GUIA DE PRÁCTICAS DE ENZIMOLOGÍA

Programa Profesional de Ingeniería Biotecnológica

IVAN PAZ ALIAGA

2013
 PREFACIO

Virtualmente todas las reacciones químicas que se llevan a cabo en los sistemas
vivientes, son catalizadas por enzimas; el ensayo de la actividad de una enzima
es probablemente uno de los procedimientos mas frecuentes en Bioquímica. La
mayoría de estos ensayos se llevan a cabo con el propósito de estimar la cantidad
de enzima activa presente en una célula o tejido o como una parte esencial de
una investigación que involucre la purificación de una enzima.

El conocimiento del comportamiento cinético de una enzima, en nuestros

estudiantes de Ciencias de la Salud, fue casi siempre teórico, debido a que esta
metodología no estaba a nuestro alcance, fundamentalmente por la falta de
reactivos y equipos apropiados. Asimismo, por la total dependencia que en este
sentido tenemos de los países de mayor tecnología, los cuales aplican su
conocimiento en la producción y utilización de estos biocatalizadores, siendo
esto un negocio bastante rentable.

El programa de Biotecnología que desde hace 13 años viene funcionando en

nuestra Universidad, está permanentemente subvencionado por la constante
preocupación de nuestras autoridades de sacar adelante esta carrera, a través de
una continua capacitación de sus docentes y una excelente implementación de
los laboratorios; esto nos ha motivado a iniciar una etapa de independencia
tecnológica, a través de la formación de Ingenieros Biotecnólogos que apuesten
por nuestra industria nacional, aprendiendo de experiencias en otros países mas
desarrollados que el nuestro, para aplicar e incluso mejorar metodologías
aprendidas, aprovechando que somos un país rico en recursos naturales
biotecnológicos.

Esta primera experiencia que se nos presentó para el dictado del curso de
Enzimología en pregrado, independizado totalmente de la Bioquímica, fue una
gran oportunidad y más que todo un reto para el autor, así como para los
alumnos de la primera promoción del programa de Ingeniería Biotecnológica,
en el afán de obtener frutos económicos a corto plazo. Los experimentos
presentados en la guía de prácticas del año 2002 (primera vez que se desarrolló
el curso), han ido cambiando, gracias a la compra de reactivos y equipos de
última generación, que la Universidad nos está proporcionando.
La presente guía de prácticas aborda el estudio de la cinética, la purificación y
la inmovilización enzimáticas, de una manera sencilla y accesible a nuestros
estudiantes del tercer año de la carrera de Ingeniería Biotecnológica, gracias a
experiencias aprendidas con profesores que aplican realmente sus
conocimientos sobre enzimas en producción; asimismo, de más de 30 años de
estar involucrado con las enzimas, tanto en la realización de trabajos de
investigación, como en docencia en la Universidad Nacional de San Agustín.

No intentamos iniciar una industria enzimática de la noche a la mañana, pero

estamos convencidos que con estos primeros pasos y con la permanente idea de
mejorar, la utilización de enzimas en las distintas industrias de nuestra región
(que cada día va en aumento), así como la posterior producción de las mismas
por nuestros Ingenieros Biotecnólogos, nos llevaran al desarrollo integral de
nuestros egresados.

Veamos a la enzimología como una excelente herramienta para empezar nuestra

propia Industria Regional……

Iván Paz Aliaga

PRESENTACIÓN DE LOS INFORMES DE PRÁCTICA

Para la elaboración del informe de prácticas se debe tener en cuenta las siguientes
recomendaciones:

1.- Objetivos:
En dos o tres frases establezca el o los propósitos de cada experimento, para qué se hizo
y por qué. A menos que sea pertinente, no incluya en este resumen una sección donde se trate
el modo de empleo de los equipos utilizados (si cree que es importante, incluya una pequeña
conclusión donde indique los resultados o ideas más relevantes)

2.- Material y Métodos:

Incluya aquí sólo cualquier desviación o adaptación utilizada en cuanto a equipos o
protocolos respecto a los establecidos en el manual de laboratorio. Si no es así, escriba
simplemente, “No se realizaron desviaciones de los protocolos propuestos”. Sin embargo, es
obligatorio incluir las referencias bibliográficas y a los nuevos procedimientos utilizados.

