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1° modulo:

La replicazione del DNA

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GLI ACIDI NUCLEICI
Gli ACIDI NUCLEICI (DNA e RNAs)
sono dei polimeri lineari la cui unità
costituzionale è il nucleotide
I nucleotidi sono formati da:
1) zucchero 5 5

2) base azotata
3) gruppo fosfato
• Lo zucchero
Deossiribosio nel DNA e ribosio nell’RNA. Il
2’-OH destabilizza la struttura rendendola
meno stabile
• Le basi azotate
Purine: composte da un doppio anello
eterociclico (A e G)
Pirimidine: composte da singolo anello
eterociclico (C, T (solo DNA) e U (solo RNA))
• Il gruppo fosfato
Mono, di o trifosfato. Conferisce carattere
acido alla molecola. Può essere legato 2
alla posizione 3’ o 5’ dello zucchero
1 9

5’

3’

La base si lega alla posizione C1 dello zucchero mediante un legame glucosidico.


Nel legame sono coinvolti l’N9 delle purine e l’N1 delle pirimidine = NUCLEOSIDE
(DEOSSIRIBONUCLEOSIDE e RIBONUCLEOSIDE)
Il gruppo fosfato si lega alla posizione C3 o C5 del nucleoside = NUCLEOTIDE 3
(DEOSSIRIBONUCLEOIDE e RIBONUCLEOTIDE)
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FORME TAUTOMERICHE delle basi azotate
forme rare 1/10000 (NB: uomo 106 basi)
→ problemi nella trascrizione e replicazione
del DNA

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Le basi possono subire
modificazioni chimiche
che sono essenziali per i
processi biologici che
coinvolgono il DNA e gli
RNAs

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I nucleotidi sono uniti tra
loro da un legame covalente
(legame fosfodiestere) che
coinvolge il gruppo fosfato
legato al C5 dello zucchero
di un nucleotide ed il C3-OH
3
dello zucchero del nucleotide
precedente.
Lo scheletro della catena è
costituito dall’alternanza di 5
zuccheri e di gruppi fosfato
con le basi che sporgono
lateralmente.
La catena ha una polarità
5’→ 3’. Il nucleotide
all’estremità della catena
5’ ha un gruppo 5’-fosfato
libero mentre il nucleotide
all’estremità opposta ha un
gruppo C3-OH libero.

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Per convenzione le catene degli acidi nucleici vengono scritte in direzione 5’-3’
3

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Il DNA
Secondo il modello proposto da Watson e Crick nel 1953 il DNA è formato da:
• due catene polinucleotidiche antiparallele avvolte l’una sull’altra a formare una
struttura a doppia elica con lo scheletro zucchero-fosfato posto sul lato esterno e le
basi impilate all’interno in posizione perpendicolare all’asse della molecola
• L’elica è destrorsa, compie un giro completo (passo) ogni 34Å ed ha un diametro
20Å. La distanza tra due basi
adiacenti è 3,4Å e ci sono
10,5 basi ogni giro dell’elica
• L’elica presenta un’
asimmetria dovuta alla
posizione delle molecole
di deossiribosio ai lati delle
basi che genera due solchi
uno MAGGIORE ed uno
MINORE con diametro
22Å e 12Å rispettivamente
• La basi sui filamenti opposti
sono unite da legami idrogeno
• I due filamenti sono detti 9
complementari
2 ponti idrogeno
A-T e T-A

3 ponti idrogeno
C-G e C-G

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Polarità: 5’→ 3’ 11
Sinistrorsa Destrorsa
antiorario orario

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La struttura del DNA proposta da Watson e Crick non è l’unica possibile. Tale forma è
detta B-DNA ed è stata ottenuta da studi di diffrazione a raggi X condotti in condizioni
di ALTA UMIDITA’ (95%) e BASSA SALINITA’ (condizioni cellulari)
In particolari condizioni il DNA può assumere molte altre strutture, le più importanti
sono: la forma A e la forma Z
A-DNA: Destrorsa con passo 25Å, 11 basi ogni giro elica e
diametro 23 Å. > angolatura delle basi rispetto l’asse della
molecola. Ottenuta da studi di diffrazione a raggi X in
condizioni di MINORE UMIDITA’ (75%) e ALTA SALINITA’.
Rispetto al B-DNA è + tozza. In vivo è la struttura tipica
dei duplex DNA-RNA e RNA-RNA; il 2’-OH del ribosio
impedisce alla molecola di assumere la forma B
Z-DNA: è SINISTRORSA (dovuto al cambiamento in alcune basi
dell’orientamento del legame glucosidico base-zucchero (da
conformazione anti → a syn). Passo 46Å, 12 coppie di basi
per giro elica e diametro 18Å. Ottenuta da studi di diffrazione
a raggi X in condizioni di ALTA SALINITÀ o in presenza di
alcoli. Sono state isolate proteine che legano ad alta affinità
il Z-DNA e prove sperimentali dicono che una piccola % del
DNA in vivo è nella forma Z. Rispetto al B-DNA (passo 34Å) è
allungata e magra.
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Altre forme C, D e E
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LA TOPOLOGIA Il DNA si può avvolgere su se stesso con conseguente
cambiamento della sua conformazione nello spazio
DEL DNA (TOPOLOGIA).
Il superavvolgimento può avvenire in molecole di DNA
circolari o lineari dove però le estremità sono fissate.
Il DNA batterico è una molecola circolare mentre quello
eucariotico è una molecola lineare ancorata a proteine
(estremità fissate).
Il cambiamento della topologia del DNA è un aspetto
fondamentale di tutte le sue attività funzionali; tutte le
attività sintetiche della doppia elica richiedono una
separazione dei filamenti (replicazione, trascrizione,
ricombinazione, ecc.).
Le molecole di DNA circolari sia batteriche che
eucariotiche sono superavvolte negativamente;
i superavvolgimenti negativi servono come un
meccanismo di immagazzinamento dell’energia libera
che aiuta quei processi che richiedono una separazione
dei due filamenti della doppia elica. La separazione dei
due filamenti è più favorita nel DNA superavvolto
negativamente piuttosto che nel DNA rilassato.
Alcuni organismi termofili hanno il DNA superavvolto
positivamente probabilmente per evitare che si denaturi
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con troppa facilità.
Il superavvolgimento crea tensione nel DNA (accade come per un elastico)

