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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

Curso BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA GRUPO 211619A_291

BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA

INFORME DE PRACTICA DE LABORATORIO

JOSE EMILIO ARTETA MOLINA


GISSELLE DEL CARMEN RICO BORRE

GRUPO 211619A_291

TUTOR VIRTUAL: GAETHER JHON FLOREZ

TUTOR DE LABORATORIO: JULIA ORDOÑEZ

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA


PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA (UNAD)
BARRANQUILLA – ATLANTICO
NOVIEMBRE - 2016
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Curso BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA GRUPO 211619A_291

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA


DETERMINACION DE LA CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
JOSE EMILIO ARTETA MOLINA
GISELLE DEL CARMEN RICO BORRE
TUTOR DE LABORATORIO: JULIA ORDOÑEZ
ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

INTRODUCCIÓN

En el siguiente informe se describe un ensayo en laboratorio realizado sobre el


crecimiento microbiano, lo cual es de vital importancia ya que esta práctica se
observa cuando se prepara una muestra de yogurt y se inocula con cultivos
comerciales (Lactobacillus siembran microorganismos en un medio de cultivo
apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes
que le aporta el medio de cultivo para proliferarse, en nuevos microorganismos.

Para ello se hace necesario tener claro conceptos como las fases de crecimiento
microbiano, cálculos para determinación de acidez, métodos directo e indirecto para
determinar la cuantificación celular y la metodología que se va a emplear para
realizar esta actividad de laboratorio.

En esta práctica se determinó la acidez de varias muestras de yogurt y se tabularon


los datos obtenidos dando como resultado una curva típica del crecimiento de
microorganismos. Por otro lado también veremos cómo influyen la cantidad de
carbohidratos en el crecimiento microbiano.
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JUSTIFICACIÓN

Para el ingeniero de alimentos se hace necesario manejar la biotecnología


alimentaria, puesto que con ella adquiere bases sólidas para la aplicación industrial
de los microorganismos, comprendiendo las etapas de crecimiento microbiano
donde estos producen metabolitos que proporcionan a los alimentos ciertas
características organolépticas como sabor, aroma, textura entre otras. Por otra parte
esta disciplina nos muestra los procesos de fermentación en donde los
microorganismos usan como sustratos como macronutrientes (Carbohidratos,
proteínas y lípidos) y micronutrientes (vitaminas y minerales) presentes en el medio
donde se van inocular como lo es en este caso el yogurt que se va a preparar en
esta práctica de laboratorio y como estos nutrientes en exceso, condiciones físicas
(Temperatura, agitación) pueden afectar en la fisiología celular microbiana.

ANALISIS CONCEPTUAL
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Se define como crecimiento el aumento de la cantidad de constituyentes y


estructuras celulares, cuando hay crecimiento en ausencia de división celular hay
aumento en el tamaño y peso de la célula. Mientras que cuando el crecimiento es
seguido de división de células hay un aumento en el número de células.

El crecimiento de una población es el aumento del número de células como


consecuencia de un crecimiento individual y posterior división. Esto ocurre de una
manera exponencial. El crecimiento exponencial es una consecuencia del hecho de
que cada célula se divide dando dos células.

La velocidad del crecimiento exponencial se expresa como el tiempo de generación


“G”, y este se define como el tiempo que tarda una población en duplicarse, los
tiempos de generación varían ampliamente entre los distintos microorganismos.

La curva del crecimiento de una población bacteriana se divide en 4 fases

 Latencia

Cuando una población bacteriana es inoculada en un medio fresco el crecimiento


no suele comenzar de inmediato, sino después de un tiempo llamado latencia.

La fase de latencia representa un periodo de transición para los microorganismos


cuando son transferidos a una nueva condición. En esta fase se producen las
enzimas necesarias para que ellos puedan crecer en un nuevo medio ambiente. En
esta fase no hay incremento de células, pero hay gran actividad metabólica,
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aumento en el tamaño individual de las células, en el contenido proteico, ADN y


peso seco de las células.

 Exponencial o logarítmica

Es el periodo de la curva del crecimiento en el cual el microorganismo crece


exponencialmente, es decir que cada vez que pasa un cierto tiempo de generación
la población se duplica. Bajo condiciones apropiadas la velocidad de crecimiento es
máxima. Las condiciones ambientales afectan la velocidad de crecimiento
exponencial.

 Fase estacionaria

En cultivos en recipientes cerrados una población no puede crecer indefinidamente


de forma exponencial. Las limitaciones de crecimiento ocurren ya sea por
agotamiento de algún nutriente esencial, por acumulación de productos tóxicos,
porque se alcance un número de células elevado para el espacio disponible o por
combinación de las causas anteriores.