3.- Datos y Resultados:

Durante el experimento se deben registrar todos los datos generados; esto significa copiar
todas las tablas, gráficas, fórmulas, etc., que exige el manual de laboratorio y/o elaborar
nuevas tablas, gráficas, cuando sea necesario, para representar los datos correctamente.
Además, esta sección debe incluir todos los cálculos, promedios, análisis de error y
correcciones de los datos obtenidos.

4.- Discusión y Conclusiones:

Este acápite debe incluir las interpretaciones, conclusiones o sugerencias relacionadas
con los resultados obtenidos. Si es posible, incluya los resultados que se esperaban y se
discutirá por que se alcanzaron y por qué no. Respalde sus opiniones con evidencias,
incluyendo cualquier suposición que haga. ¡NO HAGA UN RESUMEN DE TODO EL
EXPERIMENTO, ES SOLO UNA DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS FINALES!

5.- Bibliografía:
Incluya cualquier cita que haya consultado para realizar el experimento o para elaborar el
informe.

Algunas sugerencias importantes:

- Sea honesto y conciso en todo momento

- Titule todas sus tablas y gráficas indicando lo que representan e incluya la

información mínima para que esta se describa por si misma.

- Los ejes de las gráficas al emplear papel milimetrado, deben dividirse en porciones
con las que sea fácil trabajar (por ejemplo 5, 10, 15, etc.; y no 2,3, 4,6, 6,9, etc.
 - Si va a trabajar con cifras de muchos decimales, mejor utilice expresiones
exponenciales (por ejemplo 52 x 10-5 en lugar de 0,00052).

- El informe no es un diario personal por lo tanto no debe incluir anotaciones personales

- Recuerde que no se le va a evaluar sus resultados, lo más importante es que estos se

representen correctamente, estableciendo explicaciones e hipótesis inteligentes de los
datos obtenidos.

- Puede utilizar procesadores de texto y hojas de cálculo para facilitar la escritura del
informe y el análisis de datos.

ENZIMOLOGÍA
 PRÁCTICA Nº 1

TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN

Las técnicas que permiten seguir el curso de una reacción enzimática pueden ser de dos tipos:
discontinuas y continuas; en el primer tipo, las observaciones no se hacen directamente en la
mezcla de reacción sino en alícuotas tomadas a diferentes tiempos, lo que nos proporciona
un número dado de puntos por separado. Otra alternativa más frecuentemente utilizada es la
determinación de la reacción a un tiempo determinado, lo que nos permite el análisis puntual
de los productos formados en ese tiempo. En este caso, para seguir el curso de la reacción en
el tiempo, se requiere de la preparación de mezclas de incubación por separado, en las que
se detiene la reacción a tiempos diferentes, para así poder construir la curva cinética.

Usualmente se requiere de por lo menos tres puntos para la determinación de la velocidad;

uno a tiempo cero, el segundo después de un intervalo de tiempo adecuado y el tercero
después de aproximadamente dos veces ese tiempo; esto permite chequear la linealidad de la
curva en el intervalo de tiempo seleccionado. Las técnicas discontinuas usualmente consisten
en estimaciones químicas del sustrato o del producto de la reacción.

En las técnicas continuas por el contrario, las observaciones se realizan en la mezcla, mientras
ocurre la reacción, de modo que haciendo un número largo de lecturas o mediante un registro
automático, se pueden trazar u obtener directamente las curvas cinéticas.

La mayoría de las técnicas utilizadas para seguir las reacciones enzimáticas son de tipo
continuo y son preferibles mientras sea posible. Con este tipo de técnicas solo es necesario
tomar un número suficiente de lecturas para estar seguros de que se ha obtenido una línea
recta. En muchos casos se puede utilizar un registrador automático en cuyo caso, la velocidad
es la pendiente del trazado obtenido. En otros casos, el instrumento puede brindarnos
directamente la velocidad.

Existen muchas técnicas para determinar la actividad de una enzima, algunas de las cuales
pasaremos a definir a continuación:

1. Técnicas Espectrofotométricas
Si el sustrato o el producto absorben luz a una longitud de onda determinada, la reacción
puede ser monitoreada siguiendo los cambios en la absorbancia a esa longitud de onda, esto
es respaldado por la ley de Lambert y Beer:

A=ε.c.l
ENZIMOLOGÍA

Esto es generalmente verdadero para cualquier longitud de onda de luz visible (rango 400 –
700 nm) o ultravioleta cercano (de 200 a 400 nm).
Las determinaciones de velocidad deben hacerse preferiblemente, a partir de procedimientos
donde la absorbancia aumente en el tiempo y no a la inversa, debido a que en las etapas
tempranas, que son las mas cruciales de la reacción, se opera en la parte más sensible de la
escala de absorbancia (las de menor valor). Se prefieren instrumento de lectura directa,
acoplados a registradores automáticos que permiten seguir el curso de la reacción
gráficamente.

Existen dos problemas principales en los métodos espectrofotométricos; en primer lugar, solo
pueden ser utilizados satisfactoriamente en las zonas de bajas absorbancias; valores altos,
además de reducir la sensibilidad, producen desviaciones de la ley de Lambert y Beer debido
a interacciones de las moléculas de soluto en soluciones concentradas. En segundo lugar, se
pueden introducir errores cuando hay un valor de absorbancia de fondo alto, o cuando la
muestra contiene material en suspensión.

Las técnicas espectrofotométricas son ampliamente utilizadas para seguir el curso de una
reacción enzimática y son preferidas a cualquier otra técnica por su sencillez, simplicidad y
sensibilidad. Un ejemplo clásico son las enzimas de óxido-reducción que utilizan como
cofactor al NAD+, donde se aprovecha la propiedad que tiene esta sustancia en su forma
reducida (NADH), de absorber selectivamente luz a una longitud de onda de 340nm.

2. Técnicas Fluorimétricas
Los compuestos fluorescentes son aquellos que absorben la luz a una longitud de onda
determinada y luego emiten luz de una longitud de onda mayor. En general la fluorimetría es
varias veces (unas 100 veces) más sensible que la espectrofotometría; sin embargo, los
efectos de fluorescencia varían con la temperatura, por lo que es muy importante controlarla.

Los coenzimas NADH y NADPH tienen la propiedad de fluorescencia, absorbiendo luz a

340 nm y emitiéndola a 460 nm; por consiguiente, las reacciones que utilizan estos
coenzimas, pueden ser seguidas a través de estas técnicas. Se utilizan ampliamente en el
estudio de reacciones de hidrólisis, empleando sustratos sintéticos no fluorescentes, los
cuales son esteres de alcoholes o aminas altamente fluorescentes. Por ejemplo, la enzima
triacilglicerol lipasa puede ser monitoreada por la siguiente reacción:
lipasa
dibutiril fluoresceína fluoresceína
en esta reacción el producto es fluorescente

Es importante indicar que tanto tirosina como triptófano fluorescen a 330-350 nm; si se tiene
en cuenta que estos aminoácidos están presentes en las enzimas, estos producen un alto fondo
de emisión en la región UV. Por esta razón es que es aconsejable restringir el uso de
fluorimetría en los análisis enzimáticos a la detección de sustancias que emiten luz en la
región visible.
ENZIMOLOGÍA

3. Técnicas Electroquímicas
 Muchas reacciones enzimáticas involucran la producción de un ácido o base a partir de un
compuesto neutral (o viceversa), por lo que el curso de esas reacciones puede ser seguido
mediante el cambio del pH, a medida que la reacción procede. Sin embargo existe un
problema, el cambio del pH puede producir la inactivación de la enzima, además, el efecto
amortiguador que tiene la misma enzima, (por ser una proteína), y/o el del buffer empleado,
pueden influir en los cambios antes mencionados.

La mejor forma de monitorear el curso de estas reacciones es mediante el uso de un pH-stat;

este equipo consiste en un pH metro acoplado a una jeringuilla automática que actúa como
bureta, y un circuito para desconectar el motor de la bureta, cuando el pH de la mezcla de
reacción se encuentra en el valor original fijado. A medida que la reacción procede y el pH
de la misma empieza a cambiar, se conecta el motor que fuerza el álcali (o el ácido) de la
bureta a la celda de reacción (la cual se mantiene en constante agitación), para recobrar el
valor original de pH.

Un registrador automático acoplado a este instrumento permite obtener el gráfico de la

cantidad de álcali o ácido añadida en relación con el tiempo de reacción. De este modo el
pH se mantiene aproximadamente constante y la cantidad de álcali (o ácido) requerida para
esto, es una medida de la velocidad de reacción. Este tipo de técnica se usa ampliamente para
monitorear la hidrólisis de esteres.

4. Técnicas Radioquímicas:
La utilización de sustratos radiactivos permite el uso de técnicas radioquímicas. Los
isótopos mas frecuentemente usados con propósito de marcaje son hidrógeno-3 (tritio),
carbono-14, fósforo-32, azufre-35 y yodo-131. Todos estos isótopos emiten radiación beta
(electrones) durante su desintegración.

Para la utilización de estas técnicas se requiere que la reacción proceda durante un tiempo
fijo, posteriormente el sustrato se separa del producto por técnicas cromatográficas o
electroforesis y la concentración del producto se determina indirectamente por medición de
la radioactividad de la fracción de producto.

Las emisiones beta de alta energía 32P o 131I) pueden ser detectadas directamente con un
contador Geiger-Müller, mientras que las emisiones de baja energía (3H, 14C, 35S) son
usualmente monitoreadas por un contador de centelleo líquido.

Un ejemplo típico de análisis enzimático con este procedimiento es la medición de la

actividad de colinesterasa, utilizando acetil colina marcada con carbono 14:

CH3-COO-CH2-CH2N+(CH3)3 
14 14
CH3-COOH + HO-CH2-CH2N+(CH3)3
Acetilcolina ácido acético colina

ENZIMOLOGÍA
Después de la incubación, el sustrato que no reaccionó y la colina deben ser eliminados en
una resina de intercambio iónico y se determina la radioactividad de la fracción de ácido
acético.

Los procedimientos radioquímicos son extremadamente sensibles pero tienen algunas

desventajas, la peligrosidad en la manipulación de radioisótopos y las etapas de separación
que deben realizarse.

5. Técnicas microcalorimétricas:
La microcalorimetria en el análisis enzimático está ganando cada vez mas importancia por
su sensibilidad, ausencia de interferencias y sus posibilidades casi universales de aplicación.

En la mayoría de las reacciones, se gana o se pierde calor (entalpía), a medida que la reacción
procede. En microcalorimetría la reacción se lleva a cabo bajo condiciones controladas en un
calorímetro y se monitorea el cambio de temperatura; estos cambios son muy pequeños, del
orden de 0,01 a 0,0001ºC, por lo que se requiere del uso de termostatos de alta precisión,
conjuntamente con sensores de temperatura muy sensibles.

Pueden ser utilizadas reacciones secundarias con el buffer para incrementar la señal y así
aumentar la sensibilidad del procedimiento. Por ejemplo, un protón producido por la reacción
primaria puede ser atrapado por el buffer con producción de calor; en este sentido el Tris es
muy útil debido a que su calor de protonización es alto. La actividad de la hexoquinasa puede
ser estimada de esta forma, utilizando el buffer Tris a pH 8.

6. Técnicas químicas:
Actualmente muchas reacciones enzimáticas son seguidas con métodos discontinuos,
donde a determinados intervalos de tiempo se requiere de la estimación de la cantidad de
sustrato o del producto por técnicas químicas.

Un ejemplo clásico es la determinación de proteasas frente a sustratos naturales cfomo

hemoglobina, caseína, etc. Esta técnica requiere de la adición de ácido tricloroacético a la
mezcla de reacción después de transcurrido un tiempo definido (que garantice el periodo de
velocidad inicial). Los filtrados o sobrenadantes que contienen los productos de la reacción,
solubles en TCA, pueden ser estimados mediante su absorbancia a 280nm o la adición, en
medio alcalino, del reactivo Folin Ciocalteau (se produce un complejo de color azul debido
a la reacción de los grupos aromáticos presentes en estos productos (Phe, Tyr y Trp) que
absorben luz a una longitud de onda entre 650 y 750 nm). En cualquiera de los dos casos, la
actividad enzimática puede expresarse en términos de micromoles de tirosina por unidad de
tiempo.

ENZIMOLOGÍA

En la presente práctica determinaremos la actividad de la enzima ureasa utilizando un método

discontinuo y un método continuo. La enzima empleada, cuyo número EC es 3.5.1.2, ha sido
purificada previamente a partir de semillas de frijol (Merck); la reacción que cataliza es la
siguiente:

NH2
O=C + 2H2O  2NH3 + H2CO3
NH2

Uno de los productos formados del amoniaco, a través de una técnica química, reacciona con
el reactivo de Nessler (K2HgI4) en medio alcalino, formando un complejo de color castaño
cuya intensidad cumple con la ley de Lambert y Beer y puede ser evaluado en el
espectrofotómetro utilizando una longitud de onda de 420nm.

Asimismo, los dos productos de la reacción se ionizan cuando esta se realiza en agua
destilada, formando amonio (NH4+), bicarbonato (HCO3-) y carbonato (CO3=), cuyos pKs son
respectivamente, 9,25, 6,35 y 10,25. Esto determina un aumento en la conductividad de la
mezcla, la cual puede ser evaluada con un conductímetro (técnica electroquímica)

OBJETIVOS:

1.- Que el alumno diferencie un método de determinación de actividad enzimática continuo

de uno discontinuo.

2.- Que el alumno describa las técnicas más comunes para determinar actividad enzimática y
que sepa ejecutar algunas de ellas, por lo menos las factibles de desarrollar en nuestro
laboratorio.

PARTE EXPERIMENTAL:

EXPERIMENTO 1.-
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA UTILIZANDO UNA TÉCNICA
QUÍMICA DISCONTINUA:

Procedimiento:
En un tubo de ensayo coloque 2,4 ml de buffer fosfato 0,05M pH 7,4
Adicione 0,4 ml de solución de urea 0,3M, mezcle bien y retire una alícuota de 0,2 ml a otro
tubo de ensayo. Pre-incube el tubo madre por 5 minutos como mínimo a 20ºC.
Sin retirar el tubo del baño maría, adicione 0,3 ml de una solución de ureasa que contiene 5,0
mg de la enzima por ml., disuelta en buffer fosfato 0,05M pH 7,4 – EDTA 0,05mM. Mezcle
bien y vuelva a incubar (ese instante constituye el tiempo cero).
Retire muestras de 0,2 ml cada 3 minutos (unas 5 muestras) y realice con ellas (así como con
la primera alícuota) una determinación de amonio de acuerdo al siguiente esquema:
ENZIMOLOGÍA
Prepare 6 tubos de ensayo previamente, conteniendo cada uno de ellos 4,3 ml de agua
destilada y 0,5 ml de reactivo de Nessler. Enumérelos.
Recepcione en estos tubos los 0,2 ml que vaya retirando de la muestra de incubación.
Mezcle bien y deje en reposo a temperatura ambiente por 10 minutos.
Cumplido el reposo, lea sus absorbancias en el espectrofotómetro a una  de 420nm o en el
fotocolorímetro usando filtro azul.
El tubo blanco lo constituye la primera alícuota

Resultados:
Coloque sus resultados en la siguiente Tabla:

Título: ________________________________________________________________

Nº de tubo Blanco 1 2 3 4 5 6
Tiempo de - 0 min. 3 min. 6 min. 9 min. 12 min. 15 min.
incubación
Absorbancia

Absorbancia
neta

_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
________________________________________________________________

Grafique los resultados, tiempo de incubación vs absorbancia neta en papel milimetrado y

pegue su gráfica en el siguiente espacio:

Título: ________________________________________________________________

ENZIMOLOGÍA
EXPERIMENTO 2:
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA POR UNA TÉCNICA
ELECTROQUÍMICA CONTINUA.-

Procedimiento:

En un beaker de 50 ml, coloque 30 ml de solución de urea 0,03M.

Ponga el recipiente sobre un agitador magnético e introduzca en él, el electrodo de un
conductímetro, teniendo la precaución de que no choque con el imán giratorio.
Asimismo, introduzca en el recipiente el electrodo de un pH metro; fije ambos electrodos con
soportes universales. Verifique que el imán del agitador no golpee a ninguno de los dos
electrodos y que el nivel del líquido dentro del beaker sea suficiente para una correcta
medición de la conductividad y del pH; si no es así, puede agregar un poco de agua destilada.
Adicione en forma rápida y en plena agitación, 10 mg de ureasa (pulverizada previamente en
un mortero); ese instante viene a ser el tiempo cero, determine en este, el pH y la
conductancia. Se trabaja a temperatura ambiente.
A partir del tiempo cero, mida pH y conductancia cada 30 segundos por unos 8 minutos.

Resultados:
Haga a continuación una representación del sistema empleado:

Título: ________________________________________________________________

Complete la tabla con sus resultados:

Título: ________________________________________________________________

Tiempo de incubación ( Conductancia ( Siemens) pH

en segundos)
0
30
60
90
120
150
180
210
 240
270
300
330
360
390
420
450
480

Grafique en papel milimetrado: tiempo de incubación vs conductancia y tiempo de

incubación vs pH, y péguelos en el siguiente espacio:

Título: ________________________________________________________________

Título: ________________________________________________________________

ENZIMOLOGÍA

INTERROGANTES:
1.- Comente el resultado de la primera gráfica y haga la discusión correspondiente

2.- Comente el resultado de la segunda gráfica y haga la discusión correspondiente

3.- Comente el resultado de la tercera gráfica y haga la discusión correspondiente

4.- ¿Cuál seria el tiempo más apropiado para determinar actividad enzimática en cada uno de
los métodos empleados?

5.- A medida que pasa más el tiempo la reacción deja de ser de primer orden. ¿A que cree
que se deba esto?

6.- La actividad de una enzima se expresa en moles de sustrato transformado por minuto
(Unidades de actividad enzimática) ¿Cómo haría para expresar sus resultados de ambos
experimentos en estas unidades?

7.- ¿Qué ventajas muestra el método continuo sobre el discontinuo?

8.- Haga las reacciones químicas de la ionización del amoniaco y del ácido carbónico

9.- ¿Qué comentario le sugiere la variación del pH durante el periodo de incubación?

10.- Determine los porcentajes de cada forma iónica de los productos al pH promedio en el
que se realizó el experimento:

- NH4+ : ______________

- CO3H- : _____________

- CO32- : ______________

11.- Existe un método más apropiado para determinar el amonio químicamente y es

utilizando el reactivo de Berthelot’s, el cual forma un complejo de color azul cuya intensidad
se mide a 546 nm de longitud de onda. Averigüe al respecto.