Informe de Laboratorio

INFORME DE LABORATORIO
PRÁCTICA NUMERO 3
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Integrantes:
Johanna Yadira Giraldo Henao CC: 32296721
Miguel Ángel Gil Saldarriaga CC: 1035877537
Alejandra Murillo Suaza CC: 1152705906
Alejandro Gonzalez Taborda CC: 1037622372
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE MEDICINA
INSTRUMENTACIÓN QUIRÚRGICA 1
2017-2
MEDELLIN.
TABLA DE CONTENIDO.
1. INTRODUCCIÓN. ...................................................................................... 2
2. MARCO CONCEPTUAL. ........................ Error! Bookmark not defined.
3. OBJETIVOS ................................................................................................ 5
4. METODOLOGÍA ........................................................................................ 6
4.1 MATERIALES ...................................................................................... 6
4.2 PROCEDIMIENTO ............................................................................. 10
4.2.1 Flujograma protocolo 1 ................................................................. 11
4.2.2 Flujograma protocolo 2 ................................................................. 12
5. RESULTADOS. ......................................... Error! Bookmark not defined.
5.1 RESULTADOS SUSTRATO CON INHIBIDOR.Error! Bookmark not
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5.2 RESULTADOS SUSTRATO SIN INHIBIDOR ................................ 15
5.3 COMPARACIÓN ................................ Error! Bookmark not defined.
6. ANÁLISIS. ................................................ Error! Bookmark not defined.
7. CONCLUSIONES. .................................... Error! Bookmark not defined.
8. ANEXOS.................................................... Error! Bookmark not defined.
8.1 CÁLCULOS. ....................................... Error! Bookmark not defined.
8.1.1 CÁLCULOS GRUPO 3 CON INHIBIDOR.Error! Bookmark not
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8.1.2 CÁLCULOS GRUPO 2 SIN INHIBIDOR . Error! Bookmark not
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8.1.3 CONCENTRACIÒN DE SUSTRATOError! Bookmark not defined.
8.1.4 CONCENTRACIÓN DEL PRODUCTO ... Error! Bookmark not
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8.2 FICHAS DE SEGURIDAD................. Error! Bookmark not defined.
8.3 BIBLIOGRAFÍA ................................. Error! Bookmark not defined.
1
1. INTRODUCCION
Este trabajo se llevó a cabo con el fin de analizar las variaciones que presenta una
enzima propia del hígado de vaca (FOSFATASA), la cual será sometida a varios
procesos en los cuales se observan los cambios presentados dependiendo de la
concentración que tenga, la temperatura a la que esté sometida y los cambios de pH
que se apliquen.
Dependiendo de los cambios a los que se someta la solución calculamos el Km y la
V Max que se presentan. Se usaron los conocimientos aprendidos en la práctica
anterior de espectrofotometría, esto con el fin de analizar mediante el proceso de
absorbancia cual es la concentración de cada solución ya que todas fueron
sometidas a diferentes cantidades de reactivos pero a una misma temperatura
Por medio de la actividad enzimática se dan diferentes procesos y funciones en el
organismo, como lo es la digestión y la absorción de diversos componentes
necesarios para el funcionamiento ideal de nuestro cuerpo; es así por lo que en este
laboratorio se desea determinar la importancia de la fosfatasa y cómo puede
cambiar el rendimiento y la velocidad de esta enzima según la temperatura,
concentración, el pH, entre otros factores, representando todos estos datos en
diversas gráficas, tablas y ecuaciones de (Michaelis-Menten y Lineweaver-burk)
que veremos en las siguientes páginas de este trabajo.
2. MARCO CONCEPTUAL
2
Para llevar a cabo este informe de laboratorio de manera satisfactoria debemos
tener muy claros algunos conceptos que son claves para el desarrollo del tema y
que se presentaran a continuación.
Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos.
Las enzimas son catalizadores, esto quiere decir que, son sustancias que sin
consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad. No hacen
factibles las reacciones imposibles, sino que aceleran las reacciones que
espontáneamente podrían producirse. Lo dicho anteriormente hace posible que en
condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían
condiciones extremas de presión, temperatura o pH.
Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos
están catalizadas por enzimas. Las enzimas son catalizadores específicos, es decir,
cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único
sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. En una reacción catalizada por
una enzima:
• La sustancia sobre la que actúa la enzima se llama sustrato.
• El sustrato se una a una región concreta de la enzima, llamada centro activo. El
centro activo comprende un sitio de unión formado por los aminoácidos que están
en contacto directo con el sustrato y un sitio catalítico, formado por los
aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción.
• Una vez formados los productos la enzima puede comenzar un nuevo ciclo de
reacción.
La descomposición de alimentos en el cuerpo y la coagulación de la sangre son
ejemplos del trabajo de las enzimas, que además son necesarias para todas las
funciones corporales.
Por otro lado, las coenzimas son necesarias para la actividad de muchas enzimas.
El ATP, el GTP, el NAD, la coenzima A o la coenzima Q son algunos ejemplos de
coenzimas. Muchas coenzimas son vitaminas o derivados de ellas, especialmente
de la vitamina B.
3
Un sustrato es una especie química que se considera, de forma explícita, objeto de
la acción de otros reactivos. Por ejemplo, un compuesto cuya transformación es
intervenida por un catalizador.
La cinética enzimática es el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los
factores que intervienen en la actividad enzimática y se avalúan a través de la
velocidad de la reacción catalizada por la enzima. Las variables más importantes
para realizar estos estudios son: concentración de enzima, sustratos y productos,
pH y temperatura.
La actividad de la enzima puede verse obstaculizada por un componente que es
llamado inhibidor. Los inhibidores son sustancias que disminuyen la actividad
enzimática a través de interacciones con el centro activo de la enzima o con otros
centros específicos. Los inhibidores son:
• Isotéricos: ejercen su acción sobre el centro activo de la enzima y pueden ser:
o Reversibles: se da cuando se establece un equilibrio con la enzima libre,
con el complejo enzima-sustrato o con ambos.
o Irreversible: se da cuando el inhibidor modifica químicamente la enzima.
• Alostéricos: ejercen su función en un lugar diferente al centro activo de la
enzima, pueden causar un cambio conformacional de la enzima.
Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron la teoría del complejo enzima-
sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática y propusieron una
ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas. La
ecuación de Michaelis-Menten es:
𝑉=𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]/𝐾𝑚+[𝑆]
4
3. OBJETIVOS
General:
Conocer la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina de hígado de vaca
alterando sus condiciones óptimas para reaccionar.
Específicos:
• Analizar la variación de la reacción enzimática de la fosfatasa alcalina de hígado
de vaca induciendo cambios en el pH, la temperatura y la concentración.
• Calcular la velocidad máxima y el valor del Km.
• Representar gráficamente los datos obtenidos a partir de la medición de la
actividad enzimática en diferentes condiciones de su entorno.
5
4. METODOLOGIA
4.1 MATERIALES Y EQUIPOS
• Espectrofotómetro: instrumento usado en el análisis químico que sirve para

medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma
magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o
reacciones químicas que se miden en una muestra.
Figura 1
Imagen tomada: http://www.aguascolombia.com/equipos-analisis-de-agua/espectrofotometros/
• Cubetas de polietileno: son utilizadas para leer las sustancias en el

espectrofotómetro.
Figura 2
6
Imagen tomada de: http://www.ictsl.net/productos/01d63694a80f7ae0a/0000009c970a95812.html
• Baño María: es un método empleado en las industrias, en los laboratorios de

química y en la cocina para conferir temperatura uniforme a una sustancia líquida o
sólida o para calentarla lentamente, sumergiendo el recipiente que la contiene en
otro mayor con agua u otro líquido que se lleva a o está en ebullición.
Figura 3
Imagen tomada de: https://www.e-allscience.com/collections/ba-os-mar-a
• Tubos de ensayo: un tubo de ensayo es un pequeño tubo cilíndrico de vidrio con

un extremo abierto (que puede poseer tapa) y el otro cerrado y redondeado, que se
utiliza en los laboratorios para contener pequeñas muestras líquidas o sólidas,
aunque pueden tener otras fases, como realizar reacciones químicas en pequeña
escala.
Figura 4
7
Imagen tomada de: https://es.dreamstime.com/imagenes-de-archivo-soluci%C3%B3n-transparente-coloreada-en-tubos-de-
ensayo-image39781814
 Pipeta repetidora: Herramienta que permite el paso de un volumen exacto

de una determinada disolución que será agregada al tubo por medio de
alícuotas.
Figura 5
Imagen tomada de: http://www.hellotrade.com/mandel-scientific-company-canada/distriman-pipette.html
• Servilletas y pañuelos de papel: es un producto de un sólo uso elaborado con

hojas de papel absorbente.
Figura 6
Imagen tomada de: http://www.ehowenespanol.com/doblar-servilletas-papel-formar-rosas-como_2979/
8
Reactivos
 Extracto enzimático de hígado de res (fosfatasa)
 TRIS (Hidroximetil-aminometano) 20 Mm, pH óptimo.
 P-nitrofenil fosfato (PNFP) 2mM
 Estándar de p-nitrofenol (PNF) 0,5mM
 Solución acuosa de fosfato (𝐾2 𝐻𝑃𝑂4 ) 0,1M
 Hidróxido de sodio (NaOH) 2N
 Agua destilada
Tabla que se tiene en cuenta para la mezcla de reactivos ( Protocolo 1)
Volumen de Reactivos
Blanc Estándar 1 2 3 4 5 6 7 8
Tubo o
Reactivo
Agua destilada 2,6 2,7 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,2 ---
Tampón TRIS 20 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 ---
mM pH optimo: 4.0
Sustrato PNFP 0,2 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,6 ---
*2mM
Producto PNF --- 0,3 --- --- --- --- --- --- --- ---
**0.5mM
Extracto enzimático --- --- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 ---
Solución de parada 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 ---
NaOH 2N
4.2 PROCEDIMIENTO:
Con base a la tabla anterior se realizó la mezcla de los reactivos en los
respectivos tubos de ensayo, en el siguiente orden:
1. Agua destilada
9
2. Sustrato (PNFP 2Mm)
3. Tampón (TRIS, 20Mm) PH óptimo 4.0
4. Producto (PNF, 0.5Mm)
• Luego de la preparación de cada uno de los tubos de ensayo, se sumergieron
los numerados al baño maría a una temperatura de incubación de 37ºC durante
1 minuto.
• Después de transcurrido el tiempo, se agregó la enzima con un intervalo de
tiempo de 10 segundos entre tubo y tubo
• Al adicionar la enzima se empezaron a contabilizar 15 minutos (de reacción).
Después de pasados los 15 minutos, en el mismo orden se fue agregando 1 ml
de NaOH (2N). El NaOH también se le adicionó a los tubos blanco y estándar.
• Se retiraron los tubos del baño maría para finalmente determinar la
absorbancia de cada sustancia (incluyendo blanco y estándar) a una longitud de
onda de 405 nm mientras se calibraba con el blanco.
10
4.2.1 Flujo grama Protocolo 1
11
4.2.2 Flujo grama Protocolo 2
12
5. Resultados
5.1 DE SUSTRATO SIN INHIBIDOR.

