UNIVERSIDAD ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE.

Etapa 3 - Ejecución y seguimiento

REALIZADO POR

LEYDY YOHANA BURGOS MOLANO CODIGO 1056929674

TUTOR

ANGELICA ROCIO GUZMAN

TUNJA, OCTUBRE

2017
 Introducción

Los bioensayos de toxicidad son una técnica que nos permiten evaluar el grado de
afectación que una sustancia química o agente contaminante se encuentra en
organismos vivos éstos pueden ser agudos o crónicos.

El presente trabajo es un bioensayo de toxicidad realizado con semillas de lechuga

donde se evalúan los efectos fitotoxicos de compuestos puros o de mezclas
complejas en el proceso de germinación de las semillas, en nuestro caso se evalúan
los resultados del grado de toxicidad de aguas provenientes del rio Toca.

El objetivo de nuestro trabajo consistió en emplear una metodología sencilla. Para

ello analizamos el resultado de germinación de las semillas de lechuga e Interpretar
los resultados del bioensayo para evaluar el nivel de toxicidad de una muestra.
Mapa conceptual
 Diagrama de flujo bioensayo de toxicidad con semillas de
lechuga

a. Preparación de las soluciones

Solución de control positivo:

Se preparará una solución salina
de 5g/L, mezclar con 200mL de Solución de control negativo:
agua limpia, puede ser agua Alistar mínimo 200mL sin gas
destilada o de bolsa que no y sin saborizante para el
contenga cloro ni gas, mezclar bioensayo
bien y luego marcar el recipiente
que diga "Control (+) 5g/L

Solución de muestra contaminada:

Alistar 100mL de agua contaminada y
marca con el nombre de Muestra

b. Montaje Del Bioensayo

Coger 7 cajas petri y colocar en

Marcar correctamente cada caja
cada una de ellas un disco de papel
de Petri con la dilución
filtro o un recorte de papel
correspondiente y la solución que
absorbente con la forma de la
se aplicará de la siguiente manera:
circunferencia de la caja de Petri.

Caja 1: C(+) Solución salina.

Colocar 4mL de cada solución en la
caja de Petri correspondiente,
saturando el papel filtro
dispersando homogéneamente la
solución sobre éste evitando que
se formen bolsas de aire.
Caja 2: C(-)1 Agua pura
Caja 3: C(-)2 Agua pura
Caja 4: C(-)3 Agua pura
Caja 5: M1 Agua contaminada
Caja 6: M2 Agua contaminada
Caja 7: M3 Agua contaminada

Utilizar jeringas para la aplicación
de la muestra y los controles
positivos y negativos, para evitar la
contaminación cruzada.
Con la ayuda de una pinza, colocar
cuidadosamente 20 semillas de lechuga (cuatro
hileras de cinco semillas), dejando espacio
suficiente entre las semillas para permitir la
elongación de las raíces. Seleccione semillas de
tamaño, forma y color similar.

Tapar las cajas de Petri, y cubrirlas
de la luz inmediatamente después
de colocar las semillas en su
interior, envolver cada caja de
Petri con papel aluminio.
Marcar con cinta de enmascarar cada caja de Petri
envuelta con papel aluminio. Los controles
negativos se marcarán como C(-)1, C(-)2 y C(-)3, el
control positivo con una C(+) y las muestras como
M1, M2, M3, según la réplica correspondiente.

