Métodos de purificación de DNA genómico.

La separación del DNA genómico de otros componentes celulares involucra

generalmente 4 pasos.

1. Disrupción.
2. Lisis.
3. Remoción de proteínas y otros contaminantes.
4. Obtención de DNA.

Disrupción:

La Disrupción y la lisis celular es un evento de suma importancia en todos los

procesos de purificación de DNA genómico; una incompleta disrupción de células,
produce una menor cantidad de DNA obtenido.
Todos los métodos mencionados producen la lisis tanto celular como de organelos por
lo que si se busca separar DNA mitocondrial o Nuclear, se deben aplicar otras
técnicas de separación de organelos y luego aplicar un| de los otros métodos a
explicar.

Lisis enzimática de tejidos animales:

Inicialmente se usan buffers de lisis que contiene detergentes iónicos o no iónicos

como son SDS o Triton respectivamente, los cuales permiten solubilizar las
membranas celulares, y una proteasa como la proteinasa K la cual permite degradar
los componentes proteicos del lisado.

Lisis enzimática de Bacterias y levaduras:

Una ulterior lisis enzimática es necesaria para purificar DNA de levaduras y

bacterias ya que estas presentan una pared celular gruesa que impide la lisis
celular por mero uso de un detergente.
Para las bacterias se utiliza Lizozima y para las levaduras se usa Liticaza, en
ambos casos se obtienen esferoplastos membranosos los cuales pueden ser tratados
con el mismo proceso explicado anteriormente.

Disrupcion de tejidos con nitrogeno liquido:

Este tipo de disrupcion se realiza sobre un pistillo y un mortero, en el cual se

deposita la muestra, luego esta es bañada con nitrogeno líquido y congelada al
instante luego con un pistillo se realiza un polvo fino por machacado de la
muestra, el paso se realiza varias veces.

Preparación de lisados crudos:

Una técnica fácil para el aislamiento de DNA genómico es incubar los lisados de las
células a altas temperaturas (e.g., 90 °C por 20 minutos), o realizar una digestión
previa con Proteinasa K, y luego se utilizan los lisados directamente en otras
técnicas a seguir. Cabe tener en cuenta que estas técnicas” rápida-y-sucias” no son
aplicable para seguir trabajando en técnicas moleculares especificas que necesitan
DNA de alta calidad. Ademas los lisados contienen inhibidores enzimáticos, como las
sales y el DNA casi nunca en estos casos se encuentra a un pH óptimo. Una mala
inactivación de la Proteinasa K puede resultar en falsos negativos y una alta
frecuencia de fallas varias.
Método del salting-out:

Se inicia usando un lisado crudo de la muestra donde las proteínas y otros

contaminantes son precipitados por adición de sales de Acetato de amonio o acetato
de potasio en altas concentraciones. Luego el precipitado es eliminado por
centrifugación.
Las desventajas de este método son: la remoción contaminantes puede ser
ineficiente, la pureza del DNA es variable o escasa y ademas el DNA obtenido debe
ser tratado obligatoriamente con RNasas, separación por diálisis y repetidas
precipitaciones con etanol, para poder ser utilizado en otros procesos posteriores.

Extracción Orgánica:

La extracción orgánica es el método mas utilizado para las masas para la

purificación de DNA en este métodos se usan solventes orgánicos para separar el
material genético de las proteínas.
El lisado crudo es tratado con Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamilico, 25:24:1, por
repetidas veces, el fenol permite denaturar y precipitar proteínas, ademas debe
estar a un pH de mas meno 8, para que el DNA y el RNA, permanezcan en la fases
acuosa gracias a la desprotonación de sus grupos hidroxilos libres.
Las desventajas involucran la toxicidad del método, y que si no se realizan lavados
con cloroformo luego de la extracción orgánica las trazas de fenol pueden inactivar
proteínas involucradas en eventos posteriores como la Taq polimerasa.
El alcohol isoamilico es un espumante evita la formación de emulsiones y permite
observar con claridad la separación de las fases.

Precipitación con etanol:

La precipitación con etanol es un paso común para la mayoría de los métodos de

purificación de DNA, ya que el etanol es capaz de deshidratar el DNA produciendo un
cambio conformaciónal en la molécula por lo que esta precipita. Si el DNA es
transparente significa que el DNA obtenido es de alta pureza.
Gradiente de densidad de CsCl:

El DNA genómico se puede purificar por centrifugación a través de un gradiente de

densidad de CsCl. El DNA crudo o resuspendido luego de la precipitación con etanol
es mezclado con la sal y bromuro de etidio, y luego se centrifuga la mezcla por
varias horas. Luego la banda de DNA es removida y tratada con isopropanol para
eliminar el Bromuro de etidio y luego se vuelve precipitar el DNA con Etanol.
El principio que rige este proceso es la capacidad del CsCl de formar una gradiente
de densidad que permite separar moléculas donde el RNA queda en el fondo del tubo
luego en el intermedio queda el DNA y en la zona mas superficial las proteinas y
otros contaminantes.

Purificación de DNA plásmidial:

Se usa principalmente el método de la lisis alcalina o 123.

Este método consta de tres soluciones que se deben aplicar a la muestra bacteriana
para purificar los plásmidos.

Solución 1: Glucosa, Tris-HCl y EDTA.

Esta primera solución permite estabilizar el pH de la muestra gracias al buffer,
entregar un ambiente osmolar por la Glucosa y permite que quelar cationes
divalentes necesarios para la actividad endonuecleasa una vez lisadas las células.
Solución 2: SDS y NaOH.
Esta solución permite solubilizar membranas y promover la lisis bacterianas gracias
al detergente SDS y ademas permite denaturar tanto DNA genómico como plásmidial el
cual siendo pequeño y circular queda concatenado, este evento es permitido por el
NaOH.
Solución 3: Acetato de Potasio (KOH y Acido Acético).
Esta solución se utiliza para neutralizar el NaOH anterior, lo que produce la
denaturacion solo de los plásmidos concatenados, mientras que el DNA a tratar de
renaturarse atrapa tanto membranas como proteínas que luego son precipitadas por la
sal de acetato de potasio. Los contaminantes precipitados son eliminados por
centrifugación mientras que el DNA plásmidial y algunos trocitos de DNA quedan
suspendidos en el sobrenadante.
Luego el crudo antes o después de la lisis alcalina puede ser utilizado para que el
plasmido puede ser purificado por el mismo método del CsCl. El RNA une más cesio
que el DNA por lo que precipita.

Purificación de DNA plásmidial por precipitación con PEG:

Este método se usa luego de la lisis alcalina y permite precipitar el plasmido por
uso de polientilenglicol, es un método rápido y barato que no necesita de múltiples
maquinarias, basa su principio en que hay una relación inversa entre el tamaño
macromolecular del acido nucleico y la cantidad necesaria de polientilenglicol para
la precipitación, ósea es una precipitación diferencial.