Se hace una descripción de los resultados obtenidos durante la práctica de
laboratorio Cinético enzimático utilizando las tablas y gráficas. Se utiliza algunos
métodos aprendidos en clase: Michaelis-Menten (que relaciona Velocidad vs
Sustrato) y Lineweber-Burk (que relaciona valores inversos, o sea, 1/Velocidad vs
1/Sustrato).
A continuación, se muestra los resultados obtenidos en la práctica de laboratorio
nº3 cinética enzimática, donde se pueden ver los efectos de pH, la temperatura, la
concentración del sustrato sin inhibidor fosfato sobre la velocidad de reacción de
una enzima
Muestra Blanco 1 2 3 4 5 6 7
Reactante
Tampón TRIS 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
20 mM (pH
óptimo)
Sustrato(PNFP 0.2 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,6
2m M)
Producto(PNF 0.0 ----- ----- ----- ----- ----- ---- -----
0.5m M)
Agua destilada 2,6 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,2
Extracto 0.2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
enzimático
Tabla 1. Distribución de volúmenes para la medición de la velocidad de reacción enzimática
La absorbancia fueron medidas por la espectrofotometría de muestras con diferente

concentración de sustrato (PNFP), teniendo en cuenta que se inició con el mismo
pH y mista temperatura (37ºC).
13
N. Tubo D.O
Estándar 1.805
1 0.241
2 0.471
3 0.615
4 0.780
5 0.876
6 1.043
7 1.173
Tabla 2. Absorbancia, concentración de producto del PNF a diferentes concentraciones en

presencia de la enzima fosfatasa alcalina.
Con las formulas aprendidas en clase de Michaelis-Menten: Velocidad

(µmoles/min) vs Sustrato (µmoles) pudimos obtener la velocidad y sustrato de
cada tubo
Tubo Sustrato Velocidad
1 0.0040 mM 0.00026 mM/min
2 0.0078mM 0.00052 mM/min
3 0.010 mM 0.0006 mM/min
4 0.012 mM 0.0008 mM
5 0.014 mM 0.00093 mM/min
6 0.017 mM 0.0011 mM /min
7 0.019 mM 0.0012 mM /min

Gráfico 1. Michaelis - Menten (Velocidad de reacción vs [PNFP]) sin inhibidor
El tiempo de reacción para todas las muestras fue de 15 minutos, los valores de
Sustrato y velocidad se presentan en los cálculos, medido a 37ºC.
14
A continuación la gráfica mostrara el comportamiento de la reacción del sustrato
facilitada por catálisis enzimática.
Tubo 1/Concentración de sustrato 1/Velocidad de reacción
[µM] [µmoles/min]
1 250.0 3.846
2 128.2 1.923
3 100.0 1.666
4 83.333 1.250
5 71.428 1.075
6 58.82 909.0
7 52.63 833.33
Tabla 4. Inversos de la concentración de sustrato y velocidad de reacción. Ecuación de
Lineweaver _ Burk (1 / V y 1 / [PNFP] sin inhibidor
Resultado de los inversos de la concentración de sustrato y velocidad de reacción

del para-nitrofenil fosfato en presencia la enzima fosfatasa alcalina.
5.2. RESULTADOS SUSTRATO CON INHIBIDOR

Como en las muestras anteriores se mostrara , los resultados obtenidos en la
practica ,Donde en igual manera veremos los efectos de pH, temperatura ,
La concentración del sustrato y el inhibidor sobre su velocidad de reacción.
Volumen de reactantes(ml)
Muestra Estándar 1 2 3 4 5 6 7 8
Reactante
Tampón TRIS 20 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
mM (pH óptimo
4.0)
Sustrato(PNFP ----- 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0
2m M)
Producto(PNF 1m 0.3 ----- ----- ----- ----- ----- ---- ----- ------
M)
Inhibidor fosfato ----- 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Agua destilada 2.7 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,2 2,6
Extracto ------ 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
enzimático
15
Tabla 5. Distribución de volúmenes para la medición de la velocidad de reacción
enzimática
En la tabla se muestran la distribución de los volúmenes de solución tampón, sustrato, producto,

inhibidor fosfato, agua destilada y extracto enzimático que se usaron para analizar los efectos de
la presencia de un inhibidor en la respuesta enzimática.
Las absorbancias fueron medidas por la espectrofotometría de muestras con diferente

concentración de sustrato (PNFP), teniendo en cuenta que se inició con el mismo pH y misma
temperatura (37ºC).
N. Tubo D.O
Estándar 2.041
1 0.115
2 0.165
3 0.227
4 0.270
5 0.403
6 0.405
7 0.436
8 0.724
Tabla 6. Absorbancia, concentración de producto del PNF a diferentes concentraciones en
presencia de la enzima fosfatasa alcalina.
Con las formulas aprendidas de Michaelis-Menten: Velocidad (µmoles/min) vs