 Fase de muerte

Si la incubación continua después de que una población microbiana alcanza la fase


estacionaria, las células pueden continuar vivas y seguir metabolizando, pero va a
comenzar una disminución progresiva en el número de células viables, y cuando
esto ocurre se dice que la población ha entrado en fase de muerte.

Modelos matemáticos del crecimiento microbiano:

Para muchos propósitos en biotecnología microbiana es necesario conocer el


número de generaciones, la población de bacterias con el fin de estimar el estado
fisiológico de la población microbiana y establecer relaciones con los sustratos del
medio de cultivo o los productos de biosíntesis.

En los organismos unicelulares la célula se divide por fisión binaria dando lugar a
dos células hijas, cada una de las cuales se divide nuevamente produciendo dos
células nuevas, por lo que en cada periodo e división la población se duplica. Esta
multiplicación representa una progresión geométrica en la cual hay una relación
directa entre el número de células iniciales y la cantidad de células en otro tiempo
determinado. La expresión matemática que representa esta relación es:
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N = No2n Donde:

N= número final de células,

No = número inicial de células

N = número de generaciones

Para explicar la anterior ecuación en términos de n se aplica una transformación


logarítmica cuyo resultado es:

MEDIDA DE MASA CELULAR

MÉTODOS DIRECTOS

En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.

1) Determinación del peso húmedo:

 Se tara un tubo de centrífuga;

 Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;

 Se determina el peso del sedimento.


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Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya


cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa,
intensidad del empaquetamiento, etc.

2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca


antes de ser pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas
de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.

Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores:


es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de
laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

3) Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.

4) Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN,


ARN, proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos, etc.

Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles
dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos,
etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

MÉTODOS INDIRECTOS

1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito


por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de
carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de
ácidos.

2) Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la práctica cotidiana


del laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la medición de la
cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.

Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que
cualquier partícula pequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de
la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.

a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio


de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la
absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la suspensión).
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Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A
con la masa bacteriana en una muestra problema.

Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el


tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica
aumenta pues a longitudes de onda () cortas. La proporcionalidad entre A y masa
bacteriana sólo es válida para >107céls/ml.

b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está


situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se
mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor
sensibilidad que el espectrofotómetro.

Temperatura óptima de desarrollo:

De acuerdo a ella los microorganismos se dividen en:

Psicrófilos: se desarrollan a temperaturas relativamente bajas. Pueden crecer a


0oC y pueden crecer a temperaturas medias (psicrófilos facultativos). Para los
psicrófilos obligados estas bajas temperaturas son letales. Ej: organismos que
deterioran la carne, los vegetales y las frutas en lugares refrigerados.
Mesófilos: se desarrollan a temperaturas medias. Crecen desde 10-45 oC. Ej:
Algunas especies del suelo que causan enfermedades.
Termófilos: se desarrollan a temperaturas relativamente altas. Se desarrollan a
temperaturas superiores a 45 oC. Ej: organismos que viven en la superficie del
suelo bajo radiación solar directa, en el compost, etc.

Concentración osmótica
Influencia de la presión osmótica sobre la célula microbiana
Ósmosis: es el fenómeno de difusión a través de membranas semipermeables que
separan dos disoluciones de diferentes concentraciones de solutos. Aquí se tienden
a igualar las concentraciones a ambos lados de la membrana.
Si un microorganismo está en un medio de concentración > la concentración del
contenido celular →se hincha y puede reventar, esto es el fenómeno de la turgencia.
En relación con la concentración del medio donde se desarrollan, se dividen en:

 Microorganismos osmotolerantes: resisten altas concentraciones de solutos.


 Microorganismos osmofílicos: requieren para su desarrollo de medios con altas
concentraciones de soluto.
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 Microorganismos halofílicos: requieren de altas concentraciones salinas.

MATERIALES Y REACTIVOS

 Marmitas de acero inoxidable


 Agitador de acero inoxidable
 Leche en polvo Marca Olímpica
 Cultivos comerciales de Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus termophillus
(2 yogures Griegos de alpina y uno de Coolechera)
 Leche líquida marca Coolechera
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 Balanza Analítica
 Papel Aluminio
 Vasos desechables
 Termómetro digital
 Bureta
 Beacker de 100 ml
 Pipetas de 10 ml
 Hidróxido de sodio NaOH 0,1 N
 Fenolftaleína
 Azúcar comercial
 Estufa
 Máquina de hielo
 Utra congelador
 Licuadora industrial
 Cuchillos
 Soporte universal
 Glucosa de Maíz
 Fructosa