Enzimas de Restricción:
Muchas cepas bacterianas poseen sistemas enzimas de restricción que reconocen DNA
foráneo y los cortan para prevenir una eventual infección.
Al mismo tiempo este sistema evita que el DNA cromosomal sufra cortes o
degradación, las enzimas de restricción reconocen y cortan secuencias especificas
de DNA, como son las palindromes u otras, estas enzimas son capaces de distinguir
el DNA foráneo del propio debido a que el DNA bacteriano esta modificado metilado
lo cual evita que las enzimas los cortes, ya que la misma secuencia de
reconocimiento es sustrato tanto de la endonucleasa (corte) como de la metilasa
(metilacion). El DNA del invasor no es metilado al ingresar a la bacteria debido a
que solo el DNA Hemimetilado es sustrato de las metilasas (Endonucleasa y metilasa
siempre están apareadas). La metilacion ocurre sobre las bases nitrogenadas.
Las enzimasde restriccipon reconoces DNA de doble hebra.

Enzimas de restricción TIPO I: Reconocen secuencias asimétricas bipartidas. Donde

el sitio de corte es a 1000 pb del sitio de unión de la enzima requiere la
formación de un loop y ATP.

Enzimas de restricción TIPO II: Son las
proteica presenta dos enzimas separadas
corte se reconoce como una secuencia de
palindromes el corte es específico y no
son reacciones separadas no como en los
más famosas y conocidas. La estructura
M y R, donde la útil es la R, el sitio de
4 a 7 pares de bases organizadas en
necesita ATP. La metilacion y restricción
otros tipos.

Enzimas de restricción tipo III: Estas enzimas presentan ambas actividades R y M

simultaneas reconocen sitios de corte antisimetricos y cortan a unos 26 o 30 pares
de bases río abajo del sitio de reconocimiento. Si necesita ATP.
Las enzimas de restricción TIPO II, pueden formar tres tipos de extremos al cortar
el DNA los cuales son Romos, cohesivos en los extremos 3’ o cohesivos en los
extremos 5’, estos hechos pueden ser útiles para utilizar luego las enzimas en
procesos de corte y unión de inserto con extremos cohesivos de forma adireccional
como direccional.

Vectores de Clonamiento.
Los principales vectores de clonamiento son considerados los plásmidos y los fagos.
Los plásmidos están compuestos por dsDNA circular de 1 a 200 Kpb, su replicación es
independiente de la replicación del cromosoma bacteriano y pueden utilizar algunas
proteínas del hospedero de larga vida para su propia replicación.
Los plasmidio confieren su portador características fenotipicas como la capacidad
de expresión de factores de virulencia y la capacidad de resistir a antibióticos.
Los plásmidos presentan características especificas en cuanto a su replicación e
incompatibilidad ya que: El control del numero de copia del plasmido esta regulado
por una secuencia presente en el sitio de origen de replicación llamada replicon,
este replicon se regula por medio de interacciones cis entre secuencias de RNA, el
replicon mas conocido es el pMB1, para el cual no se necesita codificar enzimas de
replicación ya que este utiliza las DNA Pol I y III, la RNA pol, luego los dnaB,
dnaC, dnaD y dnaZ.

Regulación del replicon pMB1/ColE1:

El RNA II es el primer necesario para iniciar la replicación del DNA, este primer
es procesado a partir de un trascripto mas largo llamado pre-primer de 500
nucleótidos formado por la RNAsa H, antes de que se forme un complejo estable entre
RNA y DNA cerca del OriV (origen de replicación), la formación del hibrido es
esencial para que la RNAsa H pueda procesar el pre-primer y formar el RNA II, para
iniciar la replicación.
Por otro lado el RNA I controla negativamente el número de copias del plasmido
previniendo la separación del RNA II del pre-primer, el RNA I tiene un largo de 100
nucleótidos y es codificado por la misma hebra contraria que codifica para parte
del pre-primer, por lo que interfiere en la formación del hibrido pre-primer
RNA--;:DNA impidiendo la correcta actividad de la RNAsa H para la formación del RNA
II por corte del pre-primer (cis). Ademas al RNA I, el numero de copias del
plasmido es regulado negativamente por el polipéptido Rop, producto del gen rop,
este gen se encuentra río abajo del OriV, este polipéptido actúa de forma trans
reprimiendo la formación del RNA II, ya que estabiliza el complejo RNA I-pre-
primer.
Una sola mutación del RNA I, produce un cambio de 15 a 20 copias del plasmido por
células a mas de 500.

Marcadores seleccionables
• Tetracycline binds to a protein of the 30S subunit of the ribosome and
inhibits ribosomal translocation. The tetr gene carried on plasmid pBR322
encodes a 399-aminoacid, membrane-associated protein that prevents the
antibiotic from entering the cell.
• Ampicillin binds to and inhibits a number of enzymes in the bacterial
membrane that are involved in ths synthesis of the cell wall. The ampr gene
carried on the plasmid codes for an enzyme that is secreted into the
periplasmic space of the bacterium, where it catalyzes hydrolysis of the b-
lactam ring, with concomitant detoxification of the drug.
• Chloramphenicol binds to the ribosomal 50S subunit and inhibits protein
synthesis. The cmr or cat gene codes for a tetrameric, cytosolic protein (Mr
of each subunit = 23,000) that, in the presence of acetyl coenzyme A,
 catalyzes the formation of hydroxyl acetoxy derivatives of chloramphenicol
that are unable to bind to ribosomes.
• Kanamycin and neomycin are aminoglycosides that bind to ribosomal components
and inhibit protein synthesis. Both antibiotics are inactivated by an
aminoglycoside phosphotransferase with a molecular weight of 25,000 that
appears to be located in the periplasmic space. Phosphorylation of these
antibiotics is believed to interfere with their active transport into the
cell.

Estrategias de clonamiento:
PARA que ¿?, El aislamiento de un gen puede ser útil para determinar su secuencia
nucleotidica y por ende su estructura intrones, exones, promotores, sitios de
restricción etc.…
La comparación de secuencias genéticas puede llevar a conocer relaciones evolutivos
y de ahí la secuencia aminoacidica puede llevarnos a conocer tanto la estructura
como la función de una proteína codificada.
Ademas la información obtenida por el clonamiento puede ser utilizada en varios
campos de la ingeniería genética.