Sustrato (µmoles) Se dispone a sacar la velocidad y sustrato de cada tubo.
Tubo Sustrato Velocidad

1 0.0016mM 0.00010 mM /min
2 0.002 mM 0.00013 mM /min
3 0.003 Mm 0.0002 mM/min
4 0.0039 mM 0.00026 mM /min
5 0.00592 mM 0.000394 mM /min
16
6 0.00595 mM 0.000396 mM / min
7 0.0064 mM 0.00042 mM /min
8 0.0106 mM 0.00070 mM /min
Gráfico 7. Michaelis - Menten (Velocidad de reacción vs [PNFP]) con inhibidor
El tiempo de reacción para todas las muestras fue de 15 minutos, los valores de
Sustrato y velocidad se presentan en los cálculos, medido a 37ºC.
A continuación la gráfica mostrara el comportamiento de la reacción del sustrato
facilitada por catálisis enzimática.
.
Tubo 1/Concentración de sustrato 1/Velocidad de reacción
[µM] [µmoles/min]
1 625.0 10.000
2 500.0 7.692
3 333.333 5.000
4 256.41 3.846
5 168.91 2.538
6 168.06 2.525
7 156.25 2.380
8 94.339 1.428
Tabla 8. Inversos de la concentración de sustrato y velocidad de reacción. Ecuación de

Lineweaver _ Burk (1 / V y 1 / [PNFP] con inhibidor
17
Resultados de los inversos de concentración del sustrato y velocidad de reacción
del para-nitrofenil fosfato en presencia de la enzima alcalina.
5.3 Graficas
Velocidad de la reacción y concentración de sustrato sin inhibición.
Sustrato
0.7
0.64
0.6
0.5
0.48
0.4 0.4
Sustrato
0.32
0.3 Poly. (Sustrato)
0.24
0.2
0.16
0.1
0.08
0
0 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005
18
Velocidad de la reacción y concentración de sustrato Con inhibición
Sustrato
0.9
0.8 0.8
0.7
0.64
0.6
0.5
0.48
Sustrato
0.4 0.4
Poly. (Sustrato)
0.3 0.32
0.24
0.2
0.16
0.1
0.08
0
. 0 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 0.0006 0.0007 0.0008
Se observa en la gráfica con la sustancia sin inhibidor alcanza menos velocidad de