METODOLOGÍA

Pasteurizar en una marmita 2000 ml de leche


entera con ayuda de un termómetro hasta que
llegue a 85°C

Realizar choque térmico en un


lavaplatos con abundante hielo
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Distribuir con ayuda de un frasco medidor un


litro de leche en dos recipientes metálicos
diferentes

Licuar un litro de leche tibia con Licuar un litro de leche tibia con
100 gramos de azúcar + 70 100 gramos de azúcar + 50
gramos de leche en polvo gramos de leche en polvo

E n una marmita calentar la


E n una marmita calentar la mezcla
mezcla preparada de 45 – 50 °C
preparada de 45 – 50 °C

Inocular con un cultivo starter Inocular con un cultivo starter


comercial de Lactobacillus comercial de Lactobacillus
bulgaricus + Sptretococcus bulgaricus + Sptretococcus
Termophillus a 37 °C Termophillus a 40 °C

Servir en vasos desechables y esperar el Determinar Acidez cada


proceso de fermentación (4 horas). Medir 0.5, 1, 1.5, 2.5, 3.5 y 4.5
la temperatura inicial del proceso. horas.

Refrigerar en un ultra congelador por 10 minutos

Diagrama No. 1 Proceso de Elaboración de Yogurt con 70 y 50 gramos de leche en polvo.

Determinación Acidez de las


muestras de yogurt

Tomar 9 ml de la muestra con


una pipeta de 10 ml
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Agregar los 9ml de la muestra en


un Beacker de 100 ml

Adicionar 3 gotas de
fenolftaleína

Titular con una solución de


NaOH 0,1 N hasta una
coloración rosa pálido

Repetir este procedimiento


con las muestras de yogurt
cada 0.5, 1, 1.5, 2.5, 3.5 y 4.5
horas

Realizar los cálculos de acidez y


realizar curva de crecimiento
microbiano del yogurt

Diagrama No. 2 Determinación de Acidez para curva de crecimiento microbiano.

Preparación yogurt con glucosa de maíz

Pasteurizar 500 ml de leche entera en


una marmita a 85 ° C
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Realizar choque térmico en un lavaplatos


con abundante hielo.

Adicionar a los 500 ml de leche


pasteurizada: 50 gramos de leche en
polvo + 50 gramos de glucosa de maíz y
calentar a 45 - 50 °C, para disolver la
glucosa.

Enfriar a 42 °C e inocular con cultivo comercial


de Lactobacillus Bulgaricus – Streptococcus
termophillus y distribuir en vasos desechables.

Tomar la temperatura inicial con


termómetro digital y esperar el proceso
de fermentación por 4 horas.

Determinar acidez y realizar pruebas


organolépticas.

Diagrama No. 2 Proceso de elaboración de yogurt con glucosa de maíz.

Preparación yogurt con Fructosa

Pasteurizar 500 ml de leche entera


en una marmita a 85 ° C.
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Realizar choque térmico en un


lavaplatos con abundante hielo.

Adicionar a los 500 ml de leche


pasteurizada: 50 gramos de leche
en polvo + 50 gramos de Fructosa y
calentar a 45 - 50 °C, para disolver
la Fructosa.

Enfriar a 42 °C e inocular con cultivo


comercial de Lactobacillus Bulgaricus
– Streptococcus termophillus y
distribuir en vasos desechables.

Tomar la temperatura inicial con


termómetro digital y esperar el
proceso de fermentación por 4
horas.

Determinar acidez y realizar pruebas


organolépticas.

Diagrama No. 2 Proceso de elaboración de yogurt con Fructosa.

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

CALCULO DE LA ACIDEZ TITULABLE


La acidez de la leche se expresa como el porcentaje de peso del ácido
láctico que se encuentra en la leche. Se aplica la siguiente fórmula:

% ACIDEZ = A x B x C x 100
D
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Dónde:
A: cantidad en mililitros de NaOH.
B: Normalidad del NaOH
C: Peso equivalente del ácido láctico. (0.09)
D: peso de la muestra en miligramos.

CALCULOS: Yogurt 70g de leche en polvo

4,4 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,44 %
9 𝑚𝑙

4,5 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,45%
9 𝑚𝑙

4,6 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,46 %
9 𝑚𝑙

5,5 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,55%
9 𝑚𝑙

5,7 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,57 %
9 𝑚𝑙

6,3 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,63%
9 𝑚𝑙

Temperatura Acidez % Tiempo Volumen


Gastado ml
(NaOH)

37°C 0,44 0,5 4,4

37°C 0,45 1 4,5

37°C 0,46 1,5 4,6


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37°C 0,55 2,5 5,5

37°C 0,57 3,5 5,7

37°C 0,63 4,5 6,3

*Tabla No. 1 Yogurt con 70g de leche en polvo.