Clonamiento básico:

Clonamiento básico usando

Enzimas de restricción y
ligación por ligaza.
Mecanismo de la DNA ligaza:
Clonamiento de un inserto con Enzimas de
restricción, ligación por DNA ligaza y
reconocimiento de transformantes y
recombinantes por inserción inactivante.
Se usa un plasmido pBR322 que presenta
marcadores de resistencia para tetraciclina
y ampilicina.

El Vector pUC solo presenta marcador de

resistencia para ampilicina, ademas
presenta parte del Gen Lac Z, y un sitio
poli linker que lo atraviesa, este hecho
permite separa recombinantes y
transformantes por crecimiento sobre un
placa con IPTG y Xgal, las bacteria que
presentan el inserto tendrán el gen lac Z
truncado por lo que no podrán experimentar
complementación alfa dentro del hospedero
(el hospedero debe estar capacitado para
presentar complementación alfa) por lo que
no podrán hidrolizar el xgal y se verán de
color Blanco. Por otro lado las células
que no llevan el inserto formaran colonias
de color azul ya que experimentaran
complementación alfa y serán capaces de
hidrolizar el xgal.
El IPTG es un análogo de la lactosa,
el cual tiene la capacidad de inducir
la activación del promotor lac.
Clonamiento direccional: Tanto el
inserto como el plasmido son
digerido con la misma combinación
de enzimas de restricción una en
la porción 5` y el otro en la
porción 3´. Luego se realiza la
mezcla de ligación con DNA ligaza y
el inserto será ligado
direccionalmente según la
complementariedad de los extremos
cohesivos.
Precauciones, conviene realizar
un control de eliminación del
fragmento en electroforesis,
ademas las enzimas de restricción
deben tener corte específicos que
dejen extremos cohesivos bien
diferentes.

Clonamiento con uso de fosfatasa:

Un gran inconveniente es que el
plasmido se recircularías luego
del corte con enzima de
restricción para ello se puede
usar la reacción de la fosfatasa
alcalina la cual elimina los
fosfatos de los extremos 5´ del
plasmido linearizado luego se
realiza la mezcla de ligación con
la ligaza y se obtiene un plasmido
circular con dos nick donde un OH
5anormal se enfrenta con otro
normal en 3´, este plasmido
presenta alta eficiencia de
transformación.
 Técnicas de transformación de bacterias:

Método del cloruro de calcio:

Este método consiste en agregar una solución de cloruro de calcio a una suspensión
bacteriana en fase Log de crecimiento ya que las bacterias se están replicando y
sus membranas plasmáticas presentan múltiples zonas incompletas, que se visualizan
como poros, la función del cloruro de calcio es ralentizar el cierre de estos poros
estabilizando la membrana, y evitando que hallan repulsiones de cargas entre la
membrana y el DNA transformante y entre las mismas hebras de DNA.

Otros metodos:

B.= el
método
de

electroporación, permite formar poros sobre la bacteria por donde puede entrar el
DNA, mediante pulsos eléctricos, entre los pulsos eléctricos y la adición del DNA
no debe pasar mucho tiempo o la bacteria se vuelve a cerrar.
C.= El método de las balas implica el uso de una pistola de DNA la cual dispara
unas microesferas que llevan DNA adherido, el cual una vez dentro de la bacteria se
separa de la bala y trasforma la célula.

Fago LAMBDA:
Es un virus denominado bacteriófago, es especifico para E.coli, el virus maduro
contiene un genoma de alrededor de 48 kpb y una envoltura proteica eicosaedrica, la
trascripción de genes es muy regulada, en base a esta regulación el fago tiene dos
vías de desarrollo una lítica y otra lisogenica.
El fago presenta un genoma linear dentro de su cabeza el cual se recircularías al
ser infectado dentro de coli, luego el DNA circularizado puede integrarse al DNA de
la bacteria (profago) o permanecer en su forma circular dentro del citosol.
La replicación del genoma ocurre formando un concatamero el cual posee múltiples
genomas continuos de doble hebra, pero al momento de ensamblarse el virus complete
solo un genoma es internalizado en la cabeza.
El ciclo lítico implica la completa expresión de la actividad viral donde el genoma
se replica unas cien veces por célula infectada, solo un fago infecta una celula,
mientras que en la lisogenia la actividad viral de muchos genes se ve apagada el
genoma se incluye al genoma bacteriano dando vida aun profago y la bacteria ahora
se denomina lisogenica, el ciclo lítico queda latente y se puede activar.

Para la lisogenia se necesita la integración del DNA del fago, se usan sitios
llamados attB bacteria y attP phage para el reconocimiento de integración luego
ocurre la recombinación cruzada de los extremos POP´ y BOB´, del fago y de la
bacteria respectivamente queda la unión de los genomas en BOP´ y POB´, donde se
forman los nuevos sitios que marcan la unión de los genomas a la derecha e
izquierda del genoma del fago lambda attR y attL, respectivamente.

Regulación del Ciclo Lítico o Lísogenico:

Luego de la infección el fago puede desarrollarse en forma lítica o lisogenica,
cuando el fago elige una de las dos vías se reprime automáticamente la otra, ademas
el desarrollo de las vías implica la correcta secuencia de expresión de genes
virales apropiados.
La vía LITICA empieza cuando se inicia la trascripción hacia la izquierda y derecha
del genoma del fago circularizado en los pL (left) y pR (right) respectivamente.
La terminación de la trascripción de los genes inmediatamente tempranos ocurre en
tL1 para pL y en tR1 para pR.
El trascrito temprano de pL da vida a la proteína N la cual es un antiterminador de
la trascripción y permite que la RNA polimerasa puede seguir transcribiendo luego
de tL1 y tR1.
El trascrito temprano de pR da vida a la proteína Cro es un represor de la
trascripción que inhibe la trascripción de CI y reprime también los trascritos de
pL y pR.

Transcripción temprana-tardía

La proteína N modifica a la RNA polimerasa que transcribe a partir del promotor pL.
La capacidad de la RNA pol para seguir la trascripción esta debida a la
modificación proporcionada por N con la cual, desconoce a los terminadores de la
trascripción tL1, tL2, y a otros más localizados en el operón izquierdo O L,
produciendo los transcritos de la región b, más allá del sitio attP.
Por otro lado la RNA polimerasa pasa el terminador tR1 y trascribe eficientemente
los genes para las proteínas CII, O, P y Q; entre P y Q, se encuentra un segundo
terminador tR2, el cual es mucho mas potente que tR1 y solo se puede obviar con la
presencia de N, ósea Q solo se expresa en presencia de la proteína N.
Se observa que para el ciclo lítico luego de la infección la transcripción de los
genes tempranos N y cro, así como los genes del lado izquierdo cIII, beta y del
lado derecho, cII, q, p y o, se ve disminuida debido a que la trascripción a partir
de pL y pR, se ve inhibida por la proteína Cro, ya que esta se une a los operadores
múltiples OL y OR, los cuales están solapados con los respectivos operadores.
La inhibición de la expresión génica mediada por Cro es esencial para el ciclo
lítico ya que una excesiva actividad de pL y pR, puede ser letal para el desarrollo
del ciclo.