reacción que la que contiene el inhibidor.
19
12000.000
10000.000
8000.000
6000.000
4000.000
2000.000
0.000
0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 14.000
No competitivo
Se puede identificar en la gráfica N, el comportamiento entre la reacción con
inhibidor y sin inhibidor, al ser este un inhibidor no competitivo provoca una
disminución de lavelocidad máxima sin modificar la constante de Km. Un
inhibidor no competitivo puede unirse tanto a la enzima libre como a la enzima
ligada al sustrato, en ambos casos con la misma afinidad, sin embargo, inhibidor y
sustrato no entran en competencia por unirse sobre un mismo sitio, el sustrato se
liga al sitio activo y el inhibidor a otro sitio. El inhibidor modifica la conformación
del sitio activo obstaculizando la transformación del sustrato en producto, pero no
afecta el reconocimiento entre enzima y sustrato (aquí hay alostería).
20
6. Análisis
Mediante las observaciones y experimentos realizados en el laboratorio se pudo analizar la
influencia que tiene el pH, la temperatura, concentración de sustrato y la presencia de un
inhibidor en el comportamiento de una enzima como lo es la fosfatasa alcalina de hígado de res.
El pH es un factor importante en el momento de realizarse la actividad enzimática, es por esto
que debe ser ideal para evitar la desnaturalización de la enzima, ya que por su conformación sus
grupos ionizables pueden protonarse o desprotonarse según el pH al que sean sometidos. La
velocidad de la enzima se hace máxima, cuando hay una mayor afinidad entre la enzima y el
sustrato y para ello es necesario el pH ideal u óptimo. Este análisis se hace evidente en la tabla
(Ver tabla #7 en los anexos), en esta observamos que a medida que el pH va aumentando la
absorbancia del producto va disminuyendo.
La temperatura puede afectar la reacción enzimática de la misma manera que lo hace el pH, así
mismo esta debe de ser óptima para que la enzima conserve su estructura funcional y alcance su
velocidad máxima, es por ello que durante todo el experimento la incubación de los tubos fue a
37°C, ya que a esta temperatura la absorbancia de del producto (PNFP), es menor cuando es
sometido a dicha temperatura, ver tabla (Ver tabla #10 en los anexos). Cuando las enzimas se
someten a bajas temperaturas no poseen la energía suficiente para realizar su función enzimática
o si por el contrario son sometidas a altas temperaturas puede causar su desnaturalización.
La efectividad de la enzima también puede verse afectada o favorecida por la concentración de
sustrato, ya que este determina la cantidad de sitios activos que serán ocupados y así determina la
velocidad de la enzima. La influencia que tiene este factor en la velocidad de la enzima; donde
es posible apreciar que a medida que el sustrato aumenta, la velocidad de la reacción también, y
21
cuando la reacción presenta más baja concentración de sustrato (PNFP), la velocidad de reacción
es mínima. Sin embargo, esta velocidad se ve afectada por la presencia del inhibidor en la
reacción, ya que este provoca una menor afinidad de la enzima con el sustrato (PNFP).
En el Gráfico Michaelis - Menten (Velocidad de reacción vs [PNFP]) sin inhibidor; se muestra
el comportamiento de la reacción del sustrato facilitada por catálisis enzimática. En este se puede
evidenciar que la reacción es mucho más eficiente ya que no existe algún factor que interrumpa
la afinidad existente entre el sustrato y la enzima.
22
7. Conclusiones
CONCLUSIONES
Al terminar el análisis correspondiente sobre la cinética enzimática y los
resultados adquiridos, podemos concluir que:
-Al aumentar la concentración de sustrato la enzima se satura, por lo que
la velocidad de la reacción se vuelve constante y por más sustrato que
se le agregue esta no varía, ya que los centros activos de la enzima se
encuentran ocupados.
- Si a una reacción enzimática se le proporciona calor (energía) a
temperaturas muy altas, la enzima se desnaturaliza ya que su estructura
es proteínica; y la actividad enzimática finaliza al agregar NaOH.
- Podemos evidenciar cuando hay inhibición en una reacción enzimática,
al observar la disminución de la eficiencia de la enzima, es decir, la
disminución de la actividad enzimática.
- Durante la práctica de laboratorio se pudo determinar que la velocidad
de una reacción enzimática varía cuando se realizan alteraciones en
diferentes condiciones físicas, como lo son exactamente el pH, la
temperatura y la concentración.
23
7.1 Anexos
Ph Abs 37°C
3 2.202
4 1.984
5 1.723
6 1.648
7 1.527
8 1.363
9 0.786
10 0,780
12 1.577
STD 1.845
Tabla 10. Datos de pH y temperatura
7.2 Cálculos
Cálculos
Grupo sin inhibidor
Concentración del producto y la velocidad
Estándar
V1xc1=v2xc2
V1= 0.3 ml C1= 0.5 mM
V2= 5 ml c2=?
C2= V1XC1/V2= 0.3 ml x 0.5 mM / 5 ml = 0.03mM
Tubo 1
Ae/ Ce = Ap/Cp
No se conoce el valor de Cp así que se despeja: Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.241/ 1.805= 0.0040 mM
24
Velocidad = [𝑃] / 𝑡
Velocidad = 0.0040 mM / 15 min = 0.00026 mM/min
Tubo 2
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.471/1.805= 0.0078mM
Velocidad= [𝑃] / 𝑡
Velocidad= 0.0078 mM/ 15 min = 0.00052 mM/min
Tubo 3
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.615/1.805= 0.010 mM
Velocidad= 0.010 mM / 15 min= 0.0006 mM/min
Tubo 4
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.780 / 1.805 = 0.012 mM
Velocidad= 0.012 mM/ 15 min = 0.0008 mM
Tubo 5
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.876 / 1.805 = 0.014 mM
Velocidad= 0.014 mM/15 min= 0.00093 mM/min
Tubo 6
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 1.043/ 1.805 = 0.017 Mm
Velocidad= 0.017 mM/ 15 min = 0.0011 mM /min
Tubo 7
Cp= Ce x Ap/Ae
25
Cp= 0.03 mM x 1.173 / 1.805 = 0.019 mM
Velocidad= 0.019 mM / 15 min = 0.0012 mM /min
Grupo con inhibidor

