROMEDIO (µM/min) 2.9293
KI 2740.0127

La gráfica de la linealización se muestra en la gráfica2.

DISCUSIÓN.
Como podemos observar en el gráfico 1. 1/V vs. 1/S la pendiente aumenta a medida que se eleva la
concentración del inhibidor comportamiento característico de la inhibición no competitiva. A aparte
como se observa en los resultados arrojados por el software usando el método de regresión no lineal el
valor de Ks no varía mucho se encuentra entre 0.01167-0.001869 de forma puntual y dentro del
intervalo [0.0000310-0.0034990]. El valor de KI obtenido a partir de la definición de Vmáx aparente es
de 2740µM aproximadamente como se muestra en los resultados, la forma en la cual se supone que este
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dato es correcto, fue a partir de realizar el calculó de K I de forma puntual despejando la constante de
inhibición de la definición de Vmáx aparente obteniendo:

[I]µM Ki (µM)
500 1188.329955
750 1525.161312
1000 1407.872006

Lo anterior tomando Vmáx= 4.4861µM/min y los valores de Vmáx aparente y la [I] mostrados en la
tabla titulada “Gráfica2. Inhibición no competitiva” Así se puede observar que los valores obtenidos de
forma puntual son menores de 2740µM pero mayores de 1000µM por lo tanto podemos decir que son
del mismo orden 1*103µM y por lo tanto son consistentes.
CONCLUSIONES.
Por lo mostrado en la discusión y los resultados concluimos se cumplió el objetivo de la práctica, los
valores de Ks, Vmáx y KI se calcularon y como se observa una aproximación al valor de la constante de
inhibición es su cálculo de manera puntual aunque estos valores son subestimados; así un dato más
confiable es el obtenido por medio de la linealización de la definición de Vmáx aparente para la
inhibición no competitiva. Aunque como se advierte en la gráfica 2 la constante de inhibición obtenida
tiene un pequeño error ya que los datos se encuentran un poco alejados de la línea de tendencia y el
coeficiente de determinación lineal es de 0.94 cercano a 1 pero menor de 0.99 que sería un valor más
deseable.

REFERENCIAS.
1. Orozco Solis Jenny Berenice. Determinación de parámetros cinéticos de la actividad de
fosfatasa ácida de Actinobacillus pleuropneumoniae. Para obtener el título de Ingeniero
Biotecnologo. Dirige: M. en C. Martínez Zúñiga Rodrigo. Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología.
2. Morosco-Arias Joe Luis, Ezquerra-Brauer Josafat Marina. Fosfatasa alcalina de
camarón: Estructura, Características y funciones. Universidad de Sonora. Revista de
Ciencias Biológicas y de la Salud. Biotecnia. Vol. XVII, Número 1. 2015.
3. Herranz Xavier, González Antonio. Aproximación diagnóstica al paciente con colestasis.
GH Continuada. Noviembre-Diciembre Vol.3 No. 6.
ANEXO1. RESULTADO DE VELOCIDAD A DIFERENTENS CONCENTRACIONES DE
INHIBIDOR Y DE SUSTRATO.
[I]=0mM
6
[S] (µM) [S] (mM) V(µM/min) 1/V 1/S
50000 0.05 4.3008 0.2325 2.00E-05
50000 0.05 4.2781 0.2337 2.00E-05
10000 0.01 4.1314 0.2420 1.00E-04
10000 0.01 3.7253 0.2684 1.00E-04
5000 0.005 3.8570 0.2593 2.00E-04
5000 0.005 3.6397 0.2747 2.00E-04
1000 0.001 2.0744 0.4821 1.00E-03
1000 0.001 2.0709 0.4829 1.00E-03
500 0.0005 1.3765 0.7265 2.00E-03
500 0.0005 1.3472 0.7423 2.00E-03
100 0.0001 0.3598 2.7793 1.00E-02
100 0.0001 0.3542 2.8233 1.00E-02
75 0.000075 0.2677 3.7355 1.33E-02
75 0.000075 0.2635 3.7951 1.33E-02

[I]=0.0005mM
[S] (µM) [S] (mM) V(µM/min) 1/V 1/S
50000 0.05 3.3244 0.3008 2.00E-05
50000 0.05 3.1651 0.3159 2.00E-05
10000 0.01 2.6967 0.3708 1.00E-04
10000 0.01 3.015 0.3317 1.00E-04
5000 0.005 2.3697 0.4220 2.00E-04
5000 0.005 2.3291 0.4294 2.00E-04
2500 0.0025 1.9994 0.5002 4.00E-04
2500 0.0025 1.9235 0.5199 4.00E-04
1000 0.001 1.3131 0.7616 1.00E-03
1000 0.001 1.3416 0.7454 1.00E-03
500 0.0005 0.7917 1.2631 2.00E-03
500 0.0005 0.7123 1.4039 2.00E-03
300 0.0003 0.5573 1.7944 3.33E-03
300 0.0003 0.5313 1.8822 3.33E-03

[I]=0.00075mM
[S] (µM) [S] (mM) V(µM/min) 1/V 1/S
50000 0.05 3.0625 0.3265 2.00E-05
50000 0.05 2.6658 0.3751 2.00E-05

7
10000 0.01 2.2431 0.4458 1.00E-04
10000 0.01 2.7376 0.3653 1.00E-04
5000 0.005 2.0968 0.4769 2.00E-04
5000 0.005 2.0727 0.4825 2.00E-04
2500 0.0025 1.8574 0.5384 4.00E-04
2500 0.0025 1.6966 0.5894 4.00E-04
1000 0.001 1.1462 0.8724 1.00E-03
1000 0.001 1.0661 0.9380 1.00E-03
500 0.0005 0.6442 1.5523 2.00E-03
500 0.0005 0.6143 1.6279 2.00E-03
300 0.0003 0.4270 2.3419 3.33E-03
300 0.0003 0.4076 2.4534 3.33E-03

[I]=0.001mM
[S] (µM) [S] (mM) V(µM/min) 1/V 1/S
50000 0.05 2.5128 0.3980 2.00E-05
50000 0.05 2.3433 0.4267 2.00E-05
10000 0.01 2.1908 0.4565 1.00E-04
10000 0.01 2.1004 0.4761 1.00E-04
5000 0.005 1.9204 0.5207 2.00E-04
5000 0.005 1.9401 0.5154 2.00E-04
2500 0.0025 1.5602 0.6409 4.00E-04
2500 0.0025 1.4876 0.6722 4.00E-04
1000 0.001 0.8793 1.1373 1.00E-03
1000 0.001 0.8098 1.2349 1.00E-03
500 0.0005 0.5780 1.7301 2.00E-03
500 0.0005 0.5748 1.7397 2.00E-03
300 0.0003 0.3494 2.8620 3.33E-03
300 0.0003 0.3424 2.9206 3.33E-03

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