Trascripción tardía:

La etapa que sigue a lo anterior involucra la activación de genes para completar la

maduración y formación del fago.
Esta etapa tiene inicio con la producción de la proteína Q, la cual tb presenta
función antiterminadora para el trascrito del pR’, el cual en ausencia de Q
terminaría en tR’, el hecho de que el trascripto siga atreves del terminador tR’
implica la expresión de genes específicos del ciclo lítico (cola, cabeza etc... del
virus)

Regulación del ciclo Lítico:

Se ha observado que solamente los transcritos originados de los promotores pL y pR
son susceptibles de ser antiterminados por la acción de la proteína N, se reporta
una región en el operón pL necesario para que se llevara la antiterminación, y la
denominada nut esta región esta compuesta a su vez por dos sitios: boxA y boxB,
localizado entre el promotor pL y el terminador tL1. Mutaciones en este sitio, aún
en presencia de N, provocan que la trascripción termine en tL1. Lo mismo ocurre
para el lado derecho en la nomenclatura se agrega el sub fijo R.

La proteína Q y su función:

La expresión de los genes tardíos requiere de la función antiterminadora de la

trascripción de la proteína Q. El producto de los genes R y S son los primeros en
transcribirse a partir del promotor pR’ y están relacionados con la lisis
bacteriana.

Establecimiento y Mantenimiento de la Represión del ciclo Litico:

Si después de la infección, el fago lambda opta por la vía lisogénica, deberá

integrar su genoma al cromosoma bacteriano lo cual implica que los promotores pL y
pR, deben permanecer inactivos. En el ciclo Lísogenico el sistema de represión está
funcionalmente activo manteniéndose constantes los niveles del represor CI mientras
no exista algún disturbio que active el desarrollo lítico.
El represor CI es sintetizado a partir de dos promotores diferentes: pRE y pRM.
Ambos promotores tienen como función principal la de transcribir al gen cI, pero
actúan a diferentes tiempos en la vía lisogenica.
Para que el estado Lísogenico inicie después de la infección, se requiere de la
trascripción del promotor pRE. Este promotor está localizado ~400 pb a la derecha
del gen cI, y se solapa con la región 5’terminal del gen cII. La transcripción del
pRE es en contrasentido al del promotor pR (si pR va a la derecha pRE va a la
izquierda) y requiere del activador CII.
Una vez iniciada la trascripción del promotor pRE, estos transcritos en
contrasentido a los de pR pueden complementarse y unirse con los de pR formando una
doble hélice de ARN ósea que pRE da pie para la síntesis del RNA complementario
para la producción de Cro, por lo que esta proteína ya no se traduce. Esta
estructura deberá inhibir la expresión de Cro, así como la de CII. La inhibición de
Cro es fácilmente entendible, ya que esta proteína actúa en forma antagónica al
represor CI. Para el proceso lísogenico se requiere que los niveles de Cro estén en
su
mínima expresión. Sin embargo, resulta más difícil entender la disminución de la
expresión de CII, ya que ésta es requerida para la producción de CI. Es probable
que en el momento en que CII activa al promotor pRE, los niveles de CII en la
célula están lo suficientemente altos, y no requiera de una síntesis adicional de
CII para establecer la lisogenia. Adicionalmente, cabe mencionar que el transcrito
proveniente de pRE que transcribe al gen cI tiene un Shine Dalgarno (secuencia
previa al codon de inicio que es complementaria al ribosoma 16S) lo bastante fuerte
para que CI sea traducido en forma eficiente. El regulador positivo CII también
actúa sobre el promotor pI que transcribe al gen int, y cuyo producto es necesario
para que el cromosoma del fago se integre al cromosoma bacteriano. Los niveles de
la proteína CII en la célula deben estar lo suficientemente altos para activar a
pRE y a pI. Debido a que CII es metabólicamente inestable y es degradada fácilmente
por la acción de la proteasa HflA del huésped, se requiere un factor adicional del
fago, la proteína CIII, que contrarresta la acción de esta proteasa. Así, CIII
junto con CII son requeridos para que se lleve una eficientemente la
lisogenización. Sin embargo, CIII no será necesario si el huésped contiene un gen
hflA inactivo.
Mantenimiento de la Represión del ciclo lítico:

El mantenimiento del ciclo lisogénico es debido a la acción del represor CI,

producido por la activación del pRM que produce CI de forma casi constitutiva.
Este promotor requiere de la acción del mismo represor CI para activarse, el
promotor pRM se solapa con uno de los sitios de la región del operador O R, el sitio
OR3. Para el mantenimiento de la represión se requiere primeramente que el represor
CI actúe impidiendo la trascripción de los promotores derecho en los sitios O R1 y
OR2 (los cuales se solapan con el promotor pR), y del lado izquierdo a los sitios
OL1 y OL2 (que se solapan con el promotor pL). El dímero de CI se une
preferentemente a la región OR1 del lado derecho, y a OL1 del lado izquierdo.
Estas uniones permiten que de manera cooperativa el siguiente homodímero de CI se
una a OR2 y OL2, respectivamente.
Concentraciones “normales” del represor en la célula, permiten que los sitios O R1 y
OR2 estén ocupados generalmente, y esta interacción no se extienda al sitio OR3.
Mutaciones en el sitio OR1, hacen que el dímero se una a los sitios
OR2 y OR3, indicando que la unión es cooperativa entre los dímeros de los
represores.
La unión del represor al sitio OR2 permite que la ARN polimerasa unida al promotor
pRM, se active y transcriba al gen cI, produciéndose más represor.
Si las concentraciones de CI siguen en aumento, el promotor pRM se apagará debido a
que el represor se une al sitio O R3, ósea cuando hay tanto CI que su unión llega a
unir el OR3 el pRM se ve apagado.
Este sitio y parte del sitio OR2 se solapan con el promotor pRM.
Después de un cierto tiempo, el represor decae, su concentración baja y el sitio
OR3 es el primero en quedar libre por tener menor afinidad. Los otros sitios O R2 y
OR1 quedarían libres también, sino fuera porque el represor CI unido a OR2 es capaz
de activar nuevamente a la ARN polimerasa para pRM. De esta manera se autorregula
la expresión de CI, manteniendo constantes los niveles de CI en el citoplasma.
 Fago lambda como vector de transformación:

El fago lambda presenta un genoma de 48 Kpb y por medio de inserciones o replazos

de secuencias de DNA a clonar se debe cumplir con una limitante, ósea que el nuevo
genoma obtenido, con nuestro inserto debe ser de entre un 78 %a un 105 %, del
genoma natural del fago, que si el genoma es muy chico o muy grande habrán fallas
considerables para su empaquetamiento en la cabeza del fago y su posterior
transformación. Solo un 60% del genoma del fago es necesario para el ciclo lítico
ya que un 40 % de los genes trabajan en eventos de recombinación del DNA del fago
con el cromosoma bacteriano.
Este nuevo vector presenta una alta eficiencia de transformación, es capaz de
replicarse múltiples veces dando un gran numero de copias del inserto y ademas es
capaz de llevar grandes insertos de 10 Kpb en caso de inserción y 20 Kpb en el caso
de replazo de secuencias; manteniendo la alta eficiencia de transformación del
vector.
Los vectores fago lambda son de principalmente dos tipos; de reemplazo, una zona
del DNA es extraída y reemplazad por una de interés proporcionada por el
investigador, el otro tipo se denomina de inserción este evento ocurre por
inserción de un segmento de DNA de interés en un sitio poli linker luego de la
digestión con una sola enzima de restricción (reemplazo requiere de dos corte), la
inserción ocurre dentro de un gen especifico como un lac Z o un cI.
La ventaja del fago lambda es que solo hay una partícula viral por cada 100 células
bacterianas lo cual me indica que en la placa de lisis tendré alrededor de cien mil
clones sumamente puros a corto plazo del virus con mi inserto a clonar.
Un vector de inserción muy usado es el Lambda gt10 el cual presenta un solo y único
sitio de corte para EcoRI, dentro del gen que codifica para CI, por lo que si se
realiza una inserción en esta zona se obtiene un fago incapaz de producir CI, lo
cual implica un completo desarrollo de la vía lítica de la bacteria lo cual me
permitirá obtener un gran numero de clones.

La figura muestra un caso típico para un

vector del tipo reemplazo como podría ser un
Charon 35, este tipo de vectores son capaces
de llevar un inserto de mayor Nº de pb que
lo vectores de inserción la preparacion de
un vector de reemplazo se describe en la
figura.
Una facilidad que nos entrega el fago lambda es su capacidad para formar librerías
de genes ya que un lisado de un genoma con enzimas de restricción puede ser
empaquetado de forma diferencial dentro de un fago lambda diferente, obteniendo así
por recuperación en placas de lisis, la mayoría de la totalidad del genoma
requerido recombinante en los genomas del fago.

El

rastreo de un gen por genoteca de fago lambda se realiza utilizando bacterias

infectadas con el fago, luego las placas de lisis son traspasadas a una membrana de
nitrocelulosa donde luego son desnaturadas y el DNA remanente es hibridizado por
una sonda prefabricada especifica para el gen que estamos buscando.

Los Cósmidos son esencialmente

plásmidos modificados ya que
tienen marcadores intrínsecos
de resistencia a antibióticos y
Ori como son el ColE1 y pMB1,
las principales características
de estos cósmidos son que
presentan secuencias cos
típicas de los fago lambda que
permite que el plasmidon
cósmido pueda ser insertado
dentro de la cabeza de un fago
lambda.
Se usan varios cósmidos en los
cuales se adhieren por extremos
cohesivos varios insertos que
se quieran clonar (muy usado en
genotecas) luego se hace la
reacción de empaquetamiento en
vitro y solo, el fago cortará
en los sitios cos de internalización y se quedara con dicha parte del genoma. El
tamaño del inserto puede ser de hasta 45 Kb.
Fago M13:
El fago M 13 es un fago de tipo filamentoso que pose la capacidad de infectar
bacterias que presenten pilis sexuales F+, su genoma es de ssDNA, el cual se
circularías al ingresar en la bacteria luego a partir de esta hebra + del fago se
inicia a polimerizar la hebra complementaria -, para la expresión de proteínas se
usa como templado la hebra + y para la reproducción del genoma de virus se usa como
templado la hebra -, para así tener muchas copias resultantes del tipo +.

Se usa este tipo de fago para obtener ssDNA mutado de forma especifica.
 PCR:
Polymerase Chain Reaction.

La técnica de PCR consiste en la amplificación de una secuencia especifica de de

DNA en vitro, para realizar esta reacción se necesitan dos primer reverse y foward,
para cada hebra de DNA, una DNA polimerasa, dNTPs y un medio adecuado de reacción
(buffer, sales etc…).
El DNA se amplifica en varios ciclos de calentamiento y enfriamiento de la muestra.

LA PCR consiste principalmente en tres eventos repetitivos los cuales conforman un

ciclo de amplificación, la técnica completa incluye unos 30 a 40 ciclos.

1º etapa Denaturacion: Esta etapa permite denaturar el DNA, debe hacerse a unos 90
a 96ºC, siempre dependerá del tamaño de la hebra, dura de 30 seg. a 1 min.
Hay técnicas que implican un calentamiento rápido a 96ºC y un enfriamiento rápido a
4ºC, llamada Hotstart estas etapas tiene como objetivos asegurar la correcta y
completa denaturacion del DNA, también se pueden realizar usando solución de baja
concentración salina o disruptores de puentes de hidrogeno como son la formamida y
el formaldehído.
2º etapa Annealing: En esta etapa ocurre la unión de los primers al respectivo
templado o molde, se debe realizar a unos 54 60 ºC dependiendo de la composición y
longitud de los primers y del buffer usado. 30 seg 1 min.
3º etapa Elongación: En esta tercera etapa ocurre la síntesis de las nuevas hebras
de DNA amplificado a partir de los primers usados, entra en juego aquí la Taq
polimerasa (o cualquier otra polimerasa), la polimerasa se une a los primers y
sintetiza la nueva hebra en base a la hebra molde preexistente. Este proceso ocurre
a unos 72ºC dependiendo de la polimerasa que se use y ademas de la composición del
DNA molde y de los primers.

Se usan poliemrasas termoestables y la PCR es tan efectiva que hasta se pueden

amplificar genes completos.
La amplificación como tan solo inicia luego del tercer ciclo, ya que en el primer
ciclo 1º, se obtienen dos copias largas en 3’, ya que la polimerasa no
necesariamente se cae a la altura del primer opuesto; luego en el segundo ciclo 2º,
las dos copias largas en 3’ mas las hebras moldes, reciben primers, la elongación
de estas parejas me entregan en el tercer ciclo 3º, dos moléculas iguales a 2º, mas
las dos hebras molde, mas dos nuevas hebras acotadas entre los primers elegidos que
corresponden al segmento que se quiera amplificar.
Luego de este tercer ciclo en Nº de moléculas acotadas amplificadas aumenta de
forma exponencial mientras que las largas solo se multiplican por 2 en cada ciclo,
simplificando en una PCR de 30 ciclos tengo 2n moléculas acotadas(107374764 de
moléculas amplificadas) y 2 x n moléculas largas en 3’(60 moléculas) donde “n”
corresponde al numero de ciclos.