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Le conseguenze del superavvolgimento cambiano a seconda del verso di
attorcigliamento.

Superavvolgimento negativo: il DNA si avvolge in direzione opposta


rispetto a quella della doppia elica (diminuisce il n° di basi per giro elica).

Superavvolgimento positivo: il DNA si avvolge nella stessa direzione della


doppia elica (aumenta il n° di basi per giro elica).

Entrambi creano tensione nel DNA

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Il NUMERO DI LEGAME (Lk) è una proprietà topologica del DNA circolare
covalentemente chiuso (cccDNA) e descrive le possibili conformazioni che il
DNA può assumere nello spazio. E’ il numero di volte che il filamento si incrocia
con l’altro o il numero di volte che un filamento deve essere passato attraverso l’altro
per separare le due catene. Lk è definito dalla seguente equazione:

Lk = Tw + Wr

Numero di avvolgimento o twisting (Tw) = il numero di volte che un filamento della


doppia elica si avvolge sull’altro rispetto all’asse centrale dell’elica stessa (passo). E’
una proprietà intrinseca alla molecola ed è n° totale bp/ n° bp per giro elica (10,5
per il DNA in forma B).

Numero di avvitamento o writhing (Wr): numero di superavvolgimenti o il numero


di incroci dell’asse longitudinale

Per il DNA circolare chiuso o il DNA con estremità fissate, Lk è COSTANTE e non
può essere modificato da nessuna deformazione che non comporti la rottura e la
riunione di uno o entrambi filamenti. Pertanto se Wr cambia a causa di
superavvolgimento positivo o negativo il Tw deve cambiare nella direzione opposta.

Se Lk =costante ∆Tw = - ∆Wr 19


ISOMERI TOPOLOGICI del DNA = DNA con stessa sequenza di basi, ma differente
numero di legame (Lk)

(-)

(+)

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rilassata L = legame W = avvitamento T = avvolgimento
Superavvolto -
In una molecola rilassata
Wk = 0 quindi Lk0 = T
Il valore Lk della molecola
rilassata viene indicato
con Lk0
20 = 21-1 T= n° totale bp/ n° bp per giro elica

Se si vuole confrontare il grado di superelicità


di due topoisomeri
T = 210/10,5 = 20
W = 0 (rilassata) ∆Lk = Lk - Lk0
Lk0 = 210/10,5 + 0 = 20

Se Lk > Lk0 e ∆Lk > 0 il DNA è superavvolto


POSITIVAMENTE
Se Lk < Lk0 e ∆Lk < 0 il DNA è superavvolto
NEGATIVAMENTE

20 = 19+1
Superavvolto +

SENZA INTRODUZIONE DI TAGLI, essendo Lk costante, se si forza il DNA a cambiare


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W, la molecola compenserà cambiando T e viceversa → ∆Lk = Lk - Lk0 = 0
Per modificare Lk occorre rompere la doppia elica (nick) e far ruotare i due filamenti
l’uno rispetto all’altro in modo da o il numero di volte che un filamento si incrocia
con l’altro.

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L = legame W = avvitamento T = avvolgimento Ad ogni cambiamento la molecola
rilassata dopo taglio Superavvolto negativo risponde cercando di ritrovare il
proprio equilibrio naturale di
struttura (es DNA B 10,5 basi per
giro)
Confronto fig. A-B-C
Se si riduce L di 2 unità riducendo
di 2 unità T, la molecola introduce 2
superavvolgimenti negativi (W= -2)
per ripristinare il valore di T=20
dopo taglio (210/10,5 = 20) (18 = 20 - 2).
Lk < Lk0
Confronto fig. A-D-E
Se si aumenta L di 2 unità,
aumentando di 2 unità T, la
molecola introduce 2 superavvol-
gimenti positivi (W= +2) per ripristi-
nare il valore di T=20 (210/10,5)
Superavvolto positivo (22 = 20 - 2). Lk > Lk0
Confronto fig. A-F
Compensazione della riduzione
di L per denaturazione del
23 DNA
in regioni ricche in AT