Separación por cromatografía en columna de pigmentos

vegetales.

 Objetivos.

1. Preparar un extracto de pigmentos de plantas.

2. Emplear la técnica de cromatografía en columna para la separación de los pigmentos
extraídos.

 Introducción.

Pigmentos de las plantas.

Las plantas verdes y algunos microorganismos que abundan en la superficie terrestre

llevan a cabo un proceso llamado fotosíntesis, por el cual, mediante la energía solar,
transforman el bióxido de carbono en carbohidratos como la glucosa y su polímero el
almidón, que son compuestos con alto contenido en energía química y, por ello, estos
seres vivos son productores primarios de los ecosistemas. La glucosa formada es
utilizada por ellos mismos y por otros seres vivos durante el proceso de respiración, en el
cual se oxida hasta CO2 y H2O, obteniendo así la energía necesaria para llevar a cabo sus
diversas funciones.

Para atrapar la energía solar e iniciar el proceso de transformación de energía luminosa a

energía química, las plantas superiores contienen en sus células un organelo llamado
cloroplasto, en donde se encuentran los llamados centros de reacción, formados por
proteínas y diversos pigmentos, en especial las clorofilas. Las clorofilas a y b se
encuentran en las plantas y las bacterioclorofilas a o b se encuentran en las bacterias
fotosintéticas. Además de estas moléculas, los organismos fotosintéticos tienen otros
pigmentos con capacidad para absorber luz. Los pigmentos accesorios incluyen por
ejemplo a los carotenos, xantofilas, antocianinas y otras moléculas con colores
característicos.

La estructura de estas sustancias se muestra en la figura 1.

 Fig. 1 Estructura de algunos pigmentos de plantas.

Estas sustancias son coloridas por el número elevado de dobles ligaduras conjugadas
que poseen, lo que permite que las excite la radiación con longitud de onda en la región
del visible. La clorofila absorbe bien en la región del rojo y el azul y muy poco en la zona
del verde. Las plantas que contienen clorofila son verdes porque la luz verde se refleja, no
se absorbe. Estos pigmentos no son solubles en agua, pero pueden extraerse con
solventes orgánicos cuando las células que los contienen se rompen. Los extractos
tienen, además de pigmentos, grasas y algunos otros compuestos incoloros. Entre los
tipos de pigmentos más solubles en solventes orgánicos, se encuentran las clorofilas
(azul-verde) y los carotenoides (amarillo-naranja). Algunos colores rosas y rojos en las
plantas (por ejemplo en el betabel, la col morada, la jamaica y en las flores) se deben a
xantocianinas, las cuales si son solubles en agua y no se extraen con solventes
orgánicos.

Métodos cromatográficos

Los métodos cromatográficos son métodos de separación que involucran la transferencia

reversible de un compuesto que está adsorbido en una fase estacionaria (adsorbente) a
una fase móvil (solvente) que fluye a través de la fase estacionaria.
La separación surge de las interacciones mutuas de componentes de una muestra,
solvente y adsorbente. El adsorbente está presente en un gran exceso, con una gran
superficie y con sitios polares capaces de unir reversiblemente pequeñas concentraciones
de sustancias por un proceso esencialmente electrostático. El solvente compite con los
componentes de la muestra por los sitios de unión. Estos componentes son desplazados
reversible y continuamente en la dirección del flujo del solvente. El proceso descrito puede
escribirse como un equilibrio competitivo en donde hay una partición de los componentes
entre la fase estacionaria y la fase móvil.

Entre más polar sea un compuesto, más fuertemente se adsorbe en la fase estacionaria,
por lo que su migración a lo largo de ella es menor, siendo eluído (arrastrado) más
lentamente por la fase móvil, que los compuestos menos polares. De este modo, la
separación selectiva de los componentes de una muestra, por cromatografía, se debe a
las diferencias en la migración de los componentes individuales a lo largo de la fase
estacionaria.

El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un

cromatograma es la polaridad del solvente. Una lista de los solventes más usados en los
diferentes tipos de cromatografía, en orden de polaridad creciente, se indica en el
diagrama 1. Entre más polar sea un solvente, más rápido es el movimiento de los
compuestos y menos efectiva la separación.

Diagrama 1. Disolventes comunes.

Cromatografía en columna.

La cromatografía en una columna de adsorbente proporciona un medio para la

separación y aislamiento de los componentes de una mezcla. La muestra se aplica en la
parte superior de la columna y se deja pasar solvente a través del adsorbente. Este
proceso desarrolla el cromatograma en bandas que contienen los compuestos
individuales; estas bandas pueden ser eluídas (arrastradas) en secuencia por adición de
más solvente y recolectadas en fracciones separadas. La columna se prepara y desarrolla
usando el solvente menos polar que disuelva a la muestra y que permita el movimiento de
los compuestos a una velocidad práctica. Generalmente es necesario ir cambiando a
solventes más polares para efectuar la elusión de los compuestos, dependiendo de los
grupos funcionales que tengan los componentes de la mezcla. La facilidad de ser eluído
más rápidamente, dependerá de la menor polaridad de los grupos funcionales, como se
muestra en el diagrama 2. El cambio de solventes debe efectuarse gradualmente,
mediante mezclas de los solventes (5 a 10% del solvente siguiente en polaridad), para
evitar que se alteren las zonas que ya han sido desarrolladas (separadas).

Las sustancias demasiado polares, como azúcares o aminoácidos, no pueden separarse

de sus mezclas por cromatografía en columna, ya que con los adsorbentes anteriormente
mencionados no pueden utilizarse agua o ácido acético porque, con estos solventes
demasiado polares, el equilibrio componentes-adsorbente se desplaza hacia el de
solvente-adsorbente y de ahí al de componentes-solvente y, de esta manera, todos los
componentes de la mezcla se eluyen simultáneamente.

Diagrama 2. Velocidades de elución para diferentes grupos funcionales.

En la práctica, los pasos de desarrollo y elusión frecuentemente son distinguibles, ya que

la banda que se mueva más rápido puede empezar a emerger de la columna antes de
que se complete la separación de las bandas que se mueven más lentamente.
Frecuentemente, los compuestos a separar en la mezcla son incoloros por lo que no
pueden verse las bandas. En este caso se recolectan fracciones de volumen pequeño. se
evapora el solvente y los residuos se comparan por cromatografía en placa delgada para
determinar cuáles fracciones tienen igual composición y pueden ser reunidas.

En las condiciones de separación usadas en esta práctica ocurren algunos cambios en los
pigmentos más sensibles durante la extracción y cromatografía, lográndose únicamente
una separación parcial; además, los compuestos incoloros se detectarían en el residuo si
se evaporaran las fracciones. En este caso no se analizará la pureza de las fracciones
para comprobar que la separación fue completa; sin embargo, los principios del método si
podrán ser observados.
 Desarrollo experimental.

SUSTANCIAS Y REACTIVOS.

Gel de sílice para columna Cloruro de metileno puro.

Gel de sílice para cromatografía en capa fina Cloruro de metileno con 10% de acetato de etilo.
Hexano. Acetato de etilo puro.
Hexano con 10% de cloruro de metileno. Acetato de etilo con 10% de metanol.
Metanol puro.

 Procedimiento.

a) Preparación de la muestra de pigmentos

1. Pesa 1 g de hojas de espinaca cortadas en piezas pequeñas y colócalas en un mortero

con media cucharadita de arena y 3 mL de metanol.

2. Muele con la mano del mortero hasta obtener una papilla, añade 6 mL de hexano y
muele otra vez.

3. Con una pipeta pasa el líquido a un embudo de separación chico.

4. Repite la molienda con otros 6 mL de hexano y reúnelos con el primer extracto en el

embudo de separación.

5. Añade 10 mL de agua de la llave a la solución de hexano, tapa el embudo y agita. Deja

separar las fases y remueve la capa acuosa inferior, poniéndola en un vaso de
precipitados.

6. Repite el lavado del hexano con una segunda porción de 10 mL de agua de la llave.
Tapa, agita y deja separar muy bien las fases.
7. Remueve nuevamente la capa inferior, elimina lo más posible toda el agua. Reúne esta
segunda fase acuosa con la primera, para posteriormente deséchelas al drenaje.

8. Transfiere la solución de hexano a un matraz Erlenmeyer de 25 mL. Añade a este

matraz suficiente sulfato de sodio anhidro para que se aclare la turbidez del hexano y
quede un poco de polvo fino Deja reposar por 5 minutos agitando de vez en cuando. Si no
queda polvo fino de sulfato anhidro, añade un poco más del sufato y deja reposar otros 5
min.

9. Con una pipeta Pasteur pasa la solución colorida a otro matraz Erlenmeyer de 25 mL.
Enjuaga el sulfato de sodio con porciones de 0.2-0.3 mL de hexano. y con la pipeta
reúnelas al matraz con la solución de los pigmentos. Marca el matraz con tu número de
equipo, ponle unas tres piedras de ebullición y evapora la solución, en una parrilla en la
campana, a un volumen aproximado de 2-3 mL. Ten cuidado de no evaporar todo el
solvente para evitar la descomposición de los pigmentos.

b) Preparación de la columna de cromatografía:

1. Para empacar la columna, se coloca la llave de la columna en posición de cerrado (si la

llave es de vidrio, se deberá engrasar ligeramente). Se introduce hasta el fondo un
pequeño pedazo de algodón con ayuda de una varilla de vidrio o de metal, se agregan 5
mL del eluyente (Hexano) y se presiona suavemente el algodón para eliminar las
burbujas. Se prepara una suspensión de sílica gel para columna, 6 g en 30 mL de
eluyente y se agita la suspensión hasta que no se observen burbujas de aire. Con ayuda
de un embudo de vidrio se vierte la suspensión en la columna lo más rápido posible y se
golpea ligeramente la columna con los dedos para que el empaquetamiento sea uniforme.
Se abre la llave para eliminar el exceso de disolvente cuidando de no dejar secar la silica
gel, se debe mantener el eluyente aproximadante a 0.5 cm arriba de la sílica.

c) Cromatografía.

1. Numera consecutivamente 15 tubos de ensaye de 100 x 8 mm, marcándolos con

“masking tape”. Acomódalos en una gradilla.

2. Con una pipeta Pasteur añade a la columna de cromatografía parte del extracto en
hexano de los pigmentos de espinaca. Como la cantidad de adsorbente en la columna es
pequeña, añade sólo una pipeta del extracto. La muestra debe adsorberse en una zona
de la columna lo más angosta posible, ya que las bandas se vuelven más difusas a
medida que la columna se desarrolla. Al llevar a cabo una cromatografía es importante
mantener siempre el nivel de solvente arriba de la columna de adsorbente.

3. Con una pipeta Beral o Pasteur, enjuaga la parte superior de la columna con
cantidades muy pequeñas de hexano hasta que todo el pigmento haya entrado en la
columna. Continúa añadiendo porciones de 2-3 mL del hexano y anota todos los cambios
en la apariencia de la columna. Conforme las bandas empiezan a bajar y a separarse en
la columna, recolecta las fracciones de los pigmentos separados en los tubos de ensaye
numerados.
4. Cambia de tubo cuando esté lleno hasta dos terceras partes o antes, si notas un
cambio de coloración en el eluyente. Mientras el movimiento de los pigmentos ocurra a
una velocidad apreciable, continúa añadiendo porciones del mismo solvente, no importa
cual sea el volumen utilizado ni cuantos tubos se llenen con el mismo eluyente. Si ya no
hay movimiento de los pigmentos, empieza a usar como eluyente el solvente puro o la
mezcla de la siguiente polaridad y continúa con el mismo solvente hasta que nuevamente
ya no haya cambios. Continúa eluyendo los pigmentos con solventes y mezclas de
solventes de polaridad creciente. El orden de solventes que debe seguirse, para esta
práctica es el siguiente:

-Hexano.
-Hexano con 10% de cloruro de metileno.
-Cloruro de metileno puro.
-Cloruro de metileno con 10% de acetato de etilo.
-Acetato de etilo puro.
-Acetato de etilo con 10% de metanol.
-Metanol puro.

5. Al terminar la cromatografía, observa los tubos y en base a los colores determina

cuáles de ellos corresponden al mismo pigmento.

 Bibliografia

 Wilcox, Jr. Charles F. & Wilcox, Mary F.; “Experimental Organic Chemistry. A Small-
Scale Approach”, 2nd. Ed., Prentice-Hall, New Jersey, USA, 1995. pp. 122-145 y UV
154-162.
 Mayo, Dana W., Pike, R. M. & Trumper Peter K., "Microscale Organic Laboratory with
Multistep and Multiscale Syntheses", 3rd. Ed., John Wiley, USA, 1994. pp. 97-101.

 Williamson, Kenneth L., "Macroscale and Microscale Organic Experiments", 2nd. Ed.,
Heath and Company, USA, 1994. pp. 170-182.

 Eaton, David C., "Laboratory Investigations in Organic Chemistry", McGraw-Hill, USA,

1989. pp. 127- 139.