Condiciones que me favorecen una reacción especifica de amplificación:

Es una técnica muy sensible solo necesita 0.01 ug de DNA para amplificar.
Se deben agregar pocos primers 1 y 2, 20 pmol de cada uno.
El Buffer debe ser principalmente Tris-HCl a pH 8.
Se debe agregar una concentración de MgCl 2 no superior a los 1.5 mM, este proceso
es critico ya que le entrega especificidad a la unión de los primers a la hebra
molde por estabilización de cargas, ademas las poliemrasas en general necesitan de
cationes divalentes para su actividad.
Ademas se agregan salen de potasio y amonio para entregar fuerza iónica al medio la
cual es esencial para la
estabilhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhización de cargas entre todas
las hebras de DNA.
La cantidad de Taq polimerasa no debe ser excesiva 2 unidades, dependiendo de la
cantidad de DNA que se quiera amplificar, ya que mucha taq polimerasa puede
resultar en una amplificación poco especifica del DNA.

Dos DNA poliemrasas Distintas:

La Taq polimerasa, presenta dos diferencias sustanciales con la Pfu polimerasa,
donde la Taq presenta actividad correctora exonucleasa 5’3’, la cual es poco útil
para la secuenciación en base a PCR, pero le entrega una alta procesividad a la
enzima , mientras que la Pfu presenta la actividad correctora 3’5’, la cual es
muy útil ya que permite realizar una PCR con baja probabilidad de introducir
mutaciones dentro de la secuencia amplificada con una tasa de 1.3x10 -6
mutaciones/pb, mientras que la Taq presenta una tasa 100 veces mas elevada, al
carecer de la actividad correctora; otra sustancial diferencia es que la Taq
polimerasa deja producto de amplificación con extremos cohesivos con una A en 3’
protuberante lo cual facilita el clonamiento de estas moléculas amplificadas en
vectores plasmidiales derivados de pUC, como son los pGEM-T. Por otro lado la Pfu
deja producto de amplificación con extremos romos que son relativamente más
difíciles de clonar.

Punto clave:
El reactivo mas importante de la PCR son los Primers, ya que le entregan
especificidad a la reacción, estos deben ser de unos 15 a 25 pb, la composición en
GC debe ser alrededor de un 50%, ademas no deben ser complementarios, no deben
formar estructuras secundarias de orquilla ni ser palindromes, no deben ser
complementarios entre si en los extremos 3’ o se auto replicaran, deben tener casi
la misma temperatura de annealing, no deben unir otras parte de la secuencia que no
sea la amplificar y no deben tener secuencias repetidas o serán inespecíficos.
Muchas técnicas utilizan primer que poseen colitas volantes que poseen en su
estructura alguna secuencia de reconocimiento o algún sitio de restricción, este
ultimo también se aplica al momento de fabricar un primer directo para la hebra
molde que una secuencia palindromica a si mismo como sitio de restricción de una
enzima este echo puede permitir en un futuro la correcta inserción direccional del
g
M6en si este se quiere expresar.

Reverse transcriptase PCR:

Se realiza la amplificación de DNA a partir de mRNA, por lo que se utiliza una
trascriptasa reversa que es una DNA polimerasa dependiente de mRNA, esta primera
reacción usa un solo primer de DNA y me permite obtener una hebra de DNA
complementaria a la Hebra de mRNA usada (obtengo cDNA en el caso de Eucarionte DNA
sin intrones). Una vez obtenida la hebra de ssDNA esta es usada como molde para la
síntesis de la otra cadena complementaria por usando nuevamente un solo primer y la
polimerasa (Taq), ahora obtenida la hebra de dsDNA, puede iniciar la PCR normal con
todos sus ciclos.

Real-Time PCR:
Usa un sistema compuesto por un primer que contiene una molécula fluorescente y un
apagador.
La PCR inicia normalmente en el annealing se unen los dos primers (Fw y Rev) en sus
sitios respectivos, pero un nuevo primer se une en una de las dos hebras del DNA a
amplificar se une normalmente en dirección 5’3’, donde en el extremo 5’ esta la
molécula fluorescente (R) y en el extremo 3’ el apagador (Q); cuando la polimerasa
(debe tener actividad correctora 5’3’) inicia la elongación del primer normal y
alcanza el extremo 5’ del primer modificado elimina el nucleótido modificado R, el
cual a ser separado de su apagador Q en 3’, es libre de emitir fluorescencia.
La fluorescencia es proporcional al Nº de moléculas de DNA que se están
amplificando, por lo que este proceso me permite cuantificar la cantidad de DNA que
estoy amplificando en tiempo real.
Nested-PCR: PCR anidada. Variante de la PCR convencional que comprende dos rondas
de amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en cada una, con el
fin de incrementar la sensibilidad de detección. Primero se realiza una reacción
con los iniciadores externos para amplificar una región de ADN mas extensa, que
contiene el segmento diana. Después, con este producto de amplificación, se
ejecuta una segunda PCR con los iniciadores internos para amplificar la región
específica.
El proceso de Nested-PCR permite determinar la direccionalidad del inserto que se
logro clonar en un vector y trasformar para una célula.
Se usa el primer FW usado para amplificar inicialmente el fragmento y otro primer
especifico para una zona especifica del plasmido u otro vector usado, según la
direccionalidad del inserto de fragmento un segundo proceso de PCR dará como
resultado un producto que corresponde al fragmento entre los primers usado dando la
deducción de la justa direccionalidad del primer o viceversa un resultado nulo
indicara que el inserto no se logro clonar direccionalmente.
PCR asimétrica: Se ocupa cuando se quiere amplificar una sola hebra de DNA más que
la otra por lo que los procesos de PCR ocurren de forma normal solo que se usa un
exceso del primer forward para obtener solo dicha hebra, ademas se deben realizar
mas ciclo s que la normal.

Genotecas:
Las genotecas por definición son un pool de moléculas de DNA recombinante.
Las Genotecas contienen fragmentos de todas las secuencias de un Genoma.
Las genotecas de cDNA son obtenidas a partir de cDNA y son tejido o tiempo
especifico.
Las genotecas de DNA genómico se obtienen por técnicas de DNA recombinante usando
cósmidos o DNAs virales y trasformando bacterias para obtener la copia del gen.

