INFORME No 2.

ELECTROFORESIS
Maria Hilda Verdugo (2160010)
Astrid Johana Bautista Garces (2161444)

INTRODUCCIÓN

La mayoría de biomoleculas entre ellas el ADN, ARN y las proteínas poseen una
carga eléctrica, Esta característica permite que mediante la técnica molecular de
electroforesis dichas moléculas se muevan o migren a través de un gel hacia su
polo opuesto cuando se les aplica un campo eléctrico. su cantidad de migración
depende del tamaño o peso molecular de cada muestra. La matriz sobre la cual
migran las moléculas es de contextura porosa actuando a modo de red y debe
estar sumergida en una solución neutra para no alterar el pH de las muestras, de
esta forma las moléculas de tamaños pequeños migraran más (les es fácil pasar
por los poros de la matriz), mientras que a las moléculas de tamaños grandes les
costara movilizarse. para evidenciar el movimiento del material se agrega un
colorante que al ser puesto bajo luz UV emiten fluorescencia. Y además el haber
aplicado en el gel una solución de referencia es decir una muestra de pesos
moleculares conocido, con el fin de tener un punto comparación entre este y las
muestras desconocidas.
El ADN posee en su estructura un esqueleto compuesto por grupos fosfato que
están cargados negativamente, esto le confiere estabilidad y es una característica
aprovechada para su estudio. El presente informe se basa en una electroforesis
hecha anterior mente y con la que se pretende ver diferencias de migración entre
diferentes estados de este material genético tales como; ADN total, sometido a
PCR (recombinante), relajado y súperenrollado, y lograr relacionarlos con la
muestra de referencia.
La migración en el gel no depende totalmente del peso molecular de las muestras,
habitualmente la topografía o conformación de las moléculas interviene en este
proceso. De este modo 3 moléculas idéntica en pares de bases pero con 3
diferentes conformaciones (lineal, enrollada o superenrollada) tendrán diferentes
patrones de migración en el gel, es decir unas llegaran más lejos que otras. Las
moléculas superenrolladas son compactas y de menor volumen por lo cual les
será más fácil moverse por el entramado del gel, mientras que las otras formas
son más lentas en el avance. Por este motivo no hay que confiarse de que
nuestras muestras están todas bien situadas con respecto del ADN referencia
(habitualmente lineales), pues estos fenómenos afectan el resultado. Por tal razón
se deben hacer análisis con programas especiales para que el resultado sea más
confiable.

MATERIALES Y MÉTODOS

Gel de agarosa
Buffer de corrida 0,5X TBE
Buffer de carga
Colorante EZ-VISION
 Primero se acomodó debidamente el molde con el peine.
Se preparó el gel de agarosa al 0.8%, mezclando 0.4g de agarosa en 50 mL de
0,5X TBE, esta solución se llevó al horno microondas para fundirla y luego servirla
en el molde, allí se dejó enfriar a temperatura ambiente para posteriormente cubrir
con buffer de corrida 0,5X TBE.
Por otra parte, la preparación de las soluciones de ADN se hizo en papel ParaFilm
mezclando las diferentes muestras por separado (1uL de referencia de peso
molecular Thermo 1Kb, 5 uL de ADN total, 5 uL de PCR, 5uL de plásmido
recombinante y 5 uL de plásmido no recombinante) con 1.5uL de colorante EZ-
Vision y buffer de carga.
Posteriormente se procedió a depositar cada solución en el fondo del pozo con
una micropipeta, para poder conectar los electrodos y hacer la corrida del gel a 1-
10V/cm, para finalmente levantar el gel y visualizarlo bajo a lámpara UV.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

1.

5 4 3 2 1
1. Marcador de
referencia.
2. ADN total
3. PCR
4. Plásmido
recombinante. PCR
5. Plásmido no Distancia recorrida: 0.608
recombinante. Tamaño del fragmento: 1364pb

Imagen1. Revelación de Grafica 1. Relación de distancia de migración con el tamaño en pares de

electroforesis bases de fragmentos de ADN en cada banda.

El tamaño del ADN total (carril 2), se encuentra por encima del último valor del
marcador de peso molecular que es de 10000 pares de bases, es decir este ADN
cuenta con más de 10.000 pb como vemos en la imagen 1. La razón es porque en
esta muestra contamos con el ADN completo de un organismo (no está cortado en
fragmentos) así que al ser un único fragmento de gran tamaño se le dificultará
viajar y esto se verá traducido a un estancamiento de la molécula al inicio del gel.
Si el porcentaje de agarosa hubiese sido más bajo y se hubiese usado un
marcador con un rango de pares de bases más amplio este ADN completo
posiblemente hubiera migrado más fácilmente, como también correspondido con
algún peso molecular de referencia.
 El carril 3 que corresponde a la PCR, es una amplificación de un fragmento de
1364 pares de bases el cual recorrió una distancia mayor 0,608 cm según el
análisis de la electroforesis por medio del programa gel analyzer (grafica 1).