Estándar
V1xc1=v2xc2
V1= 0.3 ml C1= 0.5 mM
V2= 5 ml c2=?
C2= V1XC1/V2= 0.3 ml x 0.5 mM / 5 ml = 0.03mM
Tubo 1
Ae/ Ce = Ap/Cp
No se conoce el valor de Cp así que se despeja: Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.115/ 2.041= 0.0016 mM
Velocidad = 0.0016 mM / 15 min= 0.00010 mM /min
Tubo 2
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.165 / 2.041= 0.002 mM
Velocidad= 0.002 mM / 15 min= 0.00013 mM /min
Tubo 3
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp = 0.03 mM x 0.227 / 2.041= 0.003 mM
Velocidad= 0.003 mM / 15 min = 0.0002 mM/min
26
Tubo 4
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.270 / 2.041 = 0.0039 mM
Tubo 5
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.003 mM x 0.403 / 2.041 = 0.00592 mM
Tubo 6
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.405 / 2.041= 0.00595 mM
Velocidad= 0.00595 mM / 15 min = 0.000396 mM / min
Tubo 7
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.436 / 2.041 = 0.0064 mM
Tubo 8
Cp= Ce x Ap/Ae
Cp= 0.03 mM x 0.724 / 2.041 = 0.0106 mM
27
Grupo sin inhibidor
Concentración sustrato
Se aplica la formula V1.C1=V2.C2 conociendo los valores de V1, C1 Y V2 se despeja la
fórmula para encontrar la otra concentración así:
C2= V1.C1/V2
Tubo 1
C2= 0.2 ml x 2 mM / 5 ml
C2= 0.08 mM
Tubo 2
C2 = 0.4 ml x 2 mM / 5ml
C2= 0.16 mM
Tubo 3
C2= 0.6 ml x 2 mM / 5ml
C2= 0.24 mM
Tubo 4
C2= 0.8 ml x 2 mM / 5ml
C2= 0.32 mM
Tubo 5
C2= 1 ml x 2 mM / 5 ml
C2= 0.4 mM
Tubo 6
C2= 1.2 ml x 2 mM / 5 ml
C2= 0.48 mM
Tubo 7
C2= 1.6 ml x 2 mM / 5 ml
C2= 0.64 mM
28
Grupo con inhibidor
Tubo 1
C2= 0.2 ml x 2 mM / 5 ml
C2= 0.08 mM
Tubo 2
C2 = 0.4 ml x 2 mM / 5ml
C2= 0.16 mM
Tubo 3
C2= 0.6 ml x 2 mM / 5ml
C2= 0.24 mM
Tubo 4
C2= 0.8 ml x 2 mM / 5ml
C2= 0.32 mM
Tubo 5
C2= 1 ml x 2 mM / 5 ml
C2= 0.4 mM
Tubo 6
C2= 1.2 ml x 2 mM / 5 ml
C2= 0.48 mM
Tubo 7
C2= 1.6 ml x 2 mM / 5 ml
C2= 0.64 mM
Tubo 8
C2= 2 ml x 2 mM / 5 ml
C2= 0.8 mM
29
7.3 FICHAS DE SEGURIDAD
TARJETA DE EMERGENCIA
NOMBRE DEL PRODUCTO Extracto enzimático de hígado de res.
Sinónimos: Peptona de hígado- Hidrolizado enzimático de hígado de
bovino.
Laboratorio de Cinética de
Información fabricante: MERCK S.A
enzimas
Bogotá Calle 10 N° 65-28 AA: 98-96
Tel: +57 1 4254770
Teléfono de emergencia
 Cem: 123
 UdeA: 2198412- 2630370
Pictogramas de riesgo
ESTABILIDAD Y REACTIVIDAD
Estable bajo condiciones normales de temperatura y presión.
Evitar contacto con agentes oxidantes fuertes.
PELIGRO / RIESGO
Producto higroscópico, sus partículas a pesar de ser inertes pueden afectar el tracto respiratorio si son
inhaladas. Se debe mantener protegido de la humedad, cerrado y a una temperatura de 15°C y 35°C.
Puede formar gases y vapores.
PROTECCIÓN PERSONAL
Protección general: Ropa adecuada que sirva como barrera.
Protección manos: Guantes de nitrilo.
Protección ocular: Gafas de seguridad contra químicos.
Protección respiratoria: Solo necesario tapabocas o máscara de seguridad en presencia de polvo.
Ficha de seguridad
30
PRIMEROS AUXILIOS
Contacto piel: Quitar ropa contaminada. Lavar con abundante agua.
Contacto ojos: Aclarar con abundante agua.
Ingestión: Beber abundante agua. En caso de malestar, consultar al médico.
Inhalación: Trasladar al aire fresco.
MEDIDAS PARA VERTIDO ACCIDENTAL
Evitar el contacto con la sustancia, evitar la formación de polvo, no inhalar, recoger en seco y proceder
a la eliminación de residuos.
EXTINCIÓN DE INCENDIOS
No permanecer en la zona de peligro sin sistemas de respiración artificiales independientes del
ambiente, adoptar a los materiales en el contorno.
DISPOSICIÓN DE RESIDUOS
Los productos químicos deben ser eliminados de acuerdo a normativas nacionales vigentes. Los
residuos deben considerarse como especiales, los envases no contaminados deben ser tratados como
reciclables y los envases contaminados deben ser tratados como el mismo producto.
BIBLIOGRAFÌA
Microquin SRL- PEPTONA DE HÍGADO[internet]. microquin.com.ar [cited 20th March 2017].
Available from: https://microquin.com.ar/peptonadehigado.html
31
NOMBRE DEL PRODUCTO TRIS (Hidroximetil-aminometano).

Sinónimos: Trometamol-Trometano-Trometamina. (C4H11NO3)
Laboratorio de Bogotá Calle 10 N° 65-28 AA: 98-96
Cinética de enzimas
Tel: +57 1 4254770
Pictogramas de riesgo Teléfono de emergencia
 Cem: 123
 UdeA: 2198412- 2630370
Evitar contacto con agentes oxidantes fuertes, bases, nitrilos y nitratos.
Evitar calentamiento.
PELIGRO / RIESGO
No es una sustancia peligrosa de acuerdo al reglamento.
Puede provocar: vómitos, náuseas, convulsiones, diarrea
PRIMEROS AUXILIOS
32
a la eliminación de residuos. No arrojar los residuos por el desagüe y cubrir alcantarillado.
ambiente, adoptar a los materiales en el contorno. Extinguir con agua, dióxido de carbono, espuma o
polvo seco.
BIBLIOGRAFÌA
MERCK. Ficha de datos seguridad Tris (hidroximetil) [internet]. www.merck-performance-
materials.com [cited 19th March 2017]. Available from: www.merck-performance-materials.com/merck-
ppd/tris-hidroximetil-aminometano
NOMBRE DEL PRODUCTO P-nitrofenil fosfato (PNFP).