Fragmentación del DNA:

Hay dos tipos de fragmentación del DNA uno por ruptura mecánica por lo que obtengo
fragmentos de muchos tamaños diferentes y cortados por azar, y el otro método es
realizando digestión enzimática con enzimas de restricción la cual puede ser
parcial obteniendo muchos fragmentos o total obteniendo fragmentos respectivos a
los sitios de corte.
Otro método es usar DNAasa I la cual corta al azar dependiendo de la concentración
de sales y de la cantidad de enzima por este método puedo obtener todos los cortes
posibles para mi genoma.
Se usa como guardado genotecas basadas en cósmidos o PCR.
El uso de fago lambda para la construcción de genotecas requiere de varios pasos,
primero las secuencias del genoma deben ser incluidas en el cósmido entre los
sitios cos formando concatameros, luego el empaquetamiento necesita un extracto de
cabezas y colas del fago, la Proteína A y obviamente los concatameros. Si se usa
solo el genoma del fago y no un cósmido, se deben realizar cortes del genoma en
sitios conocidos con ER, obtenido fragmentos de mas de 15 Kpb luego estos debe ser
recombinados entre los brazos R y L, del fago recombinante para que luego el genoma
pueda ser incluido en la cabeza (78% y 105%)(Charon) por seguridad el DNA
recombinante se podría mutilar para su protección.

Representatividad de una genoteca:

La representatividad es el Nº total de recombinantes (N) para tener una
probabilidad (P) de que un clon en la genoteca tenga una secuencia determinada

ln(1-P)
N= ln(1-f)

Esta relación ademas depende de la fracción media de genoma en cada clon (f).

Tamaño medio inserto en pb

f=
Tamaño del genoma en pb

Ejemplo usando fago l como vector en una genoteca del genoma humano:

N = ln(1-0.99)/ln[1- (2x 104/3 x 109)] = 6.9 x105

Vectores de Expresión en E.coli:

La estructuración típica de un vector de expresión en E.coli, debe
contener un promotor fuerte de fácil regulación, seguido por una
secuencia de unión a ribosomas (RBS), luego un sitio de
poliliclonamiento donde introducir el gen a expresar y por fin un terminador
eficiente de la trascripción.
Con la expresión en procarionte de proteínas fusionadas eucariontes se pueden
obtener anticuerpos fusionados con otras proteínas (ej enzimas), para realizar
columna cromatograficas o inmunoensayos específicos.
Mientras que la expresión de proteínas nativas, puede ser útil para, aislar
productos activos de prooncogenes, hacer proteínas mutadas sitio específicamente y
para estudiar el rol de proteínas de unión a DNA.
Cuando se trabaja con proteínas fusionadas en Coli, estas siempre serán producidas
en altos niveles ya que la trascripción del gen y traducción, son mediadas por
secuencias de iniciación propias de E.coli.
La proteína resultante fusionada debe tener una porción o péptido de una proteína
propia de E.coli, o la proteína producida puede ser reconocida como extraña y ser
degradada por proteasas (más estable).
La fusión de una secuencia extraña a un gen de E.coli, da siempre como resultado
una proteína de mayor tamaño que las proteínas de E.coli normales por lo que su
separación puede realizada a partir de un gel de SDS-PAGE, luego la banda se extrae
se liofiliza y se obtiene la proteína.
Vectores de expresión con fusión a gen Lac Z:
Estos vectores de clonamiento presentan generalmente un P lac, un sitio de
policlonamiento, el gen Lac Z (beta-galactosidasa) y un terminador de la
trascripción. Por lo tanto la inserción correcta direccionalmente de cDNA derivado
de mRNA de procarionte, la justa inducción de la expresión del P lac, dará como
resultado una proteína fusionada donde el extremo amino será la proteína beta
galactosidasa con su actividad y el en extremo carboxilo encontraremos nuestra
proteína a estudiar.(pUR 270)
Otro tipo de plásmidos se componen por el promotor Pr y la proteína cro del fago
Lambda seguidos por el gen Lac Z donde en su extremo N-terminal se encuentra el
sitio de policlonamiento seguido últimamente por una señal de “Stop” y un
terminador de la trascripción., para el uso de este vector de expresión se debe
tener una coli que en su genoma exprese para el represor cI termo-sensible de la
trascripción a partir de Pr, este hecho permite controlar fielmente la expresión
del cDNA insertado en el sitio de policlonamiento, ya que al aumentar la
temperatura de incubación del cultivo se interrumpirá la represión del promotor Pr
por CI, este evento permitirá la expresión temprana de cro que a su vez un regula
la actividad del promotor Pr, lo que producirá nivel aceptables de expresión de la
proteína fusionada donde en el extremo carbonilo encontrare el péptido derivado del
inserto y en el amino la beta-galactosidasa.(pEX 2)
Otros vectores incluyen ORF, estos presentan un P lac, parte del gen cI, un sitio
de policlonamiento seguido por un gen deletiado en su extremo 5’ de Lac Z que
presenta el marco de lectura corrido. Al insertar el cDNA foráneo el marco de
lectura del gen Lac Z vuelve a ser normal, dando como producto una proteína
fusionada con en su extremo amino parte de la proteína CI, luego la proteína
eucarionte y finalmente la enzima beta-galactosidasa activa, estas bacterias pueden
aislarse sobre agar Mac Conkey.(pMR 100)
Vectores de expresión para proteínas nativas, el plasmido pKC30, es un derivado de
pBR322, y presenta una porción del genoma del fago lambda delimitada por hindIII y
BamHI, la cual incluye el promotor pL como iniciador, el gen de resistencia a
tetraciclina y el gen nutL para codificar la proteína N, si el gen nativo se
inserta en N, la regulación puede ser lograda trasformando células con el gen
represor cI termoestable y creciendo la bacteria a diferentes temperaturas para
inactivar dicho gen y promover la trascripción de la proteína.
Otro tipo de plásmidos son los plasmido tac, estos presentan un promotor del tipo
tac, compuesto por parte de la secuencia del fuerte promotor para la RNA polimerasa
del fago T7 y por otra parte del promotor lac, lo cual hace este mega promotor
compuesto muy fuerte e inducidle por IPTG (el IPTG hace que la expresión de mi gen
sea aumentada muchas veces), seguido viene el sitio de policlonamiento, el gen del
RNA 5S ribosomial y los terminadores de la trascripción. (pKK177)
Algunos plásmidos incluyen el promotor pT7Φ 10 y su respectivo terminador TΦ, esto
permite obtener un transcrito estable y eficiente, ademas para la traducción se
incluye una secuencia para inicio de la traducción tipo SΦ, que es la proteína del
capside mayor del fago T7. El uso de estos promotores involucra el conocimiento de
procesos internos de las bacterias y características de estas para obtener una
expresión suficiente de la proteína.