Marcar con cinta de enmascarar cada caja de Petri

Colocar las cajas de Petri envueltas en papel
aluminio dentro de una bolsa plástica (ziploc) para
prevenir que se escape la humedad, según la
réplica correspondiente.
 Descripción de la muestra llevada al bioensayo
La recolección de la muestra se realiza del cuerpo de agua del rio Toca fuente
hídrica que ha sido contaminada por las industrias. Una de las principales causas
de contaminación son los desechos orgánicos e industriales, el vertimiento de aguas
residuales de las viviendas.
Para obtener la muestra de agua se siguió el protocolo establecido por el IDEAM
Guía de monitoreo de vertimientos, aguas superficiales y subterráneas. Una vez
tomada la muestra seguimos con el procedimiento anteriormente mencionado
mediante flujograma y a la ejecución del bioensayo de toxicidad con semillas de
lechuga.
EJECUCION DEL ENSAYO

A. Preparación de soluciones

Solución de control positivo

Las soluciones de control positivo están diseñadas para obtener resultados similares de
los que se obtendrían con agua contaminada. Esta solución nos permitirá observar cómo
reaccionan las semillas al agua contaminada.

Se preparó una solución salina de 5g/L, disuelta en 200mL de agua limpia, sin gas ni cloro

Solución de control negativo

Se toma una muestra de agua de 200mL para el bioensayo sin gas ni saborizantes.

Solución de muestra contaminada.

Para esta solución se toma 100mL de agua contaminada del rio Jordán.

B. Montaje De Bioensayo
Para el montaje del bioensayo utilizamos las 7 cajas Petri, colocamos en cada una de las
cajas un disco de papel filtro y enseguida marcamos cada caja de la siguiente maner

MARCACIÓN CAJAS PETRI

Caja 1: Control positivo C (+) Solución salina
Caja 2: Control negativo réplica 1 C (-)1 Agua pura
Caja 3: Control negativo réplica 2 C (-)2 Agua pura
Caja 4: Control negativo réplica 3 C (-)3 Agua pura
Caja 5: Muestra contaminada réplica 1 M1 Agua contaminada
Caja 6: Muestra contaminada réplica 2 M2 Agua contaminada
Caja 7: Muestra contaminada réplica 3 M3 Agua contaminada

Las réplicas son repeticiones que se realizan del mismo tipo de agua (en este caso para
agua pura y para agua contaminada) para eliminar lo máximo errores experimentales en
el bioensayo.

Colocamos 4mL de cada solución en la caja de Petri correspondiente, saturamos el papel

filtro o absorbente dispersando homogéneamente la solución sobre éste evitando que se
formen bolsas de aire.
Con la ayuda de una pinza colocamos en cada caja Petri 20 semillas (cuatro hileras de
cinco semillas), dejando espacio suficiente entre las semillas para permitir la elongación
de las raíces.

Resultados
Después de haber completado los cinco días, enseguida evaluamos la muestra
comparando el efecto generado en los organismos expuestos a ésta con respecto a la
respuesta en los organismos del control negativo, sujetos a las mismas condiciones de
ensayo, excepto por la ausencia de contaminación.
- Cálculo del porcentaje de germinación:
Primero se anotará el número de semillas germinadas en cada caja de Petri, según lo
indicado en la siguiente tabla.
Tabla 1. Número De Semillas Germinadas

Cajas de Petri

Variable C C (-) 1 C (-) 2 C (-) 3 M1 M M3

(+) 2
# de semillas germinadas 17 16 14 15 9 8 9
Promedio 17 15 8,6667
% germinación 57,7778
% inhibición de 42,2222
germinación

Posteriormente, se obtiene el promedio de las réplicas del control negativo (Promedio C neg) y el
promedio de las réplicas de la muestra contaminada (Promedio M).

-Finalmente, se calcula el porcentaje de germinación:

Promedio M
% de germinación = ∗ 100
Promedio C neg
8,6667
% de germinación = ∗ 100 = 57,778
15
- Cálculo del porcentaje de inhibición de la germinación
(Promedio C neg − Promedio M)
% Inhibición de germinación = ∗ 100
Promedio C neg

15 − 8,6667
% Inhibición de germinación = ∗ 100 = 42.222
15

Tabla 2. Longitud de hipocótilo (mm)