Los carriles 4 y 5 corresponden a muestras de plásmido, estas no se pueden

comparar con el marcador de referencia ya que los plásmidos presentan un ADN
circular el cual puede estar relajado o súper enrollado y dependiendo de la
conformación que presente va a recorrer más o menos distancia a través del gel
independientemente del número de pares de bases que presente, por ejemplo
cuando el plásmido está superenrollado puede pasar más fácil por los poros del
gel a diferencia de un plásmido relajado el cual así presente el mismo tamaño que
el anterior recorrerá una menor distancia por la dificultad que le presenta pasar por
medio del polisacárido.
2.

Imagen 2. Marcador de peso molecular 1KB Thermo (R)

Tabla 1. Carril 4 con sus respectivas 3 bandas en donde la sección Cal. Volumen corresponde a
concentración expresada en ng/0,5µg al ser comprada con las del marcador.
Grafica 2. En ella se puede ver la intensidad que alcanza cada una de las bandas del carril 4.

Tabla 2. El carril 5 con su 3 bandas en donde cal volumen se encuentra su concentración en ng/0,5µg

Grafica 3. En ella se muestran los rangos de intensidad de cada banda.

El número de pares de bases y la concentración no nos arrojan una respuesta

para saber cuál es el plásmido recombinante, para analizar este factor se debe
comparar la migración entre los dos carriles correspondientes a plásmidos, en la
imagen 1 vemos que el plásmido del carril 4 migró más distancia a comparación
del carril 5, esto quiere decir que el 5 es el plásmido recombinante pues aparte de
su secuencia presenta un inserto que aumenta su tamaño en pares de bases, por
lo tanto es más difícil pasar por el entramado del gel recorriendo así menos
distancia.

En los carriles 4 y 5 que podemos apreciar en la imagen 1, se evidencian

diferentes bandas en un solo carril, lo cual no quiere decir que sean plásmidos
diferentes, sino se trata de varias copias del mismo plásmido que toman diferentes
conformaciones (relajado, enrollado, superenrollado), lo cual les confiere mayor o
menor capacidad para migrar a través del gel. Las dos bandas de cada carril que
recorrieron entre 0.486 cm (banda 3, tabla 1) y 0.488 cm (banda 2, tabla 2)
presentarían una conformación superenrollada a comparación de las dos bandas
anteriores a estas las cuales recorrieron una distancia de 0,411 (banda 2, tabla1)
y 0,397 (banda1, tabla 2), que presentarían una conformación enrollada. En el
carril 4 vemos una primera banda en la que su recorrido fue mínimo y no entró al
rango de tamaños propuestos por el marcador, pero se puede suponer que fue por
causa de que el plásmido adoptó una conformación relajada. Cabe aclarar que la
banda número 3 del carril 5 no se tomó en cuenta porque no se encuentra bien
definida y al parecer no corresponde a ADN como se puede ver en la gráfica 3.

Carril 4 Carril 5
banda Concentración banda Concentración
(ng/µL) (ng/µL)
1 8,6 1 6
2 24,5 2 11.8
3 15,7 TOTAL 17,8
TOTAL 48,8

Tabla 3.comparacion entre concentraciones del carril 4 y 5. Como el volumen

utilizado en la práctica fue 5µL las concentraciones de las tablas 1 y 2
fueron divididas cada una en dicho volumen.

Las concentraciones para cada banda fueron comparadas con las de las bandas
de referencia mediante el programa Gel analyzer para de esta forma obtener
valores más precisos. Al hacer la sumatoria de concentraciones por cada carril
encontramos que el plásmido con mayor concentración es el del carril 4 (48,8 ng/
µL) como se puede ver en la tabla 3.una posible explicacion con la mayor
presencia de copias de dicho plásmido en la muestra que corresponde al carril 4.

BILIOGRAFÍA
Hernandez. Angel (18/11/2011). BIOMODEL. Universidad de Alcalá, España. Extraído de:
http://biomodel.uah.es/an/plasmido/2/1-topo.htm

Salazar,A. Sandoval, A. Armendariz, J.(2013), Biologia molecular: fundamentos y

aplicaciones en la salud.editorial: McGRAW-Hill Medical.