Es posible que los métodos antes explicados podruzcan problemas a nivel de la

expresión de la proteína por lo que deben ser sustituidos por otros métodos. Las
fallas más comunes son, que las proteínas no presentan un iniciador de la
traducción metionina y estos no se traducen, algunas proteínas puede sufrir
plegamientos no idóneos y resultar inactivas o también algunas proteínas fusionadas
igualmente son reconocidas como extrañas y son degradadas.
Para ello se pueden realizar proteínas fusionas para la secreción de estas al
periplasma y luego separadas por proteasas especificas o bromuro de cianógeno.
Estos métodos alternativos se desarrollaron ya que algunas proteínas inestables en
el citoplasma no lo son en el periplasma, o mas bien son inactivas en el citoplasma
y solo adoptan el correcto plegamiento y actividad en el periplasma y ademas la
proteínas que no presentan el Met N-terminal permiten que la separación de la
proteína fusionada ocurra justo entra la señal de exportación y la proteína de
interés.
El plasmido más conocido para este uso es el pTA 1529, este plasmido presenta la
secuencia de la señal y su respectivo promotor, seguidos por el sitio de
policlonamiento donde se realizara la inserción del gen. (pSSSSPolilInker).
Elegido el método de transformación y expresión podemos inclusive tratar de
maximizar los niveles de expresión de la proteína entre otros están: Usar mutación
sitio dirigida para fomentar la iniciación de la traducción, usando células con
deficiencias en la terminación transcripcional (Rho -), para aumentar los nivel de
RNA funcional, usando secuencia cercanas al gen insertado que permitan obtener un
mRNA mas estable y con una traducción favorecida, aumentando la cinética de
síntesis, aumentando la temperatura, modificando el sitio de unión del ribosoma,
usando un promotor mas fuerte de la trascripción, aumentando la replicabilidad del
plasmido y por en de el numero de copias o simplemente aumentar la cantidad de
inductor de trascripción administrado, también se pueden usar cepas bacterianas
deficientes en proteasas o administrar inhibidores de las mismas en el crecimiento
celular y al momento de lisar las células.
Otro de vectores expresión bien caracterizado es el pBS1-2.
Este al contrario que el antes mostrado es un vector de expresión citoplasmática,
que presenta un promotor tac inducible por IPTG, la expresión de la proteína
fusionada marcada por S1 se limita al citoplasma, la proteína es marcada por S1 en
el extremo N-terminal y la proteína fusionada marcada puede ser cortada por
Trombina.
La marcación S1 es derivada del Virus de la Hepatitis y es reconocida por varios
anticuerpos policlonales como ab1016, se ha demostrado que la marcación con S1 no
afecta la actividad de la proteína expresada.
El uso de vectores con anticuerpos permite obtener la proteína marcada unida al
anticuerpo ya dentro la célula, este hecho facilita la purificación de la proteína
expresada por una columna de HPLC de afinidad.

Vectores de clonamiento y expresión en levaduras:

Las levaduras son eucariontes unicelulares de rápido crecimiento, no patógenas y
presentan las mismas ventajas de la genética bacteriana ya que se conoce su genoma,
sus vías metabólicas y se tienen ya cepas mutantes para el estudio.
El vector base para transformación de levaduras presenta un marcador de selección
para ampicilina, un sitio de replicación en común con coli pMB1 o colE1, ademas de
una porción del DNA de levadura y otro marcador de selección.
Los plásmidos integradores llevan el nombre de YIP, todos se pueden trabajar tanto
en coli como en levadura por lo que son llamados Shuttle.
YIP+2u DNA: Es un plasmido integrador que posee un origen de replicación de un
plasmido propio de levadura el 2 micra, este origen tiene la capacidad de ser
autoreplicativo y entrega hasta 50 copias del plasmido por célula es denominado
YEP.
Si aun YIP se une una secuencia ARS o autoreplicativa se obtiene un plasmido tipo
YRP de múltiples copias.
Si ahora un YRP se le introduce una secuencia CEN de centrómero se obtiene un
cromosoma artificial de levadura, el cual es estable en los procesos de mitosis y
meiosis, debido a que se comporta como cromosoma con centrómero y telómero este
cromosoma artificial de mas de 50 Kpb solo tiene no mas de 2 copias por célula y se
denomina YAC. En estos cromosomas se pueden hacer insertos de 50 a 300 Kpb.
Los marcadores típicos de levaduras son principalmente vía metabólicas para la
síntesis de AA.
Las secuencias del Vector YAC
incluyen :
CEN-centrómero, TEL-telómeros,
ARS-origen de autorreplicación,
Amp-marcador de resistencia,
Ori-Origen de replicación en
coli.
Este tipo de vectores se usan
especialmente en una cepa
especifica de levaduras la
AB1380, la cual es de coloración
rojiza, ya que trae una mutación
ocre, en un gen el ade-2,
involucrado en el metabolismo de
la adenina, el cual da como
resultado la acumulación de un
producto de color rojo.
Sin embargo los vectores que
tienen el gen SUP (4) supresor
de la mutación en ade-2 (tRNA),
recupera las funciones
metabólicas normales, resultando
en colonias no coloreadas.
Ademas las cedulas hospederas
presentan mutaciones
auxotroficas recesivas para los genes trp 1 y ura 3, los cuales son complementados
por los alelos TRP1 y URA3 provenientes del vector, lo cual nos permite identificar
las células que poseen el YAC.
Si se realiza un inserto en el sitio de policlonamiento dentro del gen SUP4, se
produce una inactivacion por inserción del gen lo cual restablece la coloración
roja de la colonia.

Vector de Clonamiento y expresión típico para levaduras:

Un vector de típico de expresión en levadura

poseen un sitio ARS o 2 micra de
autorreplicación, un marcador de resistencia a
Amp, uno o mas marcadores de resistencia
auxototróficos para aa, un Ori común (pMB1 o
colE1) para coli para trabajar en bacterias y
un promotor (fuerte) el cual puede ser
constitutivo, regulado ó Heterologo, mas un
terminador efectivo de la trascripción,
flanqueando el gen huésped que se quiera
expresar.
El pYes ademas presenta el promotor de la
polimerasa del
fago T7 para la
expresión del gen
en procariontes.
 Algunos plásmidos de importancia:

The architecture of an expression vector. An expression vector should contain a strong inducible
promoter, a multiple cloning site for the insertion of target genes, and a transcriptional terminator.
Additionally, a ribosome binding site (RBS) is included to promote efficient translation.
Figure 17.5
pKK177-3 is a tac vector containing multiple sites
downstream from the tac promoter into which a gene can
be cloned. Downstream from these sites is rrnB, which
contains an E. coli 5S gene and the T1 and T2
terminators (Amann and Brosius 1985).