Sinónimos: 4-Nitrofenil Fosfato-Sal sódica.
Laboratorio de
Cinética de enzimas Bogotá Calle 10 N° 65-28 AA: 98-96
Tel: +57 1 4254770
 Cem: 123
 UdeA: 2198412- 2630370
33
PELIGRO / RIESGO
No es una sustancia peligrosa de acuerdo al reglamento.
PRIMEROS AUXILIOS
polvo seco.
BIBLIOGRAFÌA
Pan Reck. Ficha de seguridad [internet]2006. [cited 219th March 2017]. Available from:
https://www.applichem.com/fileadmin/detenblaetter/41442_es_Esi.pdf
34
NOMBRE DEL PRODUCTO Solución acuosa de Fosfato (K2HPO4).

Sinónimos: Fosfato de potasio bibásico Anhídrido.
Laboratorio de
Tel: +57 1 4254770
 Cem: 123
 UdeA: 2198412- 2630370
Debido a la presencia de fósforo puede favorecer la eutrofia en las zonas de vertido. Producto
incombustible.
PELIGRO / RIESGO
Producto de baja toxicidad.
Puede provocar: vómitos, náuseas, convulsiones, dolor de estómago, irritación de ojos, diarrea.
PRIMEROS AUXILIOS
Ingestión: Beber abundante agua. No inducir vómito. En caso de malestar, consultar al médico.
35
polvo seco.
BIBLIOGRAFÌA.
Ficha de seguridad Solución acuosa de fosfato [internet] Nuevo León-México CTR; [cited 19th March
2017]. Available from:
https://www.ctr.com.mx/pdfcent/fosfato%20de%20potasio%20dibasico%20anhidro.pdf
36
NOMBRE DEL PRODUCTO Hidróxido de Sodio (NaOH).

Sinónimos: Soda cáustica-Hidrato de sodio-Cáustico blanco.
Laboratorio de
Tel: +57 1 4254770
 Cem: 123
 UdeA: 2198412- 2630370
Es corrosivo en ambientes húmedos y para algunos metales. Puede formarse hidrógeno.
PELIGRO / RIESGO
Sustancia muy tóxica. Puede provocar: vómitos, náuseas, convulsiones, dolor de estómago, perforación
de esófago, diarrea, quemadura de boca y garganta, quemadura de las mucosas, tos, insuficiencia
respiratoria.
PRIMEROS AUXILIOS
Ingestión: Beber abundante agua. Inducir vómito. En caso de malestar, consultar al médico.
37
polvo seco.
BIBLIOGRAFÌA
MERCK. Ficha de datos seguridad Hidróxido de sodio [internet]. www.merck-performance-
ppd/hidroxido-de-sodio
38
NOMBRE DEL PRODUCTO Hidróxido de Sodio (NaOH).

Sinónimos: Soda cáustica-Hidrato de sodio-Cáustico blanco.
Laboratorio de
Tel: +57 1 4254770
 Cem: 123
 UdeA: 2198412- 2630370
Es corrosivo en ambientes húmedos y para algunos metales. Puede formarse hidrógeno.
PELIGRO / RIESGO
Sustancia muy tóxica. Puede provocar: vómitos, náuseas, convulsiones, dolor de estómago, perforación
de esófago, diarrea, quemadura de boca y garganta, quemadura de las mucosas, tos, insuficiencia
respiratoria.
PRIMEROS AUXILIOS
Ingestión: Beber abundante agua. Inducir vómito. En caso de malestar, consultar al médico.
39
polvo seco.
BIBLIOGRAFÌA
MERCK. Ficha de datos seguridad Hidróxido de sodio [internet]. www.merck-performance-
ppd/hidroxido-de-sodio
8 bibliografia
MedlinePlus. Enzima. [En línea]. Disponible en:
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002353.htm .[Citado el 16 de
Septiembre de 2014].
• Universidad de Córdoba. Caracterización cinética de la fosfatasa
alcalina. [En línea]. Disponible en: http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiol-
mol/pdfs/30%20FOSFATASA%20ALCALINA.pdf. [Citado El 16 de Septiembre de 2014].
40
• Coenzima.com. Las coenzimas. [En línea]. Disponible en: http://www.coenzima.com/ . [Citado
el 16 de Septiembre de 2014].
• Universidad del País Vasco. Enzimas. [En línea]. Disponible en:
http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz1.htm [Citado el 16 de Septiembre de 2014].
• Universidad del País Vasco. Cinética enzimática. [En línea]. Disponible en:
http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm. [Citado el 16 de
• Isidro Sobrino. Baño maría especial de 50 litros. [En línea]. Disponible en:
http://www.isidrosobrino.com/productos/producto.asp?cat=52. [Citado el 16 de Septiembre de
2014].
• Icoformas. Nevera pequeña. [En línea]. Disponible en: http://www.icoformas.com/npeque.html
. [Citado el 16 de Septiembre de 2014].
• Química. Hoja de seguridad II Hidróxido de sodio. [En línea]. Disponible en:
http://www.quimica.unam.mx/IMG/pdf/2hsnaoh.pdf . [Citado el 16 de
• Fichas internacionales de seguridad química. Nitrofenol. [En línea].
Disponible en: http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTec
nicas/FISQ/Ficheros/0a100/nspn0066.pdf. [Citado el 16 de Septiembre de 2014].
41
42