 CALCULO LONGITUD HIPOCÓTILO (mm)
SEMILLA C(+) C (-) 1 C (-) 2 C (-) 3 M1 M2 M3
1 16 13 14 12 8 9 9
2 15 13 12 12 8 9 8
3 13 12 11 12 8 9 8
4 12 10 11 12 7 9 7
5 12 10 10 11 7 8 7
6 12 10 10 11 7 8 7
7 11 10 10 11 7 6 7
8 10 9 10 11 4 6 7
9 10 9 10 9 4 6
10 10 9 9 9
11 10 8 9 8
12 10 8 9 8
13 10 8 9 8
14 10 8 9 8
15 10 8 6
16 9 4
17 10
18
19
20
CONTAR 17 16 14 15 9 8 9
PROMEDIO 11,176 9,313 10,214 9,867 6,667 8,000 7,333
CAJA
DESVIACIÓN 1,944 2,213 1,424 1,959 1,581 1,309 0,866
CV 17,394 23,760 13,940 19,856 23,717 16,366 11,809
Promedios 9,7978 7,3333
% Inhibición Desarrollo Hipocótil 25,1534

Cálculo de porcentaje de inhibición de hipocótilo

(Promedio EH Cneg – Promedio EH M)
% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒𝑠𝑎𝑟𝑟𝑜𝑙𝑙𝑜 𝐻𝑖𝑝𝑜𝑐ó𝑡𝑖𝑙𝑜 = ∗ 100
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝐻 𝐶𝑛𝑒𝑔

9,7978 − 7,333
% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = ∗ 100 = 25,1534
9,7978
6. Medida de elongación de radícula (ER) en cada caja de Petri
 Tabla 2. Longitud de Rádicula (mm)
CALCULO LONGITUD RADÍCULA (mm)
SEMILLA C(+) C (-) 1 C (-) 2 C (-) 3 M1 M2 M3
1 6 6 5 6 6 5 5
2 5 5 5 6 5 5 5
3 4 5 5 5 3 3 5
4 4 5 5 5 3 3 4
5 4 4 5 5 3 3 3
6 4 3 4 5 2 2 2
7 4 3 4 5 2 1 2
8 4 3 4 5 1 1 2
9 3 3 3 4 1 1
10 3 3 3 4
11 3 3 2 4
12 2 3 2 3
13 2 3 1 2
14 2 3 1 2
15 2 2 1
16 2 2
17 1
18
19
20
CONTAR 17 16 14 15 9 8 9
PROMEDIO 3,235 3,500 3,500 4,133 2,889 2,875 3,222
CAJA
DESVIACIÓN 1,300 1,155 1,506 1,506 1,691 1,553 1,563
CV 40,196 32,991 43,040 36,424 58,551 54,005 48,522
Promedios 3,711 2,995
% Inhibición Desarrollo Hipocótilo 19,2864

 Cálculo de porcentaje de inhibición de radícula

(𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝑅 𝐶𝑛𝑒𝑔 – 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝑅 𝑀)

% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒𝑠𝑎𝑟𝑟𝑜𝑙𝑙𝑜 𝑅𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 = ∗ 100
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝑅 𝐶𝑛𝑒𝑔
3,711 − 2,995
% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = ∗ 100 = 19,2864
3,711

 Cálculo de índice de germinación IG

El índice de germinación (IG) se calcula multiplicando el número de semillas germinadas por la
longitud media de la raíz, expresando ambos parámetros como porcentaje respecto al testigo, o sea
al control negativo, es decir, que cada dato de longitud de radícula y de semillas germinadas deben
pasarlo a porcentaje, utilizar la siguiente formula:

𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝑅 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑚𝑚)

% 𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = ∗ 100
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝑅 𝐶𝑛𝑒𝑔 (𝑚𝑚)
7,333 (𝑚𝑚)
% 𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = ∗ 100
9,7978 (𝑚𝑚)

% 𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟a = 74,8433%

 Para germinación (éste se calculó en el punto 1):

𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

% 𝐺𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = ∗ 100
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎𝑠 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔

8,6667
% 𝐺𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = ∗ 100 = 57,778%
15
Después de tener calculados ambos porcentajes se halla el índice de germinación como se muestra
a continuación, solo se debe calcular un índice de germinación, ya que sólo se recolectó una
muestra, y las réplicas no son muestras.

𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (%) 𝑥 𝐺𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (%)

𝐼𝐺 =
100
74,8433 (%) 𝑥 57,778 (%)
𝐼𝐺 =
100

𝑰𝑮 = 𝟒𝟑,𝟐𝟒𝟐𝟗%

7. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Ya hemos finalizado nuestro bioensayo con las semillas de lechuga donde según los datos
de cada una de las tablas nos muestra que no se cumplió con el 100% de germinación de
todas las semillas ubicadas en cada caja Petri, la mayoría de las semillas presentaron un
color marrón unas claro y otras oscuras.

En cuanto a las réplicas de control negativo si las comparamos con las muestras de agua
contaminada podemos observar que no es mucha la diferencia de las semillas germinadas
lo que nos indica que el grado de toxicidad de las aguas del rio Toca no es tan alta.
El índice de germinación expresa tanto el porcentaje de semillas germinadas como el
porcentaje de crecimiento que alcanza la radícula durante el bioensayo. Los resultados
obtenidos de la única muestra que tomamos nos arrojó un resultado del 72,855%

Al parecer el procedimiento para realizar nuestro bioensayo tuvo buenos resultados

teniendo en cuenta que del 100% de las semillas que teníamos el 84,44% fueron
germinadas.

Concluimos Si La Muestra Es Tóxica.

1. ¿Su muestra supera el porcentaje de inhibición de germinación, crecimiento de radícula
o de hipocotilo en un 50%?
Según los datos obtenidos en cada tabla tenemos los siguientes resultados

ITEM %
% Inhibición De Germinación 42,2222%
% Inhibición Desarrollo Longitud Hipocótilo. 25,1534%
% Inhibición Desarrollo Long. Radícula 19,2864%
Hipocótilo.

Estos resultados nos indica que la muestra del bioensayo no supera el 50% de Inhibición

2. ¿Qué significa cada porcentaje de inhibición obtenido? ¿Entre mayor es el porcentaje de

inhibición la muestra es más tóxica o menos tóxica?

% INHIBICIÓN
% Inhibición De Germinación
% Inhibición Desarrollo Longitud Hipocótilo.
% Inhibición Desarrollo Long. Radícula
Hipocótilo.
Elongación De Hipocótilo Y Elongación De
Radícula.
ANALISIS
Este resultado nos determina el potencial de
toxicidad agudo en la siembra de semillas de
lechuga.
El porcentaje de Desarrollo Longitud Hipocótilo
como el porcentaje de Inhibición Desarrollo
Long. Radícula Hipocótilo constituyen unos
indicadores representativos donde
determinamos la capacidad de desarrollo de la
planta
A diferencia de la prueba tradicional de
germinación de semillas, la evaluación del
efecto en la elongación de la radícula y del
hipocotilo de las plántulas permite ponderar el
efecto tóxico de compuestos solubles
presentes en niveles de concentración tan
 bajos que no son suficientes para inhibir la
germinación, pero que sin embargo pueden
retardar o inhibir completamente los procesos
de elongación de la radícula o del hipocótilo.
De esta manera, la inhibición en la elongación
de la radícula e hipocotilo constituyen
indicadores muy sensibles para la evaluación
de efectos biológicos en vegetales, aportando
información complementaria a la
proporcionada al estudiar el efecto en la
germinación
Entre mayor sea el porcentaje de inhibición la muestra es más tóxica.

3. ¿En qué parte de la planta tuvo más efecto la posible presencia de tóxicos en la muestra?

Si me voy a los resultados obtenidos de la medida de elongación y medida de radícula concluimos

que la parte de la planta que tuvo más efecto por la presencia del tóxico fue la longitud de radícula
porque no tuvo mayor crecimiento y el porcentaje de germinación estuvo por debajo del 50%.