Acidez % vs Tiempo
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
Acidez %
0.3
0.2
0.1
0
1 2 3 4 5 6

 Grafico No. 1 Curva de Crecimiento microbiano para yogurt con 70g de


leche en polvo inoculado a 37°C.

CALCULOS: Yogurt 50g de leche en polvo

3,8 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,38 %
10 𝑚𝑙

3,9 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,39 %
10 𝑚𝑙
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4,2 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,42 %
10 𝑚𝑙

4,7 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,47 %
10 𝑚𝑙

5,6 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,56 %
10 𝑚𝑙

6,9 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,69 %
10 𝑚𝑙

Temperatura Acidez % Tiempo Volumen


Gastado ml
(NaOH)

40°C 0,38 0,5 3,8

40°C 0,39 1 3,9

40°C 0,42 1,5 4,2

40°C 0,47 2,5 4,7

40°C 0,56 3,5 5,6

40°C 0,69 4,5 6,9

*Tabla No. 2 Yogurt con 50g de leche en polvo.


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Acidez % vs Tiempo
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
Acidez %
0.3
0.2
0.1
0
1 2 3 4 5 6

 Grafico No. 2 Curva de crecimiento microbiano para yogurt con 50g de


leche en polvo inoculado a 37°C.

Determinación de Acidez en yogurt con glucosa de maíz

6 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,60 %
10 𝑚𝑙

Acidez Aroma Textura Color Sabor

0,60 Característico Media Blanco Simple

 Tabla de características de yogurt con glucosa de maíz.

Determinación de Acidez en yogurt con Fructosa

5,8 𝑚𝑙 ∗ 0,1𝑁 ∗ 0,09 ∗ 100


% 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = = 0,58 %
10 𝑚𝑙

Acidez Aroma Textura Color Sabor

0,58 Característico Media Oscuro Dulce

 Tabla de características de yogurt con Fructosa.


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CONCLUSIONES

Del trabajo realizado se puede concluir:

El crecimiento microbiano puede considerarse como el crecimiento de poblaciones


de muchos millones de células cuyas características son esencialmente
estadísticas, y el comportamiento de la célula individual es tomado como una
frecuencia.

El crecimiento de los microorganismos en cultivo puede determinarse midiendo


experimentalmente el incremento de la materia celular o del incremento del número
de células.

Las posibilidades fisiológicas de los microorganismos se relacionan inversamente


con sus necesidades nutricionales, ya que las síntesis de componentes celulares a
partir de materia inorgánica o compuestos simples es obviamente un proceso más
complejo de lo que sería si los productos de partida fueran sustancias orgánicas
complejas químicamente más parecidas a los constituyentes finales de las células.

Se puede concluir que para llevar a cabo un proceso de fermentación se deben


tener en cuenta las siguientes condiciones: Temperatura de inoculación del cultivo
starter, condiciones ambientales, cantidad de nutrientes empleados.

El elevado contenido de Carbohidratos (Azucares) retienen la cantidad de agua y


se dificulta la supervivencia de los microbios. El agua se mueve desde el interior de
las células hacia fuera (mediante un proceso llamado "ósmosis") y esto genera su
deshidratación parcial (plasmólisis), que impide la multiplicación de los
microorganismos.

Además el alto contenido de azucares no solo inhibe el crecimiento microbiano sino


afecta también a ciertas características organolépticas como el sabor (Flavor) y el
color del producto como se pudo observar al preparar un yogurt con glucosa de
maíz y otro con fructosa.
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BIBLIOGRAFIA

Recuperado el 04 noviembre 2016:


http://www.consumer.es/web/es/alimentacion/aprender_a_comer_bien/alimentos_
a_debate/2012/10/09/213597.php#sthash.5JvpAdmc.dpuf.

Recuperado el 07 noviembre 2016: https://www.ecured.cu/Microorganismo.

Quistián García Hylary. (2014) Curva de crecimiento microbiano tomado de:

http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com.co/2014/10/curva-del-crecimiento.html.

Instituto nacional de vigilancia de medicamentos y alimentos, INVIMA, Resolución


2310 de 1986 tomado de:

https://www.invima.gov.co/images/stories/resoluciones/resolucion_02310_1986.pdf

Recuperado el 07 noviembre 2016:


http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm

Recuperado el 07 noviembre 2016:

http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com.co/2014/10/curva-del-crecimiento.html.

Alquicira P. Lizbeth. Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa. En


http://www.academia.edu/9291458/curva_de_crecimiento_mo
Ortiz, F. (2012). Módulo de Biotecnología. Universidad Nacional Abierta y a
Distancia. Páginas: 44-47. En:
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/305689/Contenido_Biotecnologia_305689_
actualizado.pdf. 1.
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