Informe de Laboratorio

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INFORME DE LABORATORIO

4.1 MATERIALES Y EQUIPOS

• Espectrofotómetro: instrumento usado en el análisis químico que sirve para

• Cubetas de polietileno: son utilizadas para leer las sustancias en el

• Baño María: es un método empleado en las industrias, en los laboratorios de

• Tubos de ensayo: un tubo de ensayo es un pequeño tubo cilíndrico de vidrio con

 Pipeta repetidora: Herramienta que permite el paso de un volumen exacto

• Servilletas y pañuelos de papel: es un producto de un sólo uso elaborado con

Tabla que se tiene en cuenta para la mezcla de reactivos ( Protocolo 1)

5.1 DE SUSTRATO SIN INHIBIDOR.

La absorbancia fueron medidas por la espectrofotometría de muestras con diferente

Tabla 2. Absorbancia, concentración de producto del PNF a diferentes concentraciones en

Con las formulas aprendidas en clase de Michaelis-Menten: Velocidad

6 0.017 mM 0.0011 mM /min

7 0.019 mM 0.0012 mM /min

Resultado de los inversos de la concentración de sustrato y velocidad de reacción

5.2. RESULTADOS SUSTRATO CON INHIBIDOR

En la tabla se muestran la distribución de los volúmenes de solución tampón, sustrato, producto,

Las absorbancias fueron medidas por la espectrofotometría de muestras con diferente

Con las formulas aprendidas de Michaelis-Menten: Velocidad (µmoles/min) vs

Tubo Sustrato Velocidad

Tubo 1/Concentración de sustrato 1/Velocidad de reacción

Tabla 8. Inversos de la concentración de sustrato y velocidad de reacción. Ecuación de

Velocidad de la reacción y concentración de sustrato sin inhibición.

Se observa en la gráfica con la sustancia sin inhibidor alcanza menos velocidad de

inhibidor y sin inhibidor, al ser este un inhibidor no competitivo provoca una

disminución de lavelocidad máxima sin modificar la constante de Km. Un

inhibidor no competitivo puede unirse tanto a la enzima libre como a la enzima

sustrato no entran en competencia por unirse sobre un mismo sitio, el sustrato se

liga al sitio activo y el inhibidor a otro sitio. El inhibidor modifica la conformación

del sitio activo obstaculizando la transformación del sustrato en producto, pero no

afecta el reconocimiento entre enzima y sustrato (aquí hay alostería).

Mediante las observaciones y experimentos realizados en el laboratorio se pudo analizar la

influencia que tiene el pH, la temperatura, concentración de sustrato y la presencia de un

inhibidor en el comportamiento de una enzima como lo es la fosfatasa alcalina de hígado de res.

El pH es un factor importante en el momento de realizarse la actividad enzimática, es por esto

grupos ionizables pueden protonarse o desprotonarse según el pH al que sean sometidos. La

absorbancia del producto va disminuyendo.

o si por el contrario son sometidas a altas temperaturas puede causar su desnaturalización.

La efectividad de la enzima también puede verse afectada o favorecida por la concentración de

En el Gráfico Michaelis - Menten (Velocidad de reacción vs [PNFP]) sin inhibidor; se muestra

la afinidad existente entre el sustrato y la enzima.

Al terminar el análisis correspondiente sobre la cinética enzimática y los

resultados adquiridos, podemos concluir que:

-Al aumentar la concentración de sustrato la enzima se satura, por lo que

la velocidad de la reacción se vuelve constante y por más sustrato que

se le agregue esta no varía, ya que los centros activos de la enzima se

- Si a una reacción enzimática se le proporciona calor (energía) a

temperaturas muy altas, la enzima se desnaturaliza ya que su estructura

es proteínica; y la actividad enzimática finaliza al agregar NaOH.

- Podemos evidenciar cuando hay inhibición en una reacción enzimática,

al observar la disminución de la eficiencia de la enzima, es decir, la

disminución de la actividad enzimática.

- Durante la práctica de laboratorio se pudo determinar que la velocidad

de una reacción enzimática varía cuando se realizan alteraciones en

diferentes condiciones físicas, como lo son exactamente el pH, la

Grupo sin inhibidor

Concentración del producto y la velocidad

C2= V1XC1/V2= 0.3 ml x 0.5 mM / 5 ml = 0.03mM

Grupo con inhibidor

C2= V1XC1/V2= 0.3 ml x 0.5 mM / 5 ml = 0.03mM

NOMBRE DEL PRODUCTO TRIS (Hidroximetil-aminometano).