4. ¿Qué significa el Índice de Germinación obtenido? ¿Hubo inhibición o mayor desarrollo? ¿A qué
se le puede atribuir este resultado?

El índice de germinación expresa tanto el porcentaje de semillas germinadas como el porcentaje de

crecimiento que alcanza la radícula durante el bioensayo. Los resultados obtenidos de la única
muestra que tomamos nos arrojó un resultado del 43,2429%. Este resultado nos indica que no
tuvimos un mayor porcentaje de germinación ya que la muestra de agua tomada del rio Jordán es
bastante toxica.

5. ¿Hay riesgo de toxicidad en la muestra tomada?

Si analizamos que solo tuvimos un índice de gemación del 43,2429% podemos decir que sí existe
un riesgo de toxicidad en la muestra tomada, debido al agente tóxico que se encuentra
contaminando el agua del rio Jordán.

Si observamos de manera detallada el promedio de germinación de control negativo concluimos

que de las 20 semillas analizadas germinaron 15, es decir, que para el control negativo tuvimos un
resultado de germinación del 75%.
15 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎𝑠
∗ 100 = 75% 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜
20 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎𝑠

En cuanto a las muestra con agua contaminada, donde de las 20 semillas analizadas sólo germinó
un promedio de 8,66 semillas, es decir, que de un 100% tenemos un resultado de germinación del
43.3% lo que nos indica que el grado de toxicidad de las aguas del rio Jordán es alto.

𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 8,66 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎𝑠

∗ 100 = 43,3% 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
20 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎𝑠
8. EVIDENCIA FOTOGRÁFICA
 CONCLUSIONES

La ejecución de este trabajo me permitió identificar los diferentes tipos de bioensayos

utilizados para pruebas de toxicidad. Al momento de realizar el montaje del bioensayo fui
adquiriendo la habilidad para interpretar los resultados con el fin de evaluar en nivel de
toxicidad en una muestra.
Durante el análisis de la elongación de la radícula y del hipocótilo se podía verificar la
intensidad del toxico al generar una inhibición media en la estructura de las semillas; por
medio de ésta afectación a la estructura se puede establecer que parte de la semilla fue
más vulnerable con referencia al tóxico si se genera mayor inhibición a la radícula o al
hipocótilo.
De acuerdo a los resultados obtenidos experimentales se analiza que las semillas de control
negativo tienen mayor crecimiento, mientras que la muestra con agua contaminada tuvo
menor crecimiento, debido a la concentración o agentes tóxicos que se encuentran
contaminado el rio Jordán que fue la fuente hídrica escogida para elaborar el análisis, estos
agentes tóxicos son los responsables de generar una limitación en el porcentaje de
germinación de las semillas con agua contaminada
 BIBLIOGRAFÍA.

Guía componente práctico

http://campus02.unad.edu.co/ecapma03/pluginfile.php/670/mod_resource/content/3/Guia_
de_p ractica_autonoma_290.pdf
Protocolos para el monitoreo y seguimiento de tóxicos
http://campus02.unad.edu.co/ecapma03/mod/book/view.php?id=524&chapterid=79
Protocolos para el monitoreo y seguimiento de tóxicos ambientales
http://campus02.unad.edu.co/ecapma03/mod/book/view.php?id=524&chapterid=80
Bioensayos para toxicidad en agua y suelo
http://campus02.unad.edu.co/ecapma03/mod/book/view.php?id=524&chapterid=81
Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/573/cap4.pdf
ICML Laboratorio de Bioensayos y Limnología Aplicada
https://www.youtube.com/watch?v=ER_-iKg0Isg
Artículos De Estudios Científicos
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0048969707000484
Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo de Canadá (CIID). (2000).
Aquatox 2000. Canadá: Autor. Disponible en http://idl-
bnc.idrc.ca/dspace/bitstream/10625/31600/1/